JPH09511145A - イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの、核酸およびアミノ酸配列とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示およびクレームされているのは、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ相同体をコードしている遺伝子のヌクレオチドである。これらの遺伝子は、それそれ８７９、４５９、３４５アミノ酸のポリペプチドをコードしており、これらのポリペプチドもまた、開示されクレームされている。これらの遺伝子は、ＤＮＡプローブとして、あるいはＰＣＲプライマーの調製に有用である。ポリペプチドは抗原的、免疫的またはワクチン組成物として有用である。ヌクレオチドは、いずれの適切なベクター中でも発現でき、ポリペプチドの生産を可能とする。さらには、いずれかのヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの組合せを含むベクター、例えばＣＨＶ−ワクシニアもしくはアビポックスウイルス組換体等のポックスウイルスベクターシステムが、発現による産物、即ちｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質が利用可能であるように、抗原的、免疫的またはワクチン組成物中で利用可能である。糖タンパク質、またはヌクレオチド（群）を含むベクターの発現によって誘導された抗体もまた有用である。この組成物の製造方法および利用方法もまた開示され、クレームされている。同時に、特異的カナリアポックス−ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ組換体であるｖＣＰ３２０、ｖＣＰ３２２およびｖＣＰ２９４およびそれらの製造方法および使用方法もまた、開示されクレームされている。

Description

【発明の詳細な説明】 イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの、 核酸およびアミノ酸配列とその利用 発明の分野 本発明はイヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、ヌクレオチドまたは単離されたＣ ＨＶ ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ糖タンパク質をコードしている核酸、およびそれらのア ミノ酸配列、例えばワクシニアおよびアビポックスウイルス組換体等の組換えポ ックスウイルス等のベクターであってＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤを コードしているかまたはそれらを発現するもの、それらからの糖タンパク質、ワ クチン、核酸（例えば、組換えポックスウイルス、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／ またはｇＤコードを含有し、それらからの糖タンパク質を発現するワクシニアま たはアビポックスウイルス組換え体等のベクター由来）由来の、または、例えば ベクター系内でのヌクレオチドの発現等により得られた糖タンパク質由来の、免 疫学的または抗原的組成物に関し、また、前記ヌクレオチド、糖タンパク質、お よび組成物を用いる方法に関する。 以下の文中でいくつかの文献を、「参考文献」と表題を付した部分での完全な それぞれの列挙とともに、引用している。文中において引用された出版物はこれ により文書中に参考文献として取り込まれている。 発明の背景 イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）は、新生児の子犬においては致命的な出血性 の疾患を、成犬においては自己限定的な、通常は潜在性の、上部呼吸道感染を引 き起こす（Ａｐｐｅｌ，１９８７）。ＣＨＶの遺伝子構造についてはほとんど知 られていない。遺伝子はまだマッピングされておらずヌクレオチド配列も公表さ れていない。特に、免疫関連遺伝子をコードしている遺伝子はまだ同定されてい ない。 ヘルペスウイルス糖タンパク質は、例えば細胞付着および貫通、細胞から細胞 へのウイルスの拡散、および重要なことには感染の病原性プロフィールの決定な どの必須のウイルス機能を成立させる。ヘルペスウイルス糖タンパク質は宿主の 免疫系との相互作用において重要な成分である（Ｓｐｅａｒ，１９８５ａ；Ｓｐ ｅａｒ，１９８５ｂ）。ヘルペスウイルス糖タンパク質は体液と細胞の両方の免 役システムで認識される抗原であり、ワクチン接種された宿主中で防御免疫反応 を喚起することが知られている（Ｗａｃｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７； Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８０；Ｐａｐｐ−Ｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，１９７９）。 ヘルペスウイルスの感染の間、免疫反応の大部分はウイルスエンベローブ糖タ ンパク質に対して向けられている。これらの抗原は体液と細胞の両方の免疫反応 を引き出すことが示されている。他のヘルペスウイルスの系では、ヘルペスウイ ルスｇＢ、ｇＣ、および／またはｇＤ糖タンパク質による免疫化で防御免疫反応 を誘導可能であることが、いくつかの報告で示唆されている。 単純ヘルペスウイルスの十分に特徴づけられた糖タンパク質には、ｇＢ、ｇＣ 、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭがある（Ｓｐｅ ａｒ，１９８５ａ；Ｓｐｅａｒ，１９８５ｂ；Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ．，１９８６；Ｆｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ ．，１９８６；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｒｉｃｈｍａ ｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｓｗａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｚｅｚｕ ｌａｋ，１９８４；Ｒｏｉｚｍａｎ ａｎｄ Ｓｅａｒｓ，１９９０；Ｈｕｔｃ ｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ａ；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ．，１９９２ｂ；Ｂａｉｎｓ ａｎｄ Ｒｏｉｚｍａｎ，１９９３）。多くの研 究が単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質の免疫反応の誘導における重要性を示 してきた。このように、ｇＢおよびｇＤが重要な免疫反応を誘導可能であること が報告されている（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｃａｎｔｉｎ ｅ ｔ ａｌ．，１９８７；Ｃｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｌａｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ａ；Ｍａｒｔ ｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ｂ；Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４ ；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９ ８８；Ｗａｃｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａ ｌ．， １９８６ａ；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６ｂ）。ｇＣはクラスＩ限 定細胞毒性リンパ球を刺激することが可能である（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａ ｌ．，１９８５；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）一方で、ｇＤ はクラスＩＩ細胞毒性Ｔ細胞反応を刺激することが可能である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ａ；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ｂ；Ｗａｃ ｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８ ６ａ；Ｚａｒｌｉｎｇ １９８６ｂ）。ｇＧは複合体依存性のウイルス中性化の ための抗体の標的であることが示されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ． ，１９８７；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。他のヘルペスウイ ルスの由来の多くの糖タンパク質についてもまた、重要な免疫反応を誘導するこ とが知られている。 ウマヘルペスウイルスの両方の亜型は６種類の多量糖タンパク質を発現する（ Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７） 。ｇｐ２、ｇｐ１０、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１７／１８およびｇｐ２１／２ ２ａをコードしているＤＮＡ配列のゲノム部位は、ラムダｇｔｌｌ発現ベクター およびモノクローナル抗体を用いて同定されている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ． ，１９８７）。糖タンパク質ｇｐ１３およびｇｐ１４は、単純ヘルペスウイルス マップの、ｇＣおよびｇＤがそれぞれ相同性を有する、ゲノムのＬ成分の内部に 位置している（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。これらのエンベローブ 糖タンパク質は、体液と細胞の両方の宿主免疫反応の誘導に関与する、単純ヘル ペスウイルスの決定的免疫原であり（Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．，１９ ８６；Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａｌ ．，１９８４；Ｗａｃｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗａｃｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、そのためワクチン設計を試みるものの最も高い関 心の対象である。 近年、ＥＨＶ−１のＫｅｎｔｕｃｋｙ Ｔ４３１株の、ｇｐ１３をコードして いる転写単位のヌクレオチド配列が報告された（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９８８）。その糖タンパク質は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＣ−１およ びｇＣ−２、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩおよびバリセラ−ゾスター ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ；ＶＺＶ）ｇｐＶと 相同性を有することが示された（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ＥＨ Ｖ−１ ｇｐ１３はこのように、ヘルペスウイルスｇＣ−類似糖タンパク質の構 造的な相同体である。 ＥＨＶ−１ ｇｐ１４のヌクレオチド配列（Ｗｈａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９；Ｒｉｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）が近年報告された。予測さ れるｇｐ１４糖タンパク質のアミノ酸配列の解析により、対応する糖タンパク質 ＨＳＶ、ｇＢとの顕著な相同性が明らかとなった。 いくつかのＥＨＶ−１糖タンパク質に対するモノクローナル抗体が中性化する ことが示された（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。受身免疫実験 により、ｇｐ１３もしくはｇｐ１４（Ｓｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，１９８９） 、又はｇｐ１３、ｇｐ１４、もしくはｇｐ１７／１８（Ｓｔｏｋｅｓ ｅｔ ａ ｌ．，１９８９）に対するモノクローナル抗体はハムスターを致死投与から防御 することが可能であることが示された。他のｇＢおよびｇＣ糖タンパク質アナロ グもまた、アルファヘルペスウイルスにより引き起こされる疾患に対する防御に 関与している（Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｃｒａｎａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。 仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、アルファヘルペス、は、オーエスキー病の原 因となる作用物である。ＰＲＶゲノムは９０ｘ１０⁶ダルトンの、逆反復配列に よってユニークロング（Ｕ_L）部分またはユニークショート（Ｕｓ）部分（Ｓｔ ｅｖｅｌｙ、１９７７；Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．，１９７９）に分け られる二本鎖ＤＮＡから成る（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７５ ）。ＰＲＶゲノムは約１００の、発現が他のヘルペスウイルスに類似したカスケ ード様の方式で制限されているポリペプチドをコードしている（Ｂｅｎ−Ｐｏｒ ａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈａｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。 ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０は、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ｇ Ｄのアナログである（Ｗａｔｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ＤＮＡオープ ンリーディングフレームは４０２のアミノ酸をコードしている（Ｐｅｔｒｏｖｓ ｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。成熟したグリコシル化型（５０−６０ｋＤ ａ）は、Ｎ−リンク型グリコシル化なしで、Ｏ−リンク型炭水化物を含む（Ｐｅ ｔｒｏｖｓｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ブタ血清はＰＲＶ ｇｐ５０と 非常に反応性が高く、その免疫原としての重要性を示唆している。ｇｐ５０に対 するモノクローナル抗体は生体外でＰＲＶを補体とともに、または補体なしで中 性化し（Ｗａｔｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｗａｔｈｅｎ １９８５；Ｅ ｌｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、受動的にマウス（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗａｔｈｅｎ １９８５；Ｅｌｏｉｔ ｅｔ ａｌ． ，１９８８）およびブタ（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を防 御する。ＰＲＶ ｇｐ５０を発現するワクシニアウイルス組換体は血清中性化抗 体を誘導し、致死量のＰＲＶ投与からマウスとブタの両方を防御した（Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｉ ｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。 ＰＲＶ ｇＩＩＩはＨＳＶ−１ ｇＣのアナログである（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅ ｔ ａｌ．，１９８６）。ＨＳＶｇＣによるＰＲＶＩＩＩの機能的置換は観察さ れなかった（Ｗｈｅａｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＰＲＶ ｇＩＩＩは生 体外での複製には必須ではないが（Ｗａｔｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｒ ｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、成熟グリコシル化型（９８ｋＤａ） はＰＲＶエンベローブの多量の構成成分である。抗ｇｐＩＩＩモノクローナル抗 体は生体外でウイルスを補体とともに、または補体なしで中性化し（Ｈａｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｅｌｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗａｔｈｅ ｎｅｔ ａｌ．，１９８６）、受動的にマウスとブタの両方を防御する（Ｍａｒ ｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ＰＲＶ糖タンパク質ｇＩＩＩは、大 脂菌で発現されたＣｒｏ／ｇＩＩＩ 融合タンパク質により免疫化した後（Ｒｏ ｂｂｉｎｓ，Ａ．，Ｒ．ｗａｔｓｏｎ，Ｌ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，ヨーロッパ特許出 願０１６２７３８Ａ１）又はワクシニア組換体中で発現された時（Ｐａｎｉｃａ ｌｉ，Ｄ．，Ｌ．Ｇｒｉｔｚ，Ｇ．Ｍａｚｚａｒａ，ヨーロッパ特許出願０２６ １９４０Ａ２）、ネズミとブタを致死量のＰＲＶ投与から防御することができる 。 ＰＲＶ ｇｐＩＩはＨＳＶ−１ ｇＢ相同体である（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＰＲＶ ｇｐＩＩを標的としたモノクローナル抗体はウイ ルスを生体外で（Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６）補体とともに 又は補体なしで（Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）中性化する。さ らに、受身免疫の研究により、中性化モノクローナル抗体は部分的にブタを防御 する（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）ことが示された。仮性狂 犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）またはｇｐ５０（ｇＤ）を発現するＮＹ ＶＡＣ（高度に弱毒化されたワクシニアウイルス）をベースとした組換体による 免疫化することにより、毒性ＰＲＶ投与からブタを保護できることが示された（ Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。さらに、ＰＲＶ ｇＩＩお よびｇｐ５０、またはｇＩＩ、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇｐ５０を発現するワク シニア組換体は、ｇＩＩまたはｇｐ５０のみを発現する組換体よりも高いレベル の防御を引き出すことが示され、これらの糖タンパク質の潜在性の相乗作用の効 果が示唆された（Ｒｉｖｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ゲノムは、少なくとも１１の抗原的に 区別できる糖タンパク質をコードしている： ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、 ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭ（Ｒｏｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９９０）。精製されたＨＳＶ１ ｇＢ、ｇＣまたはｇＤにより免疫化されたマウ スは致死量のＨＳＶ１投与に対して防御される（Ｃｈａｎ，１９８３）。マウス はまた、ＨＳＶ１（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９７９）またはＨＳＶ２（Ｏ ａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８）ウイルス全体に対する抗体、および個々の ＨＳＶ２ ｇＢ、ｇＣ、ｇＤまたはｇＥ糖タンパク質に対する抗体（Ｂａｌａｃ ｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２）による受動免疫によって、致死量の ＨＳＶ１またはＨＳＶ２投与に対して防御された。 ＨＳＶ１ ｇＢ（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９ ８８）およびＨＳＶ１ ｇＣ（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７） ウイルスを発現するワクシニアウイルスベクターは、細胞毒性Ｔ細胞反応を誘導 することが示された。加えて、ＨＳＶ１ ｇＢ（Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、ＨＳＶ１ ｇＣ（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）またはＨＳ Ｖ１ ｇＤ（Ｐａｏｌｅｔｔｉｅｔ ａｌ．，１９８４）のいずれかを発現する 組換えワクシニアウイルスにより免疫化されたマウスは致死量のＨＳＶ１投与に 対して防御されることが示された。ＨＳＶ１ ｇＤを発現する組換えワクシニア ウイルスもまた、モルモットモデル系においてＨＳＶ２に対して防御的であるこ とが示された（Ｗａｃｈｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。 ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ）は３０以上の構造的ポリペプチドを指定し ているが、そのうち１１はグリコシル化されている（Ｍｉｓｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８１）。これらの糖タンパク質のうちの３つ、ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩ Ｖは、特徴付けがなされ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質ｇＢ、 ｇＣ、およびｇＤと相同性であることが発見されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅ ｔ ａｌ．，１９８６；Ｚａｍｂ，１９８７）。精製されたウシヘルペスウイル ス１型（ＢＨＶ１）ｇＩ（ｇＢ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）および／またはｇＩＶ（ｇ Ｄ）による免疫化により、ＢＨＶ１／Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙ ｔｉｃａ投与に対して牛は防御された（Ｂａｂｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ）。 ネコヘルペスウイルス１型（ＦＭＶ−１）は少なくとも２３の異なったタンパ ク質を含むことが知られている（Ｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｆａｒｇ ｅａｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。これらのうち、少なくとも５つが１２０ ｋＤａから６０ｋＤａの範囲で報告されている分子量でグリコシル化されている （Ｆａｒｇｅａｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９８９）。 ＦＨＶ−１の糖タンパク質は免疫原性であることが示されている（Ｍｅａｓ ｅ ｔ ａｌ．，１９８４；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９８９）。いくつかの他のアルファ ヘルペスウイルスのように、ＦＨＶ−１はＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ） と相同性を有していると見られる（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。Ｆ ＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質は、Ｂ−メルカプトエタノールによって、６６ｋＤ ａと６０ｋＤａの２つの糖タンパク質に解離する１３４ｋＤａの複合体である。 ＦＨＶ−ＩＤＮＡゲノムは大きさでおよそ１３４ｋｂである（Ｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。 ヒトＢリンパ栄養ヘルペスウイルスであるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢ Ｖ）は、亜科ガンマヘルペスウイルスに属するリンホクリプトウイルス属の仲間 である（Ｒｏｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、ＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９ ８８）、ＭＣＨＶ（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＥＨＶ１（Ｔｅ ｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）のゲノムと同様に、ＥＢＶのゲノムは完 全にシークエンスされているので（Ｂａｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、これ らの異なったヘルペスウイルスの数多くの相同性が記述されている（Ｋｉｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。 ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）はベータヘルペスウイルス亜科（ヘル ペスウイルス科）に属する。免疫学的に区別できる、ＨＣＭＶエンベローブに関 連する糖タンパク質の３つの科が記述されている（Ｇｒｅｔｃｎ ｅｔ ａｌ． ，１９８８）：ｇＣＩ（ｇｐ５５およびｇｐ９３−１３０）；ｇＣＩＩ（ｇｐ４ ７−５２）；およびｇＣＩＩＩ（ｇｐ８５−ｐ１４５）。ｇＣＩをコードしてい る遺伝子は、ＨＳＶＩｇＢと相同性である。 さらに、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ；ＭＤＶ）ｇＢを発現する鶏痘ウイルス組換体での免疫化は、ニワトリを毒性Ｍ ＤＶ投与に対して防御することが示された（Ｎａｚａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。 これらの研究の結果は、ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ糖タンパク質に対する 免疫反応により目的とする種の動物をヘルペスウイルス投与に対して防御可能で あること、および、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対応するヌク レオチドの供与は、それにより糖タンパク質、および、ベクターシステム又は糖 タンパク質からの抗原性、免疫性またはワクチン組成物の供与が可能となるため 、現在の技術水準以上の有用な進歩であることを示唆している。 さらに、ヌクレオチドの発現による糖タンパク質は、血清等の試料中の糖タン パク質の存在または不在およびそれによるＣＨＶ、または、（ＣＨＶに、または 糖タンパク質に対する）免疫性もしくは抗原性反応の存在または不在の確認のた めの抗体結合診断アッセイ、キットまたは試験にさらに用いることができる抗体 の誘発にも利用することができる。このように、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ 糖タンパク質に対応するヌクレオチドの供与からは多くの用途が生じる。 例えばラムダ等のファージやＥ．ｃｏｌｉシステム等の、多様な外来性ＤＮＡ の発現のためのベクターシステムが存在する（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９ ８７；Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＥＰＡ ０１６２７３８Ａ１；Ｐａｎｉｃａｌｉ、ＥＰ Ａ ０１６２７３８Ａ１、これらはそれぞれここに参考文献として特に取り込ま れている。） ワクシニアウイルスと、近年は他のポックスウイルスが、外来性遺伝子の挿入 と発現のために用いられている。生きている感染可能なポックスウイルス中への 外来遺伝子の挿入の基本技術は、ドナープラスミド中の外来遺伝子要素に隣接し ているポックスＤＮＡ配列とレスキューポックスウイルス中に存在する相同性シ ークエンスとの間での組み換えに関与している（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ． ，１９８７）。 特に、ポックスウイルス組換体は、この分野で公知であり、それらの開示が参 考文献としてここに取り込まれている米国特許第４７６９３３０号、同第４７７ ２８４８号、同第４６０３１１２号、同第５１００５８７号および同第５１７９ ９９３号に記載されている、例えばワクシニアウイルスやアビポックスウイルス 人工組換体の創出のための方法に類似である、２段階の工程により構築される。 第一に、ウイルス中に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス源由来の オープンリーディングフレームを、ポックスウイルスのＤＮＡ部分と相同である ＤＮＡが既に組み込まれたＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物中に配置する。 別に 、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターと連結する。プロモーター−遺伝 子連結物を、プロモーター−遺伝子連結物がその両端において、可欠座を含むポ ックスＤＮＡ領域に隣接しているＤＮＡ配列と相同性であるＤＮＡと隣接するよ うに、プラスミド構築物中に配置する。その結果生成されたプラスミド構築物は 、続いてＥ．ｃｏｌｉバクテリア内での増殖により増幅され（Ｃｌｅｗｅｌｌ、 １９７２）単離される（Ｃｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９６９；Ｍａｎｉａ ｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。 第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドを、例えば ニワトリ胚繊維芽細胞等の細胞培養へ、ポックスウイルスとともに形質移入する 。プラスミド中の相同性ポックスＤＮＡとウイルスゲノムそれぞれとの間の組み 換えにより、ゲノムの可欠領域内の外来ＤＮＡ配列の存在により改変されたポッ クスウイルスが供与される。「外来」ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡ、特に 非 ポックス源由来のＤＮＡで、そのＤＮＡが配置されたゲノムによっては本来産成 されない遺伝子産物をコードしているものを指す。 遺伝子的組み換えとは一般に、２本のＤＮＡ鎖の間のＤＮＡの相同性部分の交 換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置換しうる。核酸の 相同性部分とは、同じヌクレオチド塩基の配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮ Ａ）の部分である。 遺伝子的組み換えは感染した宿主細胞内での複製や新しいウイルスゲノムの製 造の間に自然に行われる。このように、ウイルス遺伝子の間の遺伝子的組み換え は、２以上の異なったウイルス又は他の遺伝子的構築物が共感染した宿主細胞中 においてもウイルス複製サイクルの間に起こりうる。第一のゲノムからのＤＮＡ 部分が、ＤＮＡが第一のウイルスゲノムのＤＮＡに相同性である、第二の共感染 したウイルスのゲノム部分の構築において、相互転座可能に用いられる。 しかしながら、組み換えは、完全には相同性ではない異なったゲノムのＤＮＡ 部分の間においてもまた行われる。もし、第一のゲノム由来の部分が、第一の部 分の内部の、例えば遺伝子マーカー又は相同性ＤＮＡに挿入された抗原決定基を コードしている遺伝子の存在を除いては、他のゲノム部分と相同性であるときは 、組換えは起こり得、その組換えの生成物はその遺伝子マーカーや組換体ウイル スゲノム中の遺伝子の存在により検出できる。ワクシニアウイルス組換体の創出 のための付加的なストラテジーが最近報告されている。 挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の、感染可能な改変されたウイルスでの成功裡の 発現には２つの条件が必要である。第一には、改変されたウイルスが生存可能で あるように、挿入はウイルスの可欠領域中でなければならない。挿入されたＤＮ Ａの発現のための第二の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモー ターの存在である。プロモーターは発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置する ように配置されなければならない。 ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫化のために成功裡に利用され、１ ９８０年には天然痘の世界中での根絶をついに達成した。その歴史の過程におい て、多くのワクシニア株が創成された。これらの異なった株は多様な免疫原性を 示し、潜在的な合併症、そのもっとも深刻なものはワクチン後の脳炎と突発性発 疹（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ、１９８３）、と、様々な度合いで関連している。 天然痘の根絶とともに、遺伝子的に操作された外来遺伝子の発現のためのベク ターとしての、ワクシニアの新しい役割が重要となった。数多くの異種抗原をコ ードしている遺伝子がワクシニア中で発現され、しばしば、対応する病原体の投 与に対する防御免疫という結果となった（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９０ａ中で総括）。 ワクシニアベクターの遺伝子的背景は、発現された外来免疫原の防御効率に影 響を与えることが示されている。例えば、エプスタイン バール ウイルス（Ｅ ＢＶ）ｇｐ３４０の、ワクシニアウイルスのＷｙｅｔｈワクチン株中での発現は 、コットントップ タマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ ｔａｍａｒｉｎ）をリンパ 腫によって誘導されたＥＢＶに対して防御しなかったが、同じ遺伝子のワクシニ アウイルス ＷＲラボラトリー株での発現は防御的であった（Ｍｏｒｇａｎ ｅ ｔ ａｌ．，１９８８）。 効率とワクシニアウイルスベースの組換体ワクチン候補の安全性との間の精密 なバランスは非常に重要である。組換体ウイルスは、ワクチン接種された動物中 で、防御的免疫反応を誘導するがいかなる重要な病原性性質をも欠如したやり方 で免疫原（群）を供与しなければならない。それ故に、ベクター株の弱毒化は、 現在の技術水準にわたって高度に好ましい進歩である。 数多くのワクシニア遺伝子が、組織培養における増殖に必須ではなく、その欠 失もしくは不活性化が多くの動物システム中での毒性を減少するものであるとし て同定されている。 ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードしている遺伝子がマッ ピングされ（Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、配列決定された（Ｈｒｕ ｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。チミジ ンキナーゼ遺伝子の不活性化もしくは完全な欠失は、ワクシニアウイルスの多様 な組織培養細胞中での増殖を妨げない。ＴＫ^-ワクシニアウイルスはまた、多様 な宿主中の、多様な経路で接種された部位での生体内の複製能力も有している。 単純ヘルペスウイルス２型に関して、ＴＫ^-ウイルスのモルモットへの経膣接 種は、脊髄において、ＴＫ⁺ウイルスの接種と比較して顕著に低いウイルス力価 という結果となることが示された（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８ ５）。生体外でＴＫ活性をコードしているヘルペスウイルスは活動的に代謝して いる細胞中でのウイルス増殖にとっては重要ではないが、静止状態の細胞中での 増殖には必要であることが示された（Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７ ４）。 ＴＫ^-ワクシニアの弱毒化は、大脳内および腹腔内経路で接種されたマウスに おいて示された（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。弱毒化はＷＲ神経 毒性ラボラトリー株とＷｙｅｔｈワクチン株の両方について観察された。皮内経 路で接種されたマウスにおいて、ＴＫ^-組換体は、相当する抗ワクシニア中性化 抗体を、親株のＴＫ⁺ワクシニアウイルスと匹敵するほど発生させ、この試験シ ステムにおいてはＴＫ機能の欠失はワクシニアウイルスベクターの免疫原性を顕 著には減少させないことが示唆された。それに続く、ＴＫ^-およびＴＫ⁺組み換え ワクシニアウイルス（ＷＲ株）でのマウスの鼻腔内接種においては、脳を含む他 の部位への顕著に少ない伝播が見られた（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９ １ａ）。 ヌクレオチド代謝に関与する他の酵素はリボヌクレオチド還元酵素である。ラ ージサブユニットをコードしている遺伝子の欠失による、ウイルスにコードされ た単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内のリボヌクレオチド還元酵素活性の欠損は 、分裂中の細胞内での生体内でのウイルス増殖およびＤＮＡ複製に何も影響を与 えないが、血清飢餓細胞におけるウイルス増殖能力を厳しく制限した（Ｇｏｌｄ ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。目に対する急性のＨＳＶ感染および三 叉神経の神経節における再活性化しうる潜在性の感染のためのマウスモデルを用 いたところ、リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットが欠失したＨＳＶに 関しては、野生型ＨＳＶによって示される毒性と比較して、減少された毒性が示 された（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。 リボヌクレオチド還元酵素の、スモール（Ｓｌａｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， １９８８）およびラージ（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）サブユニ ットの両方がワクシニアウイルスにおいて同定されている。挿入によるリボヌク レオチド還元酵素ラージサブユニットの失活は、ワクシニアウイルスのＷＲ株に おいて、マウスの頭蓋内接種によって測定されるウイルスの弱毒化につながる（ Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。 ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）はマッピングされ配列決定され ている（Ｓｈｉｄａ，１９８６）。ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子は、組織培養 においての増殖には必須ではない（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９７ １）。ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子の不活性化は、頭蓋内経路で接種されたウ サギの神経毒性の減少および皮内接種の部位でのより少ない病斑という結果とな る（Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ＨＡ座は、ワクシニアウイルスの ＷＲ株（Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、リスター株（Ｌｉｓｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ）（Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）およびコペンハーゲン 株（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）において外来遺伝子の挿入に用いられた 。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ^-ワクシニアウイルスは免疫原性であり（Ｇ ｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓ ｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、 対応する病原体の投与に対して防御的であることが知られている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。 牛痘ウイルス（ブライトン レッド株；Ｂｒｉｇｈｔｏｎ ｒｅｄ ｓｔｒａ ｉｎ）は、赤い（出血性の）痘をニワトリの卵の漿尿膜上に生じさせる。牛痘ゲ ノム内の自然発生的欠失は、白い痘を生じさせる変異体を創成するＰｉｃｋｕｐ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。出血性機能（ｕ）は初期遺伝子にコードされてい る３８ｋＤａのタンパク質に位置している（Ｐｉｃｋｕｐ ｅｔ ａｌ．，１９ ８６）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘 ウイルスに対する宿主炎症性反応を阻害し（Ｐａｌｕｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，１ ９８９）、血液凝固のインヒビターであることが示されている。 このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスＷＲ株において存在している（Ｋｏｔｗ ａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９ｂ）。外来遺伝子の挿入によってｕ遺伝子が不活 性化されているＷＲワクシニアウイルス組換体で接種されたマウスは、ｕ遺伝子 が手を加えられていない同様の組換体ワクシニアウイルスによって接種されたマ ウスと比べて、高いレベルで外来遺伝子産物に対する抗体を産成した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｕ領域はワクシニアウイルスコペンハーゲン株に おいても不全な機能しない型で存在している（オープンリーディングフレームＢ １３およびＢ１４ Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂで報告された 用語による）。 牛痘ウイルスは感染した細胞内で細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在化さ れる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９５９）。ＡＴＩの機能は動物から動物への 伝播の間に牛痘ウイルス粒子を保護することであると考えられている（Ｂｅｒｇ ｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７１）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩボディ のマトリックスを形成する１６０ｋＤａのタンパク質をコードしている（Ｆｕｎ ａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ）。ワクシニアウイルスは、グノム中に相同性の領域を有してはいるが、一般に ＡＴＩを産生しない。ワクシニアＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は９４ ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８） 。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株においては、ＡＴＩ領域に相当するＤ ＮＡ配列の殆どが欠失しており、ＡＴＩ領域の上流配列と融合された領域の３’ 末端が残存し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成してい る（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂ）。 多様な自然発生的な（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｄ ｒｉｌｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９； Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｐａｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐａ ｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１）および操作された（Ｐｅｒｋｕｓ ｅ ｔ ａｌ．，１９９１；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）ワクシニアウイルスゲノムの左端近くでの欠失が報 告されている。１０ｋｂの自然発生的欠失を有するＷＲ株（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａ ｌ．，１９８１；Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１）は、マウスへの 頭蓋内接種により弱毒化されることが示された（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。この欠失はのちに１７の潜在的ＯＲＦを含んでいることが示された （Ｋｏｔｗａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ｂ）。欠失領域の特異的遺伝子には、 ビロキンＮ１Ｌ（ｖｉｒｏｋｉｎｅ Ｎ１Ｌ）および３５ｋＤａタンパク質（Ｃ ３Ｌ、Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂの報告の用語による）を含 んでいる。挿入によるＮ１Ｌの不活性化は、頭蓋内接種による通常のマウスおよ びヌードマウスの両方に対する毒性を減少させる（Ｋｏｔｗａｌ ｅｔ ａｌ． ，１９８９ａ）。３５ｋＤａタンパク質はＮ１Ｌのようにワクシニアウイルス感 染細胞の培地中に分泌される。このタンパク質は、補体調整タンパク質（ｃｏｍ ｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー、特に補体４ Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）に対する相同性を有している（Ｋｏｔｗａｌ ｅ ｔ ａｌ．，１９８８ａ）。細胞内Ｃ４ｂｐのように、ワクシニア３５ｋＤａタ ンパク質は補体の第四成分に結合し、クラシカル補体カスケード（ｃｌａｓｓｉ ｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃａｓｃａｄｅ）を阻害する（Ｋｏｔｗａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。このように、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は、 ウイルスの宿主防御機構を回避を援助することに関与しているものと見られる。 ワクシニアゲノムの左端、宿主領域遺伝子Ｋ１Ｌ（Ｇｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａ ｌ．，１９８６）およびＣ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）と同 定されている２つの遺伝子を含んでいる。これらの遺伝子の両方の欠失は、ワク シニアウイルスの多様なヒト細胞系列における増殖能力を減少させる（Ｐｅｒｋ ｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。 ２つの付加的なワクチンベクターシステムが、本来宿主制限されたポックスウ イルス、アビポックスウイルスの利用に関与している。ニワトリポックスウイル ス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ；ＦＰＶ）およびカナリアポックスウイルス（ｃ ａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ；ＣＰＶ）が外来遺伝子産物の発現のために操作さ れてきている。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科ア ビポックスウイルス属の標準的なウイルスである。このウイルスは、１９２０年 代以来、生弱毒化ワクチンの利用により良好に制御されている、経済的に重要な 家禽病を引き起こす。アビポックスウイルスの複製は鳥類種に限られており（Ｍ ａｔｔｈｅｗｓ，１９８２ｂ）、アビポックスウイルスが、ヒトを含む非鳥類種 への生産的感染を引き起こしたという報告は文献にはない。この宿主制限は、ウ イルスの他の種への伝播に対する内在的安全バリアを供与し、アビポックスウイ ルスベースのワクチンベクターの獣医学およびヒトの用途での利用を、魅力的な 問題とする。 ＦＰＶは、家禽病原体由来の抗原を発現するベクターとして有利に利用されて きた。毒性鳥類インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質が、ＦＰＶ組換 体中で発現された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）。組換体をニワ トリおよび七面鳥に接種した後、同種または異種の毒性インフルエンザウイルス 投与に対して防御的である免疫反応が誘導された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． ，１９８８ａ）。ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａ ｓｅ Ｖｉｒｕｓ）の表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換体もまた開発され た（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。 ＦＰＶおよびＣＰＶの複製が、鳥類系に限定されているにも拘わらず、これら のウイルスから派生した組換体は、鳥類以外の起源の細胞中で外因性タンパク質 を発現することが発見された。さらに、このような組換体ウイルスは、外来遺伝 子産物に対する免疫学的反応を誘導することが示され、好適な場合には、対応す る病原体の投与に対して防御する余裕があることが示された（Ｔａｒｔａｇｌｉ ａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２； １９９１ｂ；１９８８ｂ）。 このように、今までは、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対する ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は教示も示唆もされておらず、これらの配列の 提供は非常に価値の高いものである。さらに、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖 タンパク質に対するヌクレオチド由来の（例えば、これらのヌクレオチドを含む ベクターシステム由来の）、ワクチン、抗原的もしくは免疫的組成物は、糖タン パク質それら自体（例えばベクターシステムにより発現されたもの）と同様に、 これまでは教示も示唆もされておらず、そして、これらのヌクレオチド、ベクタ ーシステム、糖タンパク質および組成物は非常に価値の高いものである。 本発明の目的と概要 このように、本発明の一つの目的は、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤをコード する単離された核酸またはヌクレオチドを提供することである。 ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤをコードする単離された核酸またはヌ クレオチドを含むベクターを供与することも、本発明のさらなる目的である。 ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質を、とくに、ヌクレオチドまたは 単離された核酸をベクター中での発現により供与することが本発明の別の目的で ある。 ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤをコードする単離された核酸またはヌ クレオチド、またはそれらをコードするベクター由来の、または、例えばベクタ ーの発現などで得られた糖タンパク質それ自体由来の、抗原的、ワクチン、免疫 的組成物を供与することも、本発明の付加的な目的である。 改変された組換えウイルスであって、増加された安全性を有するものを提供す ること、およびそのような組換えウイルスの作成方法を提供することも本発明の 別の目的である。 公知の組換えポックスウイルスの抗原的、ワクチンもしくは免疫的組成物と比 較してより高いレベルの安全性を有する組換えポックスウイルス抗原的、ワクチ ンもしくは免疫的組成物を提供することも本発明の付加的な目的である。 宿主中で遺伝子産物を発現するためのベクターであって、宿主中で低毒性であ るようにベクターが改変されているものを供与することも本発明のさらなる目的 である。 例えばＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ等の遺伝子産物を生体外で培養 された細胞中で発現するための、増加されたレベルの安全性を有する改変組換え ウイルスもしくは改変ベクターを用いる方法を提供することもまた本発明の別の 目的である。 これらの、および他の本発明の目的および利点は、以下を考慮することにより より容易に明らかとなるであろう。 本発明はＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤヌクレオチド、それらからの糖タンパ ク質の解析、およびそのヌクレオチド配列および糖タンパク質を用いた抗原的、 ワクチンもしくは組成物に関する。 従って、本発明はヌクレオチドもしくはイヌヘルペスウイルスｇＢ糖タンパク 質をコードしている単離された核酸を提供する。 本発明はイヌヘルペスウイルスｇＣ糖タンパク質をコードしている単離された 核酸を提供する。 本発明はイヌヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質をコードしている単離された 核酸を提供する。 そのヌクレオチドは好ましくはＤＮＡである。ヌクレオチトもしくは単離され た核酸は好ましくは図１、４および７に示されたＤＮＡ配列を有する。 本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢを提供する。 本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＣを提供する。 本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＤを提供する。 本発明はさらにイヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤに対する ヌクレオチドまたは単離された核酸を含むベクターを提供する。好ましくはその ベクターは例えば組換えワクシニアまたはアビポックスウイルスなどの組換えポ ックスウイルスであり、より好ましくはそのワクシニアまたはアビポックスウイ ルスは例えばＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣもしくはＴＲＯＶＡＣのように弱毒化され ている。 このように、１つの好ましい態様においては、本発明は、組換体ウイルスが弱 毒化された毒性および増加された安全性を有するように、ウイルスがコードして いる遺伝的機能を不活性化されている改変組換体ウイルスに関する。その機能は 、必須ではないか、または毒性に関している。ウイルスは好ましくはポックスウ イルス、特に、例えばニワトリポックスウイルスやカナリアポックスウイルスな どのワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。改変組換体ウイル スには、ウイルスゲノム中の非必須領域中に、ＣＨＶ抗原性タンパク質、例えば ＣＨＶ ｇＣ、ｇＢおよびｇＤまたはそれらのいずれかの組合せ等をコードして いる外来性ＤＮＡ配列を含んでいても良い。 さらに好ましい態様においては、本発明は、ウイルスが弱毒化された毒性を有 するように、非必須のウイルスにコードされている遺伝的機能を不活性化されて いる改変組換体ウイルスであって、その改変組換体ウイルスはさらにウイルスゲ ノムの非必須領域中に異種起源由来のＤＮＡを含んでいるものに関する。そのＤ ＮＡはＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、またはそれらのいずれかの組合せをコー ドしていても良い。特に、毒性要素をコードしているオープンリーディングフレ ームを欠失させることにより、または天然に宿主が制限されているウイルスを利 用することにより、遺伝的機能が不活性化されている。本発明に従って利用され るウイルスは、好ましくは、ポックスウイルス、特に、例えばニワトリポックス ウイルスおよびカナリアポックスウイルス等の、ワクシニアウイルスまたはアビ ポックスウイルスである。好ましくは、そのオープンリーディングフレームは、 Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ ＋ Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｌ、Ｃ７Ｌ − Ｋ１Ｌ、 およびＩ４Ｌ（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂで報告された用語 による）；およびそれらの組合せから成る群から選択される。これに関して、オ ープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封 入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝子領域またはリボヌクレオチド還元 酵素ラージサブユニット；あるいはこれらの組合せから成る。ワクシニアウイル ス改変コペンハーケン株はＮＹＶＡＣと同定されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 本発明はさらに、抗原性または免疫的反応をイヌ等の宿主中で誘導するための 抗原的、ワクチンまたは免疫的組成物であって、イヌヘルペスウイルス ｇＢ、 ｇＣおよび／またはｇＤに対するヌクレオチド（群）あるいは単離された核酸（ 群）を含む適切なベクターおよび適切な担体から成るもの；または、例えば本発 明のヌクレオチド（群）を含むベクターにおいてのそれらの発現由来等の、イヌ ヘルペスウイルス ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ糖タンパク質（群）、および 適切な担体を提供する。 本発明はさらに、発明のヌクレオチド（群）または単離された核酸（群）、糖 タンパク質（群）、組成物（群）を用いる方法をも提供する。 このように、本発明はイヌヘルペスウイルス ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ を調製するための、それらに対応するヌクレオチド（群）または単離された核酸 （群）を適切なベクター中に挿入し、ベクターを培養し、ベクターから糖タンパ ク質を回収することから成る方法を提供する。ベクターはワクシニアやアビポッ クスウイルス等のポックスウイルス、ラムダ等のファージ、またはＥ．ｃｏｌｉ や他の適切なウイルスまたは細菌ベクターであってもよい。培養は、ウイルス感 染を受けやすい細胞をウイルスベクターで感染させるかまたは、細菌ベクターシ ステムのコロニーを、例えばプレートや液体培地法等でで増殖させてもよい。そ して、回収は糖タンパク質をウイルス感染細胞または細菌細胞から分離してもよ い。 このように、好ましい態様においては、本発明は、弱毒化された毒性と増加さ れた安全性を有する改変組換体ウイルスを細胞に導入し、生体外で培養された細 胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関している。改変組換体ウイルスは、非必 須領域内に、例えばＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤまたはこれらのいずれかの組 合せ等の、抗原性タンパク質をコードしている外因性ＤＮＡ配列を有していても よい。 同様に、本発明は、本発明の抗原的、ワクチンまたは免疫的組成物をイヌ等の 宿主に投与することから成る、イヌ等の宿主細胞中でイヌヘルペスウイルスに対 する抗原的または免疫的反応を刺激する方法または接種する方法に関する。付加 的には、本発明は、本発明のヌクレオチド（群）の発現により誘導された抗体を 含む。この抗体は公知の技術によりモノクローナル抗体とすることができ、そし て、抗体もしくはモノクローナル抗体は、血清などの試料中のＣＨＶ ｇＢ、ｇ Ｃおよび／またはｇＤの存在または不在およびそれによるＣＨＶ、またはＣＨＶ もしくはその糖タンパク質に対する抗体または免疫反応、の存在または不在を決 定するための結合診断アッセイ、試験またはキットに用いられてもよい。 これらおよび他の本発明の範囲内の実施態様は、記載されているかまたは、以 下の詳細な説明から明らかである。図面の簡単な説明 以下の、実施例を通して与えられ、本発明を記載された特定の実施例に限定す るために意図されているのではない詳細な説明は、付随している図面と関連づけ ることによって最もよく理解されるであろうが、ここにおいて、 図１は、ＣＨＶ ｇＢ相同体のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配 列（配列番号１および２）を示し； 図２はＣＨＶ ｇＢ相同体のハイドロパシー性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔ ｙ）分析を示し； 図３Ａおよび３Ｂは８つのｇＢ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番 号２−９）； 図４はＣＨＶ ｇＣ相同体およびＯＲＦ２のヌクレオチド配列と予測されるア ミノ酸配列（配列番号１０−１１）を示し； 図５はＣＨＶ ｇＤ相同体のハイドロパシー性分析を示し； 図６は４つのｇＣ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番号１１−１４ ）； 図７はＣＨＶ ｇＤ相同体のヌクレオチド配列と予測されるアミノ酸配列（配 列番号１５−１６）を示し； 図８はＣＨＶ ｇＤ相同体のハイドロパシー性分析を示し； 図９は４つのｇＤ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番号１６−２０ ）； 図１０は、チミジンキナーゼ遺伝子欠失用のプラスミドｐＳＤ４６０の構築方 法および組換体ワクシニアウイルスｖＰ４１０の開発を模式的に示し； 図１１は、出血性領域欠失用のプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法および組換 体ワクシニアウイルスｖ５３３の開発を模式的に示し； 図１２は、ＡＴＩ領域欠失用のプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築方法および組 換体ワクシニアウイルスｖＰ６１８の開発を模式的に示し； 図１３は、血液凝集素遺伝子欠失用のプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法およ び組換体ワクシニアウイルスｖＰ７２３の開発を模式的に示し； 図１４は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失用のプラスミドｐＭＰＣ Ｋ１Δの構築方法および組換体ワクシニアウイルスｖＰ８０４の開発を模式的に 示し； 図１５は、リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット欠失用のプラスミド ｐＳＤ５４８の構築方法および組換体ワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡ Ｃ）の開発を模式的に示し； 図１６は、狂犬病糖タンパク質 Ｇ遺伝子のＴＫ欠失座への挿入用のプラスミ ドｐＲＷ８４２の構築方法および組換体ワクシニアウイルスｖＰ８７９の開発を 模式的に示し； 図１７は、Ｃ５０ＲＦを含むカナリアポックスＰｖｕII断片のＤＮＡ配列を示 し； 図１８Ａおよび１８Ｂは、組換体カナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧ）の構築方法を模式的に示し； 図１９は、ＮＹＶＡＣの開発のために欠失されたＯＲＦを模式的に示し； 図２０は、Ｆ８ ＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 （配列番号６９）を示し； 図２１は、Ｆ７ ＯＲＦを含む２３５６塩基対のＴＲＯＶＡＣ ＤＮＡ断片の ヌクレオチド配列（配列番号７２）を示し； 図２２Ａから２２Ｄは、狂犬病中性化抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）、 ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０^5.5ＴＣＩＤ５０）の、同一または別のワクチン （０、２８、および１８０日にワクチンが与えられ、抗体力価は０、７、２８、 ３５、５６、１７３、１８７および２０８日に測定）で前もって免疫化されたボ ランティアのうちでのブースター効果のグラフを示し； 図２３は、ｐＣＨＶ３７およびｖＣＰ３２０に含まれた、１３Ｌでプロモート されたＣＨＶ ｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示し； 図２４は、ＡＬＶＡＣ Ｃ６フランキングアーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｍ ）の遺伝子のヌクレオチド配列を示し； 図２５は、ｖＣＰ３２０感染細胞（³⁵Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、 ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ３２０感染細胞（レーンＣ）およびＣ ＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶ ｇＢ特異的モノクローナル抗体 １１２５Ｂ２（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手 ）とともにイムノプレシピテーションされ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）のイムノプレシピテーショ ン分析を示し； 図２６は、ｐＣＨＶ４０およびｖＣＰ３２２に含まれた、Ｈ６でプロモートさ れたＣＨＶ ｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示し； 図２７は、ｖＣＰ３２２感染細胞（³⁵Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、 ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ３２２感染細胞（レーンＣ）およびＣ ＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶ ｇＣ特異的モノクローナル抗体 ２０１１Ａ９（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手 ）とともにイムノプレシピテーションされ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）のイムノプレシピテーショ ン分析を示し； 図２８は、ｐＣＨＶ２６およびｖＣＰ２９４に含まれた、Ｈ６でプロモートさ れたＣＨＶ ｇＤ遺伝子のヌクレオチド配列を示し； 図２９は、ｖＣＰ２９４感染細胞（³⁵Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、 ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ２９４感染細胞（レーンＣ）およびＣ ＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶ ｇＤ特異的モノクローナル抗体 ２０８Ｄ１１（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手 ）とともにイムノプレシピテーションされ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）のイムノプレシピテーショ ン分析を示している。詳細な説明 本発明は、ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をコードしているヌクレオチ ドを提供する。これらの遺伝子は、それぞれ８７９、４５９および３４５アミノ 酸のポリペプチドをコードしている。これらの糖タンパク質の予測されるアミノ 酸配列と、他のヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＣおよびｇＤアミノ酸配列との比較 により、ＣＨＶはアルファヘルペスウイルスの一つであること；このウイルスの 以前の生物学的特徴に従った分類と一致する結論が示唆された。この分析により 、ｇＢ相同体間のホモロジーはｇＣまたはｇＤ相同体間のホモロジーより大きい こともまた明らかとなり、ｇＢに関する構造上または機能上の束縛はｇＣもしく はｇＤに関するものより大きいことが示唆された。 相同性ｇＢ、ｇＣおよびｇＤポリペプチドを並べることにより、非常に多くの システイン残基が完全に保存されていることが明らかとなった。これらの結果は 、これらのシステイン残基が、それらのジスルフィド結合を形成する能力により 、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質の構造および機能の無欠さを維持すること において重要であることを示唆している。事実、ＨＳＶ１においては、システイ ン１はシステイン５とともにジスルフィド結合を形成し、システイン２はシステ イ ン６とともにジスルフィド結合を形成し、システイン３はシステイン４とともに ジスルフィド結合を形成することが示されている（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１ ９９２）。さらに、これらの残基のいずれかに対する変異は、結果として生じる 糖タンパク質の立体配置、プロセシング、機能に多大な効果を有する（Ｗｉｌｃ ｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ、１９９０）。故に、本 発明の糖タンパク質中でのシステイン残基の保存もまた、構造上の重要性を有す る。 ｇＣ、ｇＤ、にｇＢ相同体の間の高いホモロジーの程度もまた、これらの糖タ ンパク質が共通した機能を有することを示唆している。事実、ＢＨＶ１のｇＢ相 同体はｇＢ^-ＰＲＶウイルスをレスキューできることが示されており、これらの ２つの糖タンパク質が機能的に同等であることが示唆されている（Ｋｏｐｐ ＆ Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，１９９２）。 相同性ｇＢ、ｇＣおよびｇＤポリペプチドを並べることにより、潜在的なＮ− 結合グリコシル化サイトがいくらか保存されていることが明らかとなった。Ｎ− グリコシル化は、例えばタンパク質の立体配置の保持、プロテアーゼ分解に対す る防御等の多様な機能において役割を有していると考えられている。しかしなが ら、ヘルペスウイルス糖タンパク質に対するＮ−結合炭化水素の生物学的重要性 はまだ完全には理解されていない。例えば、ＨＳＶ１感染細胞のツニカマイシン 処理は、感染可能なウイルス粒子の生産を阻害することが示されている（Ｐｉｚ ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。それに加えて、ＨＳＶ１ウイルス粒子のエン ドグリコシダーゼ処理は感染性を減少させることが示された（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。他方では、グリコシル化サイトの変異は感染性に影響しな いので、ＨＳＶ１ ｇＤのＮ−結合グリコシル化絶対に必須であるとは見えない （Ｓｏｄｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。故に、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タ ンパク質のグリコシル化サイトは比較的よく保存されているが、これらのポリペ プチドの適切なグリコシル化は、完全には必須ではない。 ヘルペスウイルスのＧ＋Ｃ含量は３３−７５％の間で変化する（Ｒｏｉｚｍａ ｎ，１９８２）。この拡散している多様性は、ウイルスにコードされているかま たは誘導された、ヌクレオチド代謝に関与する酵素の存在（または不在）に基づ く非選択的変異偏向によるものであることが示唆されている（Ｈｏｎｅｓｓ ｅ ｔ ａｌ．，１９８４）。例えば、ＶＺＶおよびヘルペスウイルス サイミリ（ ｓａｉｍｉｒｉ；ＨＶＳ）は両方とも比較的低いＧ＋Ｃ含量（それぞれ、４６％ と４６％）を有し、そして両方とも酵素チミジル酸シンセターゼをコードしてい るが、この酵素はＴＴＰ合成に関与している（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ ，１９８６；Ｈｏｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。他方でＨＳＶ１、ＨＣ ＭＶおよびＥＢＶは比較的高いＧ＋Ｃ含量を有しているが（６８％、５７％およ び６０％）、チミジル酸シンセターゼをコードしているようには見えない（Ｈｏ ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ＣＨＶはＤＮＡ密度分析によって、いず れのヘルペスウイルスよりも低いＧ＋Ｃ含量３３％（Ｐｌｕｍｍｅｒ ｅｔ ａ ｌ．，１９６９；Ｒｏｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２）；比較的低い本発 明のヌクレオチドのＧ＋Ｃ含量に相当する値（２９％）を有することが同定され ている。ＣＨＶはヌクレオチド代謝に関する酵素をコードしていないという理論 に拘束されることを望んではいないが、本発明から、ＣＨＶ ｇＣ遺伝子のすぐ 下の下流に位置しているＯＲＦはＶＺＶ チミジル酸シンセターゼとは相同性で はないと判明した。故に、もしＣＨＶがチミジル酸シンセターゼ遺伝子を含んで いれば、それはＶＺＶと同じゲノム中の位置には発見されなかった。 ＣＨＶにさらされた新生の子犬は通常はＣＨＶ特異的中性化抗体を形成するこ となしに死ぬ。同時に、母体の抗体または血清陽性イヌ由来の免疫血清処理は子 犬を致命的なＣＨＶ感染から防御できる（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，１９７０）。 故に、血清中性化抗体は致命的なＣＨＶ感染から子犬を防御できる。同様に、血 清中性化抗体は成犬を自己限定的の潜在性上部呼吸路感染から防御できる。 ３つのＣＨＶ糖タンパク質である、ｇｐ１４５／１１２、ｇｐ８０およびｇｐ ４７は、ＣＨＶ中性化抗体を誘導することが知られている（Ｘｕａｎ ｅｔ ａ ｌ．，１９９１）。これらの糖タンパク質をコードしている遺伝子はまだ同定さ れていない。いかなる一の理論に拘束されることも望んではいないが、しかしな がら、これらの抗原は本発明のｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子にコードされている 可能性がある。いくつかの報告が、ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤに対する免疫 反応は、ヘルペスウイルスの投与からの標的の種の動物の防御を提供可能である ことを示唆しているため（Ｂａｂｕｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｎａｚａｒ ｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｒｉｖｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、本発明のＣＨＶ ｇＢ、ｇ ＣおよびｇＤ遺伝子は、効率の良いＣＨＶ糖タンパク質、免疫的またはワクチン 組成物およびそれらの使用方法を提供する。 特に、本発明のヌクレオチドは発現のためのいかなる適切なベクターシステム 中にも挿入できる。例えば、ヌクレオチド（群）は、公知の方法を用いてＥ．ｃ ｏｌｉシステム等の（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＥＰＡ ０１６２７３８Ａ１； Ｐａｎｉｃａｌｉ、ＥＰＡ ０２６１９４０Ａ２を参照）いかなる適切な細菌ベ クター中に挿入できる。 このヌクレオチド（群）は、例えばラムダ、ポックスウイルス、ヘルペスウイ ルス（参考文献として取り込まれているＲｏｉｚｍａｎ、ＵＳ特許第４７６９３ ３１号を参照）、バキュロウイルス、ポリオウイルス（Ｋｉｔｓｏｎ ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３０６８−３０７５，１９９１参考文献としてこ こに取込みを参照）。アデノウイルス（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９ ９２，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｓ ｅｍｉｎｅｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．３）ｐ．２３７−５２，１ ９９３；Ｂａｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．４ ，ｐ．３８６１−６５；Ｇｒａｈａｍ，Ｔｉｂｔｅｃｈ ８，８５−８７，Ａｐ ｒｉｌ，１９９０；Ｐｒｅｖｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．ＶＩｒｏｌ．７ ０，４２９−４３４を参照、それぞれはここに参考文献として取り込まれている ）システム等の、いかなる適切なファージまたはウイルスベクターシステムに、 公知の方法により挿入できる。 好ましいベクターシステムはポックスウイルスベクターシステムであり、特に 、米国特許第４７６９３３０号、第４７７２８４８号、第４６０３１１２号、５ １００５８７号および５１７９９９３号のように組換えられているアビポックス ワクシニアウイルスシステムである。しかしながら、弱毒化されたポックスウイ ルスシステムはさらに好ましい。 新しいワクシニアワクチン株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の開発のために、ワ クシニアウイルスのコペンハーケンワクチン株を、公知のまたは潜在性の毒性要 素をコードしている、ゲノムの６つの非必須領域を欠失することにより改変した 。欠失の順序を以下に詳述する。全てのワクシニア制限酵素断片、オープンリー ディングフレームおよびヌクレオチド位置の命名は、Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ ．，１９９０ａ，ｂにおいて報告された用語に基づいている。 欠失遺伝子座を、外来遺伝子挿入のための受容体座としても操作した。 ＮＹＶＡＣにおいて欠失された領域は以下に列挙されている。略語、欠失され た領域のオープンリーディングフレームの命名（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０ａ，ｂ）および特定された欠失を通した全ての欠失を含むワクシニア組 換体（ｖＰ）の命名もまた、以下に列挙する。 （１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０； （２）出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３； （３）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８； （４）血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３； （５）宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および （６）リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ） ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ） ＮＹＶＡＣは、毒性や宿主領域に関する遺伝子産物をコードしている１８のオ ープンリーディングフレームの特異的欠失により開発された、遺伝子的操作をさ れたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは、ｉ）新生マウスへの大脳内接 種後の減少した毒性、ｉｉ）遺伝的（ｎｕ ⁺／ｎｕ ⁺）もしくは化学的（シクロフ ォスフォアミド）に免疫無防備状態のマウス中での無毒性、ｉｉｉ）免疫無防備 状態のマウスにおける散在性感染の誘発の欠如、ｉｖ）ウサギ皮膚上での顕著な 硬化および潰瘍化の欠如、ｖ）接種部位からの迅速な消散、およびｖｉ）ヒト起 源のものを含む組織培養細胞系統上での顕著に減少された複製能力、という数多 くの基準からみて高度に弱毒化されている。にもかかわらず、ＮＹＶＡＣをベー スとしたベクターは、外因性免疫原に対する完全な反応を誘導し、防御的免疫を 提供した。 ＴＲＯＶＡＣとは、生後１日のニワトリのワクチンに認可されているニワトリ ポックスウイルスのＦＰ−１ワクチン株から派生した、プラーククローン単離体 である弱毒化されたニワトリポックスを指す。ＡＬＶＡＣとは、認可されたカナ リアポックスワクチンであるＫａｎａｐｏｘ（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ ．，１９９２）のプラーククローンされた派生体である、弱毒化されたカナリア ポックスウイルスベースのベクターである。ＡＬＶＡＣは、いくつかのＫａｎａ ｐｏｘの一般的性質と同様の、いくつかの一般的性質を有する。ＡＬＶＡＣをベ ースとした外因性免疫原を発現する組換えウイルスもまた、ワクチンベクターと して効率的であることが示されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１ ９９３ａ，ｂ）。このアビポックスベクターは、生産的な複製は鳥類種のみに限 られている。ヒト細胞培養においては、カナリアポックスウイルスの複製は、ウ イルス複製サイクル中のウイルスＤＮＡ合成の前で中止される。にもかかわらず 、外来免疫原を発現するよう操作された場合は、実際の発現とプロセシングが生 体外のほ乳類細胞中で観察され、多くのほ乳類種への接種により、外因性免疫原 に対する抗体および細胞免疫反応を誘導し、同種の病原体の投与に対する防御を 提供する。（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａ ｌ．，１９９１）。近年のヨーロッパとアメリカ両方におけるカナリアポックス ／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）のフェーズＩ臨床試験では、 実験的ワクチンは十分に抗毒性であり、防御的レベルの狂犬病ウイルス中性化抗 体力価を誘導することが示された（Ｃａｄｏｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｆｒ ｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧワクチン接種か ら派生した末梢血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激された 場合に顕著なレベルのリンパ球拡散を示した（Ｆｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９ ９２）。 ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣはまた、国立衛生研究所（ＮＩＨ ）（アメリカの公的衛生施設）、組換えＤＮＡ勧告委肩会、ウイルスやベクター 等の遺伝子的材料の物理的規制のためのガイドライン、すなわち特定のウイルス やベクターの病原性に基づくこのようなベクターやウイルスの利用のための安全 な手順のガイドラインを公布している機関が、その物理的規制レベルを物理的規 制レベルの減少：ＢＳＬ２からＢＳＬ１へ、を認可したという点で全てのポック スウイルスの中でも独特であると認識されている。ワクシニアウイルスコペンハ ー ゲン株−普通の天然痘ワクチン−ですらも、より高い物理的規制レベル、すなわ ちＢＳＬ２を有している。従って、当業者はＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲ ＯＶＡＣが他のいかなるポックスウイルスよりも低い病原性を有していることを 認識している。 明らかに、弱毒化されたＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣのプロフ ィールとそれらが示す、体液と細胞内の両方において外因性免疫原に対する免疫 的反応を誘導する能力に基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９ ３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９９２）、このような組換えウイルスは前に記述されたワクシニアベー スの組換えウイルスを超えた顕著な利点を提供する。 バクテリアまたは組換えウイルスに感染させた細胞を増殖させた後、糖タンパ ク質（群）はクロマトグラフィー等の公知の技術により回収される（Ｒｏｂｂｉ ｎｓ、ＥＰＡ０１６２７３８Ａ１；Ｐａｎｉｃａｌｉ，ＥＰＡ０２６１９４０Ａ ２参照）。 回収された糖タンパク質（群）は続いて、適切な担体を含むワクチン、抗原的 または免疫的組成物に用いることができる。従って、本発明のヌクレオチドは極 めて有用である。 別の選択としては、ウイルスベクターシステム、特に好ましいポックスウイル スベクターシステムは、適切な担体を含むワクチン、抗原的または免疫的組成物 中で用いることができる。組成物中のＣＨＶ組換えポックスウイルスは、生体内 で投与または接種の後にＣＨＶタンパク質を発現する。 本発明の抗原的、免疫的またはワクチン組成物（本発明のヌクレオチド（群） を含むベクターシステムから発現された糖タンパク質（群）を含むもの又はＣＨ Ｖ組換えポックスウイルス等の適切なベクターシステムを含むもの）は、血清陽 性イヌ由来の免疫血清または母体の抗体と同様のやり方で子犬に投与される（Ｃ ａｒｍｉｃｈａｅｌ，１９７０）。血清陰性イヌは、組成物を他の抗原的、ワク チンまたは免疫的組成物が投与されるのと同じやり方で投与される。獣医学の当 業者は、この開示から、例えば年齢、体重、品種、性別および全体的な健康等の 、特定の犬または子犬の要素を考慮しながら、過度の実験によらずに、投与量を 決 定できる。 付加的には、本発明の組換えウイルスおよびそれらからの発現産物は、動物の 体内で免疫または抗体反応を刺激する。これらの抗体から、当業者に公知の方法 で、モノクローナル抗体が調製可能であり、これらのモノクローナル抗体はまた は本発明のヌクレオチドから発現された抗体は、公知の抗体結合アッセイ、特定 のＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ抗原（群）またはそれらに対する抗体 の存在または不在、およびその結果からのウイルスの存在又は不在の決定、ある いはウイルスまたは抗原（群）に対する免疫反応が容易に刺激されるか否かの決 定のための診断キットまたは試験に用いることができる。 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって生産されたイムノグロブ リンである。モノクローナル抗体は単一の抗原決定基のみと反応し、従来の血清 から派生した抗体よりも高い特異性を提供する。さらに、多数のモノクローナル 抗体をスクリーニングすることにより、所望の特異性、結合活性、イソタイプを 有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系列は、恒常的 で、低コストである、化学的に同一の抗体の供給源を提供し、そしてそのような 抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体の作成方法は当業者によ く知られており、例えばここに参考文献として取り込まれている、１９８９年４ 月１日に成立したＫｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，米国特許第４１９６ ２６５号等である。 モノクローナル抗体の使用は知られている。このような使用の一つは診断方法 であり、例えばここに参考文献として取り込まれている、１９８３年３月８日に 成立したＤａｖｉｄ，Ｇ．およびＧｒｅｅｎ，Ｈ．，米国特許第４３７６１１０ 号等である。 モノクローナル抗体は例えばここに参考文献として取り込まれているＭｉｌｓ ｔｅｉｎ，Ｃ．，１９８０，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ ２４３： ６６，７０等のように、免疫吸収クロマトグラフィーによって物質を回収するた めにもまた用いられる。 付加的には、本発明のヌクレオチドは、試料中のＣＨＶ ＤＮＡの存在を確認 するためのプローブとして、またＣＨＶ ＤＮＡのクローニングまたは複製のた めのＰＣＲプライマーの開発時と同様に用いることができる。ＤＮＡをプローブ として用いる方法またはＰＣＲプライマーを調製する方法は当業者に公知である 。 このように、本発明のヌクレオチドおよび本発明のヌクレオチドの発現産物は （故に、ヌクレオチドそれ自体も）、極めて有用である。 以下の非限定的実施例は、説明のためのみに示され、本発明を制限するものと は考えられていない。実施例 方法と材料 ＣＨＶ ＤＮＡゲノムの調製 ＣＨＶ（Ｌ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、コーネル 大学より入手）はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）において増殖させた。ウイルスＤＮＡを定法により単離した（Ｔ ａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。 ＤＮＡ ハイブリダイゼーション ＣＨＶゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、 アガロースゲルで泳動し、ジーン−スクリーン膜（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ ｕｃｌｅａｒ）へ製造者が推奨する条件で移動した。ハイブリダイゼーションは ４４℃、５３℃または５９℃で、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび１０％デキ ストラン硫酸中で行った。ハイブリダイゼーションプローブは、ネコヘルペスウ イルス（ＦＨＶ）ｇＢ遺伝子内側部分を含む１８００ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ 断片、ＦＨＶ ｇＣ遺伝子の３’末端を含む９５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片、ＦＨＶ ｇＤ遺伝子の３’末端を含む９７０ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ ｄＩＩＩ断片を含んでいた（Ａｕｄｏｎｎｅｔ、未刊行の結果）。 ＤＮＡのクローニングとシークエンス ＣＨＶゲノム断片をｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化した。プラスミドＤＮ Ａは定法をもちいて調製、操作した。ヌクレオチド配列決定は二本鎖プラスミド テンプレートに対して、改変Ｔ７酵素、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、製造者の椎奨する標準的 方法に従って行った。Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを用いて最初の配列 を得、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂオリゴヌクレオチド合成装置により調製されたカスタムプライマーが、 それに続く反応に用いられた。 ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析 ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析は、ＰＣ／Ｇ ＥＮＥ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＬ ＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）およびＩＢＩ−Ｐｕｓｔｅｌｌ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）ソフトウェ アパックを用いて行った。ホモロジー検索は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース ２０または２３）（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ｄ）データベースについて、ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒａｏｎ ＆Ｌｉｐ ｍａｎ，１９８８）を用いて行った。 ＤＮＡクローニングと合成 プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に 従って増殖させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。制限 エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手し た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ＢＡＬ−３１エキソヌクレ アーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｂｓより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０またはＡ ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０ＢＤＮＡ合成装置により前述のように 調製された（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＤＮＡシークエンスは ジデオキシチェーン終結法により（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７）Ｓ ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を用いて前述のとお り行った（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。配列確認のためのＤＮＡの複製 連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を 、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとＧｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ増幅試 薬 キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用 いて自動化Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡサーマルサイクラー 中で行った。過剰のＤＮＡ配列を、制限酵素消化とそれに続くＢＡＬ−３１エキ ソヌクレアーゼによる限定分解および合成ヌクレオチドを用いた突然変異（Ｍａ ｎｄｅｃｋｉ，１９８６）によりプラスミド中から除去した。 細胞、ウイルス、および形質導入 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起 源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。組 換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのインサイチュ ハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニン グは以前に記述された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの起源と培養条件は以 前に記述されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。組換えによる組換体ウイルスの開発、ニトロセルロ ースフィルターのインサイチュハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシ ダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。 親カナリアポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのための ワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維 芽細胞において２００回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイル スシードは寒天の下で４回の連続的プラーク精製にかけられ、１つのプラークは ５回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組 換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポック ス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。 ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株は以前に記述さ れた（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後一日のニワトリ のワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅ ｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスうろことして得られた。こ のウイルスはニワトリ受精卵中で約５０回連続継代され続いてニワトリ胚繊維芽 細胞において２５回継代された。このウイルスは４回の連続的プラーク精製にか けられた。１つのプラーク単離体がさらに初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯ ＶＡＣと命名され、ストックウイルスとした。 ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターおよびその派生 体は以前に記述されたように増殖された（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９ ８７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＶＥＲＯ細胞およびニ ワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は以前に記述されたように増殖された（Ｔａｙｌ ｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。実施例１ ＣＨＶ ｇＢ遺伝子の同定と配列決定 ＣＨＶゲノムＤＮＡと、放射性同位体で標識化したネコヘルペスウイルス（Ｆ ＨＶ）ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子とを、比較的低い厳密性条件でハイブリダイ ゼーションさせることにより（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果）、一つの相補 的な配列が同定された。この配列を含む６ｋｂｐのＸｂａＩ断片がクローン化さ れハイブリダイズした領域のヌクレオチド配列が同定された。ＣＨＶ ｇＢ遺伝 子をコードしているヌクレオチドの配列を、それから予測されるアミノ酸配列発 現（ｇＢ 糖タンパク質）とともに図１に示す。想像上の膜内外領域および潜在 的ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴおよびポリアデニル化シグナル配列には下線を引いた。ヌ クレオチドおよび予測されるアミノ酸残基には配列の右側へ番号を付した。 位置２０１から始まり位置２８４０で終わるオープンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）が同定された。このＯＲＦの（予測された）翻訳産物は８７９アミノ酸 長である。このアミノ酸配列をＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２０）データベ ースと比較することにより、数多くのヘルペスウイルスのｇＢ糖タンパク質の顕 著なホモロジーが明らかとなった。付加的な分析により、（予測された）ＣＨＶ 遺伝子産物は、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）またはエプステイ ン−バーウイルス（ＥＢＶ）等のベータやガンマヘルペスウイルスよりも、単純 ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）等のアルファヘルペスウイルスのｇＢ糖タン パク質に相同性であることが判明した。これらの分析およびその結果を以下の表 １に示す。これらの分析は、ＣＨＶはアルファヘルペスウイルスに分類されるべ きであること；生物学的特性に基づく以前のこのウイルスの分類（Ｃａｒｍｉｃ ｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９６５；Ｒｏｉｚｍａｎ，１９８２）と一致する 結論を示唆していた。 表１の数値はＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓプログラムを用いて得られたもので、完全ホ モロジーとして表示されている。ｇＢアミノ酸配列全体を用いた。配列変数は： ミスマッチペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、拡張ギャップペ ナルティ＝１である。文献：ＦＨＶ（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、 ＥＨＶ１（Ｗｈａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎ ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ＢＨＶ１（Ｗｈｉｔｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８）、ＶＺＶ（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、ＭＤＶ（Ｒｏ ｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＨＳＶ１（Ｂｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８ ４）、ＨＣＭＶ（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）およびＥＢ Ｖ（Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。実施例２ ＣＨＶ ｇＢヌクレオチド配列の分析 ＣＨＶ ｇＢ遺伝子の５’および３’非コード領域は、ＴＡＴＡボックス、Ｃ ＡＡＴボックスおよびポリアデニル化シグナル配列等の、多くのＲＮＡポリメラ ーゼＩＩ制御配列モチーフを含んでいる（Ｃｏｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８ ０；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ＆ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，１９７６）（図１）。潜在的 ＴＡＴＡボックスは位置３４、３６、１１９および１４８、およそ１６５ｂｐ、 １６０ｂｐ、８０ｂｐおよび５０ｂｐぶんＣＨＶ ｇＢ開始コドンの上流に見ら れる。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＡＴＴＧ）は位置８９、９７および１６５ 、およそ１１０ｂｐ、１００ｂｐおよび３５ｂｐぶんＣＨＶ ｇＢ開始コドンの 上流に見られる。潜在的ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は位置２ ８３９および２９６１、およそ０ｂｐおよび１２０ｂｐぶんＣＨＶ ｇＢ終止コ ドンの下流に見られる。 開始コドンの周りのヌクレオチド配列は翻訳開始の効率に影響を与える（Ｋｏ ｚａｋ，１９８６）。特に、配列［Ａ／Ｇ］ＮＮＡＴＧＧは、最も効率が良いこ とが判明している。故に、Ｋｏｚａｋの法則と比べて、ＣＨＶ ｇＢ開始コドン の周辺のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＴＧＴ）は位置−３において好ましいが、 位置＋４においては好ましくない（図１）。ＣＨＶ ｇＢ遺伝子はＫｏｚａｋの 法則に従わないという事実は普通でなくはない。ＦＨＶ（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａ ｌ．，１９９２）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ｖａ ｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＶＺＶ）（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、ＭＤＶ（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）およびＨＳ Ｖ１（Ｂｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４）ｇＢ遺伝子もまた位置＋４にピリミ ジンを有している。実施例３ 予測されるＣＨＶ ｇＢアミノ酸配列の分析 ＣＨＶ ｇＢ相同体の椎定されたアミノ酸配列を図１に示す。このアミノ酸配 列のハイドロパシー性分析は図２に示されている。このプロフィールは、Ｋｙｔ ｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）の方法および１３アミノ酸のインター バルを用いたＰＣ／ＧＥＮＥ ＳＯＡＰプログラムにより得られた。縦軸は、正 の値は疎水性であり負の値は親水性である、相対的なハイドロパシー性を示して いる。横軸はＣＨＶ ｇＢ相同体のアミノ酸番号を示している。 このアミノ酸配列のハイドロパシー性の分析により、２つの顕著な疎水性のピ ークの存在が明らかとなった。第１のピークは、Ｎ末端に位置しており、いかな る一の理論に拘束されることを意図するわけではないが、潜在的なシグナル配列 を示している。Ｎ末端シグナル配列は小胞体膜を通過する輸送を開始し、適切な 転写後の修飾と糖タンパク質のターゲッティングに重要であり得る（Ｂｌｏｂｅ ｌ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。シグナル配列は約１５から３０残基の間で変わ り得、通常は塩基性Ｎ末端領域、中央疎水性領域、および短い、比較的極性のＣ 末端領域から成る。それに加えて、分解部位は通常−３、−１ルールに従い、位 置−１の残基は小さく（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｎ ）位置−３の残基は芳香性（Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）、荷電（Ａ ｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇ）または大きくて極性（ＡｓｎまたはＧｌｎ）ではな く、そして−３から＋３まではプロリンではない（ｖｏｎ Ｈｅｊｉｎｅ，１９ ９６）。ＰＳＩＧＮＡＬ、真核シグナル配列を検出するために設計されたＰＣ／ ＧＥＮＥプログラム、での分析では、ＣＨＶ ｇＢのＮ末端は潜在的シグナル配 列としては同定されなかったが、この領域は典型的なシグナル配列に相当する要 素；すなわち疎水性コア（２−１７残基）および比較的極性Ｃ末端領域（図１） 、を有している。ＰＳＩＧＮＡＬがＣＨＶ ｇＢのＮ末端領域にシグナル配列を 検出しなかった事実は特有ではない。このアルゴリズムはＶＺＶ ｇＢ相同体の Ｎ末端領域においてもまた、シグナル配列を検出しなかった。 第２の、非常に幅広い、疎水性ピーク（群）（図２）は、アミノ酸残基７２５ と７４１との間、７４６−７５０および７６６−７７２の予想される膜通過部分 （Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）の方法を用いた）とともにあり、い かなる理論に拘束されることを意図するものではないが、膜固定領域として機能 している。ＨＳＶ１ ｇＢの膜内外ドメインは、他のｇＢ相同体と同様に、膜を ３回横切っているという仮説が出されている（Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。ＣＨＶ ｇＢのハイドロパシー性分析により、少なくとも２つの別 個の疎水性ピークの存在が明らかとなった。故に、ＣＨＶ ｇＢおよびＨＳＶ１ ｇＢは類似の膜内外構造を有している。 ＣＨＶ ｇＢのアミノ酸配列を他のヘルペスウイルス由来の類似の配列と並べ ることにより、Ｎ末端、椎定分解部位（下記参照）をとりまく領域およびＣ末端 近傍の領域を除いた配列全体を通しての広い相同性が判明した。図３Ａおよび３ Ｂは８つのｇＢ相同体のアミノ酸配列を示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１ 、ＰＲＶ、ＨＳＶ１、ＶＺＶ、ＨＣＭＶおよびＥＢＶ ｇＢ相同体のアミノ酸配 列（配列が得られた文献については、表１の下のテキストを参照）がＰＣ／ＧＥ ＮＥ ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて配列された。ダッシュで示されたギャ ップは相同性を最大にするために導入された。並べられた８つの全ての配列にお いて同一の残基は、アスターリスク（＊）によって示されている。並べられた配 列の多数において同一の残基は、ピリオド（．）によって示されている。保存さ れたシステイン残基は箱に入れた。潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位は陰を 付されている。椎定プロテアーゼ分解部位は下線が引かれている。 この並列により、数多くのシステイン残基の多数が完璧に保存されていること が明らかとなった。例えば、ＣＨＶ ｇＢは１１のシステイン残基を含有してい るが、それらのうちの１０はアルファ、ベータ、ガンマヘルペスウイルスの全て において完全に保存されていた。事実、ＣＨＶ ｇＢにおいて唯一保存されてい ないシステイン残基はＮ末端付近で発見され推定シグナル配列中に位置している 。これらの結果はｇＢ 糖タンパク質は比較的類似の三次構造を有することを示 している。 ｇＢ アミノ酸配列を並べることにより、潜在的なＮ−結合型グリコシル化部 位が比較的よく保存されていることが明らかとなった（図３Ａおよび３Ｂ）。Ｎ −結合型オリゴサッカライドは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒもしくはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈ ｒ（ここにおいて、Ｘはプロリンではない）（Ｂａｕｓｅ，１９８３）という配 列を有するＡｓｎ残基に付加されうる。ＣＨＶ ｇＢは１３の潜在的Ｎ−結合型 グリコシル化部位を有している。しかしながら、これらのうち３つは、推定細胞 質ドメインに位置しており、そのため、グリコシル化されていないであろう。潜 在的Ｎ−結合型グリコシル化部位の配置は、多数のｇＢ 糖タンパク質において 比較的よく保存されていた（図３Ａおよび３Ｂ）。 殆どのヘルペスウイルスのｇＢ糖タンパク質は成熟化の間に内部で分解され、 その後のペプチドはジスルフィド結合により一緒に保持されている。ＶＺＶ ｇ Ｂ相同体（ｇｐＩＩ）は、例えば、ＡｒｇとＳｅｒ残基の間で分解され、その結 果、分子量約６０ｋｄの２つの糖タンパク質となる（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ．， １９８６）。ＦＨＶ ｇＢ糖タンパク質（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ）、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ１）（Ｗｈａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ＢＨＶ１（ Ｗｈｉｔｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＭＤＶ（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ ．，１９８９）およびＨＣＭＶ（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８ ７）等もまた分解される。さらに、配列Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ− −Ｓｅｒ／Ａｌａは、ＶＺＶ分解部位の配列Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− −Ｓｅｒと類似で、これらのｇＢ糖タンパク質それぞれと事実上同一の位置にお いて存在している。これとは逆に、この配列は、分解されないＨＳＶ１（Ｂｚｉ ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４）およびＥＢＶ（Ｐｅｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５）ｇＢ糖タンパク質においては発見されていない。この分解を行うこと の重要性は不明である。しかしながら、ＢＨＶ１（Ｂｌｅｗｅｔｔ ＆ Ｍｉｓ ｒａ、１９９１）およびＨＣＭＶ（Ｓｐａｅｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の 株であって、この分解部位を変異させ、そのため分解されないｇＢ糖タンパク質 をコードしているものは感染性であるので、それは生体外の複製には必須ではな いように見える。ＣＨＶ ｇＢは内部でプロテアーゼにより分解されるという理 論に拘束されることを意図してはいないが、配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒ ｇ−−ＳｅｒはＣＨＶにおいてＶＺＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１、ＰＲＶ、ＢＨＶ１、 ＭＤＶおよびＨＣＭＶと同様の位置に存在している。実施例４ ＣＨＶ ｇＣ遺伝子の同定とシークエンス ＣＨＶゲノム断片をランダムにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中にクローン化し た。これらの断片の末端のヌクレオチド配列を決定し、潜在的ＯＲＦの予測され るアミノ酸配列を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２０）アミノ酸データベー スに対してホモロジー分析を行った。この方法を用いることにより、ヘルペスウ イルスｇＣ糖タンパク質とホモロジーを有するＯＲＦをコードしている１２ｋｂ のＸｂａＩが同定された。このＯＲＦのヌクレオチド配列は図４中に示されてい る。図４は、ＣＨＶ ｇＣ相同体およびＯＲＦ２のヌクレオチド配列と予測され るアミノ酸配列を示している。推定膜内外領域および潜在性ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴ およびポリアデニル化シグナル配列に下線を引いた。ヌクレオチドおよび予測さ れるアミノ酸残基には、配列の右に向かって番号を付した。推定ＣＨＶ ｇＣ遺 伝子は位置２０１からはじまり、位置１５８０で終わる。予測された翻訳産物は 、４５９アミノ酸長である。このアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス由来のｇ Ｃ糖タンパク質の配列との比較を以下の表２に示すが、広いホモロジーが明らか となり、このＯＲＦはＣＨＶ ｇＣ相同体をコードしていることが示唆された（ 表２）。 表２の値はＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓプログラムを用いて得、ホモロジーパーセント で示した。ｇＣアミノ酸配列全体を用いた。配列変数は表１を参照されたい。文 献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果）、ＥＨＶ１（Ａｌｌｅｎ ＆ Ｃｏｏｇｌｅ，１９８８）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ＆ Ｏｎｉｏｎｓ， １９９０）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、ＢＨＶ１（ Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ，１９８６）、ＭＤＶ（Ｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９ ）およびＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。実施例５ ＣＨＶ ｇＣヌクレオチド配列の分析 潜在的ＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）が位置２２および８１、ＣＨＶ ｇ Ｃ開始コドンのおよそ１８０ｂｐおよび１２０ｂｐ上流域に見られる（図４）。 付加的なＴＡＴＡ配列が位置１７５にも見られる。それはｇＣ開始コドンに近接 しているので、しかしながら、潜在的なＴＡＴＡボックス配列ではないかもしれ ない。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＣＡＡＴおよびＡＴＴＧ）は、位置１３、 ５９および１１９、ｇＣ開始コドンの約１９０ｂｐ、１４０ｂｐおよび８０ｂｐ 上流域においてみられる。潜在的ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ） は位置１７４４、ＣＨＶ ｇＣ終止コドンの約１６５ｂｐ下流域ででありＯＲＦ ２内部の４５ｂｐにおいて見られる（下記参照）。他の潜在的ポリアデニル化シ グナル類似配列はｇＣ−３′非コード領域に見られる。 ＣＨＶ ｇＢ遺伝子のように、ＣＨＶ ｇＣ開始コドン（ＡＡＡＡＴＧＡ）の 周辺のヌクレオチド配列はＫｏｚａｋの法則に関して位置−３では好ましいが位 置＋４では好ましくない（図４）。ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ．末刊行の結果） 、ＥＨＶ１（Ａｌｌｅｎ ＆ Ｃｏｏｇｌｅ、１９８８）およびＶＺＶ（Ｄａｖ ｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ，１９８６）ｇＣ遺伝子もまた位置＋４において好ま しくないヌクレオチドを有している。実施例６ 予測されるＣＨＶ ｇＣアミノ酸配列の分析 ＣＨＶ ｇＣ相同体の推定アミノ酸配列を図４に示す。図５はＣＨＶ ｇＣ相 同体のハイドロパシー性分析を示している。Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ （１９８２）および１３アミノ酸の間隔を用いたＰＣ／ＧＥＮＥ ＳＯＡＰプロ グラムによって、プロフィールを得た。垂直軸は、正の値は疎水性、負の値は親 水性である相対的ハイドロパシー性を示す。水平軸はＣＨＶ ｇＣ相同体のアミ ノ酸番号を示す。 予測されたＣＨＶ ｇＣアミノ酸配列のハイドロパシー性分析により、２つの 顕著な疎水性のピークの存在が明らかとなった（図５）。第１のピークは、Ｎ− 末端に位置しており、いかなる一の理論にも拘束されることを望んではいないが 、潜在的シグナル配列を表している。ＰＳＩＧＮＡＬでの分析ではこのポリペプ チドのＮ−末端を潜在的シグナル配列として同定はできなかったが、この領域は 塩基性Ｎ−末端領域、疎水性核（残基６−２０）および相対的極性Ｃ−末端領域 を 有している（図４）。第２の疎水性ピーク、残基４２４−４３３および４４９− ４５６の間の予測された膜貫通部分（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） の方法を用いた）は、いかなる一の理論に拘束されることを意図するわけではな いが、膜固定領域として機能している。図６は４つのｇＣ相同体のアミノ酸ホモ ロジーを示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１およびＨＳＶ１ ｇＣ相同体の アミノ酸配列（文献については図２を参照）は、ＰＣ／ＧＥＮＥ ＣＬＵＳＴＡ Ｌプログラムを用いて並べられた。ダッシュで示されるギャップは、ホモロジー を最大化するために導入された。配列された残基で４つの配列全てにおいて同一 のものはアスターリスクにより示した。並列された配列の多数において同一であ った残基はピリオド（．）で示した。保存されているシステイン残基は箱に入れ た。潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位は陰を付した。 ＣＨＶ ｇＣアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス由来の相同体の配列とを並 列させることにより、Ｎ−末端の例外を除いた、全体の配列を通しての適度なレ ベルでのホモロジーが明らかとなった（図６）。この並列により多数のシステイ ン残基が完璧に保存されていることが明らかとなった。例えば、ＣＨＶ ｇＣは １０のシステイン残基を含んでいるが、そのうちの８つは全てのアルファヘルペ スウイルスにおいて完璧に保存されていた。事実、ＣＨＶ ｇＣにおいて保存さ れていないシステイン残基だけが推定膜貫通または細胞内ドメインに位置してい る。これらの結果はｇＣ糖タンパク質が比較的類似した三次構造を有することを 示している。他のｇＣ配列との並列により、潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位 が比較的保存されていることが明らかとなった。実施例７ ＯＲＦ２の同定とシークエンス ＣＨＶ ｇＣ遺伝子の下流領域のヌクレオチド配列の分析により、第２のＯＲ Ｆの存在が明らかとなった（図４）。このＯＲＦ（ＯＲＦ２）は、位置１６９９ からはじまり位置２２２６で終わる。予測される転写産物は１７５アミノ酸長で ある。以下の図３は、この配列と、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２３）デー タベースとの比較を示しているが、他のアルファヘルペスウイルスｇＣ遺伝子の 下流域に位置しているＯＲＦとの顕著なホモロジーが判明した。ＯＲＦ２相同体 に対するホモロジーのスコアは、ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ、ウマヘルペスウイル ス４型（ＥＨＶ４）、ＭＤＶ、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）およ び恐らくＨＳＶ１において、ｇＣ遺伝子の下流域に位置しているＯＲＦが、高度 に多様であるが進化上で関連している遺伝子ファミリーを表していることを示し ている。これとは逆に、ＶＺＶ ｇＣ遺伝子の隣に位置しているＯＲＦ（遺伝子 １３）は、対応する位置にある他のいずれのＯＲＦとも、顕著な相同性を示して いない。さらに、遺伝子１３はゲノム上で、他の全てのＯＲＦ２類似遺伝子に関 連した方向とは逆の方向で配置されている（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ， １９８６）。これらの結果はこれらの２群の遺伝子にコードされているタンパク 質の、提案されている機能と一致している；ＶＺＶ遺伝子１３は、チミジル酸シ ンセターゼ（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ，１９８６）をコードし、他方、 ＨＳＶ１ ＯＲＦ２類似遺伝子（ＵＬ４５）は、推定ウイルス粒子タンパク質を コードしている（Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。故に、ＣＨＶ、 ＦＨＶ、ＥＨＶ１、ＥＨＶ４、ＭＤＶ、ＨＶＴおよび恐らくはＨＳＶ１において 、ｇＣ遺伝子の隣に位置しているＯＲＦは、ＶＺＶ ｇＣ相同体の下流域にコー ドされているタンパク質とは構造上も機能上も関係のないタンパク質をコードし ている。 表３の数値はＦＡＳＴＡおよびＲＤＦ２プログラムを用いて得られた（Ｐｅａｒ ｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）。１のｋｔｕｐ（ａ ｋｔｕｐ ｏｆ １）が用いられた。括弧内の数値は、ＦＡＳＴＡスコアと、１００個の無作為に 置換された型の潜在的に関連している配列から得られたスコアの平均との間の標 準偏差の数字を示している。文献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果） 、ＥＨＶ１（Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏ ｌｓｏｎ ＆ Ｏｎｉｏｎｓ，１９９０）、ＭＤＶ（Ｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８９）、ＨＶＴ（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＨＳＶ１（Ｍｃ Ｇｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）およびＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓ ｃｏｔｔ，１９８６）。実施例８ ＣＨＶ ＯＲＦ２ヌクレオチド配列の分析 潜在的ＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）は、位置１６０４、１６０６、１６ ３５および１６６２、ＯＲＦ２の開始コドンのおよそ９５、９３、６５および３ ５ｂｐ上流であって、ｇＣ遺伝子の終止コドンのおよそ２４、２６、５５および ８０ｂｐ下流にみられる（図４）。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＣＡＡＴ）は 、位置１５８４、開始コドンのおよそ１１５ｂｐ上流でみられる。潜在的ポリア デニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は、ＯＲＦ２の終止コドンから０−１５ ｂｐ下流域であるオーバーラップしている位置２２２５、２２２９、２２３４お よび２２３８、みられる。ＯＲＦ２開始コドン（ＡＡＴＡＴＧＧ）を取り巻いて いるヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋの法則に関しては位置−３と＋４において 好ましい。実施例９ ＣＨＶ ｇＤ遺伝子の同定とシークエンス ＣＨＶ ｇＣ相同体をマッピングした時に用いた方法と同様の方法を用いて、 ヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質とホモロジーを有する７ｋｂのＰｓｔＩ断片 を同定した。図７はＣＨＶ ｇＤ相同体のヌクレオチド配列と予測されたアミノ 酸配列を示している。推定シグナル配列、膜内外領域および潜在的ポリアデニル 化シグナル配列に下線を引いた。ヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸残 基には配列の右から番号を付した。ＣＨＶ ｇＤ遺伝子は位置２０１からはじま り位置１２３８で終わる。（予測される）翻訳産物は３４５アミノ酸長である。 以下の表４は、このアミノ酸配列と他のｇＤ糖タンパク質の配列との比較、およ び明らかとなった広いホモロジーを示しており、このＯＲＦがＣＨＶ ｇＤ相同 体をコードしていることを示唆している。 表４の数値はＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓプログラムを用いて得られ、ホモロジー％で 示されている。ｇＤアミノ酸配列全体を用いた。配列変数については図１を参照 されたい。文献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果）、ＥＨＶ１（Ｆｌ ｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ＰＲＶ（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、ＢＨＶ１（Ｔｉｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およ びＨＳＶ１（Ｌａｓｋｙ ＆ Ｄｏｗｂｅｎｋｏ，１９８４）。実施例１０ ＣＨＶ ｇＤヌクレオチド配列の分析 ＣＨＶ ｇＤ遺伝子のすぐ近くの上流域にはＴＡＴＡあるいはＣＡＡＴ／ＡＴ ＴＧ配列は同定されなかった（図７）。しかしながら、多数のＴＡＴＡボックス 類似配列は見つかった。潜在的ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は 、位置１２６０および１２８７、ＣＨＶ ｇＤ終止コドンのおよそ２５および５ ０ｂｐ上流に見られた。ＣＨＶ ｇＢおよびｇＣ遺伝子のように、ＣＨＶ ｇＤ 遺伝子（ＡＡＡＡＴＧＡ）を取り巻くヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋの法則に 関して、位置−３では好ましく、位置＋４ではそうではなかった（図７）。ＦＨ Ｖ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果）、ＥＨＶ１（Ａｕｄｏｎｎｅｔ ｅｔ ａ ｌ．，１９９０；Ｆｌｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ＰＲＶ（Ｐｅｔ ｒｏｖｓｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）およびＢＨＶ１（Ｔｉｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）ｇＤ遺伝子もまた、位置＋４において好ましくないヌクレ オチドを有している。実施例１１ 予測されるＣＨＶ ｇＤアミノ酸配列の分析 ＣＨＶ ｇＤ相同体の推定アミノ酸配列を図７に示す。図８はＣＨＶ ｇＤ相 同体のハイドロパシー性分析を示している。プロフィールは、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄ ｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（１９８２）および１１のアミノ酸のインターバルを用 いた、ＰＣ／ＧＥＮＥ ＳＯＡＰプログラムにより得られた。垂直軸は、正の値 が疎水性で負の値が親水性である相対ハイドロパシー性を示している。水平軸は 、ＣＨＶ ｇＤ相同体のアミノ酸の番号を示している。 予測されたＣＨＶ ｇＤアミノ酸配列のハイドロパシー性の分析により、二つ の顕著な疎水性ピークの存在が判明した（図８）。第１のピークはＮ−末端に位 置し、いかなる一の理論に拘束されることを意図するものではないが、潜在的シ グナル配列を示している。事実、ＰＳＩＧＮＡＬは位置１６および１７の間に潜 在的分解部位を同定した。第２の疎水性ピークは、残基３０４−３１１および３ ２７−３３２の間の予測された膜貫通部分（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９ ８５）の方法を用いた）とともに、いかなる一の理論に拘束されることを望んで はいないが、膜固定領域として機能している。 図９は４種のｇＤ相同体のアミノ酸ホモロジーを示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ 、ＥＨＶ１およびＨＳＶ１ ｇＤ相同体のアミノ酸配列（文献については表４を 参照）ＰＣ／ＧＥＮＥ ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて並列された。ダッシ ュで示されるギャップはホモロジーを最大化するために導入された。４配列全て において同一である並列された残基はアスターリスク（＊）で示されている。多 数の配列において同一である並列された残基はピリオド（．）で示されている。 保存されているシステイン残基は箱に入れた。潜在的Ｎ−結合型グリコシル化サ イトは陰を付した。他のヘルペスウイルス由来の相同性配列とＣＨＶ ｇＤアミ ノ酸配列との並列により、Ｎ−末端を除いた配列全体に亘る適度な度合いのホモ ロジーが明らかとなった（図９）。この並列から、大多数のシステイン残基が完 全 に保存されていることが判明した。例えば、ＣＨＶ ｇＤは６個のシステイン残 基を有しているが、それら全てが、全てのヘルペスウイルス中で完全に保存され ていた。これらの結果は、ｇＤ糖タンパク質は比較的類似の三次構造を有してい ることを示している。この並列から、潜在的Ｎ−結合型グリコシル化サイトがよ く保存されていることもまた判明した。ＣＨＶ ｇＤグリコシル化サイトが利用 されているという、いかなる一の理論に拘束されることを望んではいないが、潜 在的ＨＳＶ１ ｇＤ糖タンパク質サイトは全て利用されていることが知られてい る（Ｓｏｄｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。実施例１２ ゲノム構造 ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子はＣＨＶゲノム上での特定の位置にマッピングされて いない。しかしながら、これらの遺伝子に隣接する領域のヌクレオチド分析によ り、ＣＨＶのゲノム構造は他のアルファヘルペスウイルスに類似していることが 示唆された。例えば、ＣＨＶ ｇＢ遺伝子のすぐ上流に位置しているＯＲＦは、 ＶＺＶの遺伝子３０（Ｄａｖｉｓｏｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ，１９８６）およびＨＳ Ｖ１のＵＬ２８（ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）とホモロジーを有 しているが、両方ともそれらのウイルスのｇＢ相同体のすぐ上流に位置している 。ＯＲＦ２は、ＣＨＶ ｇＣ遺伝子のすぐ下流に位置しているが、ＦＨＶ（Ａｕ ｄｏｎｎｅｔ，未刊行の結果）、ＥＨＶ１（Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１ ９９２）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ＆ Ｏｎｉｏｎｓ，１９９０）、ＨＶ Ｔ（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８）および恐らくＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃ ｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）においてｇＣ相同体のすぐ下流に位置しているＯ ＲＦ群とホモロジーを有している。さらに付加的には、ＣＨＶ ｇＤ遺伝子のす ぐ下流に位置しているＯＲＦは、ＥＨＶ１のｇＩ遺伝子（Ａｕｄｏｎｎｅｔ ｅ ｔ ａｌ．，１９９０）およびＰＲＶのｇｐ６３遺伝子（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）と相同性を有しているが、それらは両方とも、それ らのウイルス中でｇＤ相同体のすぐ下流に位置している（データは示していない ）。実施例１３ チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のための プラスミドｐＳＤ４６０の構築 今、図１０を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクロ ーン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を 含んでいる。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断され、Ｈｉ ｎｄＩＩＩ Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消 化されたｐＵＣ８中にクローン化され、ｐＳＤ４４７となった。ｐＳＤ４４７は Ｊ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）全体の遺伝子を有している。開始コドン はＮｌａＩＩＩサイト内部に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩサイト内部に含まれ ている。転写方向は図１０中に矢印で示されている。 左側の隣接アーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｍ）を得るため、０．８ｋｂｐの ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、続いてＮｌａＩＩ Ｉで消化し、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。ア ニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号 ２１／配列番号２２） を０．５ｋｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃ ｏＲＩで切断したｐＵＣ１８中へ連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を生成した。 ワクシニア右隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含む制限酵素断片を得る ために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内部においてＳｓｐＩで（部分的に）、 そしてＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分において消化し、２．９ｋ ｂｐのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成 ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号２３／配列番号２４） と連結し、ｐＳＤ４５９を創出した。 隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、０．５ ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩ ＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＤ４５９と連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を創 出した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ− ２との組換えのドナープラスミドとして用いた。ＭＰＳＹＮ４５（配列番号２３ ）をテンプレートとして、および相補的な２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳ ＹＮ４７（配列番号２５）（５’ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３ ’）をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、³⁵Ｐ標識 されたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０がプラークハイブリダイ ゼーションにより同定された。実施例１４ 出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）の欠失のための プラスミドｐＳＤ４８６の構築 今、図１１を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクロ ーン化されたワクシニアＳａｌＩ Ｇ（位置１６０７４４−１７３３５１）を有 している。ｐＳＤ４２２は、右側に近接したワクシニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８ 中にクローン化されたＳａｌＩ Ｊ（位置１７３３５１−１８２７４６）を有し ている。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２５４９−１７３５５ ２）を欠失させたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ４１９を左側隣接アーム の源として、そしてｐＳＤ４２２を右側の隣接アームの源として用いた。領域ｕ の転写方向は図１１において矢印で示されている。 所望でない配列をｐＳＤ４１９から取り除くため、ＮｃｏＩサイト（位置１７ ２２５３）の左側の配列は、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化し続いて Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーショ ンし、プラスミドｐＳＤ４７６を生成した。ワクシニア右隣接アームは、ｐＳＤ ４２２を、Ｂ１４Ｒの終止コドンでＨｐａＩで消化し、そして０．３ｋｂｐ右側 をＮｒｕＩで消化して得た。この０．３ｋｂｐ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から 単離した３．４ｋｂｐのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ ４７７とした。ワクシニアｕ領域のｐＳＤ４７７の部分的欠失の位置は三角形で 示した。残りのプラスミドｐＳＤ４７７中のＢ１３Ｒをコードしている領域配列 を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニ ーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列 番号２６／配列番号２７） と連結させ、ｐＳＤ４７９とした。ｐＳＤ４７９は、ＢａｍＨＩサイトが続いて いる開始コドン（下線）を有している。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを Ｂ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座中に、ｕプロモーターのコントロール下で配置する ため、３．２ｋｂｐのベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）を含むＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩに挿入 し、ｐＳＤ４７９ＢＧとした。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４ １０との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖ Ｐ５３３は、色素基質Ｘ−ｇａｌ存在下でプループラークとして単離された。ｖ Ｐ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠失されベータガラクトシダーゼ で置換されていた。 ベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ５３３から取り除くため、ｐＳＤ４７７か らの派生体でポリリンカー領域は含むが、ｕ欠失結合部分の開始コドンは有さな いｐＳＤ４８６を用いた。第１に、前述のｐＳＤ４７７由来ＣｌａＩ／ＨｐａＩ ベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４ ０ｍｅｒ（配列番号２８／配列番号２９） と連結させ、プラスミドｐＳＤ４７８とした。次にｐＵＣ／ワクシニア結合部分 のＥｃｏＲＩサイトを、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊 して、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ^-とした。ｐＳＤ４７８Ｅ^-をＢａｍＨＩおよび ＨｐａＩで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５ ／ＨＥＭ６（配列番号３０／配列番号３１） と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６とした。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニア ウイルスｖＰ５３３との組換えにドナープラスミドとして用いて、Ｘ−ｇａｌ存 在下で透明プラークとして単離されたｖＰ５３３を創出した。実施例１５ ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）欠失のための プラスミドｐＭＰ４９４Δの構築 今、図１２を参照しているが、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローン化された ＳａｌＩ Ｂを含んでいる。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り 除くため、ｐＳＤ４１４を、ＸｂａＩでワクシニア配列の内部（位置１３７０７ ９）で、ＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、続いてＥ．ｃ ｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドｐＳ Ｄ４８３とした。Ａ２６Ｌ領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くた め、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩで切断し（位置１４０６６５およびｐＵＣ／ワク シニア結合部分）、ライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８４とした。Ａ２６ Ｌコード領域を除去するため、ｐＳＤ４８４はＮｄｅＩで（部分的に）Ａ２６Ｌ ＯＲＦの僅かに上流を（位置１３９００４）、ＨｐａＩでＡ２６ＬＯＲＦの僅か に下流を（位置１３７８８９）切断した。５．２ｋｂｐのベクター断片を単離し 、アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番 号３２／配列番号３３） と連結し、Ａ２６Ｌ上流領域を再構築し、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａ Ｉ制限酵素サイトを有する短いポリリンカー領域で、Ａ２６ＬＯＲＦを上記のよ うに置換した。構築されたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５ のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトは固有ではないので、 所望でないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトをｐＳＤ４８３（前述）から、Ｂ ｇｌＩＩ（位置１４０１３６）、およびＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部 分を消化し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化することに より取り除いた。生成されたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８ ９由来のＡ２６ＬＯＲＦを含む１．８ｋｂｐのＣｌａＩ（位置１３７１９８）／ ＥｃｏＲＶ（位置１３９０４８）断片を、対応するｐＳＤ４８５由来の０．７ｋ ｂｐポリリンカーを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片で置換し、ｐＳＤ４９２を生 成した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩサイ トは固有である。 Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む ３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４ ９３ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ５ ５３の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ５８１は、ベ ータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失領域内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブルー プラークとして単離された。 ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１か ら除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリ リンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号３４） を用いた突然変異により欠失させた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。生成され たプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいては、Ａ２６Ｌ ＯＲＦの全体を含む位置 ［１３７８８９−１３８９３７］を取り巻くワクシニアウイルスＤＮＡが欠失し ていた。ｐＭＰ４９４Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖ Ｐ５８１との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が、Ｘ−ｇ ａｌ存在下での透明プラークとして単離され、得られた。実施例１６ 血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のための プラスミドｐＳＤ４６７の構築 今、図１３を参照しているが、ワクシニアＳａｌＩ Ｇ制限酵素断片（位置１ ６０７４４−１７３３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ Ａ／Ｂ結合部分（位置１６２５ ３９）で交差している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシ ニアＳａｌＩ Ｇ断片を有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図 １３中に矢印で示されている。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｂから派生したワクシニア配列 は、ｐＳＤ４１９をＨｉｎｄＩＩＩでワクシニア配列内部とｐＵＣ／ワクシニア 結合部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成された プラスミド、ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを、左に０．４ｋｂｐのワク シニア配列、右に０．４ｋｂｐのワクシニア配列と隣接した状態で有している。 Ａ５６Ｒコード配列を、ｐＳＤ４５６をＲｓａＩで（部分的；位置１６１０９０ ）Ａ５６Ｒコード配列の上流を、またＥａｑＩで（位置１６２０５４）遺伝子の 末端ちかくを切断することにより除去した。３．６ｋｂｐＲｓａＩ／ＥａｑＩベ クター断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配 列番号３５）ＭＰＳＹＮ６２（配列番号３６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号３７ ）およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号３８） とライゲーションし、Ａ５６Ｒ ＯＲＦの上流域を再構築し、Ａ５６Ｒ ＯＲＦ を上記のポリリンカー領域で置換した。その結果生成されたプラスミドはｐＳＤ ４６６である。プラスミドｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は位置［１６１１８ ５−１６２０５３］を含んでいる。ｐＳＤ４６６中の欠失サイトは図１３に三角 形で示されている。 Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）の支配下で含む３．３ ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＳＤ４６６Ｋ ＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８の 組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７０８は、ベータガ ラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失部内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラーク として単離された。 ベータガラクトシダーゼ配列を、ｖＰ７０８からドナープラスミドｐＳＤ４６ ７を用いて除去した。ｐＳＤ４６７は、ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ で消化した後にＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーショ ンして、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩサイトがｐＵＣ／ワクシニア結 合部分から取り除いてある以外はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳ Ｄ４６７との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、ｖＰ７２３ が生成し、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離された。実施例１７ オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の 欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築 今は、図１４を参照しているが、以下のワクシニアクローンがｐＭＣＳＫ１Δ の構築のために利用された。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａ ｌＩ Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８中にクローン化されたＫｐｎＩ Ｆである。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再び連結され、ｐＳＤ４５１と なった。ｐＳＤ４５１中では、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ中のＳｐｈＩサイト（位置２ ７４１６）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローン化されたＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ である。 ワクシニア由来の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠失のための基質を 供与するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアＭ２ Ｌ欠失座に以下のように挿入された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳ Ｄ４０９中のＢｇｌＩＩサイトを除去するために、プラスミドをワクシニア配列 中（位置２８２１２）でＢｇｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩでｐＵＣワクシニア結 合部分で切断し、続いて連結しｐＭＰ４０９Ｂとした。ｐＭＰ４０９Ｂを固有の ＳｐｈＩサイト（位置２７４１６）で切断した。続いてＭ２Ｌコード配列を合成 ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０； Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。 ＭＰＳＹＮ８２（配列番号３９） その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、Ｍ２Ｌ欠失座に上記のように 挿入された固有のＢｇｌＩＩサイトを含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクト シダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）の支配下 で含む３．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ（部分）／ＢｇｌＩＩカセットをｐＭＰ４０９ ＤのＢｇｌＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９ ＤＢＧはレスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３の組換えにおいてドナープラ スミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７８４は、Ｍ２Ｌ欠失 座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラ ークとして単離された。 ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドが、ＳｍａＩ、 ＨｉｎｄＩＩＩ、で切断されＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化さ れたｐＵＣ８中に集められた。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ配列からなる左隣 接アームはｐＳＤ４２０をＸｂａＩで消化し（位置１８６２８）続いてＥ．ｃｏ ｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した後ＢｇｌＩＩで消化して（位置１９ ７０６）得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ配列からなる右隣接アームはｐＳ Ｄ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９７７８） で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ Ｃ中のＢｇｌＩＩサイト（位置１９７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ中 のＢｇｌＩＩサイト（位置２９０６２）との間のワクシニア配列を欠失された。 プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠失サイトは図１４において 三角形で示されている。 ワクシニア欠失結合部位の過剰のＤＮＡを取り除くため、プラスミドｐＭＰ５ ８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩサイト（位置１８８１１；１９６５５） で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドＭ ＰＳＹＮ２３３（配列番号４０） を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、ｐＭＣＳＫ１Δは、 １２のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を含む位置 １８８０５−２９１０８のワクシニア配列を欠失していた。ｐＭＣＳＫ１Δと、 ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ７８４との組換えにより、 ワクシニア欠失変異体、ｖＰ８０４が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラーク として単離された。実施例１８ リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の 欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築 今、図１５を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクロ ーン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ Ｉ（位置６３８７５−７０３６７）を 有している。ｐＳＤ４０５をＥｃｏＲＶでワクシニア配列内部（位置６７９３３ ）を、およびＳｍａＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラ スミドｐＳＤ５１８とした。ｐＳＤ５１８はｐＳＤ５４８の構築において用いら れた、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。 ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７３７１−６５０５９にわたっている。Ｉ４ Ｌの転写方向は図１５中で矢印によって示されている。Ｉ４Ｌコード配列部分を 欠失させたベクタープラスミド断片を得るため、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位 置６５３８１）、およびＨｐａＩ（位置６７００１）で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポ リメラーゼクレノー断片で平滑化した。この４．８ｋｂｐのベクター断片は、Ｅ ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１ ９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａ ｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３． ２ｋｂｐのＳｍａＩカセットと連結され、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧとなっ た。ｐＳＤ５２４ＫＢＧを、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えでドナー プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、ｖｐ８５５は、ベータガ ラクトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子部分欠失部位中に含み、Ｘ−ｇａｌ存在下でブル ープラークとして得られた。 ベータガラクトシダーゼとＩ４Ｌ ＯＲＦの残りの部分をｖＰ８５５から欠失 させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。左および右ワクシニア 隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図１５中に模式的に示されているよ うにｐＵＣ８中に集められた。 左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、 ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌ クレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号４１／配列番号４２） と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１とした。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分）お よびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂｐの断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇ ｌＩＩ（位置６４４５９）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）で切断し、０．５ｋｂ ｐの断片を単離した。２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左の完全ワクシ ニア隣接アームを有するプラスミドｐＳＤ５３７とした。 右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、ｐＵＣ ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオ チド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号４３／配列番号４４） と連結させ、ｐＳＤ５３２とした。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／Ｅｃｏ ＲＩで切断し、２．７ｋｂｐのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、Ｒｓ ａＩでワクシニア内部（位置６７４３６）を、ＥｃｏＲＩでワクシニア／ｐＵＣ 結合を切断し、０．６ｋｂｐの断片を単離した。この２つの断片を連結し、Ｉ４ Ｌコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むｐＳＤ５３８とした。 右ワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８由来の０．６ｋｂｐＥｃｏＲＩ／Ｂ ｇｌＩＩ断片として単離され、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＳＤ５３ ７中へ連結された。その結果生成したプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ Ｌ ＯＲＦ（６５０４７−６７３８６）はポリリンカー領域で置換され、ポリリ ンカー領域は左で０．６ｋｂｐのワクシニア配列、右で０．６ｋｂｐのワクシニ ア配列と、すべてｐＵＣのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配 列内部での欠失部位は、図１５で三角形で示されている。組換えワクシニアウイ ルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列と、ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生 部分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシ ニアＩ４Ｌ欠失カセットがｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１へ移動され、ｐＵＣ派生 体からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した （Ｃｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／Ｐ ｓｔＩで切断し、１．２ｋｂｐ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ Ｉで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂｐ）中へ挿入し、ｐＳＤ５４８とした。 ｐＳＤ５４８とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ８５５との 組換えの結果、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で 透明プラークとして単離された。 組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡを、制限酵素消化とそれに 続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りの ものであった。ｖＰ８６６をテンプレートとして、上に詳述された６欠失座に隣 接するプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｎｇｅｌｋｅ ｅｔ ａ ｌ．，１９８８）により、期待されたサイズのＤＮＡ断片が生産された。ＰＣＲ により生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部 位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスｖＰ８ ６６は、上記の６つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡ Ｃ」と命名された。実施例１９ 狂犬病糖タンパク質 Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入 ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ ）の支配下で狂犬病糖タンパク質 Ｇをコードしている遺伝子を、ＴＫ欠失プラ スミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を 除いてプラスミドｐＳＤ４６０（図１０）と同一である。 今、図１６を参照しているが、ポリリンカー領域はｐＳＤ４６０をＳｍａＩで 切断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドＶＱ１Ａ／ ＶＱ１Ｂ（配列番号４５／配列番号４６） と連結することにより挿入され、ベクターｐＳＤ５１３を生成した。ｐＳＤ５１ ３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａ ｌ．，１９８８ａ，ｂ）支配下の狂犬病糖タンパク質 Ｇを含むＳｍａＩ末端化 １．８ｋｂｐのカセットと連結した。生成したプラスミドはｐＲＷ８４２と命名 された。ｐＲＷ８４２はＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）との組換 えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９ を、狂犬病糖タンパク質 Ｇに対する³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラー クハイブリダイゼーションにより同定した。 本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与 する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された 個体内でのランナウェイ感染（ｒｕｎａｗａｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を有利に 減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境 への汚染を減少もさせる。 改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝 子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養 された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。実施例２０ ニューカッスル病ウイルスの 融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現する ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築 本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターＴＲＯＶＡＣ、およびＴＲ ＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換 体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性ＮＤＶ株テキサスのＦ およびＨＮ遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）ベクター を構築した。創出された組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された。ＴＲＯＶ ＡＣ−ＮＤＶは実際にプロセシングされたＮＤＶ糖タンパク質を、組換えウイル スを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後１日のニワトリへの接種により、それ に続く毒性ＮＤＶ投与に対して防御する。 細胞とウイルス ＮＤＶテキサス株は短期潜伏性の株である。ＦおよびＨＮ遺 伝子のｃＤＮＡの調製は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９ ９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＦＰＶウイルスのＦＰ−１ と命名された株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ ）。それは生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウ イルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶ たとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続 くニワトリ胚繊維芽細胞で２５回の継代により弱毒化された。ウイルスは４回の 連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初期ＣＥＦ細胞中で増 幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテ ストで ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを生成するために用いられたストックウイルスは、プラー ク単離体から初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられた。 ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築 ５’末端からの２２ヌクレオチドを除く全ての Ｆタンパク質をコードしている配列を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＮ ＤＶ８１（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）から切り出し、ｐＵＣ１８ のＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＣＥ１３とした。以前に記述されたワクシニア ウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇ ｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）は、 ｐＣＥ１３をＳａｌＩで消化し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー 断片で充填し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＥ１３中に挿 入した。Ｈ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、続い てｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８とした。完全５’末端は、ｐＣＥ３８をＫ ｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌク レオチドＣＥ７５（配列番号４７）およびＣＥ７６（配列番号４８）を挿入して 生成し、ｐＣＥ４７を生成した。 ＮＤＶ−Ｆの３’末端非コード領域を取り除くため、ｐＣＥ１３由来のＳｍａＩ からｐｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩおよびＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＣ Ｅ２３とした。非コード領域をｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌク レアーゼＩＩＩ、ＳＴヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩによる連続的消化により除 去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列 番号４９）およびＣＥ４３（配列番号５０）を続いて挿入しｐＣＥ２９とした。 ＮＤＶ−Ｆ配列の３’末端を続いて、既にｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ 断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩ−ＳａｃＩサイトに挿入することによりＮＤＶ−Ｆ の５’末端を有しているプラスミドｐＣＥ２０に挿入しｐＣＥ３２とした。ｐＣ Ｅ２０の開発は以前にＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。 Ｈ６プロモーターおよびｐＣＥ４７に含まれているＮＤＶ−Ｆ５’配列を、ｐ ＣＥ３２に含まれている３’ＮＤＶ−Ｆ配列とを整列させるために、ｐＣＥ４７ のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩサイ トへ挿入し、ｐＣＥ４９とした。Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆは続いてＯＲ Ｆを除いたＦ８座（以下に記述）へ、ｐＣＥ４９由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎｒｕ Ｉ断片をｐＪＣＡ００２（以下に記述）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩサイト へ挿入することにより移し、ｐＣＥ５４とした。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分 的にＢａｍＨＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチ ドＣＥ１６６（配列番号５１）およびＣＥ１６７（配列番号５２）を挿入するこ とにより、ｐＣＥ５４へ転写終結シグナルを挿入し、ｐＣＥ５８とした。 ＮＤＶ−Ｆ完全３’末端を、ｐＣＥ５４をテンプレートとして、オリゴヌクレオ チドＣＥ１８２（配列番号５３）およびＣＥ１８３（配列番号５４）をプライマ ーとした複製連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。 ＰＣＲ断片はＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩにより消化させ、ＨｐａＩおよび部分的 にＰｖｕＩＩにより消化したｐＣＥ５８中へクローン化した。その結果生成され たプラスミドはｐＣＥ６４と命名された。ｐＣＥ６４由来の完全Ｈ６プロモータ ーおよびＦコード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６の ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩサイトにクローン化することにより、翻訳終結シグナ ルを挿入し、最終ＮＤＶ−ＦカセットであるｐＣＥ７１を生成した。プラスミド ｐＲＷ８４６は実質的にｐＪＣＡ００２（以下に記述）と同一ではあるが、Ｈ６ プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。ｐＲＷ８４６を ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターは除 かれるが停止シグナルは手つかずで残る。 ＮＤＶ−ＨＮカセットの構築 プラスミドｐＲＷ８０２の構築は以前にＥｄｂ ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０中で記述された。このプラスミドはワクシニ アウイルスＨ６プロモーターの３’末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列をｐＵＣ９ ベクター中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５’末端を含 むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ ｏＲＶサイトに挿入しｐＲＷ８３０とした。アニーリングさせキナーゼ処理した オリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列番号５５）およびＣＥ１６３（配列番号５ ６）をｐＲＷ８３０に挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全３’末端を得て 、最終ＮＤＶ−ＨＮカセットであるｐＣＥ５９を生成した。 ＦＰＶ挿入ベクターの構築 プラスミドｐＲＷ７３１−１５は、ゲノムＤＮＡ からクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をコードしてい る。３６６０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖に関してヌクレオチ ド配列が決定された。ここでＦ８と名付けられたオープンリーディングフレーム の限定が決定された。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−Ｅ ｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８オープンリ ーディングフレームの全体は、ｐＲＷ７６１中のＸｂａＩサイトおよびＳｓｐＩ サイトの間に含まれている。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組換えにおいてＦ８ ＯＲＦを取り除く挿入プラスミドを創出するために、以下の工程が行われた。プ ラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで、部分的にＳｓｐＩで消化した。ゲル から単離された３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドをアニーリングさせた ２本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号５７）およびＪＣＡ０１８（ 配列番号５８）と連結した。 このライゲーションの結果生成されたプラスミドはｐＪＣＡ００２と命名された 。 ＮＤＦ ＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築 Ｈ６プロモートされたＮＤ Ｖ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆカセット中に、Ｅ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼクレノー断片で充填したｐＣＥ５９由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を、 ｐＣＥ７１のＨｐａＩサイトへクローン化することにより挿入し、ｐＣＥ８０と した。プラスミドｐＣＥ８０は完全にＮｄｅＩで、部分的にＢｇｌＩＩで部分的 に消化し、Ｆ８隣接アームに連結し、ともにＨ６プロモーターによって駆動され ているＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含む４７６０ｂｐ断片を生成した。プラス ミドｐＪＣＡ０２１は、ｐＲＷ７３１−１５由来の４９００ｂｐのＰｖｕＩ−Ｈ ｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ⁺のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩに挿入することにより 得られた。プラスミドｐＪＣＡ０２１を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化 し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片と連結し、ｐＪＣＡ ０２４とした。プラスミドｐＪＣＡ０２４は、それ故、ＦＰＶ隣接アームの間に ３’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を有 している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されてい る。ＮＤＶ−Ｆ配列に近い右隣接アームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。 ＮＤＶ−ＨＮ配列に近い左隣接アームは１７００ｂｐＦＰＶ配列からなる。 ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発 プラスミドｐＪＣＡ０２４を、ＴＲＯＶＡＣを 感染させた初期ＣＥＦ細胞中に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウ ム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異的 放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋 な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて１つの代表 プラークを増幅し、その結果得られたＴＲＯＶＡＣ組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤ Ｖ（ｖＦＰ９６）と命名された。 免疫蛍光 直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅ ｔ ａｌ．，１９９０）、ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、およびモノ特異的試薬 として、ＮＤＦ−ＶまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換体に 対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。 イムノプレシピテーション イムノプレシピテーション反応を、記述されたよ うに（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）ＳＰＡＦＡＳ Ｉｎｃ．Ｓｔｏ ｒｒｓ，ＣＴより得たポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて行った。 ストックウイルスを、Ｆ８ＯＲＦのが欠失されていることを確認するためにイ ンサイチュ プラークハイブリダイゼーションにより選別した。ＴＲＯＶＡＣゲ ノムへのＮＤＶ遺伝子の正確な挿入およびＦ８ＯＲＦの欠失は、サザンブロット ハイブリダイゼーションによってもまた確認された。 ＮＤＶ感染細胞中では、Ｆ 糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性 膜内外領域によって膜に固定され、プレカーサーＦ₀の、２つのジスルフィド結 合したポリペプチドＦ₁およびＦ₂への翻訳後の分解を必要とする。Ｆ₀の分解は 、与えられたＮＤＶ株の病原性の決定において重要であり（Ｈｏｍｍａ ａｎｄ Ｏｃｈｉａｉ，１９７３；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９７６；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０）、分解サイトのアミノ酸配列は、それ故にウイルス の毒性の決定に重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換体ｖＦＰ２９を生成した ＮＤＶ−Ｆ配列中の分解サイトのアミノ酸は、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａ ｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３９）（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を有 し、これは毒性ＮＤＶ株で要求されると判明している配列（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｅｓｐｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｌｅ ｅ ｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＧｉｎｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８ ６；Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）と一致していた。ＮＤＶ毒性株に 感染した細胞中で合成されるＨＮ糖タンパク質は分解されていない７４ｋＤａの 糖タンパク質である。例えばＵｌｓｔｅｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのような 極端に無毒性の株は、活性化には分解を要求するＨＮ（ＨＮ₀）をコードしてい る（Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶ ＡＣ−ＮＤＶ中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されて いるかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清 を用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の 表面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供 されていることを決定するために、ＦもしくはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発 現するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの 血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が 確認された。 イムノプレシピテーション実験を、親および組換えウイルスに感染させたＣＥ Ｆ細胞の（³⁵Ｓ）メチオニン標識破砕物を用いて行った。Ｆ₁およびＦ₂のグリコ シル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ５４．７および１０ ．３ｋＤａである（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ポリクロー ナル抗ＮＤＶ血清を用いたイムノプレシピテーション実験において、適当なサイ ズの融合特異的産物がＮＤＶ−Ｆ単独組換体ｖＦＰ２９（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換体ｖＦＰ９６から検出 された。適切なサイズのＨＮ糖タンパク質もまたＮＤＶ−ＮＨ単独組換体ｖＦＰ ４７（Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ から検出された。感染させなかった細胞、および親ＴＲＯＶＡＣを感染させたＣ ＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。 ＣＥＦ細胞においてＦおよびＨＮ糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供さ れ、そこにおいてそれらはＮＤＶ免疫血清によって認識された。イムノプレシピ テーション分析により、毒性株で要求されるようにＦ₀タンパク質は正確にＦ₁ およびＦ₂成分へと分解されることが示された。同じようにＨＮ糖タンパク質は 組換体ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染させたＣＥＦ細胞中で正確にプロセシングさ れた。 以前の報告（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂ，ｃ ；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）では、ＨＮもしくはＦのいずれかのみ の発現で、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた 。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免 疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。ＳＶ ５ウイルスはＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できる が、Ｆ糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。（Ｍｅｒｚ ｅｔ ａｌ． ，１９８０）。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合 成分の不活性化によるものであると提案されている（Ｎｏｒｒｂｙ ｅｔ ａｌ ．，１９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中性化抗体の誘導に反応 性である（Ａｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、および両方の糖タンパク質 は、独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を 誘導できることが示されているが、最も効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タ ンパク質を発現しなくてはならないことが理解されている。実施例２１ 狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｇを発現する ＡＬＶＡＣ組換体の構築 本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶ ＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発 およびその安全性と効率を記述する。 細胞とウイルス 親カナリアポックス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリア のためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚 繊維芽細胞上で２００回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシ ードは４回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、１つ のプラーククローンがさらに５回の付加的な継代により増幅され、その後ストッ クウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製さ れたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。 カナリアポックス挿入ベクターの構築 ８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕ ＩＩ断片を、ｐＵＣ９中のＰｖｕＩＩサイトの間にクローン化し、ｐＲＷ７６４ ．５とした。この断片の配列を図１７（配列番号５９）中の位置１３７２および ２２５１の間に示す。Ｃ５と命名されたオープンリーディングフレームの限定が 決定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置１６６から開始され 、位置４８７で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干 渉することなくＣ５の欠失がなされた。位置１６７から位置４５５までの塩基は 配列（配列番号６０） ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ により置換された。この置換用配列はＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏ ＲＩ挿入サイトおよび、それに続くワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼによ って認識される翻訳停止および転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９８７）を有している。Ｃ５ ＯＲＦ欠失は以下に記述されるように行った。プ ラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、直線状産物を単離した 。ＲｓａＩ直線状断片を再びＢｇｌＩＩで切断し、今、位置１５６から位置４６ ２へのＲｓａＩからＢｇｌＩＩへの欠失のあるｐＲＷ７６４．５断片を単離し、 以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた （配列番号６１および６２） オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングさせ、ｐＲＷ７ ６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに上記のように挿入した。その結果 生成されたプラスミドはｐＲＷ８３１と命名された。 狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿入ベクターの構築 ｐＲＷ８３８の構築を以下に記述 する。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンおよ び狂犬病ＧのＡＴＧとオーバーラップしているが、これらをｐＵＣ９中にｐＲＷ ７３７としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーター 、ＮｒｕＩでの開始、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩを通ってそれに続くＢｇｌＩＩ を含んでいる。 オリゴヌクレオチドＡからＥ（（配列番号６３）−（配列番号６７））の配列は ： アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＡからＥの配置は以下の通りである： オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングさせ（９５℃、 ５分間、続いて室温まで冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイトに挿入した。その 結果生成されたプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで 切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）の１．６ ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のためのベクターとして用い、ｐＲＷ ７３９を生成した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯのＨｉｎｄＩＩＩサイトは狂犬病Ｇ遺伝 子の翻訳開始コドンから８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ 中の狂犬病Ｇ遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒ ｕＩで切断し、完全にＢｇｌＩＩで切断し、以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕ ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｈ６プロモーターの３’末端を狂犬病Ｇ遺伝子全 体を通して含んでいる１．７ｋｂｐのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＲＷ８２ ４のＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩサイトの間に挿入した。その結果生成されたプラ スミドはｐＲＷ８３２と命名された。ｐＲＷ８２４への挿入によりＮｒｕＩのＨ ６プロモーター５’を付加した。ｐＲＷ８２４の、ＳｍａＩが続いているＢａｍ ＨＩの配列は（配列番号６８）：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４ は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有し ている。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切 り出した。１．８ｋｂｐｐＲＷ８３２のＳｍａＩ断片は、Ｈ６プロモートされた 狂犬病Ｇを有しており、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩサイト中に挿入され、プラスミ ドｐＲＷ８３８を生成した。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発 プラスミドｐＲＷ８３８を、ＡＬＶＡＣを感染させ た初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１ ９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法に より形質導入した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション に基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで６回の連続した プラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生 成されたＡＬＶＡＣ組換体はＡＬＶＡＣ−ＲＧと命名された（ｖＣＰ６５）（図 １８Ａおよび１８Ｂもまた参照されたい）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノム への、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。 免疫蛍光 成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分 はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面 上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確 認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた初期ＣＥＦ細胞 について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて行った。Ａ ＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親 ＡＬＶＡＣに感染させたものは検出されなかった。 イムノプレシピテーション 予め形成された初期ＣＥＦ単層、Ｖｅｒｏ（アフ リカグリーンモンキー腎臓細胞の系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）およびＭＲＣ− ５細胞（ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ＡＴＣＣ＃Ｃ ＣＬ１７１）を、１０ｐｆｕの親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで放射性標識³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述され たように処理した（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。イムノプレシピ テーションを、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約６７ｋＤ ａの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ＡＬＶＡＣウイルスに 感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。 連続継代実験 非鳥類種の範囲でのＡＬＶＡＣウイルスの研究においては、拡 散的感染も明白な病気も観察されなかった（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９ ９１ｂ）。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適 応しないようにするために、連続継代実験を行った。 ２つのウイルス、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧを３種類の細胞系統で１０連 続盲継代（ｂｌｉｎｄ ｐａｓｓａｇｅ）を行った： （１）１１日経過白レグホン胚から調製された初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ ）細胞； （２）Ｖｅｒｏ細胞−アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の連続系統（ＡＴＣ Ｃ＃ＣＣＬ８１）； （３）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統（ＡＴＣ Ｃ＃ＣＣＬ１７１）。 最初の接種は０．１ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで、一皿あたり２ｘ１０⁶の細胞 を含む３枚の６０ｍｍのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、４ ０μｇ／ｍｌのＤＮＡ複製阻害剤シトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ）の存在下 で接種した。１時間、３７℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収 されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、２つのデ ィッシュ（試料ｔ０からｔ７）では５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ ＮＢＣＳで、第３ のディッシュでは４０μｇ／ｍｌのＡｒａ Ｃを含む５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％Ｎ ＢＣＳで（試料ｔ７Ａ）置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、 試料ｔ０は−７０℃で凍結した。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間保温し 、その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。 それぞれの細胞系統のｔ７試料の１ｍｌを希釈せずに、同じ細胞系統の３枚の ディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供するため）に、そして１枚の初 期ＣＥＦ細胞のディッシュに接種した。試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを継代１と して扱った。付加的なＣＥＦ細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも 知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。 この工程を１０回（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８回（Ｖｅｒｏ）の連続 盲継代について繰り返した。試料は続いて３回凍結、融解させ、初期ＣＥＦ単層 上での滴定によりアッセイした。 それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のＣＥＦ単層上のプラーク滴定に より決定した。まとめた実験の結果を表５および６に示す。 結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧは両方ともＣＥＦ単層 上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Ｖｅｒｏ細 胞においては、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、そしてＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継 代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５細胞においては 、同様の結果が明白となり、１継代の後はウイルスは検出されなかった。表５お よび６には４継代の結果のみを示したが、この一連の工程はＶｅｒｏについては ８継代、ＭＲＣ−５については１０継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種 細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。 継代１においては、比較的高いレベルのウイルスが、ＭＲＣ−５およびＶｅｒ ｏ細胞のｔ７試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはｔ ０試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保 温されたｔ７Ａ試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類 種細胞で７日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく 残存ウイルスを示していることを表している。 アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの７日の回収物を許 容的ＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られた時点、またＣＰＥ が見られなかった場合は７日で回収した。この実験の結果を表７に示す。許容的 細胞系統を通した増幅の後ですらも、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞は付加的な ２継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、 いずれのウイルスもＶｅｒｏもしくはＭＲＣ−５細胞中での増殖への適応は無か ったことを示している。 マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）への接種 ４匹のＨＩＶ血清陽性マカクを最初にＡ ＬＶＡＣ−ＲＧで表８に記述したように接種した。１００日後、これらの動物を ブースター効果を決定するために再接種し、さらに付加的に７匹の動物をある投 与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、５６℃、３０分間熱失活さ せた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて血清を分析した。 チンパンジーへの接種 ２匹の雄成チンパンジー（５０−６５ｋｇの体重範囲 ）を、１ｘ１０⁷ｐｆｕのｖＣＰ６５で筋肉内または皮下で接種した。動物は反 応を観察し、ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）による抗狂 犬病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から１３週 間後に同じ投与量で再接種した。 マウスへの接種 マウスの群を５０−１００μｌの範囲の異なったバッチのｖ ＣＰ６５の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。１４日目に、１５− ４３マウスＬＤ５０の狂犬病ウイルス毒性ＣＶＳ株を頭蓋内接種で投与した。マ ウスの生存を観察し、５０％防御率（ＰＤ₅₀）を、接種後２８日に計算した。 イヌおよびネコへの接種 生後５ケ月の１０匹のビーグル犬および生後４ケ月 の１０匹のネコに、６．７もしくは７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇを皮下で接種した。４匹のイヌおよびネコには接種しなかった。動物から接種 後１４および２８日に採血し、抗狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験で評価した。６．７ ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には接種後２９日に、３ ．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ）もしくは４．３ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（ネコ ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。 リスザルへの接種 ４匹のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の ３つの群に、３つのウイルス、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス 、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換体、または（ｃ）ｖ Ｃ Ｐ３７、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポッ クス組換体、の１つを接種した。接種は、ケタミン麻酔（ｋｅｔａｍｉｎｅ ａ ｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）のもとで行った。各々の動物は同時：（１）２０μｌを 右目の表面に傷付処理なしに点眼；（２）１００μｌを口内へいくつかの水滴と して；（３）１００μｌを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の２つの皮内接種部 位それぞれに；（４）１００μｌを右大腿部前方筋肉中に受け取った。 ４匹の猿に各々のウイルスを、２匹はトータルで５．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ、２匹 はトータルで７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ接種した。動物から規則的な間隔で採血し、 血清をＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を用いて抗狂犬病 抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した 。最初の接種の６ケ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを受け取った４匹の猿、最初にｖＣ Ｐ３７を受け取った２匹の猿、最初にＡＬＶＡＣを受け取った２匹の猿に加えて 接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下接種し た。ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７３）により狂犬病中和抗 体の存在について血清を観察した。 ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種 ウイルスが生産的に複製されない 非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため 、５つの細胞型、１つは鳥類種で４つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病 Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種された 細胞は： （ａ）Ｖｅｒｏ、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１ ； （ｂ）ＭＲＣ−５、ヒト胚肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１； （ｃ）ＷＩＳＨ、ヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５； （ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；お よび （ｅ）初期ＣＥＦ細胞。 １１日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロ ールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された２ｘ１０⁶の細胞の単層につ いて以下に記述するように行った。 Ａ ＤＮＡ分析の方法 ３枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを５ｐｆｕ／細胞のウイルスで試験の もとで接種し、別の１つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおい た。１つのディッシュは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ Ｃ） の存在下で保温した。３７℃、６０分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単 層を吸収されなかったウイルスを除去するために２回洗浄した。培地（Ａｒａ Ｃが存在もしくは不在）は続いて置換された。１つのディッシュ（Ａｒａ Ｃ無 し）からの細胞を、時間０の試料として回収した。残りのディッシュは、３７℃ で７２時間保温し、そのとき細胞を回収しＤＮＡ蓄積分析に用いた。２ｘ１０⁶ の細胞それぞれは、０．５ｍｌの４０ｍＭＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）に再懸濁し、３７℃で５分間保温した。等量の、４２℃で予め保温された １２０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに 混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも１５分固定化された 。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッ ファー（１％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１００μｇ／ｍｌプロテイナー ゼＫ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、２００ｍＭＥＤＴＡ）中で１２−１６分 間５０℃で保温した。溶解バッファーを、続いて５．０ｍｌの滅菌０．５ｘＴＢ Ｅ（４４．５ｍＭトリス−ホウ酸、４４．５ｍＭホウ酸、、０．５ｍＭＥＤＴＡ ）で置換し、４℃で６時間にわたり３回ＴＢＥバッファーを交換して平衡化した 。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞ＲＮＡおよ びＤＮＡと分画した。電気泳動は２０時間にわたり１８０Ｖで５０−９０秒のラ ンプで、１５℃、０．５ｘＴＢＥ中で行った。ＤＮＡはラムダＤＮＡ分子量スタ ンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドはエチジウムブ ロミド染色により可視化した。ＤＮＡは続いてニトロセルロース膜に移され、精 製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製された放射性標識プローブで探索した。 Ｂ．ウイルス収量の評価 投入多重度を０．１ｐｆｕ／細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディ ッシュに接種した。感染後７２時間で、３回連続の凍結融解サイクルにより破砕 した。ウイルス収量はＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。 Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析 多重度１０ｐｆｕ／細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し 、さらに付加的は１つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。１ 時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。３０ 分の期間の後に、この培地を２５μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含むメチオ ニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーＡ 溶解バッファーを添加して溶解させた。イムノプレシピテーションを、狂犬病Ｇ 特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。 結果：ウイルス収量の評価 ０．１ｐｆｕ／細胞での接種後７２時間後の収量 の滴定の結果を表９に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなさ れうる一方で、４つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方 法では検出されなかったことを示唆している。 ウイルスＤＮＡの蓄積の分析 生産的ウイルス複製の防御が、ＤＮＡ複製の前 で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のＤＮＡを 電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存 在を探索した。感染させなかった細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた時間０の ＣＥＦ細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞、およ び４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染さ せた感染後７２時間のＣＥＦ細胞由来のＤＮＡは全て、いくらかの、恐らくは放 射性標識ＡＬＶＡＣ ＤＮＡプローブの調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの混入に よるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後７２時間のＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５ ０ｋｂｐの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をＤＮＡ 合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった 。Ｖｅｒｏ細胞中で生成された相当する試料では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させ た時間０のＶｅｒｏ細胞において、約３５０ｋｂｐのかすかなバンドが示された 。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後７２時間には増幅 さ れており、ウイルスの繁殖の増加とはならないＶｅｒｏ細胞において、いくらか のレベルのウイルス特異的ＤＮＡの複製が起こっていることが示唆された。ＭＲ Ｃ−５細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下で はウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験を 続いて付加的なヒト細胞系統、特にＷＩＳＨおよびデトロイト５３２細胞を含む ように拡張した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性コントロールとして用意した 。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種した、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２細胞のいずれにお いても、ウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界は まだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスＤＮ Ａ蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスＤＮ Ａ複製を³Ｈチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、Ｖｅｒｏおよび ＭＲＣ−５について得られた結果を支持していた。 狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析 いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の 発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するた め、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた、³⁵Ｓ−メチオニン標識さ れた鳥類および非鳥類細胞破砕物についてイムノプレシピテーション実験を行っ た。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いたイムノプレシピテーショ ンの結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５ 、ＷＩＳＨおよびデトロイト細胞中で６７ｋＤａの糖タンパク質のイムノプレシ ピテーションを示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていな いか又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。 この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体 は感染を開始しＨ６ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの転写制御のも とで外来遺伝子を発現することは可能であるが、ＤＮＡ複製を通した複製は進行 せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Ｖｅｒｏ細胞 中においては、いくらかのレベルでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積は見ら れたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結 果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はＤＮＡ複製の開始に 先だって起こるが、その一方Ｖｅｒｏ細胞中では防御はウイルスＤＮＡ複製の開 始に続いて起こることを示唆しているであろう。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを 決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病 ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ＡＬＶＡＣ −ＲＧを用いた同様の試験を行った。９つの異なったウイルス調製物（シードウ イルスを１０連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ（Ｊ）を含む） を、６．７から８．４のｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの感染力価の範囲で連続的に 希釈し、５０から１００μｌの希釈液を４匹の生後６週間のマウスの足部に接種 した。マウスに１４日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定によ り決定された１５から４３マウスＬＤ₅₀を含む３００μｌの狂犬病ウイルスＣＶ Ｓ株を投与した。ＰＤ₅₀（５０％防御量）として表された能力を、投与後１４日 に計算した。この実験の結果を表１０に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ は一貫して、３．３３から４．５６、平均３．７３（標準偏差０．４８）のＰＤ₅₀ 値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示され た。この研究の拡散として、雄マウスを、６．０ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡ Ｃを含む５０μｌのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋 内に接種した。マウスを接種後１日、３および６日に犠牲にし、脳を取り除き、 固定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのＡＬＶＡＣ−ＲＧの 神経毒性の証拠は無いことが示された。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、１ ４の生後５ケ月のビーグル犬の群および１４の生後４ケ月のネコの群を試験した 。それぞれの種の４匹の動物はワクチン接種されなかった。５匹の動物は６．７ ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を皮下で受け取り、５匹の動物は７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀ を同じ経路で受け取った。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種 されなかったまたは６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を受け取った動物に、接種後２９ 日目に３．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ、側頭中）または４．３ｌｏｇ₁₀マウ スＬＤ₅₀（ネコ、首中）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験 の結果を表１１に示した。 いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な 反応は見られなかった。６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された５匹のイヌの うちの４匹は、ワクチン接種後１４日で抗体力価を有し、２９日には全てのイヌ が有していた。全てのイヌは、対照の４匹中３匹を殺した投与に対して保護され た。ネコにおいては、６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を受け取った５匹のうち３匹が 、１４日に特異的抗体力価を有し、２９日には全てのネコが陽性であったが平均 抗体力価は２．９ＩＵと低かった。全ての対照を殺した投与に対して５匹中３匹 が生き残った。７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された全てのネコは１４日に 抗体力価を有し、２９日には、相乗平均力価は８．１国際単位と計算された。 リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ− ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応 を調べた。猿のグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在につい て血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、 不利な反応はいずれの猿においても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚 外傷から、皮下接種の後、接種後２日および４日のみに単離された。全ての検体 ７日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧで接種された４匹の全ての猿が、ＲＦＦＩ試験で測定された抗狂犬 病血清中性化抗体を生産した。最初の接種から約６ケ月後、全ての猿および１匹 の付加的な接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在に ついて血清を分析した。結果を表１２に示す。 狂犬病にかかったことのない５匹の猿のうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種 後７日までに血清学的反応を生成した。接種後１１日までには、５匹の猿全てが 検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした４匹の猿の、 全てがワクチン接種後の３日と７日との間に顕著な血清中性化力価の増加を示し た。この結果はリスザルのＡＬＶＡＣ−ＲＧでのワクチン接種は、不利な副作用 を引き起こさず、初期中性化抗体反応が誘導されうることを示している。アムナ ネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）反応もまた再ワクチン接種で誘導される 。ＡＬＶＡＣもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体へ の事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった 。 ＨＩＶ−２血清陽性マカクのＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫的反応を評価 した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中性化抗体の存在をＲＦＦＩ 試験によって評価した。その結果は、表１３に示されているが、皮下経路で接種 されたＨＩＶ−２陽性動物は、抗狂犬病抗体を１回の接種の１１日後までに生成 した。アムナネスティック反応が、最初の接種の約３ケ月後に与えられたブース ター接種の後で検出された。経口経路で組換体を受け取った動物においては反応 は検出されなかった。加えて、一連の６匹の動物を、減少させた量のＡＬＶＡＣ −ＲＧで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された６匹の内の５匹 が、接種後１４日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。ＨＩＶに事前に さらされたチンパンジーを、７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧで皮下も しくは筋内経路で接種した。接種後３ケ月に、両方の動物を同じ方法で再接種し た。結果を表１４に示す。 筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方の チンパンジーは最初の接種に１４日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反 応が検出された。 実施例２２ 狂犬病糖タンパク質を発現する カナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を用いた ヒトの免疫化 ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は実施例２１および図１８Ａおよび１８Ｂで 記述されたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ＡＬ ＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を特定の病原体のない卵から派生した初期ＣＥＦ細 胞中で増殖させた。細胞を多重度０．０１で感染させ、３７℃で３日間保温した 。 ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破 砕により得た；細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた 清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤（アミノ酸混合物）を加え、１回分の量 ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安 定剤中のウイルス懸濁液を１０倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減 少してゆく３つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。 細胞基質、培地およびウイルスシードおよび最終産物の品質制御テストを、実 験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましく ない特徴は何も発見されなかった。 臨床前データ 生体外での研究により、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬ ＶＡＣ−ＲＧの増殖を支持しないことが示された；一連の８（Ｖｅｒｏ）および １０（ＭＲＣ−５）盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中で の増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ ６５）を感染もしくは接種したヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイ ト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫもしくはＥＢＶを形質転換したリンパ芽球細胞）の分 析で、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはＤＮ Ａ合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら 、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全 ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスＤ ＮＡ複製に先だって行われることを示している。 ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効率は、動物における一連の 実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類（乳 児および成マウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リス ザル、アカゲザルマカク、およびチンパンジーに、１０⁵から１０⁸ｐｆｕの範囲 にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内お よび皮内であったが、経口（サルおよびマウス）および頭蓋（マウス）内も用い られた。 カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は乱切部位において「 受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮 内接種は、拡散せずに７−１０日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こし た。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくな い副作用は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種に続いて、 齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩ Ｔ）で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された 。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウ イルス投与実験により、防御が立証された。 ボランティア ２５人の健康な、２０−４５歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の 経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、 血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、 あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去３ケ月以内の免疫グロブリン の注入、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎表面抗原に対 する血清陽性が含まれていた。 研究計画 参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バ ツチ番号Ｅ０７５１（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｓｅｒｕｍｓ ＆ Ｖ ａｃｃｉｎｅ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または研究用ワクチンＡＬＶＡＣ−Ｒ Ｇ（ｖＣＰ６５）を割り当てた。 この試みは量増加研究と命名された。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５） ワクチンの３つのバッチは、３つのグループのボランティア（グループＡ、Ｂお よびＣ）に順番に、各々の段階の間に２週間の間隔を置いて用いられた。３つの バッチの濃度はそれぞれ、１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5組織培養感染量（ＴＣＩ Ｄ₅₀）／投与量であった。 それぞれのボランティアは、同じワクチンを４週間の間隔をおいて三角筋領域 に皮下で２投与量受け取った。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には 参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。 ２回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチ ンの中程度の量を割り当てられたグループＢのボランティアは、少ない量を１時 間前に接種され、大量を割り当てられたグループＣは、少量および中程度の量を １時間の間隔をおいて連続的に受け取った。 ６ケ月後、最も多い投与量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（グループＣ） およびＨＤＣワクチンの受取人に、３回目の量のワクチンを要請した；彼らは無 作為に、前回と同じワクチンを受け取るかまたは別のワクチンを受け取るように された。その結果、以下の免疫化の手順に相当する４種類のグループが形成され た。１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖ ＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖ ＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。 副作用の観察 全ての対象を注入後１時間観察し、次の５日間毎日再検査した 。彼らは局所的および全体的反応を次の３週間記録するよう要請され、１週間に ２回問診された。 実験室調査者 登録前およびそれぞれの接種後２、４および６日後の血液見本 を得た。分析は、完全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセ イを含んでいた。 抗体アッセイ 最初の注入の７日前および、研究の７、２８、３５、５６、１ ７３、１８７および２０８日に抗体アッセイを行った。 狂犬病に対する中性化抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ） （Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｙａｅｇｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ｏｎ Ｒａｂｉｓ中）を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ＥＬ ＩＳＡにより測定した。抗原である、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で破壊した精製カ ナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化され た血清の希釈液を室温で２時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼ で標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清で明らかとされた。この結果は４９０ｎｍ の光学密度により表されている。 分析 ２５人の対象が登録され、研究を実行された。１０人の男性と１５人の 女性で平均年齢は３１．９歳であった（２１から４８まで）。３人を除く全ての 対象が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた；残りの対象の３人は典型的な 傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。３人の対象は少量の実験用ワク チン（１０^3.5、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）の投与量で受け取り、９人の対象は１０^{5. 5} ＴＣＩＤ₅₀の投与量で受け取り、１０人はＨＤＣワクチンを受け取った。 安全性（表１４） 最初のシリーズの免疫化の間、接種後２４時間以内に３７ ．７℃を超える熱が、１人のＨＤＣ受取人（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６ ５ １０^5.5ＴＣＩＤ₅₀の受取人（３８℃）において見られた。ワクチン接種に 帰 属される他の全体的反応はいずれの受取人においても観察されなかった。 局所的反応は皮下でＨＤＣワクチンを接種された受取人１０人中９人で見られ 、ｖＣＰ６５の１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀での受取人ではそれぞれ ３人中０人、３人中１人および９人中９人であった。 圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的 兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常２４ 時間以内に沈静化し、７２時間以上は続かなかった。 血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無か った。 免疫反応；狂犬病に対する中性化抗体（表１６） 最初の注入から２８日後に 全てのＨＤＣ受取人は防御的力価（０．５ＩＵ／ｍｌ以上）を有していた。これ とは対照的に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の受取人は、グループＡおよび Ｂ（１０^3.5、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）では０人が、グループＣ（１０^5.5ＴＣＩＤ_{5 0} ）では９人中２人のみがこの防御的力価に達していた。 ５６日目（即ち第２の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６ ５）の受取人のうち、グループＡでは３人中０人、グループＢでは３人中２人、 およびグループＣでは９人中９人においてこの防御的力価が達成され、１０人の ＨＤＣ受取人の全てにおいても保持されていた。 ５６日の相乗平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣそれぞれにおいて ０．０５、０．４７、４．４および１１．５ＩＵ／ｍｌであった。 １８０日には、全ての対象において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが 、ＨＤＣ受取人１０人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）受取人９人中５ 人において最小防御力価である０．５ＩＵ／ｍｌより大きく残存していた；相乗 平均力価はグループＨＤＣおよびグループＣで、それぞれ０．５１および０．４ ５ＩＵ／ｍｌであった。 カナリアポックスウイルスに対する抗体（表１７） 観察された免疫化前力価 は、高い力価を示した対象が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず 、力価０．２２から１．２３０．Ｄ．単位で広く変化していた。免疫化前と２回 目の免疫化後の力価との間での２倍より大きい増加と定義した場合、血清変換は グ ループＢでは対象３人中１人、グループＣでは対象９人中９人で得られたが、Ｈ ＤＣまたはグループＡでは対象は１人も血清変換されなかった。 ブースター注入 ワクチンは同様に６ケ月後のブースター接種時にも十分耐性 があった：ＨＤＣブースター受取人９人中２人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６ ５）ブースター受取人１０人中１人で熱がみられた。局所的反応はＨＤＣブース ター受取人９人中６人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター受取人９ 人中５人でみられた。 観察 図２２Ａ−２２Ｄは、狂犬病中性化抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験（ ＲＦＦＩＴ）ＩＵ／ｍｌ）を示している：同じまたは別のワクチンで予め免疫化 されたボランティア体内におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀ ）のブースター効果。ワクチンは０、２８および１８７日および２０８日に与え られた。０、７、２８、３５、５６、１７３および１８０日に抗体力価を測定し た。 図２２Ａ−２２Ｄに示されるとおり、与えられたブースター量は免疫化の方式 に拘わらず全ての対象中で、狂犬病抗体力価のさらなる増加をもたらした。しか しながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースターは全体的に、ＨＤＣブー スターより低い免疫反応を誘導し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）グループは他の３つ のグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣ Ｐ６５）ブースター注入は、ＨＤＣワクチンを以前に受け取った対象５人中３人 、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された対象５人すべて において、カナリアポックス抗体力価の増加をもたらした。 全体として、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖 を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は 無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランテ ィアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパ ク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。 狂犬病中性化抗体は、マウス中の血清中性化試験と相関することが知られてい る高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀ の受取人９人のうち、５人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。 狂犬病抗体の防御的力価が、２回目の接種の後で、試験された多量の受取人の全 て、および、中程度の量の受取人においてすら３人中２人において得られた。こ の研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化Ｈ ＤＣにはされていない、皮下経路で投与された。この接種経路は、接種部位を注 意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりＨＤＣ受取人に おける抗体の遅い出現が説明できる：事実、ＨＤＣ受取人は７日には１人も抗体 増加を有していなかったが、ＨＤＣワクチンが筋内で投与された殆どの研究にお いては、かなりの割合の対象が有している（Ｋｌｉｅｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１；Ｋｕｗｅｒ ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９ ８１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の投与に限定されない。 狂犬病中性化抗体のＧＭＴ（相乗平均）は、試験しているワクチンはＨＤＣ対 照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本 研究で用いられた３種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、よ り多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。 この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。 抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である；事 実、狂犬病抗体力価は量、どの免疫化の方式でも、６ケ月後に全ての対象におい て得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に 誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンに よるブースターにブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワ クシニアウイルス組換体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて 免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ ．，Ｌａｎｃｅｔ １９９１，３３７：５６７−７２；Ｅｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４７０−７２，１９９１）。 このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間に おいて免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点がある が、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともな わずに利用可能であることが明白に示された。 実施例２３ ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ₅₀の 様々なワクシニアウイルス株との比較 マウス 雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂ ｓｔｅｒ ｍｉｃｅ）を、タコニック ファーム（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入し、マウス用食事および水 ａｄ ｌｉ ｂｉｔｕｍで生後３週間で使用するまで育てた（「通常」マウス）。両方の性の 新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続い ての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは２日間の期間内に配 達された。 ウイルス ＡＬＶＡＣはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により 派生し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製された。ショ糖密度勾配 遠心分離による精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。 ワクシニアウイルスＷＲ（Ｌ）変異体は、ＷＲの大プラーク表現型の選択により 派生された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。ニューヨーク州保 健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるＷｙｅｔｈは、Ｐａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌｓ Ｃａｌｆ Ｌｙｍｐｈ ＴｙｐｅワクチンＤｒｙｖａｘ、制御番 号３０２００１Ｂより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスＶＣ−２をＩ ｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅより得た。ワクシニアウイルス 株ＮＹＶＡＣはコペンハーゲンＶＣ−２から派生された。Ｗｙｅｔｈ株を除く全 てのワクシニアウイルス株をＶｅｒｏアフリカグリーンモンキー腎臓細胞中で培 養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてＶｅｒｏ細胞上でのプラーク 形成単位を数え上げた。Ｗｙｅｔｈ株はＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＣＥＦ細胞中 で数え上げた。 接種 １０匹の通常マウスに、ストック調整物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で １０倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の１つを、０．０５ｍｌ頭蓋内経 路（ｉｃ）で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製 物を接種に用いた。 １０匹の、生後１日または２日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入 量が０．０３ｍｌで用いられたこと以外は同じようにｉｃで接種した。 全てのマウスについて、接種後１４日（新生マウス）または２１日（通常マウ ス）の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見 つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。 実験集団の死亡率５０％を達成するために要求される致死量（ＬＤ₅₀）をＲｅ ｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法により測定した。 ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対す るｉｃ経路でのＬＤ₅₀と様々なワクシニアウイルス株との比較 若マウス、通常 マウスにおけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、他の試験されたワクシニ アウイルスよりも数桁のオーダーで低かった（表１８）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬ ＶＡＣは、Ｗｙｅｔｈ株より通常マウス中で３０００倍以上も毒性が低いこと； １２５０００以上も親ＶＣ−２より毒性が低いこと；および６３００００００倍 もＷＲ（Ｌ）派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹＶ ＡＣは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両方 とも極端に大量（３．８５ｘ１０⁸ｐｆｕ；ＡＬＶＡＣ および３ｘ１０⁸ｐｆｕ ；ＮＹＶＡＣ）に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によって マウスにおいて死を引き起こすが、ＡＬＶＡＣは一般的に頭蓋内経路で投与され た場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。 ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、新生異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬ Ｄ₅₀と、様々なワクシニアウイルス株との比較 ５つのポックスウイルス株の相 対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内（ｉｃ）投与モデルシステムにおい て滴定により試験した（表１９）。終了点としての死亡率に関し、ＬＤ₅₀値は、 ＡＬＶＡＣは１０００００倍以上もワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株よりも非毒 性であること；ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株より２０００００ 倍以上も非毒性であること；およびワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ株より２５００ ００００倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最 も多量の投与量６．３ｘ１０⁷ｐｆｕでは、死亡率１００％という結果であった 。６．３ｘ１０⁶ｐｆｕでは、３３．３％という死亡率であった。死の原因は、 実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量（約６．３ＬＤ₅₀）のグループ の平均生存時間（ＭＳＴ）は６．７プラスマイナス１．５日だったので、毒物学 的またはトラウマ的本質ではないようであった。５ＬＤ₅₀の投与量ではＭＳＴが ４．８プラスマイナス０．６日であるＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣの ＭＳＴは顕著に長かった（Ｐ＝０．００１）。 ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは１５０００倍以上も毒性であり；ＶＣー ２は３５０００倍以上も毒性であり；ＷＲ（Ｌ）は３００００００倍以上も毒性 であった。ＡＬＶＡＣと同様に、最も多量の２つのＮＹＶＡＣ投与量６ｘ１０⁸ ｐｆｕおよび６ｘ１０⁷ｐｆｕは、１００％の死亡率を引き起こした。しかしな がら、３８０ＬＤ₅₀に相当する、最も多量に投与されたマウスのＭＳＴはたった の２日であった（９匹が２日に死に、１匹が４日に死んだ）。これと対照的に、 最も多量の５００ＬＤ₅₀に相当するＷＲ−Ｌを投与された全てのマウスは、４日 まで生存した。 実施例２４ ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）および ＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価 イムノプレシピテーション 事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層 に１０ｐｆｕ／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）もしくはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで２％の透析牛胎児 血清を添加したＥＭＥＭ中で接種を行った。１時間の保温の後で、接種物を除去 し、培地を２０μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含むＥＭＥＭ（メチオニンフ リー）で置換した。一晩、約１６時間の保温の後、細胞をバッファーＡ（１％Ｎ ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、５００単位／ｍｌのアプロチ ニンおよび０．０２％フェニルメチルスルフオニルフロリド）の添加により溶解 させた。イムノプレシピテーションを、Ｃ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ博士、Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈ研究所、ニューヨーク州保健部、Ａｌｂａｎｙ、ニューヨークによって 供給された２４−３Ｆ１０と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクロー ナル抗体、およびベーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体 （型番＃６０５−５００）を用いて行った。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロ ジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージーより得られたプロテインＡセ ファロースＣＬ−４８を支持マトリクスとして用いた。イムノプレシピテーショ ン沈殿物は、Ｄｒｅｙｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）の方法に従って１０ ％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ゲルを固定化し、間接撮影用に１Ｍ サリチル酸ナトリウムで１時間処理し、イムノプレシピテーションされたタンパ ク質種を視覚化するためにコダックＸＡＲ−２フイルムに曝露した。 動物の起源 ニュージーランド白ウサギはＨａｒｅ−Ｍａｒｌａｎｄ（Ｈｅｗ ｉｔｔ、ニュージャージー）より得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター異 系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後４週 間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ⁺ｎｕ⁺）マウスはタコニックファーム社（ Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ニューヨーク）より得た。全ての動物はＮＩＨガイドラ インに従って維持された。全ての動物プロトコルはＩＡＣＵＣ協会で承認されて いる。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。 ウサギにおける外傷 ２匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ １０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷または１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳ またはＰＢＳのみを０．１ｍｌ接種した。ウサギを４日から外傷が治るまで毎日 観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。 接種部位からのウイルスの回収 １匹のウサギに、皮下で複数の部位に、１０⁶ 、１０⁷、１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０／ １ｍｌ接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取さ れた皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に 、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはＣＥＦ単層上でのプラ ーク滴定によりアッセイした。 マウス中での毒性 マウス１０匹、またはヌードマウス実験では５匹のグルー プを、いくつかの０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中のウイルス希釈液のうちの１つで、 ｉｐ接種した。実施例２３を参照した。 シクロホスファミド（ＣＹ）処理 マウスをｉｐ経路で４ｍｇ（０．０２ｍｌ ）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）で−２日に接種し、続いて０日にウイルスを接種した。 感染後に続く日々には、マウスにＣＹをｉｐ接種：１日には４ｍｇ；４、７およ び１１日には２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日には３ｍｇ。免疫抑 制を間接的にクルターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）により１ １日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていない マウス（ｎ＝４）で１μｌあたり１３５００細胞、ＣＹ処理対照マウス（ｎ＝５ ）で１μｌあたり４２２０細胞であった。 ＬＤ₅₀の計算 死亡率５０％をなすために必要な致死量（ＬＤ₅₀）を、Ｒｅｅ ｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８） により決定した。 ＮＹＶＡＣ−ＲＧのマウス中での能力試験 生後４−６週間のマウスに、５０ から１００μｌのＶＶ−ＲＧ（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、ＡＬＶ ＡＣ−ＲＧ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ− ＲＧのいずれかの、２．０−８．０ ｌｏｇ₁₀ 組織培養感染量５０％（ＴＣＩ Ｄ₅₀）を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは８匹のグループからな っていた。接種後１４日に、マウスに脳内接種で１５ＬＤ₅₀の狂犬病ウイルスＣ ＶＳ株を投与した（０．０３ｍｌ）。２８日には、生存したマウスを数え、防御 量５０％（ＰＤ₅₀）を計算した。 ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導 ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣは、コペン ハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるＶＣ−２から開発された。 ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能 を含む１８のワクシニアＯＲＦを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分 で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないＯＲＦ が現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図１９はＮＹＶＡＣを開 発するために欠失されたＯＲＦを模式的に示している。図１９の上部は、ワクシ ニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限地図を示している。拡大部分は、ＮＹＶＡＣの開発において連続的に 欠失されたＶＣ−２の６つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述 されている（実施例１３から１８）。以下に、座からＯＲＦが欠失された欠失座 を、機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記す る。 ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統上での複製の研究 ヒト起源 の細胞中でのワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製のレベルを 決定するために、６種類の細胞系統に、細胞あたり０．１ｐｆｕの投入多重度で 液体培地で接種し、７２時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン（ ＶＣ−２）も接種した。初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞（１０−１１日経 過したＳＰＦ起源の受精卵から得た、Ｓｐａｆａｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ、 ＣＴ）を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表させて含めた。培養を ２つの基準：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分 析した。 多数のヒト派生細胞中でのＮＹＶＡＣの複製能力を図２０に示した。ＶＣ−２ およびＮＹＶＡＣは両方ともＣＥＦ細胞中で生産的に複製可能であったが、ＮＹ ＶＡＣは僅かに収量が減少した。ＶＣ−２は、試験された６種類のヒト派生細胞 系統のうち、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−バー ウイルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照）を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であっ た。これに反し、ＮＹＶＡＣは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統において もその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上 の感染可能なウイルスの少量の増加が、ＮＹＶＡＣに感染させたＭＲＣ−５（Ａ ＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ ５４、ヒト包皮、ダウン症）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚 肺細胞）およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞、Ｗｈｉｔｔｉｋｅｒ Ｂｉｏｐｒ ｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、型番＃７０−１５１ ）細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ 細胞から得られた収量、または親ＶＣ−２（表２０）と比較して、顕著に減少し ていた。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のＣＥＦ細胞中の２４時間での収量は７２時 間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに ４８時間（さらに２回のウイルス増殖サイクル）保温することは、従って、得ら れる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。 ヒト派生細胞系統ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２において得られる低レベ ルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのＮＹＶＡＣ 特異的ＤＮＡ蓄積がみられた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞でみられたものと関連 して、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系統ＤＮＡ蓄積レ ベルの相対ウイルス収量を比較した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積はい ずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。 同等の実験をアビポックスウイルスＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製 の結果は表２０に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致 して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ＡＬＶ ＡＣがこれらのヒト派生細胞内で生産的複製の欠失は、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ 蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも一 致している。 ヒト細胞中でのＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の 発現 効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在 無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タ ンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換体ウイルス（ｖＰ８７９、実施例１９）³⁵Ｓ メチオニン存在下でで接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タ ンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質のイムノプレシ ピテーションを行った。６７ｋＤａのタンパク質のイムノプレシピテーションが 検出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的 に交叉反応する生産物は、非感染もしくは親ＮＹＶＡＣ感染細胞破砕物において は検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得 られた。 ウサギ皮膚への接種 皮内（ｉｄ）接種に続いくウサギの外傷の誘導および本 質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている（Ｂ ｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０； Ｆｅｎｎｅｒ，１９５８；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｇｈｅｎ ｄｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｎｏｓ，１９６４）。故に、ワクシニア株ＷＲ（ＡＴ ＣＣ＃ＶＲ１１９、ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０上でプラーク精製、およ びＬ変異体と命名されたプラーク単離体、ＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５ Ｐａｎｉｃ ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１に記載の通りに選択）、Ｗｙｅｔｈ（ＡＴＣＣ ＃ＶＲ３２５、ＤＲＹＶＡＣとして流通、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡ Ｃでのｉｄ接種と関連した外傷の本質を、２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２ ８）への接種により評価した。２匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体 的感受性を示し、ウサギＡ１２８はウサギＡ０６９よりも深刻ではない反応を示 した。ウサギ１２８Ａにおいては、外傷は比較的小さく接種後２７日までに治癒 した。ウサギＡ０６９においては、外傷は強烈で、特にＷＲ接種部位に対してひ どく、４９日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して 接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な 外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。 全ての外傷を、４日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大 きさと治癒に要した日数の平均を計算した（表２１）。対照ＰＢＳを接種した部 位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株ＷＲ 、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈを接種した部位で観察された。重要なことには、Ｎ ＹＶＡＣを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。 感染可能なウイルスの接種部位での持続性 これらのウイルスの接種部位での 相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、１０⁶ 、１０⁷または１０⁸ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷｙｅｔｈまたはＮＹＶＡＣを含 む０．１ｍｌのＰＢＳを接種した。各々のウイルスは、１０⁷ｐｆｕ量を背脊椎 上に、１０⁶および１０⁸量を隣接させて位置させた。接種部位を１１日間毎日観 察した。ＷＲは最も強烈な反応を誘導し、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈが続いた（ 表２２）。潰瘍化は最初に９日目にＷＲおよびＷｙｅｔｈで、１０日目にＶＣ− ２で観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は潰瘍化も硬化も 示さなかった。接種後１１日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に 破壊し、ウイルスをＣＥＦ細胞で滴定した。結果を表２２に示す。この時点で、 投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株ＷＲの回収 は、投与ウイルス量に関係なく約１０⁶ｐｆｕであった。ワクシニア株Ｗｙｅｔ ｈおよびＶＣ−２の回収は投与量に関係なく１０³から１０⁴ｐｆｕであった。感 染可能なウイルスはＮＹＶＡＣ接種部位から回収されなかった。 遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種 大量のＮＹＶＡＣ（５ｘ１０⁸ ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０⁹ｐｆｕ）を腹腔経路でヌードマウスに接種し たが、１００日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられな かった。これと対照的に、ＷＲ（１０³から１０⁴ｐｆｕ）、Ｗｙｅｔｈ（５ｘ１ ０⁷または５ｘ１０⁸ｐｆｕ）もしくはＶＣ−２（１０⁴から１０⁹ｐｆｕ）を接種 したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に 尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。ＷＲまたは Ｗｙｅｔｈを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後に は死へとつながっていたが、ＶＣ−２に感染させたマウスは殆どは最後には回復 した。計算されたＬＤ₅₀値は表２３に示されている。 特に、ＶＣ−２を接種されたマウスは、つま先に、１から２日後には尾に外傷 （赤い丘疹）を示した。これらの外傷は接種後（ｐｉ）１１から１３日の間に最 も高い投与量のマウスにおいて（１０⁹、１０⁸か、１０⁷かおよび１０⁶ｐｆｕ） 、ｐｉ１６日には１０⁵ｐｆｕ投与されたマウス、およびｐｉ２１日には１０⁴ｐ ｆｕ投与されたマウスにおいて起こった。１０³および１０²ｐｆｕを接種したマ ウスにおいては、１００日の観察期間の間は外傷はみられなかった。ｐｉ２３日 には、１０⁹および１０⁸ｐｆｕを接種したマウスにおいて、７日後には他のグル ープ（１０⁷から１０⁴ｐｆｕ）において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に１０⁹ および１０⁸ｐｆｕグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、１００日 間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、ｐｉ３０−３５日頃に起じてき た痘様外傷が、２、３のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常はｐｉ ６０−９０日の間に治癒した。１０⁹ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹 だけ死に（ｐｉ３４日）、１０⁸ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ 死んだ（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２を接種されたマウスにおいて他に死亡は観察さ れなかった。 １０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ１７日で痘外傷を示 し始めた。これらの外傷はＶＣ−２を注入されたマウスによって示された（つま 先、尾と拡がる）外傷と同様に現れた。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種 したマウスはｐｉ３４日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のＷＲ（１ ０⁴ｐｆｕ）を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外 傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。１０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ 株を接種したマウスは全て、ｐｉ２１日から３１日の間に死ぬか必要と思われた ときは安楽死された。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウス５匹の うち４匹はｐｉ３５日から５７日の間に死ぬか必要と思われるときには安楽死さ れた。低いＷＲの投与量（１から１００ｐｆｕ）を接種されたマウスにおいて死 亡は観察されなかった。 ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株を多量に（５ｘ１０⁷ｐｆｕおよび５ｘ１０⁸ ｐｆｕ）接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ 。５ｘ１０⁶ｐｆｕもしくはこれ以下のＷｙｅｔｈを注入されたマウスは病気も しくは外傷の兆候を示さなかった。 表２３に示されるとおり、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポ ックスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株ＷＲ、Ｗ ｙｅｔｈおよびＶＣ−２に対するＬＤ₅₀値は、このモデルシステムにおいては、 ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように 、Ｗｙｅｔｈ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入 されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌード マウスでみられたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マ ウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、 ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを投与されたＣＹ処理マウスにおいて、投与量に関 係なく、いくつかの死亡が観察された。これらのランダムな出来事が死の原因と 考えられる。 全てのＷｙｅｔｈ投与量（９．５ｘ１０⁴から９．５ｘ１０⁸ｐｆｕ）で注入さ れたマウスは、ｐｉ７日と１５日の間にそれらの尾および／またはつま先に痘外 傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷 に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのＶＣ− ２投与量（１．６５ｘ１０⁵から１．６５ｘ１０⁹ｐｆｕ）で注入されたマウスも また、Ｗｙｅｔｈで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および／また はつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察され た。少量のＷＲウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、こ れらのグループにおいて死亡は引き起こされた。 ＮＹＶＡＣ−ＲＧの能力試験 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化 が、その結果生じたＮＹＶＡＣ株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化さ せることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイ ルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能 力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子と して用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬 病に対する標準ＮＩＨマウス能力試験（ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，１９７３）により 評価した。表２４は高度弱毒化ＮＹＶＡＣベクターから得られたＰＤ₅₀値は、ｔ ｋ 座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体 （Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）を用いて得られた値と同一であり、鳥 類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧについて得られたＰＤ₅₀値に近かった。 観察 公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するＮＹＶ ＡＣを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これ らの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、ＷＲ、２つのワクシニアウ イルス株、Ｗｙｅｔｈ（ニューヨーク市保健局）およびコペンハーゲン（ＶＣ− ２）、さらにカナリアポックスウイルス株、ＡＬＶＡＣ（実施例２３を参照）と 比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよび ウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるＷＲ、立証された特性とともに以 前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン（ＶＣ−２ ）およびＷｙｅｔｈ、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供 しているＡＬＶＡＣに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した 。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよ びコペンハーゲン（ＶＣ−２）と比較して高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質 を明白に示している（表１８−２４）。重要なことには、ＮＹＶＡＣのＬＤ₅₀値 は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣについて見られた値と匹敵 するものであった。ＮＹＶＡＣによる死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、極端に大量 のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された（実施例２３、表１ ８、１９、２３）。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異的は必然的 結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル（ヌードマウ スおよびＣＹ処理）における分析はまた、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲ ン株と比較して、ＮＹＶＡＣの相対的に高い弱毒化特性を示している（表２１お よび２２）。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病 気の証拠が、ＮＹＶＡＣを接種された動物またはＡＬＶＡＣを接種させた動物に おいては、観察期間にわたって観察されなかったことである。ＮＹＶＡＣ中の複 数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のＮＹＶＡ Ｃの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された（表２１およ び２２）。非鳥類種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣについての結果 を考えると、ＡＬＶＡＣの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引 き起 こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているのではな い。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることは あり得る。ＮＹＶＡＣの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。 同じく、実施例２３を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、ＷＲ、およ び以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Ｗｙｅｔｈおよ びコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を示してい る。事実、試験された動物モデルシステムにおける、ＮＹＶＡＣの病原性プロフ ィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス 、ＡＬＶＡＣのそれに近かった。ヒト（表２０）およびマウス、ブタ、イヌおよ びウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの 生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への潜 在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播 の、低い可能性をベクターに提供する。 重要なことには、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補株は効率的であることが示 されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体 は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を 誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体は、致 死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。ＮＹＶＡＣベースの狂犬 病糖タンパク質組換体の能力は、ｔｋ遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコ ペンハーゲンベースに対するＰＤ₅₀値に匹敵していた（表２４）。ＮＹＶＡＣベ ースの組換体は麻疹ウイルス中性化抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて 仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが 示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全 性の利点を付与している（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。さ らには、ＮＹＶＡＣの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワ クシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。 以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例２３を含む文書中の実 施例は、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることを示している：ａ）接種部位 での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位か らの感染可能はウイルスの速やかな消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がない（ヌ ードマウス）；ｄ）大きく減少された毒性（頭蓋内投与、生後３週間および新生 マウス）；ｅ）大きく減少された病原性および免疫不全対象物（ヌードおよびシ クロホスファミド処理マウス）において拡散性がない；およびｆ）劇的に減少さ れた、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化さ れているにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外因性抗原に対して強 力な免疫反応を誘導する能力を保持している。 実施例２５ トリインフルエンザウイルス 血球凝集素糖タンパク質を発現する ＴＲＯＶＡＣ組換体の構築 この実施例はトリインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子 を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。 細胞およびウイルス Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクロ ーンを含むプラスミドを、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｅｂｓｔｅｒ、 Ｓｔ．Ｊｕ ｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐ ｈｉｓ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅより入手した。ＦＰ−１と命名されたＦＰＶ株は以 前に記述されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。これは 、生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Ｄｕｖｅ ｔｔｅはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。 親株はふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽（Ｃ ＥＦ）細胞で２５回の継代により弱毒化された。このウイルスは１９８０年にＲ ｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅで得られ、マスターウイル スシードを作り出した。このウイルスは１９８９年にＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ に受領され、ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク 単離体を初期ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイル スとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）お よびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成するために用いられたストッ クウイルスは、初期ＣＥＦ中で８回の継代にかけられさらに増幅された。ＴＲＯ ＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成するために用いられたストックウイル スは、初期ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられさらに増幅された。 Ｆ８座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 プラスミドｐＲＷ７３１ ．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕ ＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を有している。３６５９ｂｐＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片 のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図２０に示す（ 配列番号６９）。本研究室でＦ８と命名されたオープンリーディングフレームの 限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置 ４ ９５から開始され位置１８８７で終了する。以下に記述するように、位置７７９ から位置１９２６までを欠失させた。 プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含む ｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩ で完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバン ドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号５ ７）およびＪＣＡ０１８（配列番号５８）と連結した。 この連結により生じたプラスミドをｐＪＣＡ００２と命名した。プラスミドｐ ＪＣＡ００４はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を プラスミドｐＪＣＡ００２中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモータ ーの配列は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。 プラスミドｐＪＣＡ００４をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、非関連遺伝子と Ｈ６プロモーター３７末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌク レオチドＲＷ１７８（配列番号７０）およびＲＷ１７９（配列番号７１）をＥｃ ｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ サイトの間に入れ、ｐＲＷ８４６を生成した。 それ故、プラスミドｐＲＷ８４６はＨ６プロモーターの５’ＥｃｏＲＶを、ＯＲ Ｆ欠失されたＦ８座に有している。プラスミドｐＲＷ８４６中のＨ６プロモータ ーの３’ＨｉｎｃＩＩサイトに、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロ モーター（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）により認識される転写終結コド ンおよびＳｍａＩサイトが続いている。 Ｆ７座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築 元々のＦ７ＯＲＦが欠失 されていない挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、５．５ｋｂｐのＦＰゲノ ムのＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩサイト中に有している。挿入サイト はこれらの配列内部の固有のＨｉｎｃＩＩである。図２１に示されているヌクレ オチド配列（配列番号７２）は、固有のＨｉｎｃＩＩサイトを含む２３５６ｂｐ の領域について決定された。この配列の解析により、固有のＨｉｎｃＩＩサイト （図２１、下線）は９０アミノ酸のポリペプチドをコードしているＯＲＦの内部 に位置していることが明らかとなった。ＯＲＦは位置１５３１のＡＴＧにより始 まり、位置８９８で終わる（図２１中で矢印で示された位置）。 ＯＲＦ欠失させた挿入プラスミドのためのアームはｐＲＷ７３１．１３をテン プレートとして用いたＰＣＲにより派生した。ＯＲＦの上流領域に相当する５９ ６ｂｐのアーム（ＨＢと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列番号 ７３）およびＦ７３ＰＢ（配列番号７４）により増幅された。 ＯＲＦの下流領域に相当する２７０ｂｐのアーム（ＥＨと命名）は、オリゴヌク レオチドＦ７５ＰＨＥ（配列番号７５）およびＦ７３ＰＨ１（配列番号７６）に より増幅された。 断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化し、１２６ｂｐの断片を生成した。ＥｃｏＲＶサ イトは３’末端にあり、５’末端はＨｉｎｃＩＩの３’末端を含むようＰＣＲに より形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔ ｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１とし た。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐ Ｆ７Ｄ１をＡｐａＩで直線化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、５９６ ｂｐのＨＢ断片へ連結した。生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と命名した。全 体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。 プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化し、６００ｂｐの 断片を生成させた。この断片をＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平 滑化し、続いてＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。その結果生成さ れたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と命名した。このプラスミドは４０４ｂｐのＨＢア ームと１２６ｂｐのＥＨアームを含んでいる。 プラスミドｐＦ７Ｄ３を、ＸｈｏＩで直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ ーゼクレノー断片で２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で平滑化した。この直線化された プラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号７ ７）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号７８）と連結させた。 これは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ制限サイトを含むマルチプル クローニング領域をＥＨアームとＨＢアームとの間に挿入するために行った。生 成されたプラスミドをｐＦ７ＤＯと命名した。 Ｆ８座へのＨ４血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３ ／８０から派生したトリインフルエンザＨ４をコードしているｃＤＮＡは、プラ スミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。プラス ミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラー ゼクレノー断片でｄＮＴＰの存在下で平滑化した。Ｈ４コード領域を含む平滑化 ２．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片を、ｐＩＢＩ２５（Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅ ｎ、ＣＴ）のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐ ＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、直線状の産物を単離しＨｉｎｄＩＩ Ｉで再び切断した。今、１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩを欠失された プラスミドｐＲＷ８２８は、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列番号７９ ）およびＲＷ１５３（配列番号８０）のベクターとして用いた。これらのオリゴ ヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶサイトからのＨ６プロモーターの３’部分を表し、 Ｈ４ｃＤＮＡのＡＴＧをプロモーターのＡＴＧと並列させている。 これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＢａｎＩＩおよびＨｉｎｄＩ ＩＩで切断し、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩ欠失ｐＲＷ８２８ベクター中 に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶおよびＤ ｒａＩで切断し、３’Ｈ６プロモートされたＨ４コード配列を含む１．７ｋｂｐ 断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩサイトに 挿入し、ｐＲＷ８４８とした。プラスミドｐＲＷ８４８は、それ故、ワクシニア ウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード領域を、ニワトリポックスウイ ルスＦ８座ＯＲＦ欠失領域中に有している。 Ｆ８座へのＨ５血球凝集素挿入プラスミドの構築 Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅ ｌａｎｄ／１３７８／８３から派生したトリインフルエンザＨ５をコードしてい るｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＨ２９中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手 した。合成ヌクレオチドＲＷ１０（配列番号８１）からＲＷ１３（配列番号８４ ）までは、以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コ ドンをＨ５遺伝子のＡＴＧとオーバーラップさせるために設計された。配列は、 Ｈ５遺伝子の５’ＳａｌＩサイトを通して連続しており、Ｈ５停止コドンを含む ３’Ｈ５ＤｒａＩサイトで再び開始する。 オリゴヌクレオチドを、９５℃で３分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニ ーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる 。 ｐＲＷ７４２のＥｃｏＲＶとＰｓｔＩサイトとの間へのオリゴヌクレオチドの クローン化によりｐＲＷ７４４を生成した。ｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩ サイトに挿入されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝 子を有するプラスミドｐＲＷ７４２Ｂは以前に記述された。ＰｓｔＩおよびＥｃ ｏＲＶによる消化で、非関連遺伝子およびＨ６プロモーターの３’末端を除去し た。今、プラスミドｐＲＷ７４４はトリインフルエンザＨ５のＡＴＧとオーバー ラップしたＨ６プロモーターの３’部分を有している。このプラスミドはまた、 ５’ＳａｌＩサイトを通ったＨ５配列およびＨ５停止コドン（ＤｒａＩサイトを 含む）からの３’配列を含む。ＤｒａＩサイトの利用によりＨ５ ３’非コード 末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメ ラーゼにより認識される転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ）を付与する。Ｈ６プロモートされたＨ５の構築を完成させるため、Ｈ５コード 領域を１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片としてｐＴＨ２９から単離した。 プラスミドｐＲＷ７４４をＤｒａＩで部分分解し、直線状断片を単離し、Ｓａｌ Ｉ で再び消化した、ＳａｌＩとＤｒａＩとの間の８ベースを欠失させたプラスミド を、１．６ｋｂＰのＰＴＨ２９ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片のベクターとして用いた 。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７５９をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切 断した。３’Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含む１．７ｋｂｐのｐＲＷ７ ５９ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶ− ＨｉｎｃＩＩサイトに挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４９は 、ＯＲＦ欠失Ｆ８座内にＨ６プロモートされたトリインフルエンザウイルスＨ５ 遺伝子を含んでいた。 Ｆ７座へのＨ７血球凝集素挿入ベクターの構築 Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５ 由来のＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ７１は、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔ ｅｒより入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌ ｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、ｐＩＢＩ２５のＨｉｎ ｃＩＩサイトに挿入し、ｐＲＷ８２７とした。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６ ５（配列番号８５）およびＲＷ１６６（配列番号８６）とをアニーリングさせ、 ＨｉｎｃＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶおよびＳｔｙ Ｉサイトに挿入し、ｐＲＷ８４５とした。 オリコヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号８５）およびＲＷ１６６（配列番号 ８６）はＨ６プロモーターの３’部分をＨ７遺伝子に連結している。Ｈ７遺伝子 の３’非コード末端は、ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ消化の直線状産物を単離し、 ＥｃｏＲＩで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドＲＷ２２ ７（配列番号８７）およびＲＷ２２８（配列番号８８）とアニーリングさせるこ とにより除去した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８５４である。 ｐＲＷ８５４のＨ７の停止コドンにはＨｐａＩサイトが続いている。ＯＲＦ欠失 されたＦ７座中のＨ６プロモートされたＨ７構築物中間体を、ｐＲＷ８５４のＥ ｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｓｔＩサイトを平滑化させ たｐＲＷ８５８中に移動させることにより生成した。プラスミドｐＲＷ８５８（ 以下に記述）は、Ｈ６プロモーターをＦ７ＯＲＦ欠失中に含む挿入プラスミドで ある。 プラスミドｐＲＷ８５８は、非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを有す る８５０ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、以前に記述されたｐＦＤＯのＳｍａ Ｉサイトに挿入することによって構築された。この非関連配列は、ｐＲＷ８５８ のＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３’末端の２４ｂｐ上流のサイト）およびＰ ｓｔＩでの消化により取り除いた。３．５ｋｂｐのその結果生じた断片を単離し Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を用いて２ｍＭのｄＮＴＰ存在下 で平滑末端化した。この平滑化された断片を、ｐＲＷ８５４（以前に記述）から 派出した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結された。このＥｃｏＲ Ｖ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶ Ｈ６プロモーターの最３’２４ｂｐの３’に並列さ れた完全ＡＩＶ ＨＡ（Ｈ７）遺伝子を有している。その結果生成されたプラス ミドはｐＲＷ８６１と命名された。 １２６ｂｐＥＨアーム（以前に定義）は、ｐＲＷ８６１中で、ＴＲＯＶＡＣＤ ＮＡとの組換え頻度を増加させるために伸長された。これを実行するため、５７ ５ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（以前に定義）から派 生させた。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩサイトとＮａｅＩサイト との間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、ＡＩＶ Ｈ７遺伝子に隣 接している７２５ｂｐのＥＨアームおよび４０４ｂｐのＨＢアームを有し、ｐＲ Ｗ８６９と命名された。プラスミドｐＲＷ８６９は、それ故、５’末端でワク シニアウイルスＨ６プロモーターに連結されたＨ７コード配列を有している。左 隣接アームは４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり右隣接アームは欠失ＯＲＦ Ｆ７座への挿入を目的とした７２５ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなる。 ＴＲＯＶＡＣ−トリインフルエンザウイルス組換体の開発 トリインフルエン ザウイルスＨＡコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、ＴＲＯＶＡＣを 感染させた初期ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム 沈殿法により形質導入した。ＨＡ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼ ーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続し たプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅されてストック ウイルスとされた。プラスミドｐＲＷ８４９は、生体外組換えテストにおいて用 いられ、その結果、Ｈ５血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８ ９）を生成した。プラスミドｐＲＷ８４８が用いられ、その結果、Ｈ４血球凝集 素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成した。プラスミドｐＲ Ｗ８６９が用いられ、その結果、Ｈ７血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ ７（ｖＦＰ１００）を生成した。 免疫蛍光 インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、ＨＡ分子は合 成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形 質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したＨＡ₁およびＨＡ₂サブユニ ットとなるタンパク質分解である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエン ベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。ＴＲＯＶＡＣ −ＡＩＨ組換体に感染させた細胞中でＨＡ分子が細胞表面で発現されているかど うかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述さ れたように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）行った。ＴＲＯＶＡＣ− ＡＩＨ４ではＨ４血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５ではＨ５血球凝集素が 、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ではＨ７血球凝集素が表面で発現していることが、表 面蛍光により確認された。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡ特異的モノクロー ナル抗体のプールを用いて検出された。Ｈ４ＨＡの発現はヤギ単独特異的抗Ｈ４ 血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異的モノクローナル抗体調製 物を用いて分析した。 イムノプレシピテーション ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝 集素のポリペプチドの分解が必要であるため、血球凝集素分子の分解サイトおよ びそのの周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが 同定されている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスは、ＨＡ₁にカルボキシ末端にお いて１以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸 を認識する細胞内プロテアーゼに血球凝集素を分解することを可能にし、感染可 能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられ ている。無毒性株のＨ４血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが 添加されないかぎり分解されない。 ＴＲＯＶＡＣ組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシング されているか否かを決定するため、イムノプレシピテーション実験を記述された ように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、上記の特異的試薬を用いて 行った。 ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）によって発現されたＨ５血球凝集素の イムノプレシピテーション分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および ２３ｋＤａの分子量の分解産物ＨＡ₁およびＨＡ₂として明瞭であることを示した 。感染させていない細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させた細胞にお いては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−Ａ ＩＨ５（ｖＦＰ１００）によって発現されたＨ５血球凝集素のイムノプレシピテ ーション分析により、分解産物ＨＡ₂特異的沈殿を示した。ＨＡ₁分解産物は認識 されなかった。感染させていないＣＥＦ細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに 感染させたＣＥＦ細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。 これと対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）によって発現されたＨ ４血球凝集素のイムノプレシピテーション分析においては、プレカーサータンパ ク質ＨＡ₀のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中での発 現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに 感染させたＣＥＦ細胞においては、Ｈ４特異的タンパク質は検出されなかった。 組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによる インサイチュハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によ るスクリーニングは以前に記述された通りである（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。実施例２６ ベクターシステム中のＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ ヌクレオチド、それからの発現および ベクターシステムおよび発現産物の利用 ＣＨＶ ｇＢ糖タンパク質の発現を、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーター の制御下にあるＣＨＶ ｇＢ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ＣＨＶｇ Ｃ糖タンパク質の発現を、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下にある ＣＨＶ ｇＣ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ＣＨＶ ｇＤ糖タンパク 質の発現を、ワクシニアウイルス４２Ｋ遺伝子プロモーターの制御下にあるＣＨ Ｖ ｇＤ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ｇＢおよびｇＣをコードして いるものはＡＴＩ座中に、ｇＤをコードしているものはＨＡ座にある。 ドナープラスミドの開発 ＣＨＶ ｇＢをコードしている配列はＰＣＲ派生さ せた。ＣＨＶ ｇＢ断片を、プラスミド中のＡＴＩ ＯＲＦ欠失座中のＩ３Ｌ− ＣＨＶ ｇＢカセットにＩ３Ｌプロモーター要素をコードしているＰＣＲ派生断 片と融合した。ＣＨＶ ｇＣをコードしているものはＰＣＲ派生され、プラスミ ド中のＨＡ ＯＲＦ欠失座内に融合された。 ドナープラスミドを、Ｉ３Ｌ−ＣＨＶ ｇＢ−−Ｈ６−ＣＨＶ ｇＣ二重構築 物をＮＹＶＡＣ ＡＴＩ欠失座中へ挿入するために用いた。 生体外組換えを、Ｖｅｒｏ細胞において、ドナープラスミド、およびレスキュ ーウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を用いて行った。組換体ウイルス を定法に従って同定、精製した（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。 ＣＨＶ ｇＢおよびＣＨＶ ｇＣ遺伝子をＡＴＩ ＯＲＦ欠失座中に含むＮＹＶ ＡＣベース組換体は、ＮＹＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣと命名された。 ドナープラスミドの開発 ＣＨＶ ｇＤをコードしている配列を、４２Ｋプロ モーターと融合し、その結果ＮＹＶＡＣ ＨＡ ＯＲＦ欠失座へ挿入用に開発さ れたプラスミドとなった。 生体外組換えを、Ｖｅｒｏ細胞のにおいて、ＣＨＶ−ｇＤ４２Ｋドナープラス ミド、およびレスキューウイルスとしての組換体ワクシニアウイルスＣＨＶ−ｇ ＢｇＣ（ＮＹＶＡＣがバックグラウンド）を用いて行った。これは定法に従って 行った（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＣＨＶ ｇＢおよびｇＣ 遺伝子をＡＴＩ ＯＲＦ欠失座に、ＣＨＶ ｇＤ遺伝子をＨＡ ＯＲＦ欠失座中 に含むＮＹＶＡＣベース組換体をＮＹＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣｇＤと命名した。 ＡＬＶＡＣドナープラスミドの開発 Ｉ３Ｌ−ＣＨＶ ｇＢ−−Ｈ６−ＣＨＶ ｇＣ−−４２Ｋ−ＣＨＶ ｇＤ三重構築物をＡＬＶＡＣ Ｃ３ ＯＲＦ欠失座 に挿入するためのドナープラスミドであるプラスミドが、上記のプラスミドから 構築された。 生体外組換えを、初期ニワトリ胚繊維芽細胞において、ドナープラスミドおよ びレスキューウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）を用いて行った。続いて 生成された組換体の同定および精製を定法により行った（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＣＨＶ ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をＣ３ ＯＲＦ欠 失座中に有するＡＬＶＡＣベース組換体をＡＬＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣｇＤと命 名した。 分析により、組換体による糖タンパク質の発現、および糖タンパク質は実質的 に予測された配列であることを確認した。実施例２７ ｖＣＰ３２０の開発；ＣＨＶ ｇＢを発現する ＡＬＶＡＣ組換体 ｖＣＰ３２０、ＣＨＶ ｇＢを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順によ り開発した。ＣＨＶ ｇＢ遺伝子を含む６ｋｂのＸｂａＩ断片をＣＨＶゲノムＤ ＮＡから単離し、ｐＢＳＫ＋のＸｂａＩサイトにクローニングした。この操作に より開発されたプラスミドをｐＣＨＶ２と称した。 ＣＨＶ ｇＢ遺伝子を、続いてカナリアポックス隣接アームの間にクローン化 した。これは、ＣＨＶ ｇＢを含むｐＣＨＶ２の３７００ｂｐのＳａｃＩ−Ｅｃ ｏＲＶ断片を、ｐＢＨＶＣ１６の５８００ｂｐのＳａｃＩ−ＮａｅＩ断片中にク ロン化することにより達成した。（ｐＢＨＶＣ１６はＣ５隣接アーム中にクロー ン化されたＢＨＶ１ ｇＣ遺伝子のコピーを有している。）この操作により生成 されたプラスミドをｐＣＨＶ１４と称した。 外来性３’非コード領域を除去した。これは、ｇＢ遺伝子の３′末端を含む２ １０ｂｐのＳｍａＩ−ＣｌａＩ消化したＰＣＲ断片を、５５００ｂｐのｐＣＨＶ １４の部分ＳｍａＩ−ＣｌａＩ断片中にクローン化することにより達成された。 （このＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣＨＶＰ３９（配 列番号８９）およびＣＨＶＰ４０によって生成された。 この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ１５と称した。 Ｉ３ＬプロモーターをｇＢ開始コドンの上流にクローン化した。さらに、ｇＢ 遺伝子の５’末端に位置している３つのＴ₅ＮＴ初期転写終結シグナル配列を改 変した。これは、Ｉ３ＬプロモーターおよびｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変５’末端 を含む１４０ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ消化ＰＣＲ断片を、ｐＣＨＶ１５の６３ ００ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片中にクローン化することにより達成した。（ このＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２より、プライマーＣＨＶＰ４２（配列番 号９１） およびＣＨＶＰ７８（配列番号９２） により生成された。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２７と称し た。 ｐＣＨＶ２７のＳｃａＩ−ＳａｌＩに隣接している配列の誤りを修正した。こ れは、Ｉ３ＬプロモーターおよびＣＨＶ ｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変５’末端を 含む、ｐＣＨＶ２７の１８０ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＣＨＶ１５の ６３００ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片中にクローン化することにより達成した 。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２８と称した。 ＣＨＶｇＢ遺伝子の３′末端の近くの早期転写終結シグナル配列を続いて改変 した。これは、ＣＨＶｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変領域を含む３３０ｂｐの、Ｓｐ ｅＩ−Ａｓｐ７１８消化断片を、ｐＣＨＶ２８の５４５０ｂｐのＳｐｅＩ−Ａｓ ｐ７１８断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は１５ ０ｂｐＰＣＲ断片、２８０ｂｐＰＣＲ断片およびプライマーＣＨＶＰ８９（配列 番号９３） およびＣＨＶＰ９２（配列番号９４） から得られた。１５０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２から、プライマー ＣＨＶＰ８９（配列番号９３） およびＣＨＶＰ９０（配列番号９５） により得た。２８０ｂｐＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ２から、プライマー ＣＨＶＰ９１（配列番号９６） およびＣＨＶＰ９２（配列番号９４） により得た。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３１と称した。 ＣＨＶ ｇＢ遺伝子の中部にある初期転写終結シグナル配列を続いて改変した 。これは、ｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変領域を含む、４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｂ ｓａＢＩ消化ＰＣＲ断片を、５０００ｂｐのｐＣＨＶ３１のＢａｍＨＩ−Ｂｓａ ＢＩ断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は、３８０ ｂｐＰＣＲ断片、２１０ｂｐＰＣＲ断片およびプライマーＣＨＶＰ８７（配列番 号９７） およびＣＨＶＰ９４（配列番号９８） から得た。）３８０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣ ＨＶＰ９３（配列番号９９） およびＣＨＶＰ９４（配列番号９８） により得られた。２１０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨ２から、プライマー ＣＨＶ８７（配列番号９７）およびＣＨＶＰ８８（配列番号１００）により得た 。 この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３２と称した。 以前の操作で除かれたｇＢ遺伝子の一部をｐＣＨＶ３２中に再びクローン化し た。これは、以前の操作で除去されたｇＢ遺伝子の３’末端を含むｐＣＨＶ３１ の２０００ｂｐの部分ＢｓａＢＩ−ＰｓｔＩ断片を、５４５０ｂｐのｐＣＨＶ３ ２のＢｓａＢＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローン化することにより達成した。この操 作で生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３６と称した。 Ｉ３ＬプロモートされたｇＢ遺伝子を、続いて、Ｃ６隣接アームの間にクロー ン化した。これは、Ｉ３ＬプロモートされたｇＢ遺伝子を含むｐＣＨＶ３６の２ ７５０ｂｐのＳａｌＩ−ＳｍａＩ断片を、４３５０ｂｐのｐＨＩＶ３４のＳａｌ Ｉ−ＳｍａＩ断片中にクローン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４は、 Ｃ６隣接アームの間にクローン化された、Ｈ６プロモートされたＨＩＶ２ ｇｐ １２０（＋ＴＭ）遺伝子のコピーを有している。）この操作により得られたプラ スミドをｐＣＨＶ３７と称した。ｐＣＨＶ３７中のＩ３ＬプロモートされたｇＢ 遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１０１）を図２３に示す。ＡＬＶＡＣ Ｃ６隣接 アームのＤＮＡ配列（配列番号１０２）を図２４に示す。 ｐＣＨＶ３７を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣ とともに用いてｖＣＰ３２０を得た。 イムノプレシピテーション分析を、ｖＣＰ３２０がＣＨＶ ｇＢを発現するか 否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ） （ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）、ｖＣＰ３２０（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／ 細胞）もしくはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしくは感 染させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透析牛 胎児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａｇｌ ｅ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１８時 間で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０、３ ０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナトリウ ムおよび０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＢ特異的モノクローナル 抗体１１２５Ｂ２（Ｄｒ．Ｍｉｃｈｅｌ Ｒｉｖｉｅｒｅ、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒ ｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いてＣＨ Ｖ ｇＢの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質Ａ− セファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗マウ スタンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッファ ーＡで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿したタン パク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝６． ８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール） を添加することにより免疫複合体から解離させ、５分間沸騰させた。タンパク質 をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウム で間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ３ ２０に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿した が、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）か らは沈殿しなかった（図２５）。これらの結果はｖＣＰ３２０はＣＨＶ ｇＢを 発現することを示している。実施例２８ ｖＣＰ３２２の開発；ＣＨＶ ｇＣを発現する ＡＬＶＡＣ組換体 ｖＣＰ３２２、ＣＨＶ ｇＣを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順によ り開発した。ＣＨＶ ｇＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＣＨＶゲ ノムＤＮＡから単離し、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡのＥｃｏＲＩサイトにクローニ ングした。（ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡはＣ３隣接アームの間にクローン化された Ｈ６プロモーターのコピーを有している。）この操作は、ｇＣ遺伝子をＨ６プロ モーターの下流でＣ３隣接アームの間に位置づける。この操作により開発された プラスミドをｐＣＨＶ１７と称した。 外来性３’非コード領域を除去し、ｇＣ遺伝子の３’末端の近くに位置してい る３つのＴ₅ＮＴ初期転写終結シグナル配列を改変した。これは、オリゴヌクレ オチドＣＨＶＬ６６（配列番号１０３） およびＣＨＶＬ６７（配列番号１０４） を、ｐＣＨＶ１７の８４００ｂｐのＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローン化する ことにより達成した。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ20と称し た。 ｇＣ遺伝子の開始コドンを続いてＨ６プロモーターの開始コドンに整列させた 。さらに、２つの初期転写終了シグナル配列を改変した。これは、Ｈ６プロモー ターの３’末端およびＴ₅ＮＴ改変ｇＣ遺伝子を含む、７４０ｂｐのＮｒｕＩ− ＢｓｒＧＩ消化ＰＣＲ断片を、７９００ｂｐのｐＣＨＶ２０のＮｒｕＩ−Ｂｓｒ ＧＩ断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は、５００ ｂｐのＰＣＲ断片、３００ｂｐのＰＣＲ断片およびオリゴヌクレオチドＣＨＶＰ ９６（配列番号１０５） およびＣＨＶＰ９７（配列番号１０６） を用いて生成した。５００ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ１３からオ リゴヌクレオチドＣＨＶＰ６８（配列番号１０７） およびＣＨＶＰ６９（配列番号１０８） により生成した。３００ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ１３からオリ ゴヌクレオチドＣＨＶＰ９５（配列番号１０９） およびＣＨＶＰ９６（配列番号１０５） により生成した。（ｐＣＨＶ１３は、ｇＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ ゲノム断片をｐＢＳＫ＋のＥｃｏＲＩサイトにクローニングすることにより得ら れた。）この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３８と称した。 Ｈ６プロモートされたｇＣ遺伝子を続いてＣ６隣接アーム中にクローン化した 。これは、Ｈ６プロモートされたｇＣ遺伝子を含むｐＣＨＶ３８の１４００ｂｐ ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片およびオリゴヌクレオチドＣＨＶＬ９８（配列番号１１ ０、５’−ＡＡＴＴＴＧＣＡ−３’）を、ｐＨＩＶ３４の４５００ｂｐのＮｒｕ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片中にクローン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４は 、Ｈ６プロモートされたＨＩＶ２ ｇｐ１２０（＋ＴＭ）遺伝子をＣ６隣接アー ム中に有している。）この操作によって生成されたプラスミドをｐＣＨＶ４０と 称した。ｐＣＨＶ４０中のＨ６プロモートされたｇＣ遺伝子のＤＮＡ配列（配列 番号１１１）を図２６に示す。ＡＬＶＡＣ Ｃ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列 番号１０２）を図２４に示す。 ｐＣＨＶ４０を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣ とともに用いてｖＣＰ３２２を得た。 イムノプレシピテーション分析を、ｖＣＰ３２２がＣＨＶ ｇＣを発現するか 否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ） （ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）もしくはｖＣＰ３２２（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐ ｆｕ／細胞）またはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしく は感染させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透 析牛胎児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａ ｇｌｅ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１ ８時間で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０ 。３０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナト リウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＣ特異的モノクロー ナル抗体２０１１Ａ９（Ｄｒ．Ｍｉｃｈｅｌ Ｒｉｖｉｅｒｅ、Ｒｈｏｎｅ Ｍ ｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いて ＣＨＶ ｇＢの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質 Ａ−セファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗 マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッ ファーＡで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿した タンパク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝ ６． をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウム で間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ３ ２２に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿した が、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）か らは沈殿しなかった（図２７）。これらの結果はｖＣＰ３２２はＣＨＶ ｇＣを 発現することを示している。実施例２９ ｖＣＰ２９４の開発；ＣＨＶ ｇＤを発現する ＡＬＶＡＣ組換体 ｖＣＰ２９４、ＣＨＶ ｇＤを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順によ り開発した。ＣＨＶ ｇＤ遺伝子を含む７ｋｂのＰｓｔＩ断片をＣＨＶゲノムＤ ＮＡから単離し、ｐＢＳＫ＋のＰｓｔＩサイトにクローニングした。この操作に より開発されたプラスミドをｐＣＨＶ１１と称した。 ＣＨＶ ｇＤ遺伝子を、続いてカナリアポックス隣接アームの間にクローン化 した。これは、ＣＨＶ ｇＤを含むｐＣＨＶ１１の１４７５ｂｐのＰｓｔＩ−Ｓ ｎａＢＩ断片を、ｐＨＩＶ３４の５６００ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩ断片中に クロン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４はＣ６隣接アーム中にクロー ン化されたＨ６プロモートされたＨＩＶ２ ｇｐ１２０（＋ＴＭ）遺伝子のコピ ーを有している。）これにより、ＣＨＶｇＤ遺伝子はＨ６プロモータの下流でＣ ６隣接アームの間に位置づける。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨ Ｖ１８と称した。 ｇＤ遺伝子の開始コドンを続いてＨ６プロモーターの開始コドンに整列させた 。これは、オリゴヌクレオチドＣＨＶＬ８１（配列番号１１２） およびオリコヌクレオチドＣＨＶＬ８２（配列番号１１３） をｐＣＨＶ１８の５６００ｂｐのＮｒｕＩ−ＰｆｌＭＩ断片中にクローン化する ことにより達成した。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２１と称 した。 ＣＨＶ ｇＤ遺伝子の３’末端にある、３つの初期転写終了シグナル配列を続 いて改変した。これは、「Ｔ₅ＮＴ改変」ｇＤ遺伝子の３’末端およびＣ３隣接 アームを含む、１４００ｂｐのｐＣＨＶ２２のＢｇｌＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を 、３７００ｂｐのｐＣＨＶ２１のＢｇｌＩＩ−Ａｓｐ７１８断片中にクローン化 することにより達成した。（ｐＣＨＶ２２は、「Ｔ₅ＮＴ改変」ｇＤ遺伝子の３ ’末端を含む４３０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲ断片を３９００ｂ ｐのｐＨＩＶ４３のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片中にクローン化して形成した。 ｐＨＩＶ４３は、Ｃ３隣接アームの間にクローン化されたＨ６プロモートされた ＨＩＶ１ ｇｐ１２０−マウスＩＬ−２融合遺伝子を有している。（このＰＣＲ 断片はプラスミドｐＣＨＶ１８から、オリゴヌクレオチドＣＨＶＰ７９（配列番 号１１４） およびＣＨＶＰ８０（配列番号１１５） により生成された。））この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２４と 称した。 続いて、「Ｔ₅ＮＴ改変」ＣＨＶ ｇＤ遺伝子の中央領域を、ｐＣＨＶ２４中 にクローン化した。これは、「Ｔ₅ＮＴ改変」ＣＨＶ ｇＤ遺伝子の中央領域を 含む２４０ｂｐのＢｇｌＩＩ−消化ＰＣＲ断片を、ｐＣＨＶ２４のＢｇｌＩＩサ イト中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片はプラスミドｐ ＣＨＶ１８から、オリゴヌクレオチドＣＨＶＰ８３（配列番号１１６） およびＣＨＶＰ８４（配列番号１１７） により生成された。）この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２５と称 した。 Ｃ３隣接アームを続いてＣ６隣接アームで置換した。これは、Ｃ６隣接アーム を含むｐＣＨＶ２１の１１６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片を、ｐＣＨ Ｖ２５の４１００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片中にクローン化すること により達成した。この操作によって生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２６と称し た。ｐＣＨＶ２６中のＨ６プロモートされたｇＤ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号 １１８）を図２８に示す。ＡＬＶＡＣ Ｃ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号 １０２）を図２４に示す。 ｐＣＨＶ２６を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣ とともに用いてｖＣＰ２９４を得た。 イムノプレシピテーション分析を、ｖＣＰ２９４がＣＨＶ ｇＤを発現するか 否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ） （ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）、ｖＣＰ２９４（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／ 細胞）またはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしくは感染 させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透析牛胎 児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａｇｌｅ ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１８時間 で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０。３０ ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナトリウム および０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＣ特異的モノクローナル抗 体２０８Ｄ１１（Ｄｒ．Ｍｉｃｈｅｌ Ｒｉｖｉｅｒｅ、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉ ｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いてＣＨＶ ｇＢの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セ ファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗マウス タンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッファー Ａで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿したタンパ ク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝６．８ ）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール）を 添加することにより免疫複合体から解離させ、５分間沸騰させた。タンパク質を ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムで 間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ２９ ４に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿したが 、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）から は沈殿しなかった（図２９）。これらの結果はｖＣＰ２９４はＣＨＶ ｇＤを発 現することを示している。 このように本発明の好適な実施例を詳細に記述してきたが、添付したクレーム によって定義された発明は、上の記述で示された特定の詳細に限定されるもので は無いことは、それらの精神もしくは範囲から外れること無しにそれらの明らか な変化が可能であることから理解されよう。 組換体は、子犬および成犬においてＣＨＶに対する抗体もしくは免疫反応を刺 激するために利用可能であり、組換体を感染させた細胞から単離可能である発現 産物もまたそうである。さらに、組換体またはそれらの発現産物は、組換体また はそれらの発現産物を投与された動物において抗体を生産可能であり、その抗体 はさらにここに記述したように利用可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 リムバッチ，ケイス ジェフリー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 12180 トロイ ウインター ストリート エク ステンション 379

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣまたはｇＤ糖タンパク質をコードしている 単離された核酸。 ２．配列番号１、１０および１５のいずれか１つの配列を有することを特徴とす る請求の範囲第１項記載の単離された核酸。 ３．ＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の核酸。 ４．イヌヘルペスウイルスｇＢ糖タンパク質をコードしていることを特徴とする 請求の範囲第１項記載の単離された核酸。 ５．イヌヘルペスウイルスｇＣ糖タンパク質をコードしていることを特徴とする 請求の範囲第１項記載の単離された核酸。 ６．イヌヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質をコードしていることを特徴とする 請求の範囲第１項記載の単離された核酸。 ７．請求の範囲第３項記載の単離された核酸を含むことを特徴とするベクター。 ８．前記ベクターがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第７項 記載のベクター。 ９．前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスで あることを特徴とする請求の範囲第８項記載のベクター。 10．ウイルスが弱毒化された毒性を有するように内部でウイルスにコードされた 遺伝子機能を不活性化されているが、保持された効果を有し；ウイルスゲノムの 非必須領域中にイヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの少なくとも１つを コードしている外因性ＤＮＡをさらに含む改変組換体であることを特徴とする請 求の範囲第７項記載のベクター。 11．前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１０ 項記載のベクター。 12．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の 範囲第１１項記載のベクター。 13．少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより前 記遺伝子機能を不活性化されていることを特徴とする請求の範囲第１２項記載 のベクター。 14．前記欠失された遺伝子機能がＣ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレーム または宿主範囲機能を含むことを特徴とする請求の範囲第１３項記載のベクター 。 15．Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌからなる 群より選択された少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠 失されていることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のベクター。 16．チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子 およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットからなる群より選択された 少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠失されていること を特徴とする請求の範囲第１４項記載のベクター。 17．Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌおよび Ｉ４Ｌが前記ウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１５項 記載のベクター。 18．チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子 、宿主範囲領域およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットが前記ウイ ルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。 19．ＮＹＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１７項記載 のベクター。 20．ＮＹＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１８項記載 のベクター。 21．宿主中で弱毒化された毒性を有するように改変され；イヌヘルペスウイルス ｇＢ、ｇＣおよびｇＤの少なくとも１つをコードする外因性ＤＮＡをウイルスゲ ノムの非必須領域中に含む改変組換体アビポックスウイルスであることを特徴と する請求の範囲第７項記載のベクター。 22．前記ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第２１項記載のベクター。 23．前記カナリアポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞上での２００以上 の連続継代を通して弱毒化されたＲｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株であり、そ それ由来のプラーククローンが５回の付加的な継代を通して増幅されたものであ ることを特徴とする請求の範囲第２２項記載のベクター。 24．ＡＬＶＡＣ組換体であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のベクタ ー。 25．ｖＣＰ３２０、ｖＣＰ３２２またはｖＣＰ２９４であることを特徴とする請 求の範囲第２４項記載のベクター。 26．適当な担体との夾雑物中にある請求の範囲第７、１０、１９、２１又は２４ 項のいずれか１項記載のベクターから成ることを特徴とする、抗原的または免疫 的反応を誘導するための組成物。 27．請求の範囲第７、１０、１９、２１又は２４項のいずれか１項記載のベクタ ーを細胞内に導入することから成ることを特徴とする遺伝子産物を生体外で培養 された細胞内で発現させるための方法。 28．請求の範囲第７、１０、１９、２１又は２４項のいずれか１項記載のベクタ ーの生体外発現により単離されたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ またはｇＤ。