JPH09511387A - 新規な細胞表面受容体、抗体組成物、及びこれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 凝固因子Ｖ及びVIIIに大いに相同であるが、これらと同一ではない細胞受容体の新規なクラスが同定される。又、その受容体のＤＮＡ及びアミノ酸残基配列が記載される。又、本発明は本発明の細胞受容体の精製及び合成に有益な方法、配列及びベクターを開示する。受容体又は同定されたアミノ酸残基配列を含むポリペプチドと免疫反応できる抗体組成物並びに関連する治療プロトコル及び診断プロトコルが又記載され、本明細書に開示された抗体を使用するＴリンパ球増殖の抑制に関するポリペプチド、組成物、及び方法が同様に記載される。又、受容体は凝固因子Ｘａを結合することが実証され、その結合は受容体の種々の開示されたモノクローナル抗体により抑制される。又、本発明はリンパ球増殖を刺激又は同時刺激することができるポリペプチド、抗体及び組成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な細胞表面受容体、抗体組成物、及びこれらの使用方法 技術分野 本発明は、凝固因子Ｖ及びVIIIに大いに相同であるが、これらと同一ではない 細胞外受容体分子の新規なクラスに関する。その受容体のＤＮＡ配列及びアミノ 酸残基配列が記載され、同様に、その受容体または同定されたアミノ酸残基配列 を含むポリペプチドと免疫反応することができる抗体組成物並びに関連する治療 プロトコル及び診断プロトコルが記載される。又、本明細書に開示された抗体を 使用する正常なＴリンパ球増殖及び異常なＴリンパ球増殖を抑制するのに有益な 薬剤、組成物及び方法が開示される。又、開示された受容体は凝固因子Xaを結合 することができ、その結合は受容体の開示された第一世代モノクローナル抗体に より抑制される。 背景 血液凝固及び線維素溶解に関与する同じ酵素がまた付加的な生物学的機能及び 異種の生物学的機能を媒介することが次第に明らかになってきた。ホルモン介在 性成長因子活性のメカニズムに驚く程類似して、トロンビンは特定の細胞受容体 により完全に協調された反応において種々の細胞型に対し強力な分裂効果を与え る(Chen,L.B.ら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 72: 131(1975); Glenn,K.C.ら，N-a ture 278: 711(1979); Baker,J.B．ら，Nature 278: 743(1979))。同様に、有糸 分裂誘発、悪性形質転換、プロトオンコジーン発現、及び細胞分化の間の微妙な バランスがプロテアーゼ活性により大いに影響されることが示されていた(Unkel ess,J.C.ら，J.Exp.Med．137: 85(1973); Sullivan,L.M.ら，Cell 45: 905(1986 ); 及びFenner,F．ら，オルトポックスウイルス アカデミック・プレス(サンジ エゴ)(1989))。 凝固メカニズム及び線維素溶解メカニズム(Furieら，Cell 53:505-518(1988)) を保存することに加えて、或る種のプロテアーゼは特殊プロテアーゼ受容体のシ グナリング特性により多面的な細胞応答、例えば、運動性(Ossowski，Cell 52: 321-328(1988))、分化(Bories ら，Cell 59: 959-968(1989))、及び有糸分裂誘 発(Glennら，Nature 278: 711-714(1979); Kirchheimer ら，PNAS USA 86: 5424 -5428(1989))に影響する。リガンド依存性局所タンパク質分解(Vu ら，C-ell 64 : 1057-1068(1991))または物理的受容体占有(Appellaら，J.Biol.Chem．262: 44 37-4440(1987))の結果として、プロテアーゼ受容体は細胞内第二メッセンジャー の放出( Vuら，上記文献(1991); Paris ら，J.Biol.Chem．259: 10989-10994(19 84))、タンパク質リン酸化(Goldenら，J.Cell Biol．111: 3117-3127(1990))、 及び早期活性化遺伝子の転写(Danielら，J.Biol.Chem．261: 9579-9582(1986)) による細胞活性化の複雑な経路を開始する。 又、成長因子受容体の異常な発現が或る種の新形成に寄与することが報告され ていたが(Ulrich ら，Nature 309: 418-425(1984); Sherr ら，Cell 41: 665-67 6(1985); Downwardら，Nature 307: 521-527(1984))、それが又ヒト白血病誘発 に関与するか否かは不明のままである（例えば、Sawyers ら，Cell 64: 337-350 (1991); Heardら，Cell 51: 663-673(1987); Meekerら，Blood 76: 285-289(199 0)を参照のこと）。 又、種々の免疫−炎症反応がプロテアーゼ活性により影響される。それらの相 補細胞受容体へのウロキナーゼ、同様にトロンビンの結合は、in vivo で好中球 及び単球の局所蓄積により強力な走化反応を生じる（Bovie,M.D.P.ら，J.Immun- ol.139: 169(1987); Bar-Shavit,R．ら，Science 220: 728(1983))。更に、合成 プロテアーゼインヒビターはNK介在性標的細胞溶解及びCTL 介在性標的細胞溶解 だけでなく、単球合成及びTNF-αの放出を減少又は無効にすることが示されてい た(Redelman,D.ら，J.Immunol．124: 870(1980); Chang,T.W.ら，J.Immunol．12 4: 1028(1980); Suffys,P．ら，Eur.J.Biochem．178: 257(1988); Scuderi，P. ，J.Immunol．143: 168(1989))。 特定の細胞免疫エフェクター機能におけるプロテアーゼの更に直接の関与のこ の概念が最近細胞毒性のNKクローン及びCTL クローン中の関連セリンプロテアー ゼのファミリーの同定により強化された(Masson,D.ら，Cell 49: 679(1987))。 グランザイムと称される、これらのセリンプロテアーゼ(Jenne,D.ら，PNAS USA 85: 4814(1988))は、細孔形成性タンパク質ペルフォリンと一緒に細胞下の顆粒 中に区画化され、そして内皮：Ｔ細胞接合体の形成と関連する分極エキソサイト ーシス中に局所で放出される(Masson,D.ら，J.Biol.Chem．260: 9069(1985); Pa sternack,M.S．ら，Nature 322: 740.12(1986); Podack,E.R.ら，J.Exp.Med．16 0: 695(1984))。 分子クローニングにより明らかにされるように、幾つかのグランザイムは凝固 及び線維素溶解に関与するその他のセリンプロテアーゼ、特に、プラズマ凝固プ ロテアーゼ因子IXa 及びXaと顕著な程度の相同性を共有する(Jenne,D．ら，PNAS USA 85: 4814(1988); Gershenfeld,H.K．ら，Science 232: 854(1986); Jenne ，D.ら，J.Immunol．140: 318(1988); Lobe,C.G．ら，Science 232: 858(1986); Gershenfeld,H.K.ら，PNAS USA 85: 1184(1988))。標的細胞損傷におけるペル フォリンに関する直接の役割を示唆する強制的な証拠が累積したが(Masson,D.ら ，J.Biol.Chem．260: 9069(1985); Duke,R.C.ら，J.Exp.Med．170: 1451(1989)) 、溶解プロセスにおけるグランザイム又はその他のセリンプロテアーゼの関与及 び力学的役割が不明のままである(Dennert,G．ら，PNAS USA 84: 5004(1987))。 又、細胞表面におけるタンパク質分解活性の構築は種々の必須の生物学的応答 を開始することを認めることが重要である。特定の高アフィニティー受容体はこ のような相互作用を協調し、プロテアーゼを偏在する細胞外インヒビターによる 不活化から保護し、そしてその酵素の触媒効率に最適の空間配列を与える。種々 の細胞との凝固及び線維素溶解性タンパク質の調節された関連が特殊プロテアー ゼー細胞相互作用のこれらのメカニズムを良く例示し得る(Miles,L.A．ら，Fib- rinolysis 2: 61(1988); Morrisseyら，Cell 50: 129(1987); Nesheim,M.E．ら ，J.Biol.Chem．254: 10952(1979))。 血管細胞への凝固プロテアーゼ因子Xaの結合は、膜結合因子V/Vaとのプロトロ ンビナーゼ複合体の構築の分子上の前提条件として最初に認められた(Tracyら， J.Biol.Chem．260: 2119-2124(1985); Rodgers ら，PNAS USA 80: 7001-7005(19 83))。しかしながら、更に最近の研究は又因子V/Vaとは異なる因子Xaの付加的な 細胞表面受容体の存在を仮定した。活性化されたウサギ肺胞マクロファージは因 子V/Vaに一部免疫関連した因子Xa受容体のみを発現し、これが因子V/Vaの不在下 でプロトロンビン活性化を促進する(McGeeら，J.Exp.Med．164: 1902-1914 (1986))。 モノクローナル抗体(mAb)戦略を使用して、同様の知見がヒト単球及び単球細 胞に関して独立に報告された(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969-2972(1989)) 。エフェクター細胞プロテアーゼ受容体-1(EPR-1)と称される、この白血球因子X a受容体の膜発現は、in vitroリンパ球増殖中に８〜10倍に増大された表面発現 でもって、細胞活性化によりダイナミックに調節された(Altieriら，J.Immunol ．145: 246-253(1990))。因子Va：因子Xa相互作用(Tracyら，上記文献(1985))と 較べて低アフィニティーであるが、EPR-1 への因子Xaの結合は単球表面でプロト ロンビン活性化(Altieriら，上記文献(1989))又は因子IX活性化の中間体生成物 の発生(Worfolkら，Blood 80: 1989-1997(1992))を促進した。 EPR-1 の一次構造が機能性クローニング及びｃＤＮＡ中の哺乳類細胞発現によ り今解明された。これらの結果は、EPR-1 が細胞内シグナル導入のプロテアーゼ 依存性メカニズムにおいて潜在的に示された、因子Xaの新規なトランスメンブラ ン糖タンパク質受容体であることを示す。又、本明細書に記載された抗EPR-1 抗 体は新規な実用性及び可能性を有することがわかった。 発明の簡単な要約 この一般的な状況において、本明細書に開示された知見は特に有意義である。 本開示は細胞外受容体分子の新規なクラスを記載するだけでなく、クローン型か つポリクローナルのＴリンパ球増殖に作用する免疫抑制剤が又開示される。 例えば、慢性リンパ性白血病(CLL、n=30)の患者の試験集団において、90％が 正常な対照の密度より５〜50倍高い密度でエフェクター細胞プロテアーゼ受容体 -1(EPR-1)(Altieri ら，J.Biol.Chem．264: 2969-2972(1989); Altieri ら，J.I -mmunol．145: 246-253(1990); Worfolkら，Blood 80: 1989-1997(1992))と称さ れる細胞表面抗原を異常に発現したことが本明細書に今開示される。 EPR-1 のｃＤＮＡの分子クローニングは、特異なシステインに富む細胞外モジ ュール及び多数の潜在的なセリン／スレオニンリン酸化部位を有するDraf-1プロ トオンコジーンに相同の細胞質ドメインを特徴とする新規なトランスメンブラン 分子の配列を明らかにした。EPR-1 へのリガンド結合はリンパ球有糸分裂誘発を 誘導し、そしてEPR-1 の選択されたモノクローナル抗体がＴ細胞受容体介在性の 正常なin vitroリンパ球増殖を完全に無効にする。EPR-1 はCLL 中の潜在的な病 態生理学上妥当な新規な細胞マーカーであり、かつ正常なリンパ球及び白血病性 リンパ球中の成長関連シグナリングにかかわる分裂受容体の従来認められていな いクラスの一員であることが今提案される。 こうして、一局面において、本発明は細胞受容体分子の新規なクラスに関する 。受容体分子は或る種の凝固コファクター、例えば、ヒト凝固因子Ｖ及びVIIIと 相同性の領域を共有する。機能上、受容体分子はセリンプロテアーゼリガンド、 例えば、循環タンパク質因子Xa、因子IX/IXa及びプラスミン（プラスミノゲン） を結合する。本明細書中EPR-1 と称される好ましい受容体分子はヒト因子Ｖに大 いに相同性であるが、それとは異なり、又因子Xaに結合することができる。EPR- 1 に相同のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドが又意図されている。 それ故、一実施態様において、本発明は図1A及び1Bに示され、かつ本明細書中 配列番号２として同定されるアミノ酸残基配列を有するEPR-1 タンパク質を意図 している。別の実施態様において、EPR-1 タンパク質は2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる群から選ばれたハイブリドーマにより分泌され た抗体と免疫反応することができる。別の実施態様において、EPR-1 タンパク質 は12H1、9D4 、7G12、及び13E5からなる群から選ばれたハイブリドーマにより分 泌された抗体と免疫反応することができる。更に別の実施態様において、そのタ ンパク質はTHP-1 、好中球、NK細胞、及びMOLT13からなる群から選ばれた細胞系 から単離される。 又、本発明は一種以上のそのシーケンシャルサブセットを含むEPR-1 タンパク 質又はポリペプチドを意図している。一実施態様において、EPR-1 ポリペプチド 又はタンパク質は配列番号２の残基番号48〜76に相当するアミノ酸残基配列を含 み、これは式ADCVSPPCGERDRCEGWADRHTACSSPAS により表される。別の実施態様に おいて、EPR-1 ポリペプチド又はタンパク質は式ADCVSPPCGERDRCEGWADRHTACSSPA Sにより表される配列に少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、更に好ま しくは少なくとも90％相同のアミノ酸残基配列を含む。 一実施態様において、タンパク質又はポリペプチドはMOLT13細胞系から単離さ れる。別の実施態様において、MOLT13細胞系はATCC受理番号CRL 10638 を有する MOLT13 #3 細胞系を含む。 本発明のEPR-1 タンパク質又はポリペプチドは組換え手段により調製し得るこ とが更に意図されている。一実施態様において、そのタンパク質は発現ベクター でトランスフェクトされた真核細胞中で発現される。例えば、一つの変化におい て、そのタンパク質は配列番号２のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を 含むプラスミドでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細 胞中で発現される。別の変化において、そのヌクレオチド配列は配列番号１に少 なくとも75％相同である。更に別の変化において、本発明のEPR-1 タンパク質を コードするヌクレオチド配列は本明細書中配列番号１と同定される配列である。 又、本発明は本明細書中配列番号２と同定されるアミノ酸残基配列に少なくと も75％相同のアミノ酸残基配列を有するEPR-1 タンパク質分子を意図している。 一実施態様において、EPR-1 タンパク質は因子Xaを結合することができる。 また、EPR-1 ポリペプチドが本明細書中に意図されている。種々の実施態様に おいて、EPR-1 ポリペプチドは一種以上の免疫反応性エピトープを含む。別の変 化において、本発明のポリペプチドは2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及 び6F1 からなる群から選ばれたハイブリドーマにより分泌された抗体と免疫反応 することができる。別の実施態様において、EPR-1 ポリペプチドは12H1、9D4 、 7G12、及び13E5からなる群から選ばれたハイブリドーマにより分泌された抗体と 免疫反応することができる。種々の好ましい実施態様において、抗体はモノクロ ーナルである。一実施態様において、EPR-1 ポリペプチドは下記の式により表さ れるアミノ酸残基配列を有する。 別の実施態様において、EPR-1 ポリペプチドはハイブリドーマ2E1 により分泌 された抗体と免疫反応することができる。別の変化において、ポリペプチドは式 により表されるアミノ酸残基配列に少なくとも75％相同のアミノ酸残基配列を有 する。 又、本発明はリンパ球増殖を抑制することができる合成の無毒性生物活性分子 を意図しており、これらの分子はEPR-1 に結合することができ、かつ2E1 、2C11 、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる群から選ばれたハイブリドーマに より分泌された抗体の免疫抑制効果を再生することができる。好ましい実施態様 において、これらの分子はEPR-1 に結合することができ、かつハイブリドーマ2E 1 により分泌された抗体の免疫抑制効果を再生することができる。 別の実施態様において、本発明は本明細書中配列番号２と同定されたアミノ酸 残基配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸分子を意図している。 種々の実施態様において、その核酸はＲＮＡ、ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせ を含む。一つの好ましい実施態様において、本発明の核酸分子は図1A及び1Bに示 され、かつ本明細書中配列番号１として同定されたデオキシリボヌクレオチド配 列を含む。別の変化において、本発明の核酸分子は組換え体である。 種々のその他の実施態様において、本発明の核酸分子は本明細書に開示された EPR-1 タンパク質のシーケンシャルサブセットを含む一種以上のポリペプチドを コードする。一つの変化において、本明細書に記載された核酸分子は配列番号２ の残基番号48〜76に相当するアミノ酸残基配列を含むEPR-1 ポリペプチド又はタ ンパク質をコードし、これらは式ADCVSPPCGERDRCEGWADRHTACSSPAS により表され る。別の変化において、核酸配列は式ADCVSPPCGERDRCEGWADRHTACSSPAS により表 される配列に少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、更に好ましくは少な くとも90％相同のアミノ酸残基配列を有するEPR-1 ポリペプチド又はタンパク質 をコードする。 又、本発明はEPR-1 ポリペプチド又はタンパク質と免疫反応することができる が、因子Ｘと免疫反応しない抗体結合部位を含む免疫活性分子を意図している。 種々の実施態様において、免疫活性分子はFab 、Fab'、F(ab')₂及びFvからなる 群から選ばれたものを含む、抗体分子又はその断片を含んでもよい。別の実施態 様において、免疫活性分子は抗体結合部位を含む。 その他の変化において、本発明の抗体結合部位は2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G 8 、3G10、及び6F1 からなる群から選ばれたハイブリドーマにより生じられる。 別の局面において、ハイブリドーマは12H1、7G12、9D4 、7G12、及び13E5からな る群から選ばれる。 種々の実施態様において、免疫活性分子はモノクローナル抗体又はその断片を 含む。その他の実施態様において、免疫活性分子はタンパク質と免疫反応するこ とができ、ATCC受理番号CRL 10638 を有するMOLT13 #3 細胞系から単離される。 又、本発明はEPR-1 に結合する治療有効量の免疫活性分子を個体に投与するこ とを特徴とする治療を要する個体中の抗原特異性Ｔ細胞増殖の抑制方法を意図し ている。一実施態様において、EPR-1 は膜結合される。別の実施態様において、 EPR-1 は細胞膜を含まず（即ち、可溶性形態であり）、又は単離形態及び／又は 精製形態である。 別の実施態様において、本発明は、EPR-1 と免疫反応する治療有効量の免疫活 性分子を個体に投与することを特徴とする、不可逆の全身性免疫抑制効果を誘発 しないで所定の時間の長さにわたって個体中の免疫応答性を阻止する方法を意図 している。一実施態様において、EPR-1 は膜結合される。別の実施態様において 、EPR-1 は細胞膜を含まず（即ち、可溶性形態であり）、又は単離形態及び／又 は精製形態である。 本明細書に開示された全ての種々の方法において、免疫活性分子は抗体分子又 はその断片を含み、抗体分子又は断片は抗体結合部位を含む。別の変化において 、抗体断片はFab 、Fab'、F(ab')₂及びFvからなる群から選ばれる。更に、本発 明は、抗体結合部位が2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる 群から選ばれたハイブリドーマにより生じられることを意図している。別の変化 において、抗体結合部位は7G12、12H1、9D4 、及び13E5からなる群から選ばれた ハイブリドーマにより生じられる。種々の好ましい実施態様において、抗体結合 部位はモノクローナルである。 又、本発明はリンパ増殖性疾患の特性決定に有益な診断方法を意図しており、 その方法は(a)個体から細胞を含む血液試料を得、(b)その試料をEPR-1 と免疫反 応することができる免疫活性分子と混合し、(c)その混合物をEPR-1 を発現する 細胞が免疫活性分子と免疫反応して免疫複合体を生成するのに充分な期間にわた って生物学的アッセイ条件下に保ち、(d)免疫複合体を混合物中に存在する未反 応の免疫活性分子から分離し、そして(e)それにより生成された免疫反応生成物 の存在を測定する諸工程を含む。 前記方法は工程(e)で検出された生成物の量を細胞により発現されたEPR-1 の 量と相関させる工程を更に含んでいてもよい。一つの変化において、免疫活性分 子は標識されてもよい。更に別の変化において、その疾患は慢性リンパ性白血病 (CLL)又はEPR-1 ⁺ 型有毛状細胞性白血病(HCL)である。 若干異なる状態において、本発明は有効量のEPR-1 リガンドの投与を特徴とす る、リンパ球増殖の誘発方法を又意図している。一実施態様において、そのリガ ンドは因子Xa又は因子Xa同族体を含む。別の実施態様において、そのリガンドは 可溶性分子、細胞関連分子、サイトカイン類、及びリンパ球同時刺激物質からな る群から選ばれる。 別の局面において、本発明はクローン型Ｔリンパ球増殖を抑制し、かつＴリン パ球の異常な膨張及び／又は反応性を阻止する強力な免疫抑制剤を開示する。開 示された範囲内の新規薬剤は特異な選択性を有し、即ち、それらはＴ細胞受容体 と直接相互作用せず、こうしてＴ細胞機能の付加的な乱れのリスクを低減するこ とが明らかである。このような薬剤は標的免疫抑制を必要とするあらゆる症状、 例えば、二三の例を挙げると、自己免疫障害、糖尿病、移植片絶、及び造血（リ ンパ球）悪性腫瘍に潜在的に有益である。 本発明の好ましい実施態様は約62〜74 kDaの相対分子量を有する精製タンパク 質を含み、更に図1A及び1Bに示されたアミノ酸残基配列（配列番号２）を含んで いてもよい。別の実施態様において、精製タンパク質は、それが精製される細胞 系及びその分子のグリコシル化の程度に応じて、62〜74 kDaの範囲内の相対分子 量を有する。例えば、単核細胞から誘導されたEPR-1 タンパク質は約62 kDaの相 対分子量を有してもよく、一方、THP-1 細胞から誘導されたEPR-1 タンパク質は 約74 kDaの相対分子量を有してもよい。 又、本発明は本明細書中配列番号２として同定されたEPR-1 タンパク質に少な くとも75％相同、好ましくは80％相同、更に好ましくは少なくとも85％相同、更 に好ましくは少なくとも90％相同であるEPR-1 活性を有するタンパク質又はポリ ペプチドを意図している。又、本発明は配列番号１に実質的に相同のヌクレオチ ド分子によりコードされたタンパク質及びポリペプチドを意図している。 本発明の別の局面において、本発明のEPR-1タンパク質は本発明の抗体と免疫 反応する。一実施態様において、その抗体は12H1(ATCC受理番号HB 10637)と称さ れるハイブリドーマにより産生される。別の実施態様において、その抗体は2E1 と称されるハイブリドーマにより産生される。本発明の更に別の局面において、 そのタンパク質はMOLT13 #3(ATCC受理番号CRL 10638)と称される細胞系から単離 されたEPR-1 タンパク質である。別の変化は、EPR-1 タンパク質が配列番号２に 実質的に相同のアミノ酸残基配列を有することを意図している。 又、本発明は本明細書中配列番号２として同定されたアミノ酸残基配列をコー ドするＤＮＡ分子を意図している。好ましいＤＮＡ分子が図1A及び1Bに示され、 そこに（本明細書中）配列番号１として同定される。 又、先に特定されたタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡセグメン ト及びそのＤＮＡセグメントを含むベクター、即ち、自己複製ＤＮＡ分子が本発 明により意図される。 細胞表面におけるEPR-1 受容体分子の存在に関すアッセイ方法が又意図される 。その方法は、 (a)その受容体分子を発現すると思われる細胞又は細胞溶解産物を前記抗体組 成物、例えば、ハイブリドーマ12H1と混合し、 (b)免疫反応生成物を生成するのに充分な時間にわたってその混合物を維持し 、そして (c)免疫反応生成物を測定し、それにより受容体分子の存在を検出する諸工程 を含む。 更に、本発明は本発明の化合物及び組成物を含む有益な医薬品の製造方法を含 む。例えば、本発明は、EPR-1 と免疫反応する治療有効量の免疫活性分子を医薬 上許される担体又は賦形剤と混合することを特徴とする、治療を要する個体中の 抗原特異性Ｔ細胞増殖を抑制するのに有益な医薬品の製造方法を開示する。一つ の変化において、免疫活性分子は2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F 1 からなる群から選ばれたハイブリドーマにより生じた抗体結合部位を含む。そ の他の実施態様において、その分子は抗体分子又はその断片を含む。抗体断片は Fab 、Fab'、F(ab')₂及びFvからなる群から選ばれてもよい。 又、記載されたタンパク質又はポリペプチドの範囲内の一つと関連する疾患を 有する患者の治療に対する応答の監視方法が意図されており、これらのタンパク 質又はポリペプチドは患者から採取された生体試料中に存在する細胞に局在化さ れ、かつその症状のマーカーとして有益である。その方法は本明細書に記載され たような抗体組成物を使用してそのマーカーについて分析し、治療の経過後にそ のアッセイを繰り返し、そして治療後に存在する細胞表面タンパク質の量の関数 として治療に対する患者の応答を測定することを含む。本発明に従って監視し得 る例示の症状は慢性リンパ性白血病(CLL)である。 図面の簡単な説明 図1A及び1BはEPR-1 ｃＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳を示す。 図2A、2B及び2Cは第一世代モノクローナル抗体及び第二世代モノクローナル抗 体を使用するEPR-1 の特性決定を示す。図2Aにおいて、EPR-1(Mr 約62kDa)がmAb 12H1を使用してMOLT13リンパ球抽出物からアフィニティー精製され、非還元条 件下で単一ウェル7.5 ％SDS ポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動され、ク ーマシーブルーで染色された。図2Bにおいて、図2Aに示された免疫精製されたEP R-1 がイモビロン膜に対し電気ブロットされ、スロットブロッター装置中で示さ れた抗MOLT13ハイブリドーマとともにインキュベートされ、続いて¹²⁵I-F(ab')₂ ヤギ抗マIgG とともにインキュベートされ、オートラジオグラフィーにかけられ た。図2Cにおいて、¹²⁵I表面標識PBMC抽出物が図2Bに示された陽性抗MOLT13ハイ ブリドーマ(mAb 2E1、レーン１)、又は対照mAb 6B4(レーン２)で免疫沈殿された 。MW、相対分子量マーカー(X 10 ^-3)。 図3A及び3BはEPR-1 ｃＤＮＡの哺乳類細胞発現を示す。完全長EPR-1 ｃＤＮＡ が哺乳類細胞発現ベクターpRC/CMV(インビトロゲン、サンジエゴ、CA)に挿入さ れ、配向され、そしてエレクトロポレーションによりチャイニーズハムスター卵 巣(CHO)細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの48時間後に、C HO 細胞が15倍に希釈され、0.7mg/mlのゲネチシン(G418 、ギブコ、グランドア イランド、NY)で補給されたDMEM（ウィッテーカー）選択培地中で培養された。D MEM/ ゲネチシン選択培地中の２週間の培養後に、野生型(WT)CHO 細胞又はEPR-1 トランスフェクタントが回収され、フローサイトメトリーにより抗EPR-1 mAb 12H1又は2E1 とのそれらの反応性について分析された。 図4AはEPR-1 に結合するリガンドがリンパ球増殖を誘発することを示す。³HTd Rとり込み(cpm X 10 ^-3)により測定されたリンパ球増殖が垂直の軸にプロットさ れ、一方、タンパク質濃度（μg/ml）が水平の軸にプロットされる。EPR-1 ⁺ MO LT13リンパ球の懸濁液が血清飢餓条件(0.5％のウシ胎児血清(FCS))のもとに48時 間のインキュベーションにより成長停止された。静止状態のMOLT13細胞の三重培 養物が次第に増大する濃度（0.01〜１μg/ml）の天然EPR-1 リガンド因子Xa（閉 じた円）、対照タンパク質ミオグロビン（閉じた四角）、又は10％のFCS(閉じた 三角)で３日間にわたって37℃でRPMI 1640 培地（ウィッテーカー）＋0.5 ％のF CS 中で培養された。１μCi/ ウェルの³HTdR による12時間のパルス後に、ウェ ルが回収され、そして種々の条件下でとり込まれた放射能がシンチレーションβ カウンターで定量化された。データ±S.E.M.は少なくとも２回の独立の実験を表 す。 図4Bは抗体EPR-1 mAb 2E1 が抗原特異性Ｔ細胞増殖を抑制することを示す。³ HTdR とり込み(cpm X 10 ^-3)の測定により示されるようなリンパ球増殖が垂直 の軸にプロットされ、一方、mAb 濃度（μg/ml）が水平の軸に示される。1640培 地0.5 ％のFCS中の末梢血単核細胞(PBMC)の三重培養物が96ウェル・ミクロタイ タ・プレート(3x10⁵/ ウェル)中にセットされ、示された次第に増大する濃度の 抗EPR-1 mAb 2E1（閉じた円）又は対照mAb 6B4(閉じた三角)とともに30分間にわ たって37℃でプレインキュベートされた。細胞が１μg/mlの分裂促進抗CD3 mAbO KT3で刺激され、３日間にわたって37℃で培養された。リンパ球増殖がＡに記載 されたようにして１μCi/ウェルの³HTdR による12時間のパルス後に定量化され た。mAb OKT3を使用しない未刺激培養物中の³HTdR とり込みは353 ±65 cpm(n=3 )であった。データが３回の独立の実験の平均±S.E.M.として表される。 図5A及び5Bはトランスフェクトされた細胞中のEPR-1 機能を示す。図5Aにおい て、野生型(WT)CHO細胞（閉じた四角）又はEPR-1 CHOトランスフェクタント（閉 じた円）が次第に増大する濃度の¹²⁵I- 因子Xa(0.45-36nM)で15分間にわたって2 2℃で2.5 mMのCaCl₂ の存在下でインキュベートされた。非特異的結合が50倍モ ル過剰の未標識因子Xaの存在下で分析され、そして合計から引かれて正味の 特異的結合を計算した。データは２回の独立の実験の平均±S.E.M.である。EPR- 1 CHOトランスフェクタントに飽和(27nM)で結合された¹²⁵I- 因子Xaは729,000 ±102,000 分子／細胞に相当した。 図5Bにおいて、1 X 10⁵/mlのWT CHO細胞又はEPR-1 CHOトランスフェクタント が示された次第に増大する濃度の因子Xa、10μg/mlのプロトロンビン、及び2.5m MのCaCl₂ とともに５分間にわたって22℃でプレインキュベートされた。抗EPR-1 mAb 9D4（Altieriら，上記文献(1990)）の存在下又は不在下のトロンビン形成 がAltieri ら，上記文献(1989)により記載されたような感受性クロッティングア ッセイにより分析された。データが２回の独立の実験の平均±S.E.M.として表さ れる。 図６は破傷風トキソイドを使用するin vitro研究の結果を示す。ヒト免疫グロ ブリン(Ig)レベル（μg/ml）が垂直軸に表され、一方、日数が水平軸に示される 。huSCIDマウスの破傷風トキソイド応答及びin vitroのそれに関するmAb 2E1 の 効果は以下に示される。対照（暗色のバー）及び9D4 を投与されたもの（クロス ハッチ付きのバー）は強い応答を与えることが明らかに示され、一方、ヒトIgレ ベルは2E1 を投与されたhuSCIDマウスではごくわずかである（灰色のバー又は縞 のあるバー）。 図７はin vivo 破傷風トキソイド研究の結果を示す。ヒト免疫グロブリン(Ig) レベル（μg/ml）が垂直軸に表され、一方、日数が水平軸に示される。huSCIDマ ウスの破傷風トキソイド応答及びin vivo のそれに関するmAb 2E1 の効果は以下 に示される。対照（暗色のバー）及び9D4 を投与されたもの（クロスハッチ付き のバー）は強い応答を与えることが明らかに示され、一方、ヒトIgレベルは2E1 を投与されたhuSCIDマウスではごくわずかである（灰色のバー又は縞のあるバー ）。 図8A-Cは抗EPR-1 モノクローナル抗体2E1 によるＴ細胞増殖の抑制を示す。全 ての三つの図面において、³H-TdR摂取(cpm、垂直軸)が抗体濃度（μg/ml、水平 軸）に対しプロットされる。図8Aにおいて、１μg/mlの可溶性OKT3がＴ細胞応答 を活性化するのに使用される。次第に増加する量の抗EPR-1 抗体2E1(閉じた四角 )及びmIgG（マウスIgG 、開いた四角）が水平軸に示されたように刺激された細 胞に添加され（Ab濃度、μg/ml）、そして³H-TdR摂取(cpm)が測定された。 図8Bにおいて、0.5 μg/ウェルの固定化OKT3がＴ細胞応答を活性化するのに使 用された。次第に増加する量の2E1(閉じた四角)及びmIgG（開いた四角）が水平 軸に示されたように刺激された細胞に添加され、そして³H-TdR摂取(cpm)が測定 された。 図8Cにおいて、混合リンパ球培養物(mlc)が使用された。（MLC は一般に同種 反応性である。何となれば、このような培養物中の非適合性細胞は互いに活性化 するからである）。種々の濃度のmOKT4a（閉じた三角）、2E1(閉じた四角)及びm IgG（開いた四角）が水平軸に示されたように添加され、そして³H-TdR摂取が測 定された。 図9AはPHA で刺激された細胞中のポリクローナルＴ細胞増殖に関するmAb 2E1 の投与の効果を示す。対照抗体6B4(閉じた円)及び抗EPR-1 抗体2E1(開いた円)が 約６μg/mlから約50μg/mlまで変化する量で投与された。抗体濃度（μg/ml）が 水平軸にプロットされ、³H-TdRとり込み(cpm X 10 ^-3)が垂直軸に示される。 図9BはConAで刺激された細胞中のポリクローナルＴ細胞増殖に関するmAb 2E1 の投与の効果を示す。対照抗体6B4(閉じた円)及び抗EPR-1 抗体2E1(開いた円)が 約６μg/mlから約50μg/mlまで変化する量で投与された。抗体濃度（μg/ml）が 水平軸にプロットされ、³H-TdRとり込み(cpm X 10 ^-3)が垂直軸に示される。 図10は、抗体EPR-1 モノクローナル抗体が、それが投与される細胞に対し非致 死性であることを示す。逆に、その抗体の抑制性は示されるように可逆性である 。抗体希釈（水平軸）及び³H-TdRとり込み（垂直軸）が記載されたプロトコルに 従って測定される。細胞がOKT3+PMA+2E1（閉じた逆三角形）；OKT3+PMA(閉じた 三角); OKT3 単独(閉じた四角); OKT3+2E1（閉じた円）；又はPMA 単独（開いた 三角）が、バックグラウンド（BKG 、開いた円）と同様に示される。 図11A 、11B 、及び12は2E1 がIL-2受容体発現及びIL-2生成を抑制することを 示す。IL-2濃度がOKT3刺激の24時間、48時間そして72時間後に本明細書に記載さ れたようにして分析された。24時間後に、少量のIL-2が示されるように2E1 投与 後に上澄み中で検出され、一方、かなりの量のIL-2が全てのその他のOKT3刺激ウ ェル中に存在した。図11A 及びB において、IL-2濃度(pg/ml)が垂直軸に示され る。IL-2生成が24時間後に測定された。水平軸に示されたバーは、無OKT3、OKT3 、 OKT3+2E1、OKT3+ マウスIgG 、及びOKT3（1ng/ml）が投与された時の結果を表す 。図11B は無OKT3（開いた四角）；OKT3（大きい閉じた四角）；OKT3+2E1（閉じ た三角）；OKT3+ マウスIgG2a(閉じた円)；及びOKT3（1ng/mlのみ；小さい閉じ た四角）を収容するウェル中の24時間、48時間、そして72時間の時点のIL-2速度 論を示す（水平軸）。（全てのデータ点で、投与されたOKT3の量は、特に示され ない限り１μg/mlであった）。 図12A 及びB はIL-2受容体(p55)発現が又2E1 を収容するOKT3刺激ウェル中で 減少されることを示す。図12A において、平均チャンバー数（垂直軸）が時間（ ０〜96）に対してプロットされ、読みが24時間、48時間、そして72時間に読み取 られる。図12B において、IL-2R(IL-2受容体)陽性細胞の％（垂直軸）が、図12A のように、時間に対しプロットされる。図12A 及びB の両方において、データ 点が無OKT3（開いた四角）；OKT3（閉じた四角）；及びOKT3+2E1（閉じた三角） を受ける細胞について示される。（全てのデータ点で、投与されたOKT3の量は、 特に示された場合を除いて、１μg/mlであった）。 図13A 及びB は2E1 がOKT3刺激細胞中でTNF βの合成を抑制することを示す。 図13A において、TNF-β速度論が示される。TNF-β(pg/ml、垂直軸)が時間（水 平軸）に対しプロットされる。無OKT3（開いた四角）；OKT3(大きい閉じた四角) ;OKT3+2E1（閉じた三角）；OKT3+ マウスIgG2a(閉じた円)及びOKT3（1ng/mlのみ ；小さい閉じた四角）を受け取る細胞に関するデータが示される。（全てのデー タ点で、投与されたOKT3の量は、特に示された場合を除いて、１μg/mlであった ）。 図13B において、刺激の24時間後に測定されたTNF-βレベルが示される。垂直 軸に、TNF-β(pg/ml)が示される。垂直軸に、無OKT3、OKT3、OKT3+2E1、OKT3+マ ウスIgG2a 、及びOKT3（1ng/ml）を表すバーが示される。前記のように、特に示 された場合を除いて、１μg/mlのOKT3が刺激物質として投与された。 図14A 及びB は2E1 又はマウスIgG2a(対照抗体)を投与し、又投与しないで、O KT3刺激細胞及び未刺激細胞中の増殖(A)とIL-IB 合成(B)の比較を示す。図14A において、³H-TdR摂取(cpm)により測定されるような増殖が時間に対してプロッ トされる。OKT3（閉じた四角）、OKT3+ マウスIgG2a(閉じた円)、OKT3+2E1（閉 じた三角）、及び無OKT3（開いた四角）の投与の結果が示される。特に示さ れた場合を除いて、１μg/mlのOKT3が刺激物質として投与された。 図14B において、IL-1B 産生(pg/ml)が時間に対しプロットされる。OKT3(１μ g/ml、大きい閉じた四角);OKT3+ マウスIgG2a(閉じた円)；OKT3+2E1（閉じた三 角）；無OKT3（開いた四角）；及び１ng/ml のOKT3（小さい閉じた四角）の投与 の結果が示される。特に示された場合を除いて、１μg/mlのOKT3が刺激物質とし て投与された。 図15は、huSCIDマウスをリンパ腫から保護する際の食塩水、mAb 9D4、mAb 2E1 、及びマウスIgG を含む、種々の薬剤の有効性を示す。死亡率（％）が垂直軸に プロットされる。これらのバーはアール単独（食塩水）、mAb 9D4 、mAb 2E1 、 及びマウスIgG を受けるマウスを表す。 図16は因子XaによるPBMC増殖の刺激を示す。³H-TdRとり込み(cpm X 10 ^-3)が 垂直軸に示され、一方、タンパク質濃度(nM)が水平軸にプロットされる。因子Xa 及びPMA(閉じた円)、ATIII(抗トロンビンIII）及びPMA(閉じた四角)、因子Xa単 独（開いた円）及びPMA 単独（開いた三角）とともにインキュベートされた培養 物に関するデータが４回の独立の実験の平均±S.E.M.として表される。 図17はEPR-1 、因子Ｖ、及び因子VIIIc の間の相同性又は類似性の領域を示す 。箱形にされた領域は三つの配列の間のアミノ酸残基の同一性を示す。又、因子 ＶとVIIIc のみの間の保存置換、及び同一性の領域が同定されたが、その図には 現在示されない。 発明の詳細な説明 A.定義 アミノ酸残基配列 一連の２種以上のアミノ酸残基が隣接残基との間のペプチ ド結合を介して結合してペプチド又はポリペプチドを生成した。アミノ酸残基配 列はその構成アミノ酸に関する１文字略号又は３文字略号により都合良く表され る。アミノ酸について本明細書に使用される略号は37 C.F.R．§1.822(b)(2)に 示されたものであり、下記の対応表に再現される。 本明細書中アミノ酸残基配列を含む個々の残基は、所望の機能性がそのアミノ 酸残基標配列をとり込む一種以上の分子により保持される限りＤ異性体又はＬ異 性体であってもよい。又、アミノ酸残基配列は後翻訳修飾アミノ酸、例えば、ヒ ドロキシル化、グリコシル化されたアミノ酸残基、又はジスルフィド結合により 結合された残基を含んでいてもよい。加えて、アミノ酸残基配列は一種以上の修 飾アミノ酸又は格別のアミノ酸、例えば、37 C.F.R．§1.822(b)(4)(これらは参 考として本明細書に含まれる)にリストされたものを含み得る。アミノ酸残基配 列はその構成アミノ酸に相当する略号により表すことができ、この場合、二つの 隣接する略号の間のハイフンは相当する残基間のペプチド結合を示す。 抗体 ハプテン基、即ち、リガンドに化学結合するポリペプチド。本明細書に 使用される抗体という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免 疫活性断片を含む。Fab、Fab'、F(ab')₂及びFvの如き当業界で知られているタン パク質が含まれる。典型的には、抗体は約10⁴ 〜10¹⁰M ^-1の範囲、又10¹³M ^-1程 度に高い会合定数を有する約６〜約34Åのサイズの範囲であるリガンドを結合す る。抗体は、小分子、例えば、ステロイド類及びプロスタグランジン類、生物ポ リマー、例えば、核酸、タンパク質及び多糖、並びに合成ポリマー、例えば、ポ リプロピレンを含む広範囲のリガンドを結合し得る。“抗体結合部位”は抗原を 特異的に結合する（それと免疫反応する）Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域及び超可変領 域を含む抗体分子のその構造部分である。種々の形態の“免疫反応する”という 用語は本明細書中抗原決定基を含む分子（抗原）と全抗体分子又はその一部の如 き抗体結合部位を含む分子との結合を表すのに使用される。“抗原決定基”は抗 体結合部位により免疫結合される抗原の構造部分である。又、その用語は“エピ トープ”と互換可能に使用される。抗体は抗原の単一エピトープ（モノクローナ ル）又は多重エピトープ（ポリクローナル）を結合し得る。モノクローナル抗体 という用語は本明細書中mAb として略記し得る。 リガンド 通常、静電力及び／又は水素結合を介して、特別な受容体分子に特 異的に結合する構造領域を有する分子。 ペプチド／ポリペプチド ポリペプチド及びペプチドは本明細書中隣接する残 基のα−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合により互いに連結された一 連の少なくとも二つ、一般に約50未満のアミノ酸残基を表すのに互換可能に使用 される用語である。ポリペプチドの一次構造はそのポリマーの一つの末端に一級 アミノ酸基そして他の末端にカルボン酸基を有する。こうして、ポリペプチドは 式： （式中、Ｒは所定のアミノ酸残基の特徴的な側鎖であり、かつｉはそのポリマー を構成するアミノ酸残基の数を示し、その数は２以上である） により表し得る。ポリペプチドは一種以上のアミノ酸残基配列を含み得る。又、 水溶液中のポリペプチドはその溶液のpHに応じて通常一種以上の双性イオン形態 である。 タンパク質 ポリペプチドのように互いに連結された一般に約50より多いアミ ノ酸残基を含む単一ポリペプチド又は架橋されたポリペプチドの組。タンパク質 は同じポリペプチド鎖内又は隣接するポリペプチド間に、例えば、ジスルフィド ブリッジによる化学架橋を有し得る。タンパク質はグリコシル化されてもよく、 その場合、それらは糖タンパク質と称される。 受容体 受容体及び受容体タンパク質はその他の分子（例えば、リガンド）に 特異的に結合する生物活性タンパク質分子を示すのに本明細書中で使用される用 語である。 実質的に相同は、特別な主題配列又は分子、例えば、変異体配列が一つ以上の 置換、欠失、又は付加により基準配列から変化することを意味し、その正味の効 果は基準配列と主題配列の間に不利な機能非類似性をもたらさない。本発明の目 的のために、75％より大きい類似性、好ましくは80％より大きい類似性、更に好 ましくは90％より大きい類似性、均等な生物活性、及び均等な発現特性を有する アミノ酸配列が実質的に相同と考えられ、そして“セリンプロテアーゼ受容体” 、“EPR-1”、及び“EPR-1 ペプチド又はポリペプチド”という用語により特定 されたタンパク質の範囲内に含まれる。40％より大きい類似性を有するアミノ酸 配列が実質的に類似と考えられる。相同性又は類似性を決定する目的のために、 基準配列のトランケーション又は内部欠失は無視されるべきであり、同様にその 分子のその後の修飾、例えば、グリコシル化が無視されるべきである。小さい程 度の 相同性及び匹敵する生物活性を有する配列が均等物と考えられる。同様に、本明 細書中配列番号１として同定されたヌクレオチド配列に少なくとも75％相同のヌ クレオチド配列が実質的に相同と考えられる。 B.EPR-1 図1A及び1BはEPR-1 ｃＤＮＡ配列及びタンパク質翻訳を示す。使用された方法 は実質的に下記のとおりであった。完全長EPR-1 ｃＤＮＡクローンが高ストリン ジェンシー（65℃、5X SSC）でプローブとしてλ104 を使用して下記のヒトｃＤ ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離された。λgt11 MLT、λ gt10 HEL（赤白血病細胞）、λgt11 HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）、及びpcDNAI I ダウジ（インビトロゲン、サンジエゴ、CA）。合計28の独立のクローンが単離 され、プラーク精製され、pBSKS ^- 中でサブクローン化され（pcDNAII からのク ローンを除いて）、そして制限分析により特性決定された。ＤＮＡ配列決定はシ ーケナーゼ(USB、クレーブランド、OH)を使用してエキスヌクレアーゼIII（プロ メガ、マジソン、WI）で生じたネステッド(nested)欠失の両方のストランドにつ いて行われた。 EPR-1 をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、新規なmAb パネルが EPR-1 ⁺ 細胞系MOLT13に対して産生された。パネルからのmAb のうちの７種がフ ローサイトメトリー（示されていない）により測定してMOLT13細胞と反応し、ウ ェスタンブロットにおいてアフィニティー精製EPR-1 に強く結合した（図2A及び 2B）。それらのうちの一種である2E1 が更なる研究のために選択された。モノク ローナル抗体2E1 は¹²⁵I表面標識PBMC抽出物からEPR-1 を免疫沈殿した（図2C） 。 THP-1 細胞から既に分解されたブロードMr約74kDa バンドとは反対に、PBMC抽 出物から単離されたEPR-1 はMr約62kDa の更にシャープなバンドとして現れた（ 図２）。この見掛の分子不均一性が更に研究された。先の観察(Altieriら，上記 文献(1989))と一致して、mAb 2E1 はEPR-1 を¹²⁵I表面標識THP-1 細胞からブロ ードMr約74kDa バンドとして免疫沈殿し（図２）、同実験条件下で第一世代抗EP R-1 mAb 12H1及び13E5により免疫沈殿されたバンドとは分子量及び構造編成につ いて区別できなかった（図２）。そのデータはEPR-1 に関するmAb 2E1 の認識を 確認し（図２）、そしてPBMC細胞とTHP-1 細胞の間のEPR-1 Mrの変化が受容体 グリコシル化における細胞特異性の相違を反映し得ることを示唆した（下記を参 照のこと）。最初の抗EPR-1 mAb パネル(Altieriら，上記文献(1989))と変化し て、mAb 2E1 はTHP-1 細胞に関してプロトロンビン活性化をごくわずかに抑制し （示されていない）、こうして異なるエピトープ認識を示した。 これらのmAb の一種(2E1)によるヒトリンパ球発現ライブラリー（λgt11 ｃＤ ＮＡライブラリー）の免疫スクリーニングは種々の造血EPR-1 ⁺ 細胞系から抽出 されたＲＮＡ中で1.9 Kbのメッセージでノーザンブロット中でハイブリッドを形 成する単一陽性クローン(λ104)を生じた。完全長EPR-1 クローンが、プローブ としてλ104 を使用してヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに より単離された。 28の独立クローンから演鐸されたコンセンサスEPR-1 ｃＤＮＡ配列は1,165 bp の長さであり、かつ36 bp 5'未翻訳領域及び115 bp 3’未翻訳領域を含む（図1A 及び1B）。開始メチオニンは真核生物中の翻訳の開始のためのコザックのコンセ ンサス(CCGSGATG)(Kozak,M．Nucleic Acids Res．12: 857-870(1984)を参照のこ と)に良く合致するモチーフにより先行される最初のインーフレーム(in-fra-me) ATGに帰属された。インーフレームTGA 終止コドンは推定開始ATG の33 bp 上流 に見られる（図1A）。予想されたタンパク質翻訳の分析は、EPR-1 タンパク質が 異常に塩基性であり(pI=11.6)、かつ36,822の推定分子量を有する337 アミノ酸 残基からなることを明らかにする。位置168 及び265 にある二つのＮ連結グリコ シル化部位（図1A及び1B）の他に、位置２、76、170 、及び174 に４つのＯ連結 グリコシル化部位、十位置204 にコンドロイチンスルフェート付着部位があり、 これらは一緒になって付加的な炭水化物鎖に固定を与えて62〜74 kDaのEPR-1 相 対分子量(Mr)の細胞特異性変化の原因であり得る（上記を参照のこと）。 開始メチオニンの後の最初の100 アミノ酸残基はmAb 2E1 免疫反応性エピトー プ（残基48〜76にマッピングされる）を含み、かつ特異なシステインに富むモジ ュールを特徴とし、続いて高度に帯電され、かつ表面露出された領域(残基125〜 150)、続いて26疎水性アミノ酸の推定膜スパンドメインを含む（図1A及び1B）。 EPR-1 に関するmAb 2E1 エピトープは下記のアミノ酸残基（１文字フォーマット を使用する）を含む。 81アミノ酸の長さのEPR-1 細胞質テールはセリン残基（26％）に非常に富み、 かつタンパク質キナーゼＣ、cAMP依存性キナーゼ、成長関連ヒストンキナーゼ、 及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ(Pearsonら，Methods Enzymol．200: 62-8 1(1991))に関してコンセンサス配列を含む少なくとも15の潜在的なセリン／スレ オニンリン酸化部位を含む（図１）。 EPR-1 としてのクローン化ｃＤＮＡの真正（Altieri ら，上記文献(1989); Al tieri ら，上記文献(1990); Worfolk ら，上記文献(1992)）が、二つの独立の実 験アプローチを使用して実証された。第一に、EPR-1 ｃＤＮＡで安定にトランス フェクトされたCHO 細胞はフローサイトメトリーにより抗EPR-1 mAb 12H1及び2E 1 の両方の世代と強く反応した(図3A及びB)。又、これらのデータは、たとえそ の他の分泌され、膜固定されたタンパク質(Rapoport，Crit.Rev.Biochem．20:73 -137(1986))と同様に、疎水性アミノ末端リーダー配列がEPR-1 配列から明らか ではないとしても、その分子の予想された膜配向（外部にmAb 2E1 エピトープ） を確認する（図1A及び1B）。 定量的研究は、EPR-1 ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたCHO 細胞がTH P 及びMOLT13の如きEPR-1 ⁺ 細胞系よりもかなり大きいレベルのEPR-1 を発現す ることを確認した。一般に、EPR- 1発現はトランスフェクトされたCHO 細胞中で ５倍高かった（データは示されていない）。 第二に、EPR-1 バクテリア融合タンパク質(bp248-1211)に対して生じたウサギ ポリクローナル抗体はEPR-1 をPBMC抽出物から主要Mr約62kDa バンドとして免疫 ブロットし、一方、特定のバンドが同実験条件下で前免疫血清により検出されな かった（データは示されていない）。 本発明者らの先の研究(Altieriら，上記文献(1989); Altieri ら，上記文献(1 990))において仮定された因子Xaに関するEPR-1 認識が、遺伝子操作されたトラ ンスフェクタントを使用して立証された。¹²⁵I- 因子XaとWT CHO細胞の特定の相 互作用が示されなかったが（図5A）、EPR-1 CHO トランスフェクタントは80ng因 子Xa/10⁶の細胞の最高の会合により、約10〜15nMの見掛Kdにより調節された特 定かつ飽和の反応で¹²⁵I- 因子Xaを結合した（図5A）。これらの実験条件下かつ 外在性因子V/Vaの不在下で、EPR-1 CHO トランスフェクタントは因子Xa濃度依存 様式でプロトロンビン活性化を促進したが（図5B）、因子V/Vaとのプロトロンビ ナーゼ複合体の膜集合により媒介された反応(Tracyら，J.Biol.Chem．260:2119- 2124(1985))と較べて定量的かつ速度論的に有効ではない反応で促進したことが 明らかであった。最後に、抗EPR-1 mAb 9D4 と一緒のEPR-1 CHO トランスフェク タントのプレインキュベーションは、先の観察(Altieriら，上記文献(1989)及び (1990))と一致して、¹²⁵I- 因子Xa結合及びプロトロンビン活性化を阻止した（ 図5A及び5Bを参照のこと）。 利用できるデータベースのコンピュータ・サーチはEPR-1 に相同の配列の制限 された証拠を明らかにした。EPR-1 、因子Ｖ、及び因子VIIIc のアミノ酸残基配 列の比較は、三つの分子により共有された相同領域の或る証拠を与える（図17を 参照のこと）。図17はEPR-1 、因子Ｖ、及び因子VIIIc の間の相同性又は類似性 の領域を示す。箱形にされた領域は三つの配列間のアミノ酸残基の同一性を示す 。因子Ｖ及び因子VIIIc のみの間の保存置換、及び同一性の領域が又同定された が、その図には現在示されていない。 こうして、抗体EPR-1 mAb の第一世代により示された因子V/Vaとの免疫交差反 応性(Altieriら，上記文献(1989))は共有された一種以上の不連続のエピトープ( Reeves ら，J.Clin.Invest．84: 562-567(1989))のそれらの認識、及び／又は共 通の一種以上の後翻訳成分(Hoffmanら，PNAS USA 84: 2523-2527(1987))を反映 したのかもしれない。この状況において、EPR-1 中の位置168-170 にあるＮ−及 びＯ−連結グリコシル化部位を包囲する10残基クラスターは、二つの炭水化物付 着部位を含む因子Ｖ配列残基818-829 と54％の同一性を共有する。 その他のプロテアーゼ受容体(Appellaら，上記文献(1987); Roldanら，EMBO J .9: 467-474(1990))について、E.coli細胞質テール中の多数の潜在的なリン酸化 部位は細胞内シグナル導入のプロテアーゼ依存性メカニズムにおけるこの分子の 可能な役割を示唆する。因子Xa結合がEPR-1 タンパク質分解及びトランケート活 性化受容体(Vu ら，上記文献(1991))の発生と関連するか否かは現在知られてい ない。この可能性はArg²²⁹ _-Thr²³⁰潜在的因子Xa開裂部位を含むEPR-1 細胞外ド メイン中の多数のタンパク質分解感受性部位について考慮されるべきであるが、 第一世代mAb 13E5によるEPR-1 の物理的占有は単一付着リンパ球中にシトゾルの 遊離［Ca²⁺］_i を増大するのに充分であった。EPR-1 リガンド認識の病態生理学 的妥当性は血管損傷及びアテローム性動脈硬化症の早期の分子イベントにおける その潜在的な関与にあるかもしれない。EPR-1 への因子Xa結合の結果として、局 所に生じたトロンビン又は因子Xaそれ自体(Gasicら，PNAS USA 89: 2317-2320(1 992))は血小板凝集及び分泌(Shuman，Ann.N.Y.Acad.Sci．485:349-368(1986))、 白血球走化性(Bar-Shavit ら，J.Cell.Biol．96: 282-285(1983))、及び平滑筋 細胞の増殖(Gasicら，上記文献(1992))を誘発し、こうしてアテローム性動脈硬 化症プラーク(Ross，Nature 362: 801-809(1993))の確立に寄与し得る。EPR-1 ｃＤＮＡ及びEPR-1 トランスフェクタントの利用可能性は因子Xa認識の分子要件 及びEPR-1 占有と関連する潜在的なシグナリング経路を解明することを助けるべ きである。 クローンλ104 は、抗EPR-1 mAb を使用してヒトリンパ球(MLT)λgt11ｃＤＮ Ａライブラリーの1 X 10⁶ IPTG誘導プラークの免疫スクリーニングから単離され た（データは示されていない）。免疫反応性クローンλ104 はプラーク精製され 、ｐブルースクリプト(pBSKS^-、ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA)のEcoRI 部位中 でサブクローン化され、そして制限消化により特性決定された。次いでそれはシ ーケナーゼ(USB、クレーブランド、OH)を使用するジデオキシチェインタミネー ター法により両方のストランドについて配列決定された。 EPR-1 に関するｃＤＮＡの分子クローニングは、特異なシステインに富む細胞 外モジュール及び多数の潜在的なセリン／スレオニンリン酸化部位を有する細胞 質ドメインを特徴とする新規なトランスメンブラン分子の配列を明らかにする。 EPR-1 はCLL 中の潜在的な病態生理学的妥当性の新規な細胞マーカー、かつ正 常なリンパ球及び白血病リンパ球中の成長関連シグナリングにかかわる分裂受容 体の従来認められていないクラスの一員であると本明細書中提案される。 先に注目されたように、本発明の好ましい実施態様において、EPR-1 タンパク 質は図1A及び1Bに示されたアミノ酸残基配列（配列番号２）を含むが、示された 配列の全部又は一部とかなりの相同性を共有するタンパク質及びポリペプチドが 又本発明により含まれることが理解されるべきである。特徴的に、そのタンパク 質は表面ヨウ素標識リンパ球又は炭水化物球抽出物からの免疫沈殿において分解 されるように、約62〜74 kDaの相対分子量を有する。 更に好ましい実施態様において、そのタンパク質はMOLT13 #3 と称される細胞 系から単離され、かつ約62〜74 kDaの相対分子量を有する。MOLT13 #3 細胞系は 1991年１月11日に米国、メリーランド、ロックビル、パークローン・ドライブ20 852 にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、 受理番号CRL 10638 を受けた。 本発明の別の実施態様において、そのタンパク質はヒト因子Ｘの或る抗血清だ けでなく、例えば、固定された精製ヒト因子Ｖによる免疫吸着によりその抗血清 から精製されたポリクローナル抗体と免疫反応性である。本発明の更なる局面に おいて、そのタンパク質はヒト因子VIIIの抗体と免疫反応する。それ故、本EPR タンパク質はヒト因子Ｖ又はVIIIタンパク質そのものではないが、それは因子Ｖ 及びVIIIの或るエピトープのリガンドと交差反応性であるエピトープを有する。 本発明の更に好ましい実施態様において、単離されたタンパク質は12H1と称さ れるハイブリドーマ（これは1991年１月11日にATCCに寄託され、名称ATCC HB 10 637 を与えられた）により産生された抗体の如き抗体と免疫反応する。その他の 好ましいハイブリドーマとして、2C11、2D4 、2E1 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F 1 と称されるものが挙げられる。ハイブリドーマ2E1 は1994年１月27日以前にAT CCに寄託され、名称ATCC HB 11536 を与えられた。 これらの寄託は本明細書に記載されたブダペスト条約の全ての適用条項に遵守 し、それに従って行われた。本発明の細胞系、ハイブリドーマ、及び抗体が以下 に更に記載される。 C.ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、クラス結合プロテアーゼリガンドの員として、エフ ェクター細胞プロテアーゼ受容体(EPR)と称される細胞表面受容体の新規なクラ スから誘導され、多くの型の炎症性エフェクター細胞に見られる傾向がある。こ のクラスの第一の員（EPR-1 ）はプロテアーゼリガンド（そのヒト因子Xaはプロ トタイプである）を結合するこが示される。 本発明のポリペプチドはアミノ酸残基配列中でEPR-1 の一種以上のアミノ酸残 基配列サブセットに相当する。更に、本発明のポリペプチドはヒト凝固因子Ｖの アミノ酸残基配列、又は因子Vaのアミノ酸残基配列と顕著な相同性を有し得る。 又、本発明のポリペプチドは因子VIIIのポリペプチド部分だけでなく、MFG E-8 (Stubbs ら，PNAS USA 87: 8417(1990))と称されるマウスタンパク質のポリペプ チドに対し配列の相同性を示す。しかしながら、本発明のポリペプチドは因子Ｖ 、Va、VIII、及びマウスMFG E-8 と同一ではなく、これらと区別できる。 又、本発明のポリペプチドはEPR-1 のmAb 2EI エピトープに相当するEPR-1 の 開始メチオニン後の最初の100 の残基内に含まれる29アミノ酸長さの領域(残基4 8-76)を含んでいてもよい。この29アミノ酸長さの領域は式： により表されるアミノ酸残基配列を含む。 又、このアミノ酸残基配列に相同のポリペプチドが有益であることが予測され る。相同ペプチドはmAb 2EI エピトープに少なくとも50％相同であることが好ま しい。それらは少なくとも75％相同であることが更に好ましく、それらは少なく とも85％相同であることが更に好ましく、それらは少なくとも90〜95％相同であ ることが最も好ましい。 別の実施態様において、本発明のポリペプチドはEPR-1 タンパク質のシーケン シャルサブセットを含むアミノ酸残基配列を有する。一つの変化において、その ポリペプチドは約62〜74 kDaの分子量を有するタンパク質である。又、そのポリ ペプチド又はタンパク質は抗EPR-1 抗体に結合することが好ましい。そのポリペ プチド又はタンパク質は配列番号２として本明細書に同定されたものに少なくと も75％相同のアミノ酸残基配列を有することが最も好ましい。更に好ましくは、 それらは配列番号２として本明細書に同定されたタンパク質に少なくとも85％相 同であり、更に好ましくは、それらは少なくとも90％相同であり、最も好ましく は、それらは少なくとも95％相同である。 シーケンシャルサブセットは、その用語が本明細書に使用されるように、更に 長いポリペプチド、タンパク質、又はヌクレオチド配列のサブセットを意味し、 この場合、更に大きい配列中のアミノ酸又はヌクレオチドの配列順序が保たれる 。 例えば、文字“ABCDEFGHIJKL”が配列を表す場合、そのシーケンシャルサブセッ トは“ABCDE”、“BCDEFGH”、“BCDEFGHIJKL”、“EFGH”、等を含むであろう 。 本発明のポリペプチドは本明細書中に記載された手段により種々の有益な抗体 を産生するのに使用し得る。更に、本発明のポリペプチドは競合アッセイ、例え ば、抗EPR-1 抗体に結合するのにEPR-1 と競合するのに使用し得る。又、本発明 のポリペプチドはEPR-1 の種々の部分又はそのエピトープに対し抗体（又はその 断片）を産生するのに使用し得る。 加えて、本発明のポリペプチドは、EPR-1 受容体分子が典型的に結合する受容 体（即ち、カウンター受容体）に結合し、又はそれを占有することによりＴ細胞 増殖を抑制又は中断するのに使用でき、即ち、このようなポリペプチドはカウン ター−受容体に結合するのにEPR-1 と競合するであろう。本明細書中で注目され たポリペプチドの種々の実用性は下記の説明から更に明らかになるであろう。 典型的には、本ポリペプチドはグリコシル化されず、即ち、それは通常のペプ チド合成技術により直接に、又は本発明の組換えＤＮＡ分子の原核生物宿主発現 により合成される。本発明の真核生物により生産されたポリペプチドは典型的に はグリコシル化される。 本ポリペプチドは、得られるポリペプチド分子が所望の性質を示す限り、種々 の変化、例えば、保存的又は非保存的であるアミノ酸残基の挿入、欠失、及び置 換をとり込むことができる。本明細書に記載される“所望の性質”は、そのポリ ペプチドが適当な宿主中で免疫原性であり、かつ少なくともSDS-PAGEゲル中に見 られるような変性状態で、又好ましくは、“天然”もしくは“自生”状態（即ち 、EPR-1 が細胞で発現される状態）で、EPR-1 分子の抗体又はEPR-1 の少なくと も一部に相同のポリペプチドの抗体を産生することができることを含む。付加的 な所望の性質は、ポリペプチドが細胞で発現される時又はその変性状態で抗原性 であり、その結果、EPR-1 分子と免疫反応性の抗体が又本ポリペプチドと免疫反 応することである。 本ポリペプチドが本明細書に説明されたEPR-1 に相当する配列の保存的置換を とり込む場合、置換アミノ酸残基はその他の生物学上類似のアミノ酸残基により 置換されることが好ましく、その結果、得られるポリペプチドは因子Ｖ、因子 VIIIの配列又は配列MFG E-8 とは異なる（即ち、50％未満相同である）アミノ酸 残基配列を有する。保存的置換の幾つかの例として、その他の疎水性残基に代え てイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き疎水性残基の置換が挙 げられる。又、極性残基、例えば、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、アス パラギン酸、グルタミン、アスパラギン、等がこのグループの別の員に代えて保 存的置換し得る。保存的置換をとり込むポリペプチドの更に別の局面は、置換ア ミノ酸残基が未置換の親アミノ酸残基を置換する時に生じる。置換アミノ酸の例 が37 C.F.R．§1.822(b)(4)に見られ、これらの種が参考として本明細書に含ま れる。ポリペプチドがEPR-1 の配列に相当するアミノ酸残基配列を有するが、一 種以上の保存的置換を有する場合、自生タンパク質の好ましくは約40％以下、更 に好ましくは約30％以下、更に好ましくは約20％以下が置換される。約５〜10％ 以下の保存的置換を有するポリペプチドが更に好ましい。 本発明のポリペプチドは当業者に知られているペプチド合成技術のいずれかに より合成し得る。利用可能な技術の幾つかの要約がJ.M.Stuard及びJ.D.Young， “固相ペプチド合成”，W.H．フリーマン社，サンフランシスコ(1969); 古典的 溶液合成についてJ.Meinhofer，“ホルモンのタンパク質及びペプチド”,２巻， 46頁，アカデミック・プレス(ニューヨーク),1983; E.Schroder及びK.Kubke，“ ペプチド”,１巻，アカデミック・プレス(ニューヨーク)，1965、及び米国特許 第4,631,211 号明細書に見られ、これらの開示が参考として本明細書に含まれる 。本発明による使用につき所望されるポリペプチドが比較的短い（即ち、長さが 約50未満のアミノ酸残基である）場合、直接ペプチド合成技術が、固相技術、例 えば、Merrifield(JACS 85:2149(1963))の固相技術を通常使用することにより一 般に有利とされる。前記合成に使用可能な適当な保護基が上記書籍及びJ.F.W.Mc Omie,“有機化学における保護基”,プレナム・プレス，ニューヨーク，1973に記 載されており、これが参考として本明細書に含まれる。 又、本ポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により合成し得る。このような組換え 技術は、所望のポリペプチドが比較的長い（長さが約50より大きいアミノ酸残基 である）時に特に有利とされる。組換えＤＮＡ技術が本ポリペプチドを調製する のに使用される場合（下記の項目Ｄを参照のこと）、所望のポリペプチドをコー ドするＤＮＡセグメントが前もって選択されたベクターにとり込まれ、続いてこ れが適当な宿主中で発現される。次いで、発現されたポリペプチドはゲル電気泳 動、免疫吸着クロマトグラフィー、等の如きルーチン方法により精製されること が好ましい。 本発明のEPR-1 ポリペプチドは、EPR-1 により発現されたエピトープ（抗原決 定基）を免疫学的に模擬するその能力により更に特性決定されることが好ましい 。本明細書に使用される“免疫学的に模擬する”という用語は、その種々の文法 上の形態で、本発明のEPR-1 ポリペプチドが本明細書に特定されたEPR-1 の自生 エピトープと免疫反応する本発明の抗体と免疫反応する能力を表す。 主題ポリペプチドは、それが必要とされる配列を含み、かつ本明細書に記載さ れたようにリンパ球増殖に影響し、因子Xaと免疫反応し、又は抗EPR-1 抗体と免 疫反応することができる限り、EPR-1 のアミノ酸残基配列と同一である必要はな いことが理解されるべきである。 主題ポリペプチドは、そのポリペプチドが因子Xa又は本発明の抗EPR-1 抗体と 免疫反応することができる限り、アミノ酸残基配列が本明細書に示されているポ リペプチドのあらゆる類縁体、断片又は化学誘導体を含む。それ故、本ポリペプ チドは、種々の変化がその使用に或る利点を与える場合に、このような変化、置 換、挿入、及び欠失を受け得る。これに関して、本発明のEPR-1 ポリペプチドは 図1A及び1Bに示されたEPR-1 配列のシーケンシャルサブセットと同一ではなく、 そのサブセットに相当し、この場合、一つ以上の変化がなされ、それは因子Xa又 は本明細書に記載された抗EPR-1 抗体と免疫反応する能力を保持する。 “類縁体”という用語は、本明細書に特別に示された配列と実質的に同一のア ミノ酸残基配列を有するあらゆるポリペプチドを含み、この場合、一種以上の残 基が機能上類似の残基で保存的置換されており、かつそれは記載された範囲内の 能力を示す。保存的置換の例として、その他の残基に代えて一つの非極性（疎水 性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの置換、そ の他の残基に代えて一つの極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリ シン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間の置換、その他の残 基に代えて一つの塩基性残基、例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジンの置 換、あるいはその他の残基に代えて一つの酸性残基、例えば、アスパラギン酸又 はグルタミン酸の置換が挙げられる。 又、“保存的置換”という用語は、未誘導体化残基に代えて化学誘導体化残基 の使用を含む。但し、このようなポリペプチドが必要な抑制活性を示すことを条 件とする。 “化学誘導体”は、機能性側鎖基の反応により化学誘導体化された一種以上の 残基を有する主題ポリペプチドを表す。このような誘導体化分子として、例えば 、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カ ルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホル ミル基を形成した分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は誘導体化されて塩、 メチルエステル及びエチルエステルもしくはその他の型のエステル又はヒドラジ ドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されてＯ−アシル誘導体又はＯ −アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化され てＮ−im−ベンジルヒスチジンを形成し得る。 又、化学誘導体として、20の通常のアミノ酸の一種以上の天然産アミノ酸誘導 体を含むペプチドが挙げられる。例：４−ヒドロキシプロリンがプロリンに代え て置換されてもよく、５−ヒドロキシリシンがリシンに代えて置換されてもよく 、３−メチルヒスチジンがヒスチジンに代えて置換されてもよく、ホモセリンが セリンに代えて置換されてもよく、そしてオルニチンがリシンに代えて置換され てもよい。又、本発明のポリペプチドとして、必要な活性が維持される限り、配 列が本明細書に示されているポリペプチドの配列に関して一つ以上の付加及び／ 又は欠失又は残基を有するあらゆるポリペプチドが挙げられる。本明細書で注目 されるように、図1A及び1Bに示されたEPR-1 配列（配列番号２）に75〜100 ％相 同のアミノ酸残基配列又はそのシーケンシャルサブセットを有するポリペプチド が特に好ましい。 本発明のポリペプチドがEPR-1 の配列と同一ではない配列又はそのシーケンシ ャルサブセットを有する場合、それは典型的である。何となれば、一つ以上の保 存的置換又は非保存的置換が行われており、そのアミノ酸残基の数の約30％以下 、好ましくはその数の10％以下が置換されているからである。又、付加的な残基 が “リンカー”（それにより、本発明のポリペプチドが標識又は固体マトリックス 、もしくは担体に都合良く固定し得る）を与える目的でEPR-1 ポリペプチドのど ちらかの末端に付加されてもよい。リンカー残基はEPR-1 エピトープを生成しな いことが好ましく、即ち、EPR-1 の構造に似ていないことが好ましい。 アミノ酸残基リンカーは通常少なくとも一つの残基であり、また40以上の残基 であってもよく、更にしばしば１〜10の残基であるが、EPR-1 エピトープを形成 しない。連結反応に使用される典型的なアミノ酸残基はチロシン、システイン、 リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、等である。加えて、主題ポリペプチ ドは、特にことわらない限り、末端NH₂ アシル化、例えば、アセチル化、もしく はチオグリコール酸アミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンによる末端カ ルボキシルアミド化、及び同様の末端修飾により修飾されている配列によりEPR- 1 の天然配列とは異なり得る。末端修飾は、公知であるように、プロテイナーゼ 消化による感受性を低下するのに有益であり、それ故、溶液、特に、プロテアー ゼが存在し得る生物液中のポリペプチドの半減期を延長するのに利用できる。こ れに関して、ポリペプチド環化が又有益な末端修飾である。 担体にカップリングされて当業界において担体−ハプテン接合体として知られ ているものを生成する場合、本発明のEPR-1 ポリペプチドはEPR-1 と免疫反応す る抗体を誘発することができる。それ故、免疫学的交差反応性の良く確立された 原理に鑑みて、本発明は本明細書に開示されたポリペプチドの抗原関連変異体を 意図している。“抗原関連変異体”は、相同ポリペプチド、好ましくはEPR-1 と 免疫反応する抗体分子を誘発することができる主題ポリペプチドである。 又、本発明のあらゆるペプチドが医薬上許される塩の形態で使用し得る。本発 明のペプチドと塩を生成することができる好適な酸として、無機酸、例えば、塩 酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピ オン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マ レイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スル ファニル酸等が挙げられる。 本発明のペプチドと塩を生成することができる好適な塩基として、無機塩基、 例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等；及び有機 塩基、例えば、モノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン及びアリールアミン（例 えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミ ン等）及び必要により置換されていてもよいエタノールアミン（例えば、エタノ ールアミン、ジエタノールアミン等）が挙げられる。 EPR-1 ポリペプチドは、特に、本発明の診断方法及び診断系に使用し得る。又 、EPR-1 ポリペプチドはEPR-1 のエピトープと免疫反応する抗体の調製のために 本明細書に記載された接種物を調製するのに使用し得る。加えて、EPR-1 ポリペ プチドは本明細書に記載された因子を精製するための操作中に因子VIII又は因子 Ｖの不活化を抑制するためにin vitro使用し得る。又、本発明のEPR-1 ポリペプ チドは以下に開示される本発明の治療方法に使用し得る。 D.核酸分子 EPR-1 をコードするＤＮＡセグメント（即ち、合成オリゴヌクレオチド）は化 学技術、例えば、Matteucci らのホスホトリエステル法(J.Am.Chem.Soc．103:31 85-3191(1981))により、又は自動化合成方法を使用することにより容易に合成し 得る。加えて、更に大きいＤＮＡセグメントは公知の方法、例えば、ＤＮＡセグ メントを形成するオリゴヌクレオチドの群の合成、続いてハイブリダイゼーショ ン及び完全セグメントをつくるためのオリゴヌクレオチドの連結反応により容易 に合成し得る。 勿論、コード配列を化学合成することにより、あらゆる所望の修飾が、自生ア ミノ酸残基配列をコードする配列に適当な塩基を置換することにより簡単に行い 得る。 更に、EPR-1 をコードする構造遺伝子から実質的になるＤＮＡセグメントが、 EPR-1 を形成する遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得られ、続いて部位誘導突 然変異誘発によるように修飾されて所望の置換を導入し得る。 こうして、本発明は種々の新規かつ有益な核酸分子を含む。一実施態様におい て、本発明の核酸分子は配列番号２として本明細書に同定されたタンパク質に相 同のタンパク質をコードする。別の実施態様において、本発明の核酸分子は図1A 及び1Bに示され、配列番号１として本明細書中に同定されたＤＮＡ配列を含む。 別の実施態様において、核酸配列は配列番号１として本明細書中に同定された分 子の一種以上のシーケンシャルサブセットを含んでもよく、又は配列番号２とし て本明細書中に同定されたポリペプチドの一種以上のシーケンシャルサブセット を含むポリペプチドをコードする分子を含んでもよい。 更にその他の好ましい核酸分子は、配列番号２として本明細書中に同定された EPR-1 タンパク質又はそのシーケンシャルサブセットに同一、又は少なくとも75 ％相同のアミノ酸残基配列をコードする核酸分子を含む。一実施態様において、 核酸分子は長さ約500-1000のアミノ酸残基のポリペプチド又はタンパク質をコー ドする。核酸分子は長さ約100-500 のアミノ酸のポリペプチド又はタンパク質を コードすることが更に好ましい。核酸分子は長さ約200-350 のアミノ酸のポリペ プチド又はタンパク質をコードすることが更に好ましい。 その他の好ましい実施態様において、本発明の核酸分子はキメラタンパク質、 融合タンパク質、又は接合体をコードし、この場合、前記核酸分子によりコード されたアミノ酸配列は配列番号２として本明細書中に同定された配列、又はその シーケンシャルサブセットを含む。更に別の実施態様において、前記核酸分子に よりコードされたアミノ酸配列は配列番号２、又はそのシーケンシャルサブセッ トに75〜100 ％相同である。 本発明の特に好ましい核酸分子は配列番号２により表されるタンパク質に少な くとも75％相同のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ（ 又はヌクレオチド）分子は配列番号２として本明細書中に同定されたタンパク質 に75〜100 ％相同であるタンパク質をコードすることが好ましい。 先に注目されたように、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、組換え技術 を使用して合成（又はそれ以外に修飾）し得る。ＤＮＡ構築物が本明細書に例示 として記載されるにもかかわらず、ＲＮＡ分子が又本明細書に開示された使用に ついて意図されることが明らかに理解されるべきである。例えば、本発明のタン パク質又はポリペプチドは下記の実施例４に記載されるようにして調製され、発 現し得る。 組換え技術が本発明のポリペプチドを調製するのに使用される場合、そのポリ ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）分子又はセグメントが使用される ことが好ましい。本発明により意図されている好ましいＤＮＡ分子は、ベクター に操作により結合され、続いてこれが適当な宿主中で発現される。その分子は、 それが共通の使用に従ってそれにつながれる（共有結合される）時に本明細書に 使用されるベクターに“操作により結合される”。又、本発明はここに開示され たＤＮＡ分子に均等のＲＮＡ分子を意図している。 本発明の核酸分子は化学技術、例えば、公知のホスホトリエステル法(例えば 、Matteuciら，JACS 103: 3185(1981))により容易に合成し得る。核酸分子を化 学合成することにより、鋳型ポリペプチド、例えば、自生タンパク質からのアミ ノ酸残基又はアミノ酸配列のあらゆる所望の置換、挿入又は欠失が、ＤＮＡ分子 のヌクレオチド配列の相当する変化を単に生じることにより容易に与えられる。 本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ分子が使用される時はいつでも、そ のポリペプチドをコードする分子を含むＲＮＡ分子が逆転写酵素により相補ＤＮ Ａ（ｃＤＮＡ）に転写される。次いでｃＤＮＡは本明細書に記載されるようにし て転写され、翻訳されて所望のポリペプチドを生じ得る。 本発明の好ましい局面において、本明細書中で同定されたEPR-1 のアミノ酸残 基配列（例えば、配列番号２）の少なくとも一つをコードするＤＮＡヌクレオチ ド配列（分子）が更に大きいＤＮＡ分子に操作により結合される。次いで、得ら れるＤＮＡ分子が好適な宿主に形質転換又はトランスフェクトされ、その中で発 現される。 本発明のアミノ酸残基配列をコードする核酸分子は開始コドン及び終止コドン を備えていてもよく、又は開始コドン及び終止コドンの一方もしくは両方がその 核酸分子に操作により結合された更に大きい核酸分子（例えば、ベクター）によ り与えられてもよく、その結果、相当するポリペプチドのみが生じられる。又、 付加的なアミノ酸残基をコードする核酸配列が核酸分子の3'末端及び／又は5'末 端に用意されてもよく、その結果、EPR-1 分子のアミノ酸残基配列（又はそれか ら誘導されたアミノ酸残基配列）に加えてそのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は 両方にアミノ酸残基配列を有する更に大きいポリペプチドが発現される。 本発明のＤＮＡ分子の別の組は、2E1 モノクローナル抗体エピトープを含むア ミノ酸残基配列を有するポリペプチドをコードし、その配列は式 により表され、EPR-1 のmAb 2E1 エピトープに相当する。そのヌクレオチド分子 は長さ約5-100 のアミノ酸残基、更に好ましくは長さ約4-50のアミノ酸、更に好 ましくは長さ約3-30のアミノ酸のポリペプチドをコードすることが好ましい。 本発明の核酸分子は酵素技術により生産し得る。こうして、核酸分子を前もっ て特定された認識配列で開裂する制限酵素が核酸断片を所望の核酸分子、例えば 、EPR-1 タンパク質をコードするＤＮＡ（又はＲＮＡ）を含む更に大きい核酸分 子から単離するのに使用し得る。典型的には、このようにして生産されたＤＮＡ 断片は付着末端、“オーバーハンギング”末端を有し、この場合、一本鎖核酸配 列がその分子の二本鎖部分を越えて延びる。このような付着末端の存在は一般に 平滑断端されたＤＮＡ分子に好ましい。次いで、所望のコード配列を含む単離さ れた断片が増幅及び発現に適したベクターにつながれる（クローン化される）。 PCR を使用して、有益なポリペプチドをコードする核酸配列を合成することが 可能であり、次いでこれはベクターに操作により結合され、そして適当な細胞を 形質転換又はトランスフェクトするのに使用され、その中で発現される。 本発明の組換えEPR-1 ポリペプチド及びタンパク質を多量に生産するのに特に 好ましい方法は、本明細書に記載されたPCR 反応生成物を生成するためのポリメ ラーゼ連鎖反応(PCR)においてプライマーとしての前もって選択されたオリゴヌ クレオチドの使用に頼る。 上記ＤＮＡ産物が(PCR)増幅により生産される場合、２種のプライマー、即ち 、PCR プライマー対が増幅すべき核酸の夫々のコードストランドについて使用さ れる必要がある。第一プライマーはナンセンス（マイナス又は相補）ストランド の部分になり、そして好ましい遺伝子のプラス（又はコード）ストランド中に保 存されたヌクレオチド配列にハイブリッドを形成する。それ故、コードＤＮＡ同 族体を生産するために、第一プライマーは選ばれた一種以上の遺伝子中の保存領 域にハイブリッドを形成するように（即ち、保存領域に相補性であるように）選 択される。 第二プライマーはコード（プラス）ストランドの部分になり、そしてマイナス ストランド中に保存されたヌクレオチド配列にハイブリッドを形成する。それ故 、コードＤＮＡ同族体を生産するために、第二プライマーは例えばリーダー又は 第 一フレームワーク領域をコードするその領域中のようなコード遺伝子の5'末端で 保存ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するように選ばれる。コードＤＮＡ 同族体の増幅において、第二プライマーの保存5'ヌクレオチド配列は、Loh ら， Science 243: 217-220(1989)により記載されたような末端デオキシヌクレオチジ ルトランスフェラーゼを使用して外因的に付加された配列に相補性であり得るこ とが注目されるべきである。第一プライマー及び第二プライマーの一方又は両方 はエンドヌクレアーゼ認識部位（制限部位）を形成するヌクレオチド配列を含む ことができる。その部位は増幅される遺伝子に異種であってもよく、典型的には そのプライマーの5'末端又はその付近に現れる。 PCR プライマー対の第一プライマーは本明細書中で“センスプライマー”と時 折称される。何となれば、それは核酸のコードストランド又はセンストランドに ハイブリッドを形成するからである。加えて、PCR プライマー対の第二プライマ ーは本明細書中で“アンチセンスプライマー”と時折称される。何となれば、そ れは核酸の非コードストランド又はアンチセンスストランド、即ち、コードスト ランドに相補性のストランドにハイブリッドを形成するからである。複数の第一 プライマー及び／又は複数の第二プライマーが夫々の増幅に使用でき、例えば、 第一プライマーの一種が幾つかの異なる第二プライマーと対合されて幾つかの異 なるプライマー対を形成し得る。又、第一プライマー及び第二プライマーの個々 の対が使用し得る。又、プライマーはプライマーがハイブリッドを形成する末端 又はＤＮＡの領域を示す5'プライマー又は3'プライマーであると言われる。この 場合、5'プライマー及び3'プライマーは夫々アンチセンスプライマー及びセンス プライマーである。 存在する場合、制限部位形成部分は典型的にはそのプライマーの5'末端非プラ イミング部分に位置される。第一プライマーにより形成された制限部位は典型的 には第二プライマーにより形成された制限部位を認識しない制限酵素により認識 されるものであるように選ばれ、その目的は互いに非相補性である付着末端を有 するＤＮＡ分子を生産し、こうしてベクターへの方向性挿入を可能にするためで ある。 PCR において、夫々のプライマーは第二プライマーと組み合わせて作用して標 的核酸配列を増幅する。PCR 用のPCR プライマー対の選択は、本明細書に説明さ れるように、種々の考慮事項により支配される。即ち、プライマーは選ばれた遺 伝子中に保存された配列に相補性であるヌクレオチド配列を有する。有益なプラ イミング配列が以下に開示される。 選択された遺伝子をクローニングするのに使用される戦略は、当業界で公知で あるように、種々の遺伝子を構成する核酸の型、複雑さ、及び純度に依存するで あろう。その他の因子として、遺伝子が増幅され、かつ／又は突然変異誘発され るか否かが挙げられる。 一般に、例示遺伝子はポリヌクレオチドコードストランド、例えば、ｍＲＮＡ 及び／又はゲノムＤＮＡのセンスストランドを含む。ポリヌクレオチド配列が二 本鎖ゲノムＤＮＡの形態である場合、それは通常典型的には溶融することにより 一本鎖に最初に変性される。遺伝子配列はその配列をPCR プライマー対で処理す る（接触させる）ことによりPCR 反応にかけられ、その対の夫々の員は前もって 選択されたヌクレオチド配列を有する。PCR プライマー対は、その遺伝子配列中 に保存された、好ましくは長さが少なくとも約10のヌクレオチド、更に好ましく は長さが少なくとも約20のヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリッドを形 成することによりプライマー伸長反応を開始することができる。 ここでPCR 技術を使用する際に、前記アミノ酸配列の一つ以上（例えば、配列 番号２）をコードするＤＮＡプライマー分子が使用されることが好ましい。しか しながら、付加的なヌクレオチド配列が、EPR-1 をコードするｃＤＮＡ又はゲノ ムＤＮＡ及びその更に小さいアミノ酸残基配列をクローニングすることにより使 用でき、又は明らかにし得る。図1A及び1Bの配列（配列番号２）の如きEPR-1 ア ミノ酸残基配列と同一のEPR-1 アミノ酸残基配列又はそれから誘導された配列（ 例えば、EPR-1 アミノ酸残基配列のシーケンシャルサブセット）をコードするＤ ＮＡプローブ分子が好ましい。一つの好ましいＤＮＡ分子は図1A及び1Bに示され たＤＮＡ配列（配列番号１）を含む。 又、同じアミノ酸残基について異なるコドンを使用して標的アミノ酸残基配列 をコードする混合された多重複プライマーの使用が又意図されていることが理解 されるべきである。 PCR 反応は、PCR 緩衝液中でPCR プライマー対、好ましくはその前もって決め られた量を選択された遺伝子又はＤＮＡヌクレオチド配列の核酸、好ましくはそ の前もって決められた量と混合してPCR 反応混合物を生成することにより行われ る。その混合物はPCR 反応生成物の生成に充分な時間の期間（これは典型的には 前もって決められる）にわたってポリヌクレオチド合成条件下に保たれ、それに より複数の異なるポリペプチドをコードするＤＮＡ同族体を生産する。 PCR 反応は好適な方法を使用して行われる。一般に、それは緩衝水溶液、即ち 、好ましくは７〜９、最も好ましくは約８のpHのPCR 緩衝液中で起こる。モル過 剰（ゲノム核酸について、通常約10⁶:1 のプライマー：鋳型）のプライマーが鋳 型ストランドを含む緩衝液に混合される。モル大過剰がその方法の効率を改良す るのに好ましい。又、PCR 緩衝液はデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP及び典型的には熱安定性のポリメラーゼを、全てプ ライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応に適した量で含むことが好ましい。 こうして、例えば、得られる溶液（PCR 混合物）が約１〜10分、好ましくは１〜 ４分にわたって約90℃〜100 ℃に加熱される。この加熱期間後に、その溶液が54 ℃に冷却され、これがプライマーハイブリダイゼーションに好ましい。その合成 反応は、その温度を越えるとポリメラーゼ（誘発剤）が最早有効に機能しなくな る温度までの室温で起こり得る。こうして、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが誘発 剤として使用される場合、その温度は一般に約40℃以下である。例示のPCR 緩衝 液は下記の物質を含む：緩衝液100 マイクロリットル当たり50mMのKCl 、10mMの トリス-HCl、pH8.3; 1.5mMのMgCl₂;0.001 ％(wt/容量)のゼラチン、200 μM のd ATP; 200 μM のdTTP;200μM のdCTP; 200 μM のdGTP; 及び2.5 単位のテルム ス アクアチクス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許第4,889 ,818 号、その開示が参考として本明細書に含まれる）。 その誘発剤は、酵素を含む、プライマー伸長産物の合成を行うように機能する あらゆる化合物又は系であってもよい。この目的に好適な酵素として、例えば、 E.coliＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coliＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、T4 ＤＮＡポリメラーゼ、その他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及 び熱安定性酵素を含むその他の酵素が挙げられ、これらは夫々の核酸ストランド に相補性であるプライマー伸長産物を生成するのに適した様式でヌクレオチドの 組み合わせを促進するであろう。一般に、その合成は夫々のプライマーの3'末端 で開始され、そして合成が停止し、異なる長さの分子を生産するまで、鋳型スト ランドに沿って5'方向に進行するであろう。しかしながら、上記と同じ方法を使 用して、5'末端で合成を開始し、そして上記方向に進行する誘発剤があるかもし れない。 又、誘発剤は、酵素を含む、ＲＮＡプライマー伸長産物の合成を行うように機 能する化合物又は系であってもよい。好ましい実施態様において、誘発剤はＤＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、T7ＲＮＡポリメラーゼ、T3ＲＮＡポリメ ラーゼ又はSP6 ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。これらのポリメラーゼは相 補ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する。ＲＮＡポリメラーゼの高い代謝回転速度 はChamberlinら，The Enzymes，P.Boyer編集，87-108頁，アカデミック・プレス ，ニューヨーク(1982)に記載されたように出発ポリヌクレオチドを増幅する。T7 ＲＮＡポリメラーゼの別の利点は、Joyce ら，Nuc.Acid Res．17: 711-722(1989 )により既に記載されたようにしてｃＤＮＡの一部を一種以上の突然変異誘発性 オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置換し、部分不適合鋳型を 直接に転写することにより、突然変異がポリヌクレオチド合成に導入し得ること である。転写に基く増幅系がGingerasらによりPCR プロトコル、方法及び適用の ガイド ，245-252 頁，アカデミック・プレス社，サンジエゴ，CA（1990）に記載 されていた。 誘発剤がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、それ故、リボヌクレオチド トリホスフェートをとり込む場合、充分な量のATP 、CTP 、GTP 及びUTP がプラ イマー伸長反応混合物に混合され、得られる溶液が上記のようにして処理される 。新たに合成された核酸ストランド及びその相補ストランドは、その方法の後続 の工程に使用し得る二本鎖分子を形成する。 一種又は複数の異なる遺伝子又はＤＮＡ分子について種々のポリペプチドをコ ードするＤＮＡ同族体を生産した後、ＤＮＡ分子が典型的には更に増幅される。 ＤＮＡ分子が古典的技術、例えば、自律複製ベクターへのとり込みにより増幅し 得るが、分子をベクターに挿入する前にそれらをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に かけることによりそれらを最初に増幅することが好ましい。PCR は典型的には熱 サイクルすることにより、即ち、PCR 反応混合物の温度を、下限が約10℃〜約40 ℃であり、上限が約90℃〜約100 ℃である温度範囲内で繰り返して上下すること により行われる。好ましい増幅操作が実施例１に記載されたようにして行われた 。上昇及び低下は連続であってもよいが、ポリヌクレオチド合成、変性及びハイ ブリダイゼーションに有利な温度の夫々で相対温度安定性の時間の期間につれて 位相性であることが好ましい。 PCR 増幅方法は米国特許第4,683,192 号、同第4,683,202 号、同第4,800,159 号、同第4,683,195 号及び同第4,965,188 号（これらの開示が参考として本明細 書に含まれる）、そして“PCR 技術：ＤＮＡ増幅に関する原理及び適用”，H.Er -lich編集，ストックトン・プレス，ニューヨーク(1989);及び“PCR プロトコル ：方法及び適用に関するガイド”，Innisら編集，アカデミック・プレス，サン ジエゴ，カリフォルニア（1990）を含む少なくとも幾つかの書籍に詳しく記載さ れている。又、本明細書に開示されたような使用に好ましい種々の方法及びプラ イマーが、例えば、Nilsson ら，Cell 58: 707（1989）、Ennis ら，PNAS USA 8 7: 2833-7（1990）及びZemmour ら，Immunogenetics 33: 310-20(1991)に記載さ れている。 特に、本発明における使用のためにヌクレオチド配列を増幅するのには、保存 配列を選択して、既知の対立遺伝子形態（存在する場合）の5'及び3'未翻訳領域 の比較からプライマーを設計することが好ましい。又、制限部位が5'プライマー 及び3'プライマーにとり込まれて増幅産物が配列決定ベクター又は発現ベクター にサブクローン化されることを可能にし得る。又、４塩基スペーサー配列を制限 部位の近位に入れて増幅産物を酵素で切断する効率を改良することが有益であり 得る。 好ましい実施態様において、第一プライマー及び第二プライマーの一つの対の みが増幅反応当たりに使用される。夫々複数の異なるプライマー対を使用して、 複数の異なる増幅から得られた増幅反応生成物がその後組み合わされる。しかし ながら、本発明は又同時増幅（プライマーの二つの対を使用する）、及び多重増 幅（約８、９または10までのプライマー対を使用する）によるＤＮＡ同族体生産 を意図している。 E.ベクター 本発明の組換えEPR-1 ポリペプチド及びタンパク質の発現は、上記PCR 増幅EP R-1 配列が挿入された発現ベクターの使用により行われる。発現ベクターは、公 知のベクター構築技術のいずれかを使用して構築し得る。しかしながら、これら の技術は、宿主細胞のゲノムに挿入すべき翻訳可能なヌクレオチド配列が適当な プロモーター及び／又はエンハンサー配列によりその配列の“上流”に隣接され る程度まで改良される。 本発明のヌクレオチドセグメントが操作により結合されるベクターの選択は、 当業界で公知であるように、所望の機能性、例えば、タンパク質発現、及び形質 転換又はトランスフェクトされる宿主細胞に直接依存し、これらは組換えＤＮＡ 分子を構築する技術に固有の制限である。しかしながら、本発明により意図され るベクターは、それが操作により結合されるＤＮＡセグメントに含まれる有益な タンパク質構造遺伝子の複製、そして又好ましくは発現を少なくとも誘導するこ とができる。 こうして、本発明は、好ましくは配列番号２として本明細書に同定されたEPR- 1 タンパク質を発現して、ここに開示されたEPR-1 タンパク質又はポリペプチド をコードする自己複製性組換えＤＮＡ分子を提供するために本発明の核酸分子に 操作により結合し得るベクターを意図している。好ましいＤＮＡ分子は、配列番 号１として本明細書に同定された、図1A及び1Bに示された配列を有する。 その組換え分子は、宿主細胞が所望のポリペプチドを発現するように好適な宿 主細胞を形質転換又はトランスフェクトするのに使用し得る。それ故、好ましい 核酸分子は自己複製性と見なし得る。 本発明の核酸分子が操作により結合されるベクターの選択は、当業界で公知で あるように、所望の機能性、例えば、発現の効率、宿主細胞の形質転換又はトラ ンスフェクション、等に依存する。しかしながら、本発明のベクターは本ポリペ プチド又はタンパク質をコードする核酸分子の複製、そして好ましくは又発現を 少なくとも誘導することができる。 多くの好ましい実施態様において、ベクターは又選択可能マーカーを含む。発 現後に、翻訳可能なヌクレオチド配列の生産物がその後その配列の抗体を使用し て精製し得る。選択可能マーカーの一例はネオマイシン耐性である。ネオマイシ ン耐性をコードするプラスミド、フシュスネオ(phshsneo)、フスネオ(phsneo)、 又はプコプネオ(pcopneo)は、選ばれた一種以上の遺伝子を発現する細胞の集団 がトランスフェクタントを選択培地中で増殖することにより確かめられるように 夫々のトランスフェクションに含まれてもよい。 種々の実施態様において、翻訳可能なヌクレオチド配列が適当な調節可能な転 写プロモーター、翻訳調節配列、及びポリリンカーを有するプラスミドにとり込 まれて正確な配向の翻訳可能なヌクレオチド配列の挿入を簡素化でき、そして宿 主細胞中で発現し得る。種々の宿主細胞は真核昆虫細胞、例えば、スポドプテラ フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、又は原核生物細胞、例えば、エリキ ア コリ(Escherichia coli)を含む。転写を開始するためのプロモーターを形成 する5'調節配列と、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列の5'末端で操作により結合され たリボソーム結合部位があることが好ましい。 形質転換細胞又はトランスフェクトされた細胞、例えば、E.coli中で高レベル の遺伝子発現を得るために、多量のｍＲＮＡを生じるための強力なプロモーター を使用するだけでなく、リボソーム結合部位を使用してｍＲＮＡが有効に翻訳さ れることを確実にすることが必要である。例えば、E.coli中で、リボソーム結合 部位は開始コドン(AUG)及びその開始コドンから３〜11ヌクレオチド上流に配置 された長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Shine ら，Nature，254: 34(1975 )）。シャイン−ダルガーノ(SD)配列と称される配列AGGAGGU はE.coli 16SｍＲ ＮＡの3'末端に相補性である。ｍＲＮＡ及びそのｍＲＮＡの3'末端にある配列へ のリボソームの結合は、(1)SD 配列と16S tRNAの3'末端の間の相補性の程度、及 び(2)SD 配列とそのAUG の間の間隔そしておそらくその間にあるＤＮＡ配列によ り影響され得る（例えば、Roberts ら，PNAS USA 76: 760(1979a); Roberts ら ，PNAS USA 76: 5596(1979b); Guarente ら，Science 209: 1428(1980); 及びGu arenteら，Cell 20: 543（1980）を参照のこと）。 最適化は、プラスミド（この間隔は系統的に変化される）中の遺伝子の発現の レベルを測定することにより一般に達成される。異なるｍＲＮＡの比較は、位置 -20 から+13 までに統計上好ましい配列があることを示す（この場合、AUG のＡ が位置０である；例えば、Goldら，Ann.Rev.Microbiol．35: 365（1981）を参照 のこと）。又、リーダー配列が翻訳に著しく影響するこが示されていた(Roberts ら，1979a，b上記文献)。又、リボソームの結合はAUG 後のヌクレオチド配列に より影響されることがあり、この配列がリボソーム結合に影響する（例えば、Ta niguchi ら，J.Mol.Biol．118: 533（1978）を参照のこと）。 多量の本発明の組換えポリペプチド及びタンパク質を生産するのに使用される ベクターは、バクテリア、哺乳類細胞又は昆虫細胞中の発現に設計し得る。例え ば、バクテリアE.coli中の発現について、発現ベクターは有益な量のタンパク質 又はポリペプチドの生産に適したバクテリア“宿主”細胞と一緒に使用されるこ とが好ましい。このようなベクターは原核生物レプリコン、即ち、それで形質転 換された原核生物宿主細胞、例えば、バクテリア宿主細胞中の組換えＤＮＡ分子 の自律複製及び染色体外の維持を誘導する能力を有するヌクレオチド配列を含ん でいてもよい。このようなレプリコンは当業界で公知である。加えて、原核生物 レプリコンを含むこれらの実施態様は又、その発現が選択的な利点、例えば、薬 剤耐性をそれで形質転換されたバクテリア宿主に付与する遺伝子を含んでいても よい。典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイク リンに対する耐性を付与する遺伝子である。又、ベクターは典型的には翻訳可能 なヌクレオチド配列の挿入に都合の良い制限部位を含む。 又、原核生物発現ベクターは、それ自体のタンパク質の発現のために微生物中 で使用し得るプロモーターを含む。最も普通に使用されるこれらのプロモーター として、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系並びに欧州特許出願第 0125023 号明細書に記載されたトリプトファンプロモーター系が挙げられ、これ らの関係がある開示が参考として本明細書に含まれる。 バクテリア宿主と適合性のプロモーター配列、例えば、tac プロモーターは典 型的には本発明のＤＮＡ分子の挿入に都合の良い制限部位を有するプラスミドベ クター中に用意される。バクテリア宿主と適合性のプロモーター配列は典型的に は本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含むプラスミドベク ター中に用意される。例示の原核生物発現ベクターとして、バイオラド・ラボラ トリーズ（リッチモンド、CA）から入手し得るプラスミドpUC8、pUC9、pUC18 、 pBR322、及びpBR329、ファーマシア（ピスキャットアウェー、NJ）から入手し得 るpPL 及びpKK223、並びにpBS 、M13mp19 、pNH8a 、pNH16A、pNH18a、及びpNH4 6a(ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA）が挙げられる。その他の例示のベクターと して、pCMU(Nilsson ら，Cell 58: 707(1989))が挙げられる。又、その他の適当 なベクターが既知の方法に従って合成し得る。例えば、ベクターpCMU/K^b 及びpC MUIIはpCMUIV（Nilsson ら，上記文献）の修飾体である。 又、真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは哺乳類細胞と適合性の発現 ベクターは本発明に使用される組換えＤＮＡ分子を生成するのに使用し得る。哺 乳類細胞発現ベクターは当業界で公知であり、また幾つかの商用の源から入手し 得る。典型的には、所望のＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含む このようなベクターが用意され、そして哺乳類細胞中の遺伝子発現に必要とされ るシグナルを与える。このようなベクターの典型的なものはインビトロゲン（サ ンジエゴ、CA）から入手し得るpREPシリーズのベクター及びpEBVhis 、アメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手し得るベクターpTDT1(AT CC #31255)、pCP1(ATCC #37351)及びpJ4W(ATCC #37720)並びに同様の哺乳類発現 ベクターである。 記載された範囲内の方法に従って使用するための例示のクローニングベクター 系及び発現ベクター系として、本明細書中の項目Ｂ及び実施例４に記載されたも のが挙げられる。例えば、λZAP IIベクター及びｐブルースクリプトSK- ファー ジミド（ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA）が、ｃＤＮＡライブラリーの構築だけ でなく、その後のクローニング工程及び発現工程に使用し得る。 成功して形質転換又はトランスフェクトされた細胞、即ち、本発明のｒＤＮＡ 分子を含む細胞は、公知の技術により同定し得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの 導入により得られる細胞は、Southern，J.Mol.Biol.，98: 503（1975）又はBer- ent ら，Biotech.，3:208(1985)により記載された方法の如き核酸ハイブリダイ ゼーション法を使用して特定のｒＤＮＡの存在を検出するアッセイにかけられる 。 ｒＤＮＡの存在について直接に分析することの他に、成功した形質転換又はト ランスフェクションは発現されたタンパク質の存在に関する公知の免疫学的方法 により確認し得る。例えば、発現ベクターで成功して形質転換又はトランスフェ クトされた細胞はタンパク質を生産し、次いでこれらが免疫学的方法により直接 に、又は発現されたタンパク質の機能の存在について分析し得る。 本発明は、種々の好ましい実施態様に関して本明細書に記載されるが、例示さ れた宿主細胞、発現ベクター及び発現ベクター系に限定されるものと見なされる べきではないことが理解されるであろう。当業者に公知であり、またKaufman ら ，分子生物学における現行のプロトコル，Ausubel ら編集，ユニット16，ニュー ヨーク(1990)に記載されたその他の発現ベクター系が、本発明に使用される組換 えEPR-1 ポリペプチド及びタンパク質を調製するのに意図されている。 又、真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発 現ベクターが上記のようにして組換えＤＮＡ分子を生成するのに使用し得る。真 核細胞発現ベクターは当業界で公知であり、また幾つかの商用の源から入手し得 る。典型的には、このようなベクターは所望のＤＮＡ分子の挿入に都合の良い制 限部位を備えている。このようなベクターの典型的なものはpSVL及びpKSV-10(フ ァーマシア)、pBPV-1pML2d(インターナショナル・バイオテクノロジーズ社)、pX T1及びpSG5（ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA）並びにpTDT1(ATCC，#31255)であ る。真核細胞と適合性のベクター中の使用に好ましい薬剤耐性マーカーはネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子（Southernら，J.Mol.Appl．Ge net.，1:327-341(1982)）である。 又、哺乳類発現ベクター系が本発明に使用するための組換えポリペプチド及び タンパク質の発現に意図されている。哺乳類細胞中の発現を調節するために、ウ イルス誘導プロモーターが最も普通に使用される。例えば、頻繁に使用されるプ ロモーターとして、ポリオーマ、アデノウイルス型２、及びシミアンウイルス40 （SV40）が挙げられる。SV40ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーター が特に有益である。何となれば、両方がSV40ウイルス複製開始点を又含む断片と してウイルスから容易に得られるからである。又、ウイルス複製開始点中に配置 されたBgl I 部位に向かってHind III制限部位から延びている約250 の塩基対配 列が含まれることを条件として、大小のSV40断片が又使用し得る。又、発現に所 望される配列と通常関連するプロモーターを使用することが意図されている。複 製開始点は、SV40もしくはポリオーマ及びアデノウイルスの如きその他のウイル ス起源から誘導し得るような外在性起源を含むベクターの構築により用意されて もよく、又は宿主細胞染色体複製メカニズムにより用意されてもよい。後者は宿 主細胞染色体中の発現ベクターの組込みに充分である。 本発明の組換えＤＮＡを生成できるレトロウイルス発現ベクターが又意図され ている。所望のＤＮＡ分子を生成するためのレトロウイルスベクターの構築及び 使用がSorge ら，Mol.Cell.Biol.，4: 1730-37（1984）により記載されていた。 幾つかの方法が相補付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作により結合する のに利用できる。例えば、相補ホモポリマートラクトが挿入すべきＤＮＡ分子そ してベクターＤＮＡに付加し得る。次いでそのベクター及びＤＮＡ分子が相補ホ モポリマーテールの間の水素結合によりハイブリッドを形成して組換え二重鎖Ｄ ＮＡ分子を生成するようにされる。 又、一種以上の制限部位を含む合成リンカーがＤＮＡ分子をベクターに結合す るのに使用し得る。そのＤＮＡ分子が前記のようにエンドヌクレアーゼ制限消化 により生成される場合、それはE.coliＤＮＡポリメラーゼＩのバクテリオファー ジT4ＤＮＡポリメラーゼで処理され、これが突出3'一本鎖末端を除去し、くぼん だ3'末端に詰め込む(fills in)。平滑断端ＤＮＡ分子がそれにより生成される。 平滑断端ＤＮＡ分子は、平滑断端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒作用することが できる酵素、例えば、バクテリオファージT4ＤＮＡリガーゼの存在下でモル大過 剰のリンカー分子とともにインキュベートされる。こうして、その反応の生成物 はその中に制限部位を有するリンカー配列にそれらの末端で結合されたＤＮＡ分 子である。次いでこれらのＤＮＡ分子の制限部位は適当な制限酵素で開裂され、 そしてこれらの分子が開裂された分子のものと適合性の末端を有する発現ベクタ ーにつながれる。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、イ ンターナショナル・バイオテクノロジー社（ニューヘブン、CT）を含む幾つかの 源から市販されている。 F.宿主の形質転換／トランスフェクション 又、本発明は本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換又はトランスフェクトされ た宿主細胞に関する。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。好まし い原核宿主細胞はE.coliの株、例えば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社 （ベセスダ、MD）から入手し得るE.coli株DH5 である。好ましい真核宿主細胞と して、酵母及び哺乳類細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えば、マウス、ラット 、サル又はヒト繊維芽細胞系からの細胞が挙げられる。好ましい真核宿主細胞と して又、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、例えば、ATCCからCCL61 とし て入手し得るもの、及びATCCからCRL 1658として入手し得るNIH スイスマウス胚 細胞NIH/3T3 が挙げられる。 本発明の組換えＤＮＡ分子による適当な細胞宿主の形質転換又はトランスフェ クションは、典型的には使用されるベクターの型に依存する公知の方法により行 われる。原核宿主細胞の形質転換に関して、例えば、Maniatisら，分子クローニ ング、実験マニュアル，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コー ルド・スプリング・ハーバー，NY（1982）を参照のこと。本ポリペプチドをコー ドするＲＮＡを含むレトロウイルス及び逆転写酵素による脊椎動物細胞のトラン スフェクションに関して、例えば、Sorge ら，Mol.Cell.Biol．4: 1730-37（198 4）を参照のこと。 成功して形質転換又はトランスフェクトされた細胞、即ち、本発明の組換えＤ ＮＡ分子を含む細胞は、公知の技術により同定し得る。例えば、形質転換又はト ランスフェクトされた細胞はクローン化されてモノクローナルコロニーを生産し 得る。これらのコロニーからの細胞が回収され、溶解され、そしてそれらのＤＮ Ａ含量がSouthern，J.Mol.Biol．98: 503(1975)により記載された方法の如き方 法を使用して所望のＤＮＡ分子の存在について調べられる。 所望のＤＮＡ分子の存在について直接分析することの他に、成功した形質転換 又はトランスフェクションは、そのＤＮＡが本発明のポリペプチドの発現を誘導 する時に、公知の免疫学的方法により確認し得る。形質転換又はトランスフェク トされると考えられる細胞の試料が回収され、そして本ポリペプチドに特異的に 結合する抗体により抗原性について分析される。 形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞それ自体に加えて、これらの細 胞の培養物が又本発明により意図されている。形質転換又はトランスフェクトさ れた宿主細胞を培養するのに有益な栄養培地が当業界で公知であり、また幾つか の商用の源から得られる。宿主細胞が哺乳類細胞である実施態様において、“無 血清”培地が使用されることが好ましい。 培養物から発現されたタンパク質を回収する方法が当業界で公知である。例え ば、ゲル濾過、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、イオン交換、ア フィニティークロマトグラフィー及び関連技術が培養物中に見られる発現された タンパク質を単離するのに使用し得る。加えて、免疫化学方法、例えば、イムノ アフィニティー、免疫吸着、等が、本明細書に記載された方法により例示される ように公知の方法を使用して行い得る。 G.ハイブリドーマ及び抗体組成物 1.ハイブリドーマ 本発明のハイブリドーマは、本発明のモノクローナル抗体を含む抗体を産生す る能力を有するものとして特性決定されるものである。 所望の免疫特異性を有する、即ち、特別なタンパク質、特別なタンパク質の同 定可能なエピトープ及び／又はポリペプチドと免疫反応する能力を有する抗体分 子を産生（分泌）するハイブリドーマの生産方法は一般に当業界で公知である。 例えば、有益な方法がNiman ら，PNAS USA 80: 4949-4953（1983）、及びGalfre ら，Meth.Enzymol．73: 3-46（1981）により記載されている。その他の方法が米 国特許第5,180,806 号、同第5,114,842 号、同第5,204,445 号、及びRE 32,011 号明細書に記載されており、これらの開示が参考として本明細書に含まれる。 ハイブリドーマ細胞は典型的には抗体産生細胞及びメラノーマ又はその他の自 己永続性細胞系を融合することにより生成される。このような操作がKohler及び Milstein，Nature 256: 495-497(1975)に記載されていた。特に好ましいハイブ リドーマは12H2（ATCC受理番号HB 10637）と称される。その他の好ましいハイブ リドーマとして、2C11、2D4 、2E1 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 と称されるも のが挙げられる。 典型的には、本発明のハイブリドーマは、上記技術において、免疫原として本 発明の実質的に純粋なEPR-1 タンパク質、EPR-1 同族体、又はEPR-1 ポリペプチ ドを使用することにより生産される。ハイブリドーマの調製により抗体を産生す る方法が下記の細項目３に更に記載される。 2.接種源 別の実施態様において、本発明のタンパク質又はポリペプチド、その抗原関連 変異体、又は配列番号２として本明細書に同定されたEPR-1 タンパク質の少なく とも一部に少なくとも75％相同のタンパク質もしくはポリペプチドが、医薬上許 される水性希釈組成物中に使用されて接種源を生成し、これは、有効量で投与さ れる時に、EPR-1 タンパク質又はポリペプチドと免疫反応する抗体を誘発するこ とができる。 “接種源”という用語は、その種々の文法上の形態において、EPR-1 タンパク 質又はポリペプチドの抗体の調製に使用される活性成分として本発明のEPR-1 タ ンパク質又はポリペプチドを含む組成物を記載するのに本明細書中で使用される 。 ポリペプチドが抗体を誘発するのに使用される場合、そのポリペプチドは単独 で使用でき、又は接合体もしくはポリペプチドポリマーとして担体に結合し得る が、表現の容易さのために、本発明のポリペプチドの種々の実施態様は“ポリペ プチド”という用語、及びその種々の文法上の形態により本明細書中で総括して 表されることが理解されるべきである。 約35より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドに関して、上記の抗体の産生 を誘発する目的で担体に結合されたペプチドを使用することが好ましい。 上記のように、一種以上の付加的なアミノ酸残基がポリペプチドのアミノ末端 又はカルボキシ末端に付加されて担体にポリペプチドを結合することを助けるこ とができる。ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端で付加されたシステ イン残基がジスルフィド結合を介して接合体を生成するのに特に有益であること がわかった。しかしながら、接合体を調製するのに当業界で公知のその他の方法 が又使用し得る。例示の付加的な連結操作として、ミカエル付加反応生成物、グ ルタルアルデヒドの如きジ−アルデヒドの使用、Klipstein ら，J.Infect.Dis． 147: 318-326（1983）等、又は担体へのアミド結合を形成するための水溶性カル ボジイミドの使用のようなカルボジイミドの使用が挙げられる。活性化官能基に よるタンパク質接合又はカップリングの総説に関して、Aurameasら，Scand.J．I mmunol．8(Suppl．7): 7-23(1978)を参照のこと。 有益な担体が当業界で公知であり、一般にはタンパク質そのものである。この ような担体の例はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、エデスチン、チロ グロブリン、アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)又はヒト血清アル ブミン(HSA)、赤血球、例えば、ヒツジ赤血球(SRBC)、破傷風トキソイド、及び コレラトキソイド、並びにポリアミノ酸、例えば、ポリ（Ｄ−リシン：Ｄ−グル タミン酸）、等である。 担体の選択は接種源の最終用途に更に依存し、そして種々の基準に基いている 。例えば、接種すべき特別な動物中で不利な反応を生じない担体が選択されるべ きである。 本発明の接種源は有効な免疫原量の本発明のEPR-1 タンパク質又はポリペプチ ドを含む。上記のように、更に小さいポリペプチドが接合体（即ち、担体に結合 されたもの）として使用されてもよい。単位投薬量当たりのポリペプチド又はタ ンパク質の有効量は、当業界で公知のように、特に、接種される動物の種、動物 の体重、及び選択された接種レジメに依存する。接種源は典型的には接種（投薬 ）当たり約10μg 〜約500mg 、好ましくは投薬当たり約50μg 〜約50mgのポリペ プチド又はタンパク質濃度を含む。 “投薬量”又は“単位投薬量”という用語は、それが本発明の接種源に関する ように、動物に関して単体投薬として好適な物理的に不連続の単位を表し、夫々 の単位は必要とされる希釈剤、即ち、担体、又はビヒクルと混在して所望の免疫 原効果を生じるように計算された前もって決められた量の活性物質を含む。本発 明の接種源の新規な単位投薬量に関する仕様は、(a)活性物質の特異な特性及び 得られる特別な免疫効果、及び(b)本明細書に詳しく開示されるような、動物に おける免疫学的使用のためにこのような活性物質を配合する当業界に固有の制限 により指示され、またこれらに直接依存し、これらは本発明の特徴である。 接種源は典型的にはポリペプチド、ポリペプチド−接合体、又はタンパク質を 生理学上寛容される（許される）希釈剤又はビヒクル、例えば、水、食塩水又は 食塩加リン酸緩衝液に分散させて水性組成物を生成することにより調製される。 例えば、EPR-1 タンパク質を含む接種源は典型的には同じ生理学上寛容される希 釈剤中の分散により実質的に純粋なEPR-1 タンパク質から調製される。このよう な希釈剤が当業界で公知であり、また例えば、レミントンの医薬科学、第16編、 マック・パブリッシング社、イーストン、PA（1980）1465〜1467頁に説明されて いる。 又、接種源は希釈剤の成分としてアジュバントを含んでいてもよい。完全フロ イントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)及びミョウバン の如きアジュバントが当業界で公知の物質であり、また幾つかの源から市販され ている。 3.抗体及び組成物 本タンパク質又はポリペプチドと免疫反応する抗体組成物が又本発明内に意図 されている。抗体組成物は細胞表面と会合され、又は細胞構造から遊離している タンパク質又はポリペプチドと免疫反応する。こうして、抗体組成物は細胞の外 表面でタンパク質又はポリペプチドにより提示された一種以上のエピトープ又は 無細胞ポリペプチドもしくはタンパク質のエピトープに結合する。 本発明の好ましい抗体組成物は、細胞表面で提示されたEPR-1 タンパク質分子 又はEPR-1 分子がその分子を有する細胞の溶解後に単離される時のような細胞成 分を含まないEPR-1 タンパク質分子と免疫反応する。これに関して特に好ましい 抗体組成物は、7G12、9D4 、及び12H1と称されるモノクローナル抗体(mAb)であ る。このようなmAb が本明細書及びAltieri ら，J.Biol.Chem.264(5): 2969(198 9)及びAltieri ら，J.Immum．145: 246(1990)に記載されたようにして得られる 。又、ポリクローナル抗体が意図されている。簡単に言えば、好ましい抗体組成 物は、マウスをヒト因子Ｖ、因子VIII又は本発明のポリペプチドで免疫すること により産生される。産生された抗体は本発明のポリペプチド、例えば、EPR-1 に 対する結合アフィニティーについてスクリーニングされる。単離されたEPR-1 又 は因子Ｖもしくは因子VIIIを含まない洗浄リンパ球に関するEPR-1 が抗体をスク リーニングするのに使用し得る。 ここに開示されたmAb の多くが因子Ｖ及びEPR-1 の両方と免疫反応する。しか しながら、因子Ｖに相同であるが、同一ではないポリペプチドが本mAb を得るの に使用される場合、mAb は標的ポリペプチドと免疫反応するが、因子Ｖと免疫反 応しないことが好ましい。又、開示されたmAb の幾つかが因子VIIIタンパク質と 免疫反応できるかもしれない。 本発明の抗体は凝固因子Xaの受容体、例えば、EPR-1 に結合し得る。第一世代 抗EPR-1 抗体及びそれらの同族体は因子Xaを細胞表面の部位に結合することから 競合的に抑制するのに使用し得る。こうして、細胞表面付近の因子Xaのプロテア ーゼ活性が低下し得る。その結果、本発明は又EPR-1 への因子Xaの結合の抑制方 法を意図している。本明細書に開示された第二世代抗EPR-1 抗体（これはリンパ 増殖を抑制するが、因子Xa結合を抑制しない）が、本明細書に開示されているよ うに又有益である。 ここに意図されている好ましい抗体組成物は典型的には哺乳類をヒトEPR-1 又 は本発明のポリペプチドを含む接種源で免疫することにより産生され、それによ り免疫原ポリペプチドに適した免疫特異性を有する抗体分子を哺乳類中で誘発す る。次いで抗体分子は哺乳類から回収され、スクリーニングされ、そして公知の 技術、例えば、固体担体に固定された免疫原を使用するイムノアフィニティー精 製を使用して所望の程度まで精製される。こうして産生された抗体組成物は、特 に、本発明の診断方法及び診断系に使用されて細胞、例えば、慢性リンパ性白血 病(CLL)を有する患者の白血球の表面の本ポリペプチドの発現を検出し得る。 又、モノクローナル抗体組成物(mAb)が上記のように本発明により意図されて いる。“モノクローナル抗体組成物”という用語は、その種々の文法上の形態で 、特別な抗原と免疫反応できる抗体結合部位の唯一の種を含む抗体分子の集団を 表す。こうして、本mAb 組成物は典型的にはそれが免疫反応するあらゆる抗原に 対する単一結合アフィニティーを示す。しかしながら、所定のモノクローナル抗 体組成物は二つの異なる抗体結合部位を有する抗体分子を含んでいてもよく、夫 々が異なる抗原決定基に対し免疫特異性であり、即ち、二特異性モノクローナル 抗体である。 本mAb は典型的には一種の抗体分子を分泌（産生）する単一細胞（即ち、ハイ ブリドーマ）のクローンにより産生された抗体を含む。好ましいハイブリドーマ をその調製方法が本明細書に記載され、上記の細項目１に記載される。 本発明は本発明のEPR-1 タンパク質又はポリペプチド、そして必要により哺乳 類から得られた因子Ｖ又はVIIIタンパク質と免疫反応するモノクローナル抗体の 生成方法を意図している。その方法は、下記の工程を含む。 (a)動物を本発明のEPR-1 タンパク質又はポリペプチドもしくはこれらに相同 のタンパク質、例えば、因子Ｖ又はVIIIタンパク質で免疫する工程。免疫原とし ての EPR-1 の少なくとも一部の使用が好ましい。免疫原は主題動物種から直接 採取されたタンパク質であってもい。しかしながら、抗原は又、その抗原が小さ い時、例えば、配列番号２として本明細書に同定されたアミノ酸残基配列のシー ケンシャルサブセットから実質的になるポリペプチドである時にはキーホールリ ンペットヘモシアニンの如きキャリヤータンパク質に連結し得る。その免疫化は 典型的にはその試料を免疫有効量、即ち、免疫応答を生じるのに充分な量で免疫 応答能のある哺乳類に投与することにより行われる。哺乳類はげっ歯類、例えば 、ウサギ、ラット又はマウスであることが好ましい。次いで哺乳類は哺乳類が免 疫原と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を生産するのに充分な期間にわたっ て維持される。 (b)次いで免疫された哺乳類から除去された抗体産生細胞の懸濁液が調製され る。これは典型的には哺乳類の脾臓を除去し、個々の脾臓細胞を当業界で公知の 方法を使用して生理学上寛容される培地中で機械的に分離することにより行われ る。 (c)懸濁された抗体産生細胞が形質転換された（“不死化された”）細胞系を 生産できる形質転換剤で処理される。形質転換剤及び不死化細胞系を生産するた めのそれらの使用が当業界で公知であり、ＤＮＡウイルス、例えば、エプスタイ ン−バーウイルス(EBV)、シミアンウイルス40(SV40)、ポリオーマウイルス等、 ＲＮＡウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MuLV)、ラウス肉 腫ウイルス等、ミエローマ細胞、例えば、P3X63-Ag8.653 、Sp2/O-Ag14等を含む 。 好ましい実施態様において、形質転換剤による処理は懸濁された脾臓細胞を好 適な融合プロモーターの使用により好適な細胞系、例えば、SP-2からのマウスミ エローマ細胞と融合することにより“不死化された”ハイブリドーマの生産をも たらす。好ましい比は約10⁸ の脾細胞を含む懸濁液中ミエローマ細胞当たり約５ の脾臓細胞である。好ましい融合プロモーターは約１０００から約４０００まで の平均分子量を有するポリエチレングリコール（PEG1000 、等として市販されて いる）である。しかしながら、当業界で知られているその他の融合プロモーター が使用されてもよい。 使用される細胞系は所謂“薬剤耐性”型であることが好ましく、その結果、未 融合ミエローマ細胞が選択培地中で生存せず、一方、ハイブリッドが生存するで あろう。最も普通のクラスは８−アザグアニン耐性細胞系であり、これらは酵素 ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いており、そ れ故、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地により支持さ れないであろう。又、使用されるミエローマ細胞系は、それ自体で抗体を産生し ない所謂“非分泌”型であることが一般に好ましい。しかしながら、或る場合に は、分泌ミエローマ系が好ましいことがある。 (d)次いで形質転換された細胞が、好ましくは単クローン性まで、クローン化 される。そのクローニングは未形質転換細胞を持続（支持）しない組織培地中で 行われることが好ましい。形質転換細胞がハイブリドーマである場合、これは典 型的には未融合ミエローマ細胞を持続しない選択培地中の未融合脾臓細胞、未融 合ミエローマ細胞、及び融合細胞（ハイブリドーマ）の混合物を別個の容器中で 希釈し、培養することにより行われる。細胞が未融合細胞を死滅させるのに充分 な時間（約１週間）にわたってこの培地中で培養される。その希釈は限界希釈で あってもよく、この場合、希釈剤の容積は夫々別個の容器（例えば、ミクロタイ タ・プレートの夫々のウェル）中或る数の細胞（例えば、0.3 〜0.5)を単離する ように統計上計算される。培地は薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）未 融合ミエローマ細胞系を持続しない培地（例えば、HAT 培地）である。 (e)クローン化された形質転換体の組織培地が分析（免疫分析）されて、本EPR -1 関連タンパク質もしくはポリペプチド又はEPR-1 受容体分子を有する細胞と 優先的に反応する抗体分子の存在を検出する。これは公知の免疫学的技術を使用 して行われる。 (f)次いで所望の形質転換体が適当な時間の長さにわたって適当な組織培地中 で選択され、増殖され、続いて所望の抗体が公知の技術により培養上澄みから回 収（収穫）される。好適な培地及び培養時間の長さが又公知であり、又は容易に 決定される。 極めて大きい濃度のわずかに純粋ではないモノクローナル抗体を産生するため に、所望のハイブリドーマが注射によりマウス、好ましくは同系又は半同系のマ ウスに移入し得る。ハイブリドーマは好適なインキュベーション時間後に抗体産 生腫瘍の形成をもたらし、これが宿主マウスの血流及び腹膜浸出液（腹水）中の 所望の抗体の高濃度（約５〜20mg/ml)をもたらす。 これらの組成物の調製に有益な培地及び動物は両方とも当業界で公知であり、 市販されており、合成培地、近交マウス等を含む。例示の合成培地は、4.5gm/l のグルコース、20mMのグルタミン、及び20％のウシ胎児血清を補給したダルベッ コ最小必須培地(DMEM; Dulbecco ら，Virol．8: 396(1959))である。好ましい近 交マウス系はBalb/cである。 本発明の抗体分子を産生（分泌）する本ハイブリドーマの生産方法は当業界で 公知であり、本明細書に更に説明される。妥当なハイブリドーマ技術の特に適用 可能な記載がNiman ら，PNAS USA 80: 4949-4953（1983）、及びGalfreら，Meth .Enzymol．73: 3-46(1981)により示されており、これらの記載が参考として本明 細書に含まれる。 又、モノクローナル抗体はキメラ抗体を産生する当業者に公知の方法により産 生し得る。これらの方法は、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を含む可変領域の部 分と、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を含む可変領域の部分の両方を含む免疫グ ロブリン可変領域の全部又は一部をコードする核酸を単離し、操作し、発現する ことを含む。その可変領域をコードする核酸を単離し、操作し、原核生物宿主及 び真核生物宿主中で発現する方法が以下の文献に開示されており、その開示が参 考として本明細書に含まれる。Robinsonら，PCT 国際公開番号WO 89/0099; Win- ter ら，欧州特許公開番号0239400; Reading，米国特許第4,714,681 号; Cabil- lyら，欧州特許公開番号0125023; Sorgeら，Mol.Cell Biol．4: 1730-1737(1984 );Beher ら，Science 240: 1041-1043(1988); Skerra ら，Science 240: 1030-1 041(1988);及びOrlandi ら，PNAS USA 86: 3833-3837（1989）。典型的にはその 核酸は前もって選択された抗原（リガンド）を結合する免疫グロブリン可変領域 の全部又は一部をコードする。このような核酸の起源は当業者に公知であり、例 えば、前もって選択された抗原を結合するモノクローナル抗体を産生するハイ ブリドーマから得られ、又は前もって選択された抗原が複数の免疫グロブリン可 変領域をコードする発現ライブラリーをスクリーニングし、こうして核酸を単離 するのに使用し得る。 本抗体組成物を生成するのに更に好ましい方法はHuseらの方法，Science 246: 1275（1989）を使用するFab 分子のライブラリーの生成をともなう。この方法に おいて、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖のｍＲＮＡ分子が免疫された動物から単離される。 ｍＲＮＡはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を使用して増幅される。次いで核酸 がλファージにランダムにクローン化されて組換えファージ粒子のライブラリー を生成する。ファージはE.coliの如き発現宿主を感染するのに使用される。次い でE.coli及び相当するファージ組換え体が所望のFab 断片を生産するものについ てスクリーニングし得る。好ましいλファージベクターはλgt11及びλzap2であ る。 本発明の抗体分子を含む組成物は溶液又は懸濁液の形態をとり得る。活性成分 として抗体分子を含む組成物の調製は当業界で良く理解されている。典型的には 、このような組成物は液体溶液又は懸濁液として調製されるが、液体中の溶解、 又は懸濁に適した固体形態が又調製し得る。又、その製剤は乳化し得る。活性な 治療成分は、そのアッセイに干渉せず、かつ活性成分と適合性である賦形剤とし ばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グ リセロール、エタノール、等、及びこれらの組み合わせである。加えて、所望に より、組成物は少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤等を含ん でいてもよく、これらは活性成分の有効性を高める。 抗体分子組成物は中和された許される塩形態に更に製剤化し得る。許される塩 として、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸 等の如き有機酸で生成される酸付加塩（抗体分子の遊離アミノ基により生成され る）が挙げられる。又、遊離カルボキシル基で生成される塩は無機塩基、例えば 、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム 、又は水酸化第二鉄、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチル アミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等の如き有機塩基から誘導し得る 。 H.診断アッセイ方法 本発明はEPR-1 分子、EPR-1 同族体、又はそのポリペプチド部分の検出方法を 意図している。又、そのアッセイはEPR-1 に相同の細胞表面受容体だけでなく、 EPR-1 それ自体を検出するのに使用し得る。そのアッセイは抗体特異性の適当な 選択によりEPR-1 に特異性にし得る。又、本発明のアッセイはEPR-1 の部分に相 同のポリペプチド受容体だけでなく“遊離”受容体、即ち、特別な細胞構造と会 合されていないポリペプチド又はタンパク質、EPR-1 に相同のポリペプチド、又 はそのポリペプチド部分を同定するのに使用し得る。典型的には、アッセイ方法 はCLL 細胞の如き細胞表面に露出されたEPR-1 を検出することを伴うが、未結合 形態、即ち、細胞膜に結合されていないEPR-1 タンパク質及びポリペプチドを検 出するためのアッセイが又意図されている。 標的種に対する試薬分子の相対結合アフィニティーはフローミクロフルオロメ トリー(FMF)の方法を使用して本明細書に記載されたようにして都合良く測定さ れる。こうして、標的抗原、例えば、EPR-1 を発現する細胞は、細胞表面抗原へ の本蛍光標識抗体の結合のために細胞と関連する蛍光強さがが前もって特定され た閾値レベルを越える時にはいつでも指示される。標識抗体は典型的にはフルオ レセインイソチオシアネート接合(FITC)されているが、その他の公知の蛍光標識 が使用し得る。 本発明の抗原性タンパク質又はポリペプチドの検出方法は、本明細書に開示さ れたように、タンパク質又はポリペプチドと抗ポリペプチド抗体分子の免疫反応 生成物の生成を含むことが好ましい。検出すべき抗原は血液試料又は生体組織試 料中に存在し得る。免疫反応生成物は当業者に公知の方法により検出される。多 数の臨床診断化学操作が検出可能な免疫複合体を生成するのに使用し得る。 又、本EPR-1 受容体又はポリペプチドに関するタンパク質又はポリペプチドリ ガンド（非抗体組成物）がそのアッセイ方法に使用し得る。本発明のこの局面に おける例示のリガンドは標識因子Xa酵素である。こうして、例示のアッセイ方法 が本明細書に記載されるが、本発明はこのように限定されない。 本発明の好ましいアッセイ方法は試料中のEPR-1 細胞表面受容体又は可溶性EP R-1 の存在を測定し、それにより個体又は試料中のEPR-1 発現のレベルを確かめ ることを伴う。種々の不均一アッセイプロトコル及び均一アッセイプロトコル が、生体試料、好ましくは細胞を含む試料中の細胞表面受容体（例えば、EPR-1 ）の存在、好ましくはその量を検出するのに、競合的又は非競合的に使用し得る 。本明細書に開示されたアッセイプロトコルは因子Ｖ及びVIIIからEPR-1 分子又 はそのポリペプチド部分を区別することができる。アッセイに特に好ましい受容 体は、CCL 細胞で発現された、配列番号２として本明細書に同定されたEPR-1 で ある。 一つの有益な方法は、分析すべき細胞及び／又は液体を含む生体試料、好まし くはヒトドナー又は患者から得られた生体試料を、EPR-1 タンパク質又はポリペ プチドと免疫反応できる記載された範囲内の抗体組成物の一つと混合することを 含む。又、細胞試料は混合工程の前に洗浄されて凝固因子Ｖ及びVIIIを除かれて もよい。こうして生成された免疫反応混合物は適当なアッセイ条件、例えば、生 物学的アッセイ条件のもとに抗原を発現する細胞又は可溶性抗原が抗体組成物中 の抗体と免疫反応して抗体−受容体免疫複合体を生成するのに充分な時間の期間 にわたって維持される。次いで免疫反応生成物（免疫複合体）が混合物中に存在 する未反応の抗体から分離される。次いで、生成された免疫反応生成物の存在、 所望によりその量が測定される。次いで、生成された生成物の量が細胞により発 現された受容体の量、又は発現された可溶性抗原の量と相関させられる。 生成された免疫反応生成物の存在又はその量の測定は、その生成物を同定する のに選ばれた方法に依存する。例えば、標識抗体が本発明の受容体分子（例えば EPR-1 ）と標識免疫複合体を生成するのに使用し得る。標識免疫複合体は以下に 説明されるような夫々の標識、例えば、蛍光標識、放射能標識、ビオチン標識等 を検出するのに適した方法により定量し得る。又、未標識抗体が未標識免疫複合 体を生成するのに使用されてもよく、続いてこれが未標識抗体を認識する標識抗 体を未標識免疫複合体と免疫反応させることにより検出される。それにより免疫 複合体は標識されるようになり、上記のようにして検出し得る。 これらのアッセイに使用される生物学的条件は、本発明の抗体、EPR-1 細胞標 識分子、及びタンパク質又はポリペプチド分子の生物活性を維持する条件である 。これらの条件として、約４℃〜約45℃の温度範囲、好ましくは約37℃、約５〜 約９のpH値範囲、好ましくは約７、及び蒸留水のイオン強度から約１モルの塩化 ナ トリウムまで変化するイオン強度、好ましくは生理食塩水のイオン強度が挙げら れる。このような条件の最適化方法が当業界で公知である。 好ましい実施態様において、分析すべき生体試料がドナー又は患者から採取さ れ、アリコートに配分される。少なくとも一つのアリコートが、本発明の抗体組 成物を使用して抗原発現の測定に使用される。所望により、第二アリコートがそ の試料との対照抗体の反応性を測定するのに使用し得る。これらの分析は同時に 行い得るが、通常は連続的に行われる。 本発明の更なる局面において、本アッセイで得られたデータがタンジブル媒体 、例えば、コンピュータ貯蔵又はハードコピーバージョンにより記録される。そ のデータは自動的に入力でき、そして市販されている通常のアナログ／デジタル (A/D)装置により貯蔵し得る。又、そのデータは検索され、そしてデータの本相 関関係を最も良く表示するようにとの所望に応じて報告又は表示し得る。それ故 、本法による使用に適した装置及びソフトウェアが本発明の範囲内に意図されて いる。 本発明の抗体組成物及び方法は、慢性リンパ性白血病(CLL)、及びその他の疾 患で冒された患者の治療の監視方法を与え、この方法においてEPR-1 受容体の発 現が症状と相関させられる。例えば、EPR-1 マーカーを発現する細胞の頻度はCL Lを患う患者の治療に対する応答に反比例することがわかる。更に、EPR-1 ⁺ 型 の有毛状細胞性白血病(HCL)で冒された患者は本抗体組成物により検出されるマ ーカーを発現し、それにより治療の監視を可能にする。 それ故、治療に対する患者の応答の監視方法が意図されており、この方法にお いてその疾患のマーカーは検出可能であり、かつ／又は検出される。その方法は EPR-1 マーカーについて分析すべき細胞を含む生体試料を上記のアッセイ方法に 従って本発明の抗体組成物と混合することを含む。その混合物は前もって特定さ れた反応条件下で免疫反応生成物を生成するのに充分な時間の期間にわたって維 持される。生成された免疫反応生成物の量が初期の症状と相関させられる。これ らの工程が治療レジメ中の後の時期に繰り返され、それにより治療に対する患者 の応答の測定を可能にし、細胞表面で発現されたEPR-1 分子の数の減少が症状の 改善を示す。 I.診断系 上記アッセイを行うための診断系が又本発明の範囲内にある。本発明の診断系 はキット形態であることが好ましく、そして少なくとも一つのアッセイに充分な 量で、本発明の抗体分子（又はその断片）を含む組成物を別々にパッケージされ た試薬として含む。抗体分子は標識されてもよく、又は標識試薬が別々にパッケ ージされ、そしてキット内に入れられてもよく、この場合、その標識は免疫反応 生成物が存在するか否を示すことができる。一種以上のパッケージされた試薬の 使用におけるガイダンスを与える印刷された指示が又種々の好ましい実施態様に おいて含まれていてもよい。“指示”又は“使用に関する指示”という用語は典 型的には試薬濃度又は少なくとも一つのアッセイ方法パラメーター、例えば、混 合すべき試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物に関する維持時間の期間、温度 、緩衝液条件、等を記載する明確な表示を含む。 一実施態様において、細胞を含む試料中の細胞で発現されたEPR-1 受容体の存 在について分析するための診断系が意図されている。別の実施態様において、EP R-1 タンパク質及び／又はポリペプチドの存在、前記タンパク質及び／又はポリ ペプチドが細胞表面で発現されるか否かについて分析するのに使用するための診 断系が意図されている。 好ましいキットは典型的には細胞試料中の細胞のEPR-1 関連受容体分子と免疫 反応することができる抗EPR-1 抗体用の容器を含むエンクロージャー（パッケー ジ）として提供される。典型的には又、キットは、抗EPR-1 抗体及びEPR-1 受容 体、タンパク質、又はポリペプチドが免疫反応する時に生成される免疫複合体と 免疫反応する標識抗体プローブを含む。 別の変化において、好ましいキットはEPR-1 受容体分子（その受容体分子は試 験試料中の細胞物質に付着されているか、又はそれから自由にされているかを問 わない）と免疫反応できる抗EPR-1 抗体を含む容器を含むエンクロージャー（パ ッケージ）として提供される。典型的には又、キットは、抗EPR-1 抗体とEPR-1 受容体の免疫複合体と免疫反応する標識抗体プローブを含む。 標識は普通に入手し得る標識、例えば、フルオレセイン、フィコエリスリン、 ローダミン、¹²⁵I、等のいずれであってもよく、これらに限定されない。その他 の例示の標識として、¹¹¹In 、⁹⁹Tc、⁶⁷Ga、及び¹³²I並びに非放射性標識、例え ば、ビオチン及び酵素結合抗体が挙げられる。抗体分子に結合され、又はそれに とり込まれる標識又は指示手段が、本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物 の一部として意図されている。又、意図されている標識は別々に使用されてもよ く、またこれらの原子又は分子が単独で又は付加的な試薬と組み合わせて使用し 得る。この性質の多くの有益な標識が臨床診断化学において知られている。 ポリペプチド及びタンパク質への標識の結合が又公知である。例えば、ハイブ リドーマにより産生された抗体分子は、培地中の成分として提供される放射性同 位元素含有アミノ酸の代謝とり込みにより標識し得る。例えば、Galfreら，Meth .Enzymol．73: 3-46(1981)を参照のこと。タンパク質接合又は活性化官能基によ るカップリングの技術が特に適用できる。例えば、Aurameasら，Scand.J.Inmlun ol.8(補遺7): 7-23（1978）、Rodwell ら，Biotech．3: 889-894(1984)、及び米 国特許第4,493,795 号（最後の特許が参考として本明細書に含まれる）を参照の こと。 又、本診断系は特定の結合剤を含んでいてもよい。“特定の結合剤”は、本発 明の試薬種を選択的に結合することができる化学種であるが、それ自体は本発明 の抗体分子ではない。例示の特定の結合剤は、抗体が上記免疫複合体の一部とし て存在する時に本発明の抗体分子と反応する、抗体分子、補体タンパク質又はそ の断片、プロテインＡ等である。好ましい実施態様において、特定の結合剤は標 識される。しかしながら、診断系が標識されない特定の結合剤を含む場合、その 薬剤は典型的には増幅手段又は試薬として使用される。これらの実施態様におい て、標識された特定の結合剤は、増幅手段が本試薬の一種を含む複合体に結合さ れる時に増幅手段を特異的に結合することができる。 例えば、本発明の診断キットは“ELISA”フォーマットに使用されて生体試料 又は体液試料、例えば、血清、血漿もしくは尿又は細胞の洗剤溶解産物、例えば 、10mMのCHAPS 溶解産物中のEPR-1 タンパク質又はポリペプチドの存在又は量を 検出し得る。“ELISA”は固相に結合された抗体又は抗原と試料中に存在する抗 体又は抗原の量を検出し、定量するための酵素−抗原又は酵素−抗体接合体とを 使用する酵素結合免疫吸着検定法を表す。ELISA 技術の説明が1982年にロスアル トス、 CAのランゲ・メディカル・パブリケーションズにより発行された、D.P.Sites ら 著、基本的かつ臨床上の免疫学の第４編の22章並びに米国特許第3,654,090 号、 同第3,850,752 号、及び同第4,016,043 号に見られ、これらの特許の開示が参考 として本明細書に含まれる。 好ましい実施態様において、抗体又は抗原試薬成分は固体マトリックスに固定 されて主題診断系中に別々にパッケージされる固体担体を形成し得る。その試薬 は典型的には水性媒体から吸着により固体マトリックスに固定されるが、当業者 に公知のその他の固定の様式、例えば、特異的結合方法が使用し得る。例えば、 本抗EPR-1 抗体は表面に固定されて、EPR-1 分子又はEPR-1 受容体を発現する細 胞を含む溶液を分析するのに使用し得る。又、EPR-1 、EPR-1 同族体、EPR-1 の ポリペプチド断片又はEPR-1 同族体、並びにEPR-1 を発現する完全又は部分溶解 された細胞がその表面に固定され、そして固定された種と免疫反応する抗体組成 物について溶液をスクリーニングするのに使用し得る。 これに関して有益な固体マトリックス物質として、ファーマシア・ファイン・ ケミカルズ（ピスキャットアウェー、NJ）から商品名セファデックスとして入手 し得る誘導体化された架橋デキストラン、誘導体化形態及び／又は架橋形態のア ガロース、直径約１ミクロン〜約５mmのポリスチレンビーズ（ノースシカゴ、IL のアボット・ラボラトリーズから入手し得る）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン 、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロンをベースとするウェ ブ、例えば、シート、ストリップ又はパドル、チューブ、プレート、ミクロタイ タプレートのウェル、例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル製のもの、等が 挙げられる。 本明細書に記載された診断系の試薬種、標識された特定の結合剤又は増幅剤は 溶液中に、液体分散物として、又は実質的に乾燥した粉末として、例えば、凍結 乾燥形態で用意し得る。指示手段が酵素である場合、その酵素の基質が又キット 又は系の別々のパッケージ中に用意されてもよい。通常、これらの試薬は不活性 雰囲気下でパッケージされる。前記ミクロタイタプレートの如き固体担体及び一 種以上の緩衝剤が又この診断アッセイ系中に別々にパッケージされた要素として 含まれていてもよい。 診断系は通常のパッケージ中に通常含まれる。このようなパッケージとして、 ガラス及びプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカー ボネート）のびん、バイアル、プラスチックエンベロープ及びプラスチック−箔 積層エンベロープ等が挙げられる。 J.治療方法 本明細書に実証されたようにEPR-1 に結合し、リンパ増殖を抑制する抗EPR-1 抗体の能力に鑑みて、本発明の抗EPR-1 抗体はEPR-1 アンタゴニストとして治療 に使用されてEPR-1 への因子Xa及び同様の分子の結合を町市し、こうしてリンパ 球増殖の誘発を中断又は阻止し得る。リンパ球増殖の抑制は、特に、個体がリン パ増殖性疾患、例えば、CLL 又はHCL にかかりやすい時に、種々の指示において 望ましい。 その方法は、リンパ増殖複合体の一種以上の前駆体（例えば、EPR-1 ）を含む と考えられる試料を、EPR-1 への因子Xa、因子Xa同族体、又は分裂作用及び／又 はリンパ増殖作用を有するその他の分子の結合を抑制するのに充分な量の抗EPR- 1 抗体を含む本発明の治療組成物とin vivo 又はin vitroで接触させることを含 む。一実施態様において、in vivo 接触は本発明の抗EPR-1 抗体を含む治療有効 量の生理学上寛容される組成物を患者に投与し、それにより患者中のリンパ球増 殖を抑制することにより行われる。 こうして、一実施態様において、本発明はヒトに治療有効量の本発明の抗EPR- 1抗体を投与することを含む、哺乳類、好ましくは、そして例えば、ヒトのリン パ球増殖の抑制方法を記載する。好ましい実施態様において、抗EPR-1 抗体はモ ノクローナルである。一実施態様において、抗EPR-1 抗体は2E1 、2C11、2D4 、 3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる群から選ばれる。別の実施態様において、 EPR-1 抗体は2E1 である。 本法を実施するのに代表的な患者はリンパ増殖性疾患、例えば、慢性リンパ性 白血病(CLL)又は有毛状細胞性白血病(HCL)のおそれのあるヒトである。 抗EPR-1 抗体の治療有効量は、所望の効果を得るように、即ち、患者中に存在 するEPR-1 を結合し、かつ／又はEPR-1 （膜で発現されるか、又は可溶性形態で 発現されるかを問わない）への結合のためにXaと結合し、こうして患者中のリン パ球増殖の可能性を低下するように、計算された前もって決められた量である。 （前記のように、開示された範囲内の第一世代抗EPR-1 mAb は因子Xa結合を抑制 し、一方、開示された第二世代抗EPR-1 mAb は抑制しない）。in vivo 治療の場 合、有効量はCLL 又はHCL と関連する一種以上の症候の改善により測定し得る。 こうして、本発明の抗EPR-1 抗体の投与に関する投薬量範囲は、リンパ球増殖 の症候が軽減され、又は増殖の可能性が低減される所望の効果を生じるのに充分 に大きいものである。その投薬量は副作用を生じる程に大きくてはならないが、 いずれの副作用も現在知られていない。一般に、投薬量は患者の年齢、状態、及 び性別により変化するだけでなく、患者の疾患の程度及び重度により変化し、当 業者により決定し得る。投薬量は合併症の場合に個々の医師により調節し得る。 本発明の抗EPR-1 抗体の治療有効量は、典型的には、それが生理学上寛容され る組成物中に投与される場合に、約１ピコモル(pM)から1,000 ナノモル(nM)まで 、好ましくは約100pM から約50nMまで、最も好ましくは約１nMから30nMまでの血 漿濃度又は局所濃度を得るのに充分であるような量である。 本発明の抗EPR-1 抗体は注射又は経時の徐々の注入により非経口投与し得る。 本発明の抗EPR-1 抗体は静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、皮下、腔内、経皮、 又は皮膚に投与でき、そして又それらはぜん動手段により送出されてもよい。一 般に、静脈内、腹腔内、又は皮下の投与が好ましい。 本発明の抗EPR-1 抗体を含む治療組成物は、通常、例えば、単位投薬の注射に よるように静脈内投与される。“単位投薬”という用語は、本発明の治療組成物 に関して使用される時には、患者のための単体投薬として適した物理的に不連続 の単位を表し、夫々の単位は必要とされる希釈剤、即ち、担体、又はビヒクルと 混在して所望の治療効果を生じるように計算された前もって決められた量の活性 物質を含む。 これらの組成物はその投薬製剤と適合性の方法で、かつ治療有効量で投与され る。投与すべき量は治療すべき患者、活性成分を利用す患者の系の能力、及び所 望される治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要とされる活性成分の正 確な量は医師の判断に依存し、夫々の個体に特別のものである。しかしながら、 全身適用に適した投薬量範囲が本明細書に開示され、投与量の経路に依存する。 初期投与及びブースターショットに適したレジメは又可変であるが、初期投与、 続いてその後の注射又はその他の投与による１時間以上の間隔の反復投与により 代表される。又、in vivo 治療について明記された範囲の血中濃度を維持するの に充分な連続の静脈内注入が意図されている。 K.治療組成物 本発明の治療組成物は、活性成分としてその中に分散された、本明細書に記載 された本発明の抗EPR-1 抗体の少なくとも一種と一緒に生理学上寛容される担体 を含む。好ましい実施態様において、治療組成物は治療目的でヒト患者に投与さ れる時に免疫原性ではない。 本明細書に使用される“医薬上許される”、“生理学上寛容される”という用 語及びその文法上の変化は、それらが組成物、担体、希釈剤、賦形剤、及び試薬 を表す際には、互換可能に使用され、その物質が望ましくない生理学的作用、例 えば、悪心、目眩、胃の不調等を生じないで哺乳類又はヒトに投与できることを 表す。 その中に分散された活性成分を含む薬理学的組成物の調製は当業界で良く理解 されている。典型的には、このような組成物は水性又は非水性の液体溶液又は懸 濁液として無菌組成物として調製されるが、使用前の液体中の懸濁液が又調製し 得る。 活性成分は、医薬上許され、かつ活性成分と適合性であり、本明細書に記載さ れた治療方法に使用するのに適した量の賦形剤と混合し得る。好適な賦形剤は、 例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びこれ らの組み合わせである。更に、所望により、その組成物は活性成分の有効性を高 める少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤等を含み得る。 本発明の治療組成物はその中に成分の医薬上許される塩を含み得る。医薬上許 される塩として、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸、又は酢酸、酒石酸、マンデ ル酸等の如き有機酸で生成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で生成 される）が挙げられる。又、遊離カルボキシル基で生成される塩が無機塩基、例 えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシ ウム又は水酸化第二鉄、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチ ルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の如き有機塩基から誘導し得る 。 生理学上寛容される担体は当業界で公知である。液体担体の例は、活性成分及 び水の他に物質を含まないか、又は生理pH値でリン酸ナトリウムの如き緩衝剤、 生理食塩水又はその両方、例えば、食塩加リン酸緩衝液を含む無菌水溶液である 。更に、水性担体は一種より多い緩衝塩だけでなく、塩化ナトリウム及び塩化カ リウムの如き塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ ール及びその他の溶質を含み得る。 又、液体組成物は水に加えて、又水を除いて液相を含み得る。このような付加 的な液相の例はグリセリン、綿実油の如き植物油、オレイン酸エチルの如き有機 エステル、及び水−油エマルションである。 治療組成物は典型的には治療組成物の合計の重量当たり少なくとも0.1 重量％ の抗EPR-1 抗体の量の本発明の抗EPR-1 抗体を含む。重量％は抗EPR-1 抗体と合 計組成物の重量比である。こうして、例えば、0.1 重量％は合計組成物100g当た り0.1gの抗EPR-1 抗体である。 抗EPR-1 抗体を含む組成物、又はその中の有益な化合物の治療有効量は、所望 の効果を得るように、即ち、与えられる利益に応じて、組成物が投与される個体 に有効に益するように、計算された前もって決められた量である。こうして、有 効量は患者中に生じるリンパ増殖性疾患の症状と関連する一種以上の症候の改善 により測定し得る。 こうして、本発明の抗EPR-1 抗体の投薬量範囲は、治療すべき症状が回復され る所望の効果を生じるのに充分に大きいものである。投薬量は副作用を生じない 程度に大きくてはならない。一般に、投薬量は患者の年齢、状態、及び性別、並 びに患者の疾患の程度により変化し、当業者により決定し得る。投薬量は合併症 の場合には個々の医師により調節し得る。 これらの組成物は投薬製剤と適合性の方法で治療有効量で投与される。本発明 の抗EPR-1 抗体組成物の治療量は、所望の結果を生じるのに充分な量であり、症 状及び治療化合物の効力に応じて広く変化し得る。投与すべき量は、治療すべき 患者、活性成分を利用する患者の系の能力、及び所望される治療効果の程度に依 存する。投与されるのに必要とされる活性成分の正確な量は医師の判断に依存し 、 夫々の個体に特別のものである。しかしながら、全身適用に関する好適な投薬量 範囲が本明細書に開示されており、投与の条件に依存する。又、投与に適したレ ジメは可変であるが、初期投与、続いてその後の投与による１時間以上の間隔の 反復投薬により代表される。 EPR-1 のカウンター−受容体リガンド（それが可溶性形態又は細胞表面会合形 態であるかを問わない）は開示された範囲内の診断方法及び治療方法に従って有 益であり得ることが更に意図されている。例えば、EPR-1 受容体への因子Xa又は 実質的に同様のリンパ増殖性を有する分子（即ち、その他のEPR-1 リガンド）の 結合を阻止する合成ペプチド又はポリペプチドは有益な診断化合物及び治療化合 物である。EPR-1 への因子Xaの結合を阻止する有益なペプチド又はポリペプチド として、第一世代抗体、例えば、13E5、12H1、等、前記第一世代抗体に実質的に 相同である分子、及び第一世代抗EPR-1 抗体の活性を模擬する分子が挙げられる 。 又、このようなペプチド及びポリペプチドは、2E1 エピトープを占有すること により、又はEPR-1 受容体分子への因子Xa（又はその他のEPR-1 リガンド）の結 合に干渉し、又はリンパ球増殖の開始を中断させるEPR-1 に対するその他の配座 変化を誘発することにより2E1 の如き第二世代抗EPR-1 抗体を模擬し得る。又、 本明細書に開示されたように有益なペプチド及びポリペプチドとして、リンパ増 殖を刺激しないで、EPR-1 へのその結合を模擬することに関して因子Xaに実質的 に相同であるEPR-1 リガンド分子が挙げられる。 加えて、リンパ球分裂シグナリングに直接に、又は共同で関与するEPR-1 リガ ンドは、特に、免疫応答の刺激が所望される時に、本発明の診断方法及び治療方 法に有益であることが意図されている。この状況に有益なEPR-1 リガンドとして 、因子Xa及びその同族体並びに種々の第一世代モノクローナル抗体、例えば、mA b 13E5又は12H1が挙げられる。同時刺激分子が又これに関して有益であり得るこ とが更に意図されている。例えば、同時刺激シグナル、例えば、CD28:B7/B7-2受 容体−カウンター受容体対により協調されたシグナルはin vivo の免疫応答の抗 原特異性メカニズムを維持するのに重要な役割を果たすので、これらの分子及び 同様の同時刺激効果を有するその他の分子は本明細書に開示されたリンパ球増殖 の調節に有益であろうと予測される。本発明の同時刺激分子として、OKT3の如き 抗 CD3 mAb、又はその他の非分裂濃度のPMA と組み合わせて投与されるmAb 12H1又 は13E5が挙げられる（例えば、下記の実施例12を参照のこと）。 本明細書に使用される“治療有効な”又は“有効な”という用語は、互換可能 に使用でき、本発明の治療組成物、例えば、抗EPR-1 モノクローナル抗体を含む 組成物の量を表す。例えば、抗EPR-1 抗体を含む組成物、又はその中の有益な化 合物の治療有効量は、所望の効果を得るように、即ち、与えられる利益に応じて 、組成物が投与される個体に有効に益するように計算された前もって決められた 量である。こうして、有効量は患者中に生じるリンパ増殖性疾患の症状と関連す る一種以上の症候の改善により測定し得る。 又、治療有効量は患者中のリンパ球増殖を少なくとも約10％、好ましくは少な くとも約25％、更に好ましくは少なくとも約50％、最も好ましくは少なくとも約 75〜100 ％だけ測定可能に抑制するのに充分な量であり得る。本発明のmAb 及び 化合物は典型的には溶液又は懸濁液の形態の医薬組成物として投与される。しか しながら、本発明の治療組成物は又錠剤、ピル、カプセル、エーロゾル、徐放性 製剤又は粉末として治療投与のために製剤化し得る。 これらの組成物は投薬製剤と適合性の方法で治療有効量で投与される。投与す べき量は、治療すべき患者、及び活性成分を利用する患者の能力に依存する。投 与されることを必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、夫々 の個体に特別なものである。しかしながら、好適な投薬量範囲は個体当たり毎日 １ミリグラム〜数ミリグラムのオーダーのものであり、投与の経路に依存する。 初期投与及びブースターショットに適したレジメは又可変であるが、初期投与、 続いてその後の注射又はその他の投与による１時間以上の間隔の反復投与により 代表される。 又、血中の治療有効濃度を維持するのに充分な連続の静脈内注入が意図されて いる。本発明の抗体分子の治療有効な血中濃度は、約0.01μM 〜約100 μM 、好 ましくは約0.1 μM 〜約10μM 、更に好ましくは約0.1 μM 〜約1.0 μM の範囲 である。 実施例 下記の実施例は本発明を説明することを目的とするものであり、本発明を限定 するものではない。 実施例１ EPR-1 の単離及び精製 A.細胞及び細胞培養 PMN(多形核白血球)を酸−クエン酸デキストロース凝固阻止された血液からデ キストラン沈降により単離した。血小板に富む血漿を400 x g で22℃で18分間に わたってフィコール−ハイペーク（シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO）（ 密度=1.077g/ml）による低速示差遠心分離により除去した後に、PBMC（末梢血単 核細胞）を分離した。PBMCを５mMのEDTA-PBS、pH7.2 中で徹底的に洗浄し、５mM のEDTAを含む自己血清中で30分間にわたって37℃で２回インキュベートして血小 板−単球ロゼット形成を阻止した。単球を37℃で１時間にわたって自己血清で前 被覆されたプラスチックペトリ皿への付着によりPBMCから単離した。細胞を検出 可能な内毒素を含まないRPMI 1640 培地（イルビン・サイエンティフィック、サ ンタアナ、CA）及び10％の熱不活化FCS(ウシ胎児血清；ゲミニ・バイオプロダク ツ社、カラバサス、CA)、２mMのＬ−グルタミン（イルビン）、25mMのHEPES（カ ルビオケム・ベーリング・ディアグノスチック、ラ・ジョラ、CA）、100 μg/ml のゲンタマイシン（ゲラマイシン、シェリング社、ケニルワース、NJ）中で１〜 1.5 x 10⁷/mlで懸濁させた。 単球細胞系THP-1(ATCC)を10μM の2-ME（イーストマン・コダック、ロチェス ター、NY）で更に補給した上記培地中で連続培養に保った。形質転換又はトラン スフェクトされたヒト白血病リンパ腫Ｔ細胞系HuT 78、MOLT 4、CCRF-CEM、CCRF -HSB-2 、並びにヒトＢリンパ腫細胞系Raji及びDaudi(ATCC)を推奨されるように 標準プロトコル当たり培養液中に保った。ヒト白血病リンパ腫Ｔ細胞系Jurkat、 MLT 、PEER、及びMOLT 13 は全てアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン(ATCC、ベセスダ、MD)から入手し得る。 混合リンパ球応答に関して、20 x 10⁶の新たに単離されたPBMCをT-25排気フラ スコ（コスター社、ケンブリッジ、MA）中で20 x 10⁶の照射された(10,000 ラド )Raji細胞又はDaudi 細胞の存在下で培養した。培養物を５％のCO₂ の保湿イン キュベーター中で７日間にわたって37℃でRPMI 1640 、10％のFCS 、25mMのHEPE S 、 10μM の2-ME(混合リンパ球培地(MLC))中に保った。応答細胞を回収し、400 x g で18分間にわたって22℃でフィコール−ハイペークによる遠心分離により単離 し、完全MLC 培地中で洗浄し、次いで24ウェルプレート（コスター社、ケンブリ ッジ、MA）中で2 x 10⁵/ウェルで20 x 10⁶の照射されたDaudi 細胞又はRaji細胞 の存在下で培養した。 本明細書に記載された研究用のPMBCは典型的には正常なヒトボランティアから の全血から得られた。フィコール−ハイペーク勾配（シグマ・ケミカル社、セン トルイス、MO）による単離後に、PBMCをダルベッコのPBS 中で２回洗浄した。 PBMCを10％のDMSO及び90％の熱不活化FCS(アーマー・ファーマシューティカル社 、カンカキー、IL)の溶液中で懸濁させ、次いで使用するまで液体窒素中で貯蔵 することができた。（液体窒素中の貯蔵後のPBMCの細胞表面抗原及び増殖応答は 新鮮なリンパ球の性質と同様である）。 照射されたDauji 又はRajiにより刺激された同種異系反応性細胞の長期培養に 関して、応答Ｔ細胞を上記プロトコルに従って６日毎に移入し、10％のＴ細胞成 長因子（セルラー・プロダクト社、バッファロー、NY）を含むMLC 培地中で再度 培養した。幾つかの研究において、1 x 10⁶/mlの新たに単離されたPBMCの懸濁液 を７日間にわたって５％のCO₂ 中で37℃で１μg/mlのCon A(カルビオケム)又は １μg/mlのPHA(フィトヘマグルチニン、カルビオケム)で処理した。これらの培 養からの細胞のアリコートを種々の時間間隔で回収し、洗浄し、FMF(フローミク ロフルオロメトリー)により分析した。 B.EPR-1 の単離及び精製 下記の操作に従って第一世代抗EPR-1 mAb 12H1(Altieri ら，上記文献(1990)) を使用して、EPR-1 をMOLT13細胞抽出物から単離し、アフィニティー精製した。 （mAb 12H1の調製及び同定が以下の実施例2.A.に更に記載される）。 MOLT13細胞(10⁹)を、0.05M のNaCl、0.05M のトリスHCl 、0.5 ％のCHAPS(カ ルビオケム、サンジエゴ、CA)、１mMのCaCl₂ 、１mMのPMSF、１mMのベンズアミ ジン、10μM のＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメ チルケトン（ベーリンガー・マンハイム、インジアナポリス、IN）、25μg/mlの ロイペプチン（ベーリンガー）、及び25μg/mlの大豆トリプシンインヒビター （シグメ・ケミカル社、セントルイス、MO）、pH8/4 を含む溶解緩衝液中で30分 間にわたって４℃で可溶化した。細胞溶解産物をパンソルビン（ファーマシア・ ファイン・ケミカルズ、ピスキャットアウェー、NJ）１mlで前吸着し、40,000rp m で１時間にわたって４℃で超遠心分離により清浄し、４℃で14時間にわたって 抗EPR-1 mAb 12H1（腹水の1:100 希釈）とともにインキュベートし、続いて４℃ で更に４時間にわたって50μg/mlのアリコートのセファロース接合ヤギ抗マウス IgG(カルビオケム)とともにインキュベートした。溶離したタンパク質を非還元 条件下で単一ウェルの7.5 ％のSDS ポリアクリルアミドスラブゲルによる電気泳 動により分離し、クーマシーブルー染色により視覚化した。 図2Aに示されるように、前記操作に従って単離され、溶離され、非還元条件下 で7.5 ％のSDS ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけられたEPR-1 は、約62 kDa の見掛Mrで、62〜74 kDa範囲内の相対分子量を有していた。充分な量のEPR- 1 を本明細書に開示された範囲内の方法及び操作による使用のためにこの操作に より単離した。 実施例２ モノクローナル抗体(mAb)の産生 種々のクラスの抗体を下記の方法に従って産生した。開示された範囲内の抗体 がその後の実施例に更に記載され、特性決定される。 A.第一世代抗EPR-1 モノクローナル抗体の調製 EPR-1 を同定し、単離するのに使用した第一世代モノクローナル抗体(mAb)の 多くを、最初に免疫原として精製因子Ｖを使用して産生した。ヒト因子Ｖの精製 及び特性決定に関する実験操作をAltieri ら，J.Biol.Chem．264: 2969（1989） に記載されたようにして行った。 簡単に言えば、BALB/cマウスをCFA(完全フロイントアジュバント；カルビオケ ム、サンジエゴ、CA)中の因子Ｖ50μg で腹腔内で免疫し、ハイブリドーマを記 載されたようにして生成した。抗体選択のスクリーニング戦略はTHP-1 細胞との ハイブリドーマ培養液の反応性のFMF による分析を含んでいた。THP-1 細胞の98 ％以上と反応する６種のハイブリドーマを固相RIA 中の抗体産生及び固定因子Ｖ を使用する免疫ブロッティングに関して選択し、限界希釈による２〜４回連続の サブクローニングにより最後に樹立した。 又、精製因子Ｖによる多重免疫化により生じたウサキポリクローナル抗血清を FMF によりスクリーニングし、上記戦略に従って特性決定した。加えて、因子Ｖ による免疫化により誘発されたmAb の第二パネル（これらはウェスタンブロット により因子Ｖと反応性であったが、FMF によりTHP-1 細胞とは反応性ではなかっ た）を選択し、樹立した。 mAb 7G12(IgG2a)、9D4(IgG1)、及び12H1(IgM)(ATCC 受理番号HB10637)の精製I gフラクションをAffi-gel MAPS II又はヒドロキシアパタイトカラム（バイオ− ラド、リッチモンド、CA）によるクロマトグラフィーにより調製した。抗Ｖウサ ギポリクローナル抗血清B78.9 の精製Igフラクションを硫酸アンモニウム分別及 びDEAEセファデックスによるクロマトグラフィーにより調製した。免疫精製され たB78.9 抗体を製造業者の指示に従ってAffigel 15（バイオラド、リッチモンド 、CA）で固定された精製因子Ｖから単離した。 B.第二世代抗EPR-1 モノクローナル抗体の調製 EPR-1 をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、新規なmAb パネルを EPR-1 ⁺ 細胞系MOLT13に対して産生した。マウスハイブリドーマを公表されたプ ロトコル(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969-2972(1989))に従って連続免疫化 によりMOLT13リンパ球に対して産生した。簡単に言えば、マウスハイブリドーマ を、公表されたプロトコル(Altieriら，J.Immunol．145: 246(1990))に従ってア ジュバントを使用しないで10⁶ の無傷生存細胞による連続の腹腔内免疫化により 無傷EPR-1 ⁺ MOLT13細胞に対して産生した。ハイブリドーマ培養液を最初にフロ ーサイトメトリーによりMOLT13細胞とのそれらの反応性についてスクリーニング し、続いて上記実施例1.B.に記載された操作に従って、第一世代抗EPR-1 mAb 12 H1（Altieri ら，上記文献(1990)を使用してMOLT13細胞抽出物からアフィニティ ー精製された単離されたEPR-1 とのそれらの反応性についてウェスタンブロット においてスクリーニングした。 免疫精製されたEPR-1 をイモビロン膜（ミリポア社、ベッドフォード、MA）に 対し電気ブロットし、そしてフローサイトメトリーによりスロットブロッター装 置中でMOLT13細胞と反応する中とともにインキュベートした。一次mAb の結合が ５μg/mlの¹²⁵I-F(ab')₂ヤギ抗マウスIgG(タゴ社、バーリンゲーム、CA)の添加 及びオートラジオグラフィーにより明らかにされた。 幾つかのmAb はMOLT13細胞に強く結合し、ウェスタンブロットにおいて免疫精 製されたEPR-1 を認識し、¹²⁵I表面標識PBMC抽出物からEPR-1 を免疫沈殿した。 ７種のmAb を本明細書中2C11、2D4 、2E1 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 として 同定した。７種の全てをIgG_2a イソタイプに属するものとして特性決定した。 これらの第二世代mAb は、第一世代mAb(例えば、9D4 、12H1)と違って、EPR-1 への因子Xa結合を抑制しない。第一世代モノクローナル抗体はEPR-1 への因子X a結合を抑制することができる。更に、欠失マッピング実験は、抗体の二つのク ラス（第一世代及び第二世代）が交差競合しないことを確かめた。 これらのmAb の一つ(2E1)を更なる研究のために選択し、本明細書に記載され たEPR-1 ｃＤＮＡの機能性発現クローニングに使用した（下記の実施例４を参照 のこと）。ハイブリドーマから精製されたIgG フラクションは、MAPS II系（モ ノクローナル抗体精製系、バイオラド、リッチモンド、VA）を使用してアフィニ ティークロマトグラフィーにより精製されることが好ましい。 図2Aに示されるように、EPR-1 ⁺ MOLT13リンパ球(4x10⁸)の無血清懸濁液を、0 .05M のトリスHCl 、0.15M のNaCl、0.3 ％のCHAPS 、１mMのCaCl₂ ＋プロテア ーゼインヒビター、pH7.4 を含む溶解緩衝液中で溶解した。細胞抽出物を6,000 X g で30分間にわたって４℃で遠心分離により核及びその他の不溶性物質から清 浄し、そして絶えず攪拌して1:100 の腹水希釈抗EPR-1 mAb 12H1(IgG)とともに ４℃で14時間にわたって更にインキュベートした。免疫複合体を50μg/mlのアリ コートのセファロース接合ヤギ抗マウスIgG(カルビオケム、ラ・ジョラ、CA)の 添加により４℃で４時間にわたって沈殿させ、溶解緩衝液中で６回洗浄し、溶離 し、非還元条件下で7.5 ％SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で電気泳動にか けた。溶離したタンパク質をクーマシーブルーR250で染色した。 図2Bに示されるように、ハイブリドーマによる抗MOLT13と単離されたEPR-1 の 反応性が示される。マウスハイブリドーマを公表されたプロトコル(Altieriら， J.Biol.Chem．264: 2969-2972(1989)、又上記実施例１を参照のこと)に従って連 続免疫化によりMOLT13リンパ球に対して産生した。図2Aに示された免疫精製さ れたEPR-1 をイモビロン膜（ミリポア）に電気ブロットし、ブロット緩衝液中で ４℃で一夜ブロックし、そしてスロットブロッター装置中で22℃で２時間にわた って種々の抗MOLT13ハイブリドーマとともにインキュベートした。洗浄後に、一 次mAb の結合が22℃で２時間にわたる¹²⁵I- ヤギ抗マウスIgG の５μg/mlのアリ コートの添加、続いて乾燥移入のオートラジオグラフィーにより明らかにされた 。夫々のレーンは単離されたEPR-1 との個々の抗MOLT13ハイブリドーマの反応性 に相当する。示されるように、ハイブリドーマ2E1 、2D4 、2C11、3H7 、3G8 、 3G10、及び6F1 を含む、７種のハイブリドーマはEPR-1 と反応性の免疫グロブリ ンを産生した。 図2Cは¹²⁵I表面標識リンパ球抽出物からのEPR-1 の免疫沈殿を示す。2B中の単 離されたEPR-1 と反応する抗MOLT13ハイブリドーマの一つ(mAb 2E1)を既に記載 されたようにして(Altieriら，上記文献(1989); Altieri ら，上記文献(1990)) 標識ヨウ素標識リンパ球抽出物の免疫沈殿実験に使用した。レーン１、抗EPR-1 mAb 2E1;レーン２、対照mAb 6B4。相対分子量マーカー(MW)が図2A、2B、及び2C の夫々の左側に示される。 図2A-Cに示された研究の結果は、THP-1 細胞(Altieriら，上記文献(1989))か ら既に分解されたブロードMr約74kDa バンドとは反対に、PBMC抽出物から単離さ れたEPR-1 がMr約62kDa の更にシャープなバンドとして現れることを示した。先 の観察(Altieriら，上記文献(1989))と一致して、mAb 2E1 は同じ実験条件下で 第一世代抗EPR-1 mAb 12H1又は13E5により免疫沈殿されたバンドとは分子量及び 構造編成について区別できない、ブロードMr約74kDa バンドとしてEPR-1 を¹²⁵I 表面標識THP-1 細胞から免疫沈殿した（図2A-Cを比較のこと）。そのデータはEP R-1 に関するmAb 2E1 の認識を確かめ、そしてPBMCとTHP-1 細胞の間のEPR-1 Mr の変化が受容体グリコシル化における細胞特異性の差異を反映し得ることを示唆 した（下記を参照のこと）。第一抗EPR-1 mAb パネル(Altieriら，上記文献1989 ))と変化して、mAb 2E1 のみがTHP-1 細胞に関してプロトロンビン活性化をわず かに抑制し（示されていない）、こうして異なるエピトープ認識を示した。 1.アフィニティークロマトグラフィー 簡単に言えば、抗EPR-1 mAb の精製IgG フラクション27mg(例えば、2.08mg/ mlのmAb 2E1)を絶えず攪拌して４℃で14時間にわたって0.1MのMES(シグマ・ケミ カル社、セントルイス、MO)、0.5 ％のトリトンX-100(シグマ)、及び0.5 ％のNP -40(シグマ)、pH6.5 中でAffi-Gel（バイオラド）にカップリングした。mAb に カップリングされたAffi-Gelを４℃で10分間にわたって1,000 rpm で遠心分離し 、そして1MのNaCl、0.5 ％のトリトン/NP-40、0.01％のNaN₃、次いで0.1Mのグリ シン、0.5 ％のトリトン/NP-40、0.01％のNaN₃、pH4.5、最後に0.1Mのグリシン 、0.5 ％のトリトン/NP-40、0.01％のNaN₃、pH2.7 で連続して洗浄した。MOLT13 細胞(1 X 10⁹)を、0.5 ％M のNaCl、0.05％M のトリスHCl 、0.5 ％のCHAPS（カ ルビオケム社、ラ・ジョラ、CA）、１mMのCaCl₂ 、１mMのフェニルメチルスルホ ニルフルオリド(PMSF)、１mMのベンズアミジン、10μM のＤ−フェニルアラニル −Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン(PPACK、ベーリンガーマン ハイム、ラ・ジョラ、CA)、10μg/mlのロイペプチン（ベーリンガー・マンハイ ム）、10μg/mlの大豆トリプシンインヒビター（シグマ、セントルイス、MO）、 pH8.4 を含む溶解緩衝液中で絶えず攪拌して４℃で30分間にわたって溶解した。 細胞溶解産物を４℃で30分間にわたってパンソルビン（ファーマシア・ケミカ ル社、ピスキャットアウェー、NJ）１mlとともにインキュベートし、そして４℃ で１時間にわたって40,000 rpmで超遠心分離により核及びその他の洗剤不溶性物 質を除いて清浄した。Affi-gelカップリングしたEPR-1 mAb（2E1）を絶えず攪拌 して４℃で14時間にわたってMOLT13細胞抽出物とともにインキュベートし、そし て上記の同溶解緩衝液中で洗浄した。食塩加トリス緩衝液(TBS)、pH7.0 （フラ クション１−15、夫々0.5 ml）中の洗浄後、mAb 2E1 結合物質を1MのNaCl（フラ クション16−20）、続いて0.1Mのグリシン、pH4.5（フラクション21−30）、0.1 MのNaCl（フラクション31−34）中で更に洗浄し、最後に0.1Mのグリシン、pH2.7 （フラクション35−55）中で溶離した。アフィニティークロマトグラフィー実 験において洗浄及び溶離に使用した全ての緩衝液は0.5 ％のCHAPS を含んでいた 。 これらのフラクションを1MのトリスHCl 、pH9.6 で直ちに中和し、一夜凍結乾 燥し、100 ％のアセトン中で洗浄し、TBS/0.5 ％のCHAPS 、pH7.2 中で再度懸濁 させた。溶離された物質のアリコートを還元条件又は非還元条件下で10％のSDS ゲルで電気泳動にかけ、以下に記載されたようにしてmAb 2E1 による免疫ブロッ ティングのために更に処理した。mAb アフィニティー精製された物質のアミノ末 端配列決定をオンラインHPLCを備えたアプライド・バイオシステムズ気相配列決 定装置で行った。 2.免疫ブロッティング及び免疫沈殿 種々の細胞系からのmAb 2E1 アフィニティー精製された物質又は洗剤可溶化抽 出物のアリコートを7.5 ％又は10％のSDS ゲルによる電気泳動により分離し、22 ℃で２時間にわたって450mAmpsでイモビロン膜（ミリポア）に対し電気ブロット した。その移動膜をTBS + ５％の無脂肪乾燥ミルク、pH7.4 中で４℃で14時間に わたってブロックし、更に22℃で２時間にわたって20μg/mlのアリコートのmAb 2E1 又はその他の一次mAb とともにインキュベートした。又、mAb 2E1 又はその 他の第二世代抗EPR-1 mAb の未希釈の培養上澄みを使用した。 TBS、pH7.4 中で３回洗浄した後、移動膜を更に22℃で更に２時間にわたって¹ 25I標識ヤギ抗マウスF(ab')₂断片（タゴ社、バーリンゲーム、CA）の５μg/mlの アリコートとともにインキュベートした。洗浄後、コダックX-Omat AR-X 線フィ ルム及び強化スクリーン（クロネックス、デュポン社、ウィルミントン、DE）を 使用して、放射性バンドを乾燥移動膜のオートラジオグラフィーにより視覚化し た。 免疫沈殿実験において、HEL細胞又はMOLT細胞(5 X 10⁷)のアリコートをIODO-G EN 法により2.5mCiの¹²⁵I-Na(アメーシャム社、アーリントン・ハイツ、IL)で表 面標識し、PBS 、pH7.4 中で徹底的に洗浄し、0.5 ％のCHAPS 溶解緩衝液中で溶 解し、４℃で１時間にわたって40,000 X gで超遠心分離により清浄した。¹²⁵I標 識細胞溶解産物のアリコートを、既に詳細に記載されたようにして(Altieriら， J.Immunol．145: 246(1990); Altieri ら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989))、対 照mAb 6B4 又は抗EPR-1 mAb 2E1 で免疫沈殿のために処理した。代謝標識に関し て、MOLT13細胞(4 X 10⁷)の懸濁液を37℃で２時間にわたって８％のCO₂ のイン キュベーター中で１mCi の³⁵S-メチオニン（アメーシャム）の存在下でDMEM無メ チオニン培地（ウィットテーカー）中で培養した。細胞を完全RPMI 1640 培地 中で徹底的に洗浄し、0.5 ％のCHAPS 溶解緩衝液中で溶解し、超遠心分離により 清浄し、Altieri ら，上記文献(1989)及びAltieri ら，上記文献(1990)に記載さ れたようにして免疫沈殿のために処理した。 免疫精製されたEPR-1 をイモビロン膜（ミリポア）に電気ブロットし、ブロッ ト緩衝液中で一夜にわたって４℃でブロックし、スロットブロッター装置中で22 ℃で２時間にわたって種々の抗MOLT13ハイブリドーマとともにインキュベートし た。洗浄後、一次mAb の結合が22℃で２時間にわたる¹²⁵I- ヤギ抗マウスIgG の ５μg/mlのアリコートの添加、続いて乾燥移動膜のオートラジオグラフィーによ り明らかにされた。夫々のレーンは単離されたEPR-1 との個々の抗MOLT13ハイブ リドーマの反応性に相当した（図2A-2C を参照のこと）。 ７種のmAb はフローサイトメトリーによりMOLT13細胞に強く結合し、ウェスタ ンブロットにおいて免疫精製されたEPR-1 と反応し（図2A及び2B）、¹²⁵I表面標 識リンパ球抽出物からEPR-1 を免疫沈殿させた（図2C）。これらの７種の抗体は 2E1 、2D4 、2C11、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 を含む。 これらのmAb の一つ(2E1)によるヒトλgt11ｃＤＮＡライブラリーの免疫スク リーニングは単一陽性クローン(λ104)を生じ、これはノーザンブロットにおい て種々の造血EPR-1 ⁺ 細胞系から抽出されたＲＮＡ中1.9 Kbのメッセージでハイ ブリッドを形成した。 単離されたEPR-1 と反応性の抗体を産生した抗MOLT13ハイブリドーマの一つ(m Ab 2E1)を既に記載されたプロトコル(Altieriら，上記文献(1989); Altieriら， 上記文献(1990))に従って表面ヨウ素標識リンパ球抽出物の免疫沈殿実験に使用 した。レーン１、抗EPR-1 mAb 2E1;レーン２、対照mAb 6B4 。相対分子量マーカ ー(MW)が図2A、2B、及び2Cの夫々の左側に示される。 C.EPR-1 融合タンパク質のmAb EPR-1 使用外ドメイン、推定トランスメンブランドメイン、及び細胞質テール の2/3 をコードする800 bp PstI サブクローンを原核生物発現ベクターpRSET A （インビトロゲン、サンジエゴ、CA）中にインフレームで挿入し、E.coli中でバ クテリア融合タンパク質(Mr 約31 kDa)として発現し、そして製造業者の仕様書 に従って、金属イオン結合カラムを使用してバクテリア溶解産物から精製した。 EPR-1 融合タンパク質を使用して完全／不完全フロイントアジュバント中の連 続免疫化によりウサギ中で配列特異性抗体を産生した。抗融合タンパク質抗体は WT-CHOからではなくEPR-1 CHO トランスフェクタントからEPR-1（Mr 約62 kDa） を免疫ブロットし、これは正常なリンパ球抽出物から抗EPR-1 mAb 9D4 により免 疫ブロットされた分子とは構造上区別できない（データは示されない）。 D.非抗EPR-1 mAb 記載された範囲内の方法に従って使用された抗CD16 mAb はLeu 11b(ベクトン ディキンソン、マウンテンビュー、CA)、B73.1 及び3G8 を含んでいた。（後者 はフィラデルフィア、PAにあるウィスター・インスティチュートのG.Trinchieri 博士の贈答物であった）。抗CD56 mAb NKH-1（Leu 19）はヒアリー、FLにあるコ ウルター・イムノロジーから購入された。抗CD11b mAb 及び抗CD18 mAbは夫々OK M1及び60.3であった。CD57(HNK-1)、CD3(OKT3)、CD4(OKT4)、CD8(OKT8)、CD2(OK T11)、HLA クラスＩ(W6/32)のmAb をATCC（ロックビル、MD）から獲得した。抗 α／βＴ細胞受容体(TCR)mAb WT31をベクトン・ディキンソン（マウンテンビュ ー、CA）から購入し、また抗γ／δTCR mAb δ1 はM.B.Brenner 博士（ハーバー ド・メディカル・スクール、ボストン、MA）により親切に提供された。 実施例３ 結合反応 異なる細胞型と種々のmAb の相互作用をフローミクロフルオロメトリー(FMF) により評価した。簡単に言えば、1 x 10⁶の細胞を、飽和濃度の夫々のmAb を含 むＶ底ミクロタイタプレート（コスター社、ケンブリッジ、MA）中で４℃で30分 間にわたってインキュベートした。MLC 培地中の洗浄後に、フルオレセイン接合 ヤギF(ab')₂抗マウスIgG + IgM(タゴ社、バーリンゲーム、CA)の1/20希釈アリコ ートを４℃で更に30分間にわたって添加した。細胞を洗浄し、直ちにベクトン・ ディキンソンIV/40 FACS（ベクトン・ディキンソン、マウンテンビュー、CA）で 分析した。同時の２色FMF 分析を既に記載されたようにして(Altieriら，J.Biol .Chem．264: 2969(1989))ビオチン（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン 、シグマ、セントルイス、MO）で前もって接合されたmAb 7G12又は9D4 を使用し て行い、フィコエリスリン−接合ストレプトアビジン試薬（タゴ社、バーリンゲ ー ム、CA）の1/20希釈液により明らかにした。 種々の細胞集団について行われた２色FMF 分析の正確さを確かめるために、研 究の二つの追加の組を又行った。最初に、ビオチニル化mAb との第二FITC接合抗 マウス試薬の可能な交差反応を避けるために、種々の抗Ｔ細胞又は抗NK（ナチュ ラルキラー）細胞関連マーカーmAb と混在したウサギポリクローナル抗体B78.9 のビオチン接合アリコートを使用することによりこれらの研究を繰り返した。 更に一連の研究において、直接にFITC接合されたmAb 7G12又は9D4(クロマプロ ーブ社、レッドウッドシティー、CA)を又ビオチン接合mAb OKT3、OKT4、OKT8と 組み合わせて使用した。細胞選別研究について、HuT 78細胞(1.5 x 10⁷/ml)を抗 Ｖポリクローナル抗血清B78.9 、続いてフルオレセイン接合ヤギ抗ウサギIgG(タ ゴ社、バーリンゲーム、CA)とともにインキュベートした。B78.9 ⁺ HuT 78細胞( HuT 78 ^* 、未分別集団の34％)を2000細胞／秒のスイープ速度で負の圧力下でベ クトン・ディキンソン・ファックスターで単離し、完全MLC 培地中で洗浄し、そ して20％のFCS で補給されたHuT 78ならし培地中で0.3 、１、及び３細胞／ウェ ルで96ウェル丸底プレート（コスター社、ケンブリッジ、MA）中で限界希釈によ りクローン化した。３週間後に、ポイズン分布に基いて単一細胞クローン起源の 増殖細胞をサブクローン化し、樹立し、更にFMF により表現型特性決定した。 因子Xaの単離、特性決定、及び¹²⁵I標識に関する操作は Altieriら，J.Biol． Chem．264: 2969(1989)により既に記載されたとおりであった。HuT 78^* 細胞と^{1 25} I-Xa のの相互作用を、次第に増加する濃度の¹²⁵I-Xa(0.45 〜36 nM)を2.5 mM のCaCl₂ の存在下で20分間にわたって室温で1.5 〜2 x 10⁷/mlの細胞懸濁液とと もにインキュベートすることにより分析した。そのインキュベーションの終了時 に、その反応をシリコーン油の混合物中で２分間にわたって12,000 x gで細胞懸 濁液のアリコートの遠心分離により停止して細胞関連放射能を除いて分離した。 非特異的結合をそのインキュベーション反応の開始時に添加された50倍のモル過 剰の未標識因子Xaの存在下で定量し、合計から引いて正味の特異的結合を得た。 幾つかの研究において、HuT 78^* 細胞のアリコートを連続濃度の¹²⁵I-Xa の添加 前に室温で30分間にわたって50μg/mlのmAb 9D4 とともにプレインキュベートし た。 HuT 78^* の懸濁液を2.5 mMのCaCl₂ の存在下で次第に増加する濃度の¹²⁵I-Xa で平衡にした時に、これらの細胞は提供されたリガンドを特異的かつ濃度依存性 の反応で結合し、30〜36 nM の添加された¹²⁵I-Xa で定常飽和に接近した（デー タは示されない）。THP-1 細胞で先に得られた結果(Altieriら，J.Biol．Chem． 264: 2969(1989))と定量的に同様に、この反応は10〜20nMのオーダーの見掛Kdに より調節され、そして¹²⁵I-Xa の194,000 ±26,000分子がHuT 78^* 細胞の表面で 特異的に会合された時に飽和された（示されない）。最後に、飽和量のmAb 9D4 と一緒のHuT 78^* 細胞のプレインキュベーションはこれらの細胞への¹²⁵I-Xa 特 異的結合の完全な終了を生じた（示されない）。 実施例４ EPR-1 分子の単離 EPR-1 分子の均一性までの単離は高レベルのこの表面抗原を構成的に発現する 細胞型の同定及び／又は樹立を必要とした。これらの研究を主として末梢血多形 核白血球(PMN)及び親T細胞系MOLT13 #3（Altieriら，J.Immunol．145: 246-253( 1990)）からの特別に選択されたT細胞クローナル誘導体に関して行った。 下記の研究の結果がここに、詳細な説明の項目Ｂに、また上記実施例2.B.に説 明される。 A.細胞及び細胞培養物 Ｔ白血病細胞系MOLT13、単球THP-1 、Ｂリンパ腫Dauji 、及びＴ白血病MLT(全 てATCC、ロックビル、MDから入手できる)を、10％のウシ胎児血清(FCS、ウィッ トテーカー)、１mMのＬ−グルタミン（ウィットテーカー）、及び10^-5M のβ− メルカプトエタノール（イーストマン・コダック、ロチェスター、NY）を含むRP MI 1640 培地(M.S．ウィットテーカー、ウォーカーズビル、MD)中で増殖させた 。(あらゆるEPR-1 ⁺ MOLT13細胞系が本明細書に開示されるように有益であると 推定されるが、MOLT13 #3 として同定された好ましい細胞系が寄託され、ATCC受 理番号CRL 10638 を与えられた）。 サブラインMOLT13 #3 は、抗EPR-1 mAb 12H1を使用して親系列MOLT13の蛍光選 別の２回の連続サイクルにより樹立された。蛍光分析によりmAb 12H1との最高レ ベルの反応性を発現するMOLT13細胞のみを単離し、１または３細胞／ウェルで限 界希釈することによりクローン化し、集密まで増殖させ、最後にフローサイトメ トリーによりmAb 12H1だけでなく種々のＴ細胞関連マーカーに対して誘導された mAb のパネルとの反応性について再度スクリーニングした。上記のようにして樹 立されたサブラインMOLT13 #3 は親系列と較べて７〜10倍高いレベルのEPR-1 を 発現した。 B.モノクローナル抗体 抗EPR-1 mAb 12H1(IgM)、13E5（IgG 2a）及び9D4(IgG1)の樹立及び特性決定が 既に報告されていた(Altieriら，上記文献(1989)及び(1990))。抗組織因子mAb 6 B4 を本明細書に記載された種々の実験で対照抗体として使用した。mAb 6B4 はEdgington らの米国特許第5,110,730 号明細書に記載されており、その関係が ある開示が参考として本明細書に含まれる。（モノクローナル抗体6B4 は、米国 特許第5,110,730 号として特許されたその出願に連係してブタペスト条約の要件 に従って1987年３月27日にATCCに寄託され、受理番号HB9381を指定された）。 抗EPR-1 ハイブリドーマの新規なパネルを生じるために、公表されたプロトコ ル(Altieriら，上記文献(1989))に従って、また上記実施例２に記載されたよう にして、マウスをアジュバントを含まない10⁶ のMOLT13リンパ球／注射のアリコ ートで連続的に免疫した（生存度>97 ％）。 C.免疫沈殿 末梢血単核細胞(PBMC)又は単球THP-1 細胞の¹²⁵I表面標識洗剤可溶化抽出物を 既に記載された方法(Altieriら，上記文献(1989)及び(1990))を使用して第一世 代抗EPR-1 mAb 13E5、又は本明細書に記載された新規なmAb 2E1 で免疫沈殿させ た。免疫沈殿を溶解緩衝液中で６回洗浄し、非還元条件下で10％SDS-ポリアクリ ルアミドゲルによる電気泳動により分離し、そして放射性バンドを乾燥ゲルのオ ートラジオグラフィーにより視覚化した。結果が図２に示され、更に上記実施例 2.B.に説明される。 D.EPR-1 ｃＤＮＡの分子クローニング Ｔ細胞系MLT から構築されたヒト、オリゴdT感作λgt11ｃＤＮＡライブラリー をmAb 2E1 を用いる免疫スクリーニング実験に使用した。（λgt11ライブラリー はクロンテク(パロアルト、CA);ストラタゲン（ラ・ジョラ、CA);及びインビト ロゲン（サンジエゴ、CA）の如き供給業者から市販されている）。10mMのイソプ ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG、カルビオケム、ラ・ジョラ、 CA）で誘発された100 万のプラークを二重ニトロセルロースフィルター（ミリポ ア社、ベッドフォード、MA）に移し、0.02％のトゥイーン20（シグマ・ケミカル 社、セントルイス、MO）、pH7.4 を含むTBS 中で洗浄し、TBS ＋５％の無脂肪乾 燥ミルク、pH7.4 中でブロックし、そして22℃で２時間にわたって50μg/mlの抗 EPR-1 mAb 2E1 とともにインキュベートした。洗浄後、フィルターを５μg/mlの¹²⁵ I-F(ab')₂ヤギ抗マウスIgG とともにインキュベートし、洗浄し、オートラジ オグラフィーに露出した。クローンλ104 として同定された、mAb 2E1 と反応性 の陽性クローンを単離し、連続３ラウンドの免疫スクリーニングによりプラーク 精製し、ｐブルースクリプト(pBSKS^- 、ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA)中でサ ブクローン化し、そして制限及びＤＮＡ配列分析により特性決定した。 ³²P ランダム感作（ベーリンガー・マンハイム）標識λ104 を使用して下記の オリゴdT感作ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。λgt11 MLT、λ gt11ヒト臍静脈内皮細胞、pcDNAII Dauji 、及びλgt10赤白血病。ハイブリダイ ゼーションを5X SSC、5X デンハルト溶液、１％のSDS 、0.1 ％のピロリン酸ナ トリウム、100 μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ（プロメガ、マジソン、WI）中で65 ℃で12時間にわたって行った。フィルターを2X SSC、１％のSDS 中65℃で30分間 にわたって２回洗浄し、そしてオートラジオグラフィーへの露出の前に0.2X SSC 中22℃で１回洗浄した。 28の独立のクローンを４種の異なるライブラリーから単離し、プラーク精製し 、pBSKS ^- 中でサブクローン化し（pcDNAII クローンを除いて）、そして制限分 析により特性決定した。全ての単離クローンのＤＮＡ配列決定を、シーケナーゼ (USB、クレーブランド、OH)を使用してネステッド欠失を生じたエキソヌクレア ーゼIII（プロメガ、マジソン、WI）の両方のストランドについて行った。トラ ンスフェクション実験に関して、完全長EPR-1 ｃＤＮＡクローン(HELλ407)を哺 乳類細胞発現ベクターpRC/CMV(インビトロゲン社、サンジエゴ、CA)中でそのベ クターのEcoRI 部位で挿入し、配向させ、そしてチャイニーズハムスター卵巣(C HO)細胞の亜集密(subconfluent)培養物中でエレクトロポレーションによりトラ ンスフェクトした（10〜15μg のプラスミドＤＮＡ）。トランスフェクションの 48時間後に、CHO 細胞を15倍に希釈し、10％FCS 、１mMのＬ−グルタミン、非必 須アミノ酸（イルビン・サイエンティフィック、カラバサス、CA）及び0.7 mg/m lのゲネチシン（ギブコ、グランドアイランド、NY）を含むDMEM（M.S.ウィット テーカー、ウォーカーズビル、MD）選択培地中で培養した。野生型(WT)CHO 細胞 又はEPR-1 CHOトランスフェクタントをFMF（Altieriら，J.Biol.Chem．264:2969 -2972(1989); Altieri ら，J.Immunol．145: 246-253(1990)）により抗EPR-1 mA b 12H1又は2E1 とのそれらの反応性について分析し、又は¹²⁵I- 因子Xa結合研究 及びプロトロンビン活性化（以下を参照のこと）において分析した。こ れらの結果は、この細胞系がMOLT13 EPR-1⁺ 細胞の場合よりも５倍大きいレベル でEPR-1 タンパク質を発現したことを示す（項目Ｂ、詳細な説明を参照のこと） 。 E.ノーザンブロット 全ＲＮＡをグアニジウム−イソチオシアネート法によりEPR-1 ⁺ 細胞系THP-1 （単球）、Dauji(Ｂリンパ腫)、又はMLT(Ｔリンパ腫)から抽出した。ｍＲＮＡを オリゴ-dT セルロースカラム（インビトロゲン社、サンジエゴ、CA）によるクロ マトグラフィーにより単離した。ＲＮＡ試料（10μg の全ＲＮＡ、0.5 μg のｍ ＲＮＡ）をアガロースホルムアルデヒドゲルで電気泳動にかけ、ジーンスクリー ン膜（デュポン社、ウィルミントン、DE）に移し、UV架橋し（ストラタゲン、ラ ・ジョラ、CA）、そして５％のSDS を膜の洗浄中に使用した以外は、上記のよう にしてEPR-1 ｃＤＮＡクローンとハイブリッドを形成した。 F.結合反応及びプロトロンビン活性化 因子Xaの単離、特性決定及び¹²⁵I標識に関する実験操作が既に記載されていた (Altieriら，上記文献(1989))。5X10⁶/mlのWT CHO細胞又はEPR-1 CHO トランス フェクタントの無血清懸濁液を、22℃で５分間の15,000 X gにおけるシリコーン 油（ダウ・コーニング、ニューベッドフォード、MA）の混合物中の遠心分離によ る細胞関連放射能を除く分離の前に、2.5 mMのCaCl₂ の存在下で22℃で15分間に わたって次第に増加する濃度の¹²⁵I- 因子Xa(0.45-36nM)とともにインキュベー トした。非特異的結合を50倍モル過剰の未標識因子Xaの存在下で分析し、合計か ら引いて正味の特異的結合を計算した。別の実験において、既に記載されたよう な感受性クロッティングアッセイ(Altieriら，上記文献(1989))によるプロトロ ンビン活性化の定量化の前にIX10⁵/mlのWT CHO細胞又はEPR-1 CHO トランスフェ クタントを種々の濃度の因子Xa(9-36nM)、10μg/mlのプロトロンビン、及び2.5 mMのCaCl₂ と混合した。mAb 抑制実験において、上記のような¹²⁵I- 因子Xa特異 的結合又はプロトロンビン活性化の測定の前に、WT CHO細胞又はEPR-1 CHO トラ ンスフェクタントを25μg/mlの対照mAb 6B4 又は抗EPR-1 mAb 9D4(Altieri ら， 上記文献(1990))とともに22℃で15分間にわたってプレインキュベートした。 実施例５ EPR-1 発現はCLL 治療に対する応答と相関関係がある 造血悪性腫瘍の患者から単離された末梢血細胞との抗EPR-1 mAb の反応性をフ ローミクロフルオリメトリー(FMF)で研究した。30のCLL 患者のうちの27（90％ ）で、EPR-1 ⁺ 細胞の数が正常な対照と較べて５〜６倍増大され、それにより循 環集団の殆どを含むことがわかった（正常なドナー中のEPR-1 ⁺ 細胞：16.5±3. 2 ％、n-12対CLL 中のEPR-1 ⁺ 細胞：89.1±2.5 ％、n-28）。又、CLL 細胞で発 現されたEPR-1 分子の数は正常な対照と較べて平均2.5倍の増加を示した（EPR-1 ⁺ 正常細胞の平均蛍光：85.6±16.1対EPR-1 ⁺ CLL: 215.6±50.3）。PMC 細胞 のおよそ98％がこのマーカーに対し陽性であった。２色フローサイトメトリー研 究は、CLL 患者では、CD5 及びEPR-1 の両方が小さい細胞集団中で同時に共発現 されることを確かめた。最後に、４ケ月の期間（０日目に開始）にわたって行わ れた一群のCLL 患者の連続分析は、その治療に対する陽性の生物学的応答が検出 されたEPR-1 ⁺ 細胞の数の著しい低下（67〜90％低下）と頻繁に関連しているこ とを示した。代表的な患者データが下記の表１に示され、この傾向を説明する。 それ故、EPR-1 はCLL における新規な細胞マーカーに相当し、その表面発現は その治療に対する患者の生物学的応答と逆の相関関係がある。そのデータは選択 された造血悪性腫瘍の発生及び／又は樹立におけるプロテアーゼ媒介メカニズム の可能な関与を更に強調する。 実施例６ 増殖イベントにおけるEPR-1 の関与及びマーカーとしてのその役割 A.CLL におけるEPR-1 の過発現 成長因子受容体の脱調節(deregulated)発現は或る新形成に寄与することが知 られている(Ulrich ら，Nature 309: 418-425(1984); Sherr ら，Cell 41: 665- 676(1985); Downward ら，Nature 307: 521-527(1984))が、それが又ヒト白血病 誘発に関与するか否かは不確かのままである（例えば、Sawyers ら，Cell 64: 3 37-350(1991); Heard ら，Cell 51: 663-673(1987); Meeker ら，Blood 76: 285 -289(1990)）。慢性リンパ性白血病(CLL、n=30)を有する患者の90％が正常な対 照の密度より５〜50倍高い密度でエフェクター細胞プロテアーゼ受容体-1(EPR-1 )と称される細胞表面抗原(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969-2972(1989); Al tieri ら，J.Immunol．145: 246-253(1990); Worfolk ら，Blood 80: 1989-1997 (1992))を発現することが本明細書に今開示される。 先に説明されたように、EPR-1 のｃＤＮＡの分子クローニングは、特異なシス テインに富む細胞外モジュール及び多数の潜在的なセリン／スレオニンリン酸化 部位を有する細胞質ドメインを特徴とする新規なトランスメンブラン分子の配列 を明らかにした。EPR-1 へのリガンド結合はリンパ球分裂誘発を誘導し、そして EPR-1 の選択されたモノクローナル抗体がＴ細胞受容体介在性正常リンパ球増殖 を完全に無効にする。こうして、EPR-1 はおそらくCLL における潜在的な病態生 理学的妥当な新規な細胞マーカーであり、かつ正常なリンパ球及び白血病リンパ 球において成長関連シグナリングにかかわる分裂受容体の既に認められていない クラスの一員である。 造血細胞に関するタンパク質分解メカニズムの構築は血液プロテアーゼ因子Xa のその機能性認識によりEPR-1 により寄与される(Altieriら，上記文献(1989); Alt-ieriら，上記文献(1990); Worfolk ら，上記文献(1992))。モノクローナル 抗体(mAb)反応性により既に特定されたように、EPR-1 はin vitroのポリクロー ナル又は抗原特異性の正常リンパ球増殖中の８〜10倍増大された表面発現を特徴 とするリンパ球活性化依存性抗原である(Altieriら，上記文献(1989); Altieri ら，上記文献(1990))。造血悪性腫瘍中のEPR-1 発現をフローサイトメトリーに より調べた。表１に示されるように、抗EPR-1 mAb 12H1は30人のCLL 患者のうち の27人(90％)から単離された末梢リンパ球の51〜99％と均一に反応した。蛍光強 さにより判断されるように、EPR-1 表面密度／細胞は、正常な対照と比較して、 CLL 試料中で５〜50倍増大された（表１）。対照的に、EPR-1 ⁺ 細胞又はEPR-1 密度／細胞の増大は 同実験条件下で有毛状細胞性白血病(HCL)を有する患者から単離されたリンパ球 中でmAb 12H1により検出されなかった（示されない、n=15）。 B.因子Xa／ＥPR-1 相互作用 リンパ球分裂誘発におけるEPR-1 の役割をin vitro増殖実験で調べた。最初に 、EPR-1 へのリガンド結合はリンパ球増殖を誘導することが実証された（図4Aを 参照のこと）。EPR-1 ⁺ MOLT13リンパ球の懸濁物を血清飢餓条件(0.5％のFCS)の もとに48時間のインキュベーションにより増殖停止した。静止MOLT13細胞の三重 培養物を次第に増加する濃度(0.01〜１μg/ml)の天然EPR-1 リガンド因子Xa（閉 じた円）、対照タンパク質ミオグロビン（閉じた四角）、又は10％のFCS(閉じた 三角)で３日間にわたって37℃でRPMI 1640培地（ウィットテーカー）＋0.5 ％の FCS中で培養した。１μCi/ ウェルの³HTdR による12時間のパルス後に、ウェル を回収し、種々の条件下でとり込まれた放射能をシンチレーションβカウンター 中で定量した。データ±S.E.M.は少なくとも２回の独立の実験の代表であり、そ の天然リガンド、因子XaによるEPR-1 の占有が投薬量依存様式で増殖停止MOLT13 リンパ球の増殖を誘発することを明らかに示す。 図5Aに更に示されるように、野生型CHO 細胞との¹²⁵I- 因子Xaの特定の相互作 用が示されなかったが、EPR-1 CHO トランスフェクタントは、80ngの因子Xa/10⁶ 細胞の最高の会合により、約10-15nM の見掛Ｋd により調節された特異的かつ飽 和可能な反応で¹²⁵I- 因子Xaを結合した。 図16は、EPR-1 受容体への因子Xa結合の効果がPBMCの増殖の誘発であることを 示す。実際に、因子Xaは一次分裂促進因子（次第に増加する応答細胞濃度）又は 同時分裂促進因子（低応答細胞濃度）として作用する。因子Xaの役割が下記の実 施例12に更に説明される。 図16に示されるように、因子Xa結合はPBMC増殖を刺激する。³HTdR とり込み(c pm X 10^-3)が垂直軸に示され、一方、タンパク質濃度(nM)が水平軸にプロットさ れる。3 X 10⁵/ウェルのPBMCを1ng/mlのPMA(フォルボールエステル、シグマ、セ ントルイス、MO)の存在下又は不在下で示された次第に増加する濃度の因子Xaと ともにインキュベートした。対照培養物を同実験条件下でアンチトロンビンIII( ATIII)+PMAとともにインキュベートした。細胞増殖を37℃で３日の培養後に³HTd R とり込みに より定量した。アゴニストの不在下のバックグラウンドcpm は3,463 ±293 cpm( n=4)であった。因子Xa及びPMA(閉じた円)、ATIII 及びPMA(閉じた四角)、因子Xa 単独（開いた円）及びPMA 単独（開いた三角）とともにインキュベートされた培 養物に関するデータは、４回の独立の実験の平均±S.E.M.として表される。 C.抗増殖性抗体はEPR-1 受容体分子への因子Xa結合に干渉する 逆に、図4Bに示されるように、抗EPR-1 mAb 2E1 は抗原特異性Ｔ細胞増殖を抑 制する。RPMI 1640 培地＋10％のFCS 中の末梢血単核細胞(PBMC)の三重培養物を 96ウェルミクロタイタプレート(3x10⁵/ウェル)中で構築し、37℃で30分間にわた って示された次第に増加する濃度の抗EPR-1 mAb 2E1(閉じた円)又は対照mAb 6B4 (閉じた三角)とともにプレインキュベートした。細胞を１μg/mlの分裂促進抗CD 3 mAb OKT3で刺激し、37℃で３日間培養した。リンパ球増殖をＡに記載されたよ うにして１μCi/ ウェルの³HTdR による12時間のパルス後に定量した。mAb OKT3 を使用しない未刺激培養物中の³HTdR とり込みは353 ±65 cpm(n=3)であった。 データは３回の独立の実験の平均±S.E.M.として表される。 天然リガンド、因子Xa(Altieriら，上記文献(1989); Altieri ら，上記文献(1 990); Worfolk ら，上記文献(1992))によるEPR-1 の占有は、投薬量依存様式で 成長停止MOLT13リンパ球の増殖を誘発すると本明細書に今示された（図4A）。第 二に、次第に増加する投薬量の抗EPR-1 mAb 2E1 は抗CD3 mAb OKT3により誘発さ れたクローン型リンパ球増殖を完全に抑制することが今示された（図4B）。（又 、Web-erら，J.Immunol．135: 2337-2342(1985); Geppert ら，J.Immunol．138: 1660-1666（1987）を参照のこと）。 トロンビン、ウリキナーゼ、又は因子Xaそれ自体のようなプロテアーゼの膜集 合は正常な細胞及び形質転換細胞のＤＮＡ合成及び分裂誘発を開始することが知 られている（Vuら，Cell 64: 1057-1068(1991); Kirchheimerら，PNAS USA 86: 5424-5428(1989);及びGasic ら，PNAS USA 89: 2317-2320（1992）を参照のこと ）。ここで因子Xaに関して示されるように、このメカニズムは造血細胞分裂シグ ナリング(Gasicら，上記文献(1992))及び非造血細胞分裂シグナリングの両方に 潜在的にかかわる新規な受容体認識を伴う。 更に、mAb 2E1 により生じたクローン型リンパ球増殖の顕著な抑制は、この分 裂 促進応答における今まで同定されていない一種以上のEPR-1 リガンドの関与、及 び／又はCD3 による細胞内シグナル導入におけるEPR-1 の調節役割を示唆する（ 例えば、Weber ら，上記文献(1985); Geppert ら，上記文献(1987); Chanら，Cu rr.Op-in.Immunol．4: 246-251(1992); 及びJaneway，Ann.Rev.Immunol．10: 64 5-674(1992)を参照のこと）。この状況において、セリンに富むEPR-1 細胞質ド メインは細胞分裂及び悪性形質転換に又かかわるプロトオンコジーンであるDraf -1（Nishi-daら，上記文献(1988); Fukui ら，Mol.Cell.Biol．7: 1776-1781(19 87)）に少なくとも部分的に相同と見られたことが興味をひく。 リンパ球増殖におけるその役割について示唆したが、更なる研究がCLL 及び／ 又はその他の悪性腫瘍における増大されたEPR-1 発現の潜在的な病原的役割及び 診断上の重要性を解明するのに必要とされる。 実施例７ HuSCIDマウスの破傷風トキソイド応答 二次ヒト免疫応答に関する抗EPR-1 モノクローナル抗体の効果を評価するため に、抗EPR-1 抗体を、hu-PBL-SCID マウスへの末梢血リンパ球(PBL)の投与の前 にヒトPBL とともにin vitroでインキュベートした。一つの実験プロトコルにお いて、抗体の更なる注射をin vivo で与えなかった。第二プロトコルにおいて、 追加の抗体を以下に更に記載されるように特定グループに１週基準で投与した。 先に注目されたように、記載された範囲内の実験の全てに使用したSCIDマウス はヒト免疫系に関する本発明のモノクローナル抗体の影響及び効果の評価に理想 的かつ適当なモデルである。 A.in vivo のみの抗EPR-1 モノクローナル抗体の投与 末梢血リンパ球(PBL)を、PBL の回収の前の１年以内に破傷風トキソイド(TT) ブーストを受けなかったEBV ⁺ ヒトドナーから得た。生後少なくとも６週の非漏 出性SCIDマウスを記載された範囲内の実験に使用するために選択し、夫々５匹の マウスの７つのグループ（グループ１−７）にランダムに分けた。 抗モノクローナル抗体2E1 を実験抗体として選択した。不適な特異性のイソタ イプ適合抗体（抗体9D4)を対照抗体(Cab)として使用するために選択した。破傷 風トキソイド(TT)を抗原として使用した。７つのグループの夫々に関する実験プ ロトコ ルは以下のとおりであった。 グループ１（５匹のマウス） ０日目−I.P.（腹腔内）投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ P BL(RPMI-10％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた) グループ２（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(10 μg/ mlのmAb 2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベート された)及び100 μg の2E1 グループ３（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶PBL(10 μg/m lのCab を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされ た)及び100 μg の2E1 グループ４（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶PBL(15 μg/m lのTTを含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた) 及び50μg のTT グループ５（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTT及び10μg/mlの2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間イ ンキュベートされた)、50μg のTT、及び100 μg の2E1 グループ６（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTTを含むRPMI-10 ％のFCS中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた) グループ７（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTT及び10μg/mlの2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間イ ンキュベートされた) B.in vitro及びin vivo の抗EPR-1 モノクローナル抗体の投与 末梢血リンパ球(PBL)を、PBL の回収の前の１年以内に破傷風トキソイド(TT) ブーストを受けなかったEBV ⁺ ヒトドナーから得た。生後少なくとも６週の非漏 出性SCIDマウスを記載された範囲内の実験に使用するために選択し、夫々５匹の マウスの７つのグループ（グループＡ−Ｇ）にランダムに分けた。 抗EPR-1 モノクローナル抗体2E1 を実験抗体として選択した。不適な特異性の イソタイプ適合抗体(抗体9D4)を対照抗体(Cab)として使用するために選択した。 破傷風トキソイド(TT)を抗原として使用した。７つのグループの夫々に関する実 験プロトコルは以下のとおりであった。 グループＡ（５匹のマウス） ０日目−I.P.^a投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(RPMI-1 0 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた) ７日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 14日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 21日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 28日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 35日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. グループＢ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(10 μg/ mlのmAb 2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベート された) ７日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 14日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 21日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 28日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 35日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 グループＣ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(10 μg/ mlのCab を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされ た)及び100 μg のCab ７日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg のCab 14日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg のCab 21日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg のCab 28日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg のCab 35日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg のCab グループＤ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTTを含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた )及び50μg のTT ７日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 14日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 21日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中50μg のTT 28日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. 35日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P. グループＥ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTT及び10μg/mlの2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間イ ンキュベートされた)、50μg のTT、及び100 μg の2E1 ７日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 14日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 21日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中50μg のTT及び100 μg の2E1 28日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 35日目−アール−１％のBSA(100 μl)I.P．中100 μg の2E1 グループＦ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTTを含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間インキュベートされた ) グループＧ（５匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール−１％のBSA(1000μl)中の50 X 10⁶ PBL(15 μg/ mlのTT及び10μg/mlの2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中4 X 10⁶ PBL/mlで４時間イ ンキュベートされた) ^a I.P.= 腹腔内 マウスを両方のプロトコルで２日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日 目、そして60日目に採血した。ヒトIgG 血清レベルをパンデックス自動化装置で 粒子蛍光濃度イムノアッセイにより測定し、一方、ヒトIgG 抗TTレベルを標準EL ISA アッセイ方法を使用して測定した。高分解能電気泳動を回収した血清につい て又行った。病気のマウスを犠牲にし、検死を行った（データは示されない）。 本明細書の項目Ａに記載された破傷風トキソイド研究の結果が図６に示され、 以下のように要約し得る。ヒト免疫グロブリン(Ig)レベル(μg/ml)が垂直軸に表 され、一方、日数が水平軸に示される。huSCIDマウスの破傷風トキソイド応答及 びin vitroのそれに関するmAb 2E1 の効果が以下のように示される。対照（暗色 バー）及び9D4 を投与された対照（クロスハッチ付きのバー）は強い応答を示す ことが明らかに示され、一方、ヒトIgレベルは2E1 を投与されたhuSCIDマウスで はごくわずかである（灰色又は縞のあるバー）。 相当する値は以下のとおりである。 明らかに、mAb 2E1 を受けるhuSCIDマウスの破傷風トキソイド応答に対する応 答は実際には存在せず、完全な免疫抑制効果を証明した。 本明細書の項目Ｂに記載された破傷風トキソイド研究の結果が図７に示され、 以下のように要約し得る。ヒト免疫グロブリン(Ig)レベル（μg/ml）が垂直軸に 表され、一方、日数が水平軸に示される。huSCIDマウスの破傷風トキソイド応答 及びin vivo のそれに関するmAb 2E1 の効果が以下のように示される。対照（暗 色バー）及び9D4 を投与された対照（クロスハッチ付きのバー）は強い応答を示 すことが明らかに示され、一方、ヒトIgレベルは2E1 を投与されたhuSCIDマウス ではごくわずかである（灰色又は縞のあるバー）。 相当する値は以下のとおりである。 上記の図６のように、mAb 2E1 を受けるhuSCIDマウスの破傷風トキソイド応答 に対する応答は再度実際には存在せず、完全な免疫抑制効果を証明した。 実施例８ 抗EPR-1 mAb による増殖の抑制 A.アッセイプロトコル 増殖、チミジンとり込み、及びリンホカインアッセイをGimmi ら，PNAS USA 8 8: 6575-6579(1991)、Rothman ら，J.Immunol．147: 2493-2499(1991)、又はLue ら ，J.Immunol．147: 1134-1138(1991)に記載された操作に実質的に従って行い、 これらは実質的には以下のとおりである。 1.増殖アッセイ PBMC(3 X 10⁶ 細胞/ml)又はＴ細胞(1.5 X 10⁶細胞/ml)を、熱不活化FCS を含 むRPMI 1640(RPMI-10％のFCS)、２mMのグルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウ ム、及び抗生物質(例えば、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシンスル フェート(100μg/ml)、及びゲンタマイシンスルフェート(5μg/ml))からなる完 全培地中で培養した。細胞を培地200 μl 当たり3 X 10⁶ 細胞の濃度で三重試料 中で96ウェル平底ミクロタイタプレート中で37℃で３〜７日間にわたって５％CO₂ 中で培養した。細胞を培地中で適当な刺激を加えて培養した。 OKT3 IgGを炭酸ナトリウム緩衝液(0.05M、pH9.6)中で希釈し、100 μl/ウェル を添加することによりOKT3（0.5 μg/ウェル）を平底96ウェルミクロタイタプレ ートに塗布した。プレートを４℃で18時間にわたってインキュベートした。夫々 のプレートをPBS で２回洗浄し、次いで完全培地で洗浄した。 PBL をPHA（4μg/ml）又は可溶性OKT3 mAb（1 μg/ml）とともに３〜５日にわ たって培養した。Ｔ細胞をミクロタイタプレートに前もって塗布されたOKT3 IgG で３日にわたって培養した。混合リンパ球反応に関して、PBL(2 X 10⁷細胞/ml) を完全RPMI 1640 培地中で５日にわたって平底96ウェルミクロタイタプレート中 で200 μl の全容積で空気中５％のCO₂ の保湿雰囲気中で未処理の同種PBL（1.5 X 10⁶細胞/ml）とともにインキュベートした。 ［³H］TdR とり込みを測定するために、１μCiの［³H］TdR（2Ci/ ミリモル、 アメーシャム・インターナショナル、インジアナポリス、IN）を三重の培養物に 添加し、12時間後に細胞を濾紙(PHDセル・ハーベスター、ケンブリッジ、MA）に 回収した。 抗体を10μg/mlで96ウェル平底ミクロタイタプレートに添加し、37℃で１時間 インキュベートした。 2.チミジンとり込みアッセイ チミジンとり込みを分裂促進活性のインデックスとして使用した。72時間の培 養 の最後の12時間中に、細胞を［メチル−³H］チミジン（ICN フロー、コスタメサ 、CA）１μCi（１マイクロキューリー又は37 kBq）とともにインキュベートした 。細胞をフィルターに回収し、乾燥フィルターの放射能をシンチレーションカウ ンターで測定した。 3.リンホカインアッセイ 培養上澄みを培養の開始の24時間後に回収し、製造業者の指示に従ってELISA キット（クアンチキン；Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、MN）を使用して、IL -1濃度又はIL-2濃度を二重に分析した。 B.応答活性化抗原の使用 図8A-Cは抗EPR-1 モノクローナル抗体2E1 によるＴ細胞増殖の抑制を示す。三 つの図面の全てにおいて、［³H］TdR 摂取（cpm、垂直軸）が抗体濃度（μg/ml 、水平軸）に対してプロットされる。図8Aにおいて、１μg/mlの可溶性OKT3がＴ 細胞応答を活性化するのに使用される。次第に増加する量の抗EPR-1 抗体2E1(閉 じた四角)及びmIgG（マウスIgG 、開いた四角）が、水平軸（Ab濃度、μg/ml） に示されるように刺激細胞に添加され、［³H］TdR 摂取(cpm)が測定された。 図8Bにおいて、0.5 μg/mlの固定OKT3がＴ細胞応答を活性化するのに使用され た。次第に増加する量の2E1(閉じた四角)及びmIgG（開いた四角）が、水平軸に 示されるように刺激細胞に添加され、［³H］TdR 摂取(cpm)が測定された。 図8Cにおいて、混合リンパ球培養物(mlc)が使用された。（MLC は一般に同種 異系反応性である。何となれば、このような培養中の非適合性細胞が互いに活性 化するからである）。変化する濃度のmOKT4a（閉じた三角）、2E1(閉じた四角) 及びmIgG（開いた四角）が、水平軸に示されるように添加され、［³H］TdR 摂取 が測定された。 図8A-8C において明らかに示されるように、抗EPR-1 mAb 2E1 の投与は、刺激 因子にもかかわらず、PBL の増殖をかなり抑制し、0.1 μg/ml程度に低い濃度で かなりの抑制効果を生じた。 C.ポリクローナルレクチンの使用 ポリクローナルレクチンフィトヘマグルチニン(PHA)及びコンカナバリンＡ(Co nA)をＴ細胞増殖の刺激物質として使用した。PHA（4μg/ml）又はConA（1 μg/m l）を 上記項目Ａに記載されたプロトコルに従ってPBMCに投与した。示された量の対照 (6B4)又は抗EPR-1（2E1）抗体を投与し、［³H］TdR とり込みを、記載されたよ うにして測定した。 図9AはPHA 刺激細胞中のmAb 2E1 の投与の効果を示す。対照抗体6B4(閉じた円 )及び抗EPR-1 抗体2E1(開いた円)を約６μg/mlから約50μg/mlまで変化する量で 投与した。抗体濃度（μg/ml）を水平軸にプロットし、［³H］TdR とり込み（cp m X 10^-3）が垂直軸に示される。 図9BはConA刺激細胞中のmAb 2E1 の投与の効果を示す。対照抗体6B4(閉じた円 )及び抗EPR-1 抗体2E1(開いた円)を約６μg/mlから約50μg/mlまで変化する量で 投与した。抗体濃度（μg/ml）を水平軸にプロットし、［³H］TdR とり込み（cp m X 10^-3）が垂直軸に示される。 両方の実験の結果は、比較的少量の2E1 の投与がリンパ球増殖の進行を制限す ることを示す。 D.mAb の非致死性 PBL を上記のようにして調製した（実施例１を参照のこと）。抗EPR-1 mAb 2E 1又は関係のない対照mAb 12E7を、注目された場合に、特にことわらない限り、1 0μg/mlの濃度で投与した。抗CD3 mAb OKT3(IgG2a)(ATCC、ベセスダ、MD)を“可 溶性”形態で使用し、１μg/mlの濃度で培養物に添加した。増殖アッセイ及びチ ミジンとり込みアッセイをGimmi ら，PNAS USA 88: 6575-6579（1991）に記載さ れた操作に従って行い、これらは実質的に下記のとおりである。 リンパ球を、FCSを含むRPMI 1640(RPMI-10％のFCS)、２mMのグルタミン、１mM のピルビン酸ナトリウム、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシンスルフ ェート(100μg/ml)、及びゲンタマイシンスルフェート(5μg/ml)中で培養した。 細胞を培地200 μl 当たり3 X 10⁶ 細胞の濃度で三重試料中で96ウェル平底ミク ロタイタプレート中で37℃で３日間にわたって５％CO₂ 中で培養した。細胞を培 地中で適当な刺激を加えて培養した。細胞を１ng/ml のPMA（カルビオケム、サ ンジエゴ、CA）で刺激した。抗体を96ウェル平底ミクロタイタプレートに10μg/ mlで添加し、室温で１時間インキュベートした。 チミジンとり込みを分裂促進活性のインデックスとして使用した。72時間の培 養 の最後の12時間中に、細胞を［メチル−³H］チミジン（ICN フロー、コスタメサ 、CA）１μCi（１マイクロキューリー又は37 kBq）とともにインキュベートした 。細胞をフィルターに回収し、乾燥フィルターの放射能をシンチレーションカウ ンターで測定した。 図10は、抗EPR-1 モノクローナル抗体がそれを投与する細胞に非致死性である ことを示す。逆に、その抗体の抑制性は、示されるように可逆性である。抗体希 釈（水平軸）及び［³H］TdR とり込み（垂直軸）は記載されたプロトコルに従っ て測定される。細胞をOKT3+PMA+2EI（閉じた逆三角形）；OKT3+PMA（閉じた三角 ）；0KT3単独（閉じた四角）；OKT3+2EI（閉じた円）で刺激した。又PMA 単独（ 開いた三角）がバックグラウンド(BKG、開いた円)と同様に示される。示される ように、2E1 が次第に取り去られたので、細胞は生存度を明らかに損失しないで それらの増殖活性を回復した。 実施例９ サイトカイン放出に関する抗EPR-1 mAb の効果 PBL を上記のようにして調製した（実施例１を参照のこと）。抗EPR-1 mAb 2E 1又はマウスIgG を、注目された場合に、特にことわらない限り、10μg/mlの濃 度で投与した。抗CD3 mAb OKT3(IgG2a)(ATCC 、ベセスダ、MD)を１μg/mlの濃度 で培養物に添加した。増殖アッセイ、チミジンとり込みアッセイ、及びリンポカ インアッセイを上記実施例８に記載された操作に実質的に従って行った。 図11A 、11B 及び12は、2E1 がIL-2受容体発現及びIL-2産生を抑制することを 示す。IL-2濃度をOKT3刺激の24時間後、48時間後、そして72時間後に上記のよう にして分析した。24時間後に、少量のIL-2を示されるように2E1 投与後の上澄み 中に検出し、一方、かなりの量のIL-2が全てのその他のOKT3刺激ウェル中に存在 した。図11A 及びB において、IL-2産生は2E1 を収容するウェル中で24時間後に 最小である。IL-2は刺激後の48時間又は72時間で2E1 を収容するウェル中で検出 されなかった(図11B)。 図12は、IL-2受容体(p55)発現が又2E1 を収容するOKT3刺激ウェル中で減少さ れることを示す。OKT3+2E1ウェル中のIL-2受容体発現の適度の増加は殆どおそら く細胞が2E1 の投与の前に受容体発現に“前開始”されるためである。 図13A 及びB は、2E1 がOKT3刺激細胞中の TNFβの合成を抑制することを示す 。2E1 は24時間でOKT3誘発 TNFβ分泌を抑制するが（Ａ及びＢ）、2E1 の存在下 の TNFβ分泌は最終的にはマウスIgG2a を受けるOKT3刺激細胞及び2E1 を受けて いない細胞中で分泌された TNFβのレベルに達する(B)。 図14A 及びB は、2E1 又はマウスIgG2a(対照抗体)を投与して、又は投与しな いで、OKT3刺激細胞及び未刺激細胞中の増殖(A)及びIL-IB 合成(B)の比較を示す 。図14A において、［³H］TdR 摂取(cpm)により測定される増殖が時間に対して プロットされる。OKT3（閉じた四角）；OKT3＋マウスIgG2a(閉じた円)；OKT3＋2 E1(閉じた三角)；及び無OKT3（開いた四角）の投与の結果が示される。特に示さ れた場合を除いて、１μg/mlのOKT3を刺激物質として投与した。 図14B において、IL-IB 産生(pg/ml)が時間に対してプロットされる。OKT3（ １μg/ml、大きい閉じた四角）；OKT3＋マウスIgG2a(閉じた円)；OKT3＋2E1(閉 じた三角)；無OKT3（開いた四角）；及び１ng/ml のOKT3（小さい閉じた四角） の投与の結果が示される。特に示された場合を除いて、１μg/mlのOKT3を刺激物 質として投与した。 図14A に示されるように、リンパ増殖は又抗EPR-1 mAb 2E1 を受けたOKT3で刺 激された細胞中で著しく減少された。先に実証されたように、細胞生存度は影響 されなかった。むしろ、リンパ増殖イベントが抑制された。 同様に、図14B に示されたデータは、mAb 2E1 の投与がIL-1β産生を殆ど完全 に抑制することを示す。殆どわずかな量のOKT3刺激物質を受ける細胞（即ち、１ ng/mlのOKT3を受ける細胞）でさえもが、更に大きい投与量の刺激物質を与えら れた細胞（これらは又2E1 を受ける）よりもかなり大きい量のIL-1βを産生した 。 実施例10 リンパ腫に対する抗EPR-1 mAb の効果 ヒトリンパ増殖性疾患の発生率及びそれと関連する死亡率に関する抗EPR-1 モノ クローナル抗体の効果を評価するために、抗EPR-1 抗体をhu-PBL-SCID マウスへ のヒト末梢血リンパ球(PBL)の投与の前に前記PBL とともにin vitroでインキュ ベートした。次いで追加の抗体を、更に以下に記載されるようにして特定のグル ープに１週基準で投与した。 末梢血リンパ球(PBL)を２人のEBV ⁺ ヒトドナーから得た。生後少なくとも６ 週の非漏出性SCIDマウスを記載された範囲内の実験に使用するために選択し、夫 々６匹のマウスの６つのグループ(A1-D2)、及び夫々２匹のマウスの二つのグル ープ（Ｅ及びＦ）にランダムに分けた。 抗EPR-1 モノクローナル抗体2E1 を実験抗体として選択した。不適な特異性の イソタイプ適合抗体（抗体9D4)を対照抗体としての使用のために選択した。又、 2E1とイソタイプ適合した関係のない非結合性マウス抗体(ir-Ab)を使用した。種 々のグループに関する実験プロトコルは以下のとおりであった。 グループA1及びA2（夫々６匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（RPMI-10 ％のFCS 中 ４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベートされた） ７日目−アール(100μl)I.P. 14日目−アール(100μl)I.P. 21日目−アール(100μl)I.P. 28日目−アール(100μl)I.P. 35日目−アール(100μl)I.P. グループB1及びB2（夫々６匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（10μg/mlのmAb 2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベート された）及び100 μg の2E1 ７日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の2E1 14日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の2E1 21日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の2E1 28日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の2E1 35日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の2E1 グループC1及びC2（夫々６匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（10μg/mlの9D4 を含 む RPMI-10 ％のFCS 中４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベートされた ）及び100 μg の9D4 ７日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の9D4 14日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の9D4 21日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の9D4 28日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の9D4 35日目−アール(100μl)I.P．中100 μg の9D4 グループD1及びD2（夫々６匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（15μg/mlのir-Ab を 含むRPMI-10 ％のFCS 中４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベートさ れた）及び100 μg のir-Ab ７日目−アール(100μl)I.P．中100 μg のir-Ab 14日目−アール(100μl)I.P．中100 μg のir-Ab 21日目−アール(100μl)I.P．中100 μg のir-Ab 28日目−アール(100μl)I.P．中100 μg のir-Ab 35日目−アール(100μl)I.P．中100 μg のir-Ab グループＥ（２匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（10μg/mlのmAb 2E1 を含むRPMI-10 ％のFCS 中４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベート された）及び100 μg の2E1 グループＦ（２匹のマウス） ０日目−I.P.投与されたアール(1000 μl)中50 X 10⁶ PBL（10μg/mlの9D4 を含 むRPMI-10 ％のFCS 中４時間にわたって4 X 10⁶ PBL/ml でインキュベートされ た）及び100 μg の9D4 マウスを２日目、15日目、30日目、60日目、90日目、120 日目、そして180 日 目 に採血した。グループＡ−Ｄにおいて、病気のマウスを犠牲にし、検死を行った （臓器をブアン中に保存した；データは示されない）。又、いずれかのグループ の生存率が20％未満（即ち、１匹のマウス）である時に、実験を停止した（検死 を全ての生存体について行った）。ヒトIgG/IgM 血清レベルを、パンデックスを 使用して測定した。追加のチェックとして、標準ELISA アッセイ法を使用してヒ トIgG抗TTレベルを測定した。又、BUN(血尿窒素)アッセイをグループＡ（A-1 及 びA-2 ）からのマウスについて行った。 グループＥ及びＦにおいて、マウスを犠牲にし、PBL 移入の36時間後に検死し て生存ヒトリンパ球が2E1 で治療された動物の血液中に存在するか否かを測定し た。このような細胞が存在した場合、それは2E1 が細胞毒性ではないことを確か めるであろう。ヒト腹腔細胞を、抗ヒトCD45モノクローナル抗体を使用するFACS 分析により測定した。腹腔細胞生存度を、トリパンブルーを使用して測定した。 上記研究の結果は以下のとおりであった。 グループＡ：全てのマウスが死亡した（組織データは示されない） グループＢ：2E1 を受ける全てのマウスが生存した グループＣ：全てのマウスが死亡した（組織データは示されない） グループＤ：全てのマウスが死亡した（組織データは示されない） グループＥ：生存ヒトリンパ球が検出された グループＦ：生存ヒトリンパ球が検出された グループＡ−Ｄについて集められたデータが更に図15に示され、この場合、死 亡率（％）が食塩水、mAb 9D4 、mAb 2E1 、及びマウスIgG を含む種々の保護剤 について測定される。示されるように、mAb 2E1 を受けるhuSCIDマウスのみが充 分な保護を受けた。逆に、食塩水、mAb 9D4 、又はマウスIgG を受けるマウスの 100 ％が生存しなかった。 実施例11 EPR-1 の更なる特性決定 A.EPR-1 の細胞分布 凝固カスケードXaのXaセリンプロテアーゼを結合する循環血漿タンパク質であ るＶのモノクローナル抗体を調製した（Nesheim,M.ら，J.Biol.Chem．254: 1095 2(1979)）。先の研究において、第一世代抗EPR-1 mAb（例えば、mAb 7G12、9D4 、及び12H1）は又種々の骨髄単球細胞系で発現された表面分子と反応することが 示された(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989))。mAb 抑制研究及び受容 体−リガンド化学架橋を使用して、この細胞関連免疫反応性分子がXaの高アフィ ニティー(Ｋd=30nM、ｎ約150,000)受容体として機能することが実証された(Alti eriら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989))。この研究において、mAb パネルＩは推 定膜セリンプロテアーゼ受容体(EPR-1)の細胞分布及び同定を特性決定するのに 利用された。 パネルＩ抗V mAb の反応性はin vitroで形質転換された細胞系の異常な特性で はない。mAb 7G12(Altieri ら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989))により既に同定 されたエピトープとは異なるエピトープを認識するmAb 9D4 は末梢血単球及びデ キストラン単離PMN と反応したが、後者の集団ではかなりの不均一性で反応した 。 PBMCの懸濁液をFMF により分析した時、mAb 7G12、9D4 、及び12H1はリンパ球 の特徴の前方の光散乱でもって細胞の集団（５〜20％）と一貫して反応した。同 時の２色FMF 分析を行ってこのリンパ球系集団の表現型を更に分析した。これら の研究に関して、PBMCの懸濁液をプラスチックへの付着又はナイロンウール分別 により付着細胞を分取して枯渇してPBL(末梢血リンパ球)の濃縮された集団を得 た。mAb 7G12、9D4 、又は12H1により同定されたリンパ系サブセットの約50％は OKT3^- であり、かつ夫々mAb Leu 11b 、3G8 、B73.1 、及びNKH-1 の同時結合に より明らかにされるように、NK関連マーカーCD16及びCD56を発現した。更に、ナ イロンウール分別、SRBC（ヒツジ赤血球）ロゼット形成、及びmAb OKT3による負 の選択によりPBMCから調製されたNK細胞（＜３％CD3 ⁺ 、＞85％CD16⁺ ）の濃縮 集団をFMF により分析した時、mAb 7G12及び9D4 はこれらの細胞の68％及び72％ と反応した。 残りのEPR-1 ⁺ PBL をCD3 ⁺ リンパ球として表現型上樹立した。下記の表２は このEPR-1 ⁺ サブセットの２色FMF 特性決定の代表的な研究を示す。CD4 又はCD 8 を同時発現する二重陽性細胞を同定したが、後者のフラクションは高い頻度及 びEPR-1 マーカーmAb との反応のはるかに大きな強さを一貫して示した。実際に 全てのEPR-1 ⁺ Ｔ細胞は、夫々mAb OKM1及びHNK-1 により明らかにされたように CD11b 及びCD57(Leu7)を同時発現し、約70〜80％がCD2 ⁺ (OKT11)であった（表 ２）。EPR-1 ⁺ サブセットは主としてWT31⁺ であったが、EPR-1 ⁺ 細胞の約10％ （未分別PBL の２％、ｎ＝３）は抗γ／δTCR mAb δ1 と反応性であることがわ かった。又、PBL の２色FMF 分析を、種々の抗Ｔ細胞又は抗NK細胞関連マーカー mAb と組み合わせて、ウサギポリクローナル抗体B78.9 のビオチン接合アリコー ト、又は直接にFITC接合されたmAb 7G12、又は9D4 を使用して行った時に、定量 的に匹敵する結果を得た。 B.EPR-1 はCD11b/CD18とは異なる 1.細胞表面標識及び免疫沈殿 1 x 10⁸/mlのPMN の懸濁物をヨードゲン法(Fraker，P.J．ら，Biochem.Bioph- ys.Res.Commun．80: 849(1978))により５ mCi ¹²⁵I-Na で標識ヨウ素標識した。 HEPES 食塩水緩衝液pH7.35中の徹底的な洗浄後に、細胞を４℃で30分間にわたっ て0.5 ％トリトンX-100 又は10mMのCHAPS 、0.05M のトリスHCl 、0.15M のNaCl 、１mMのベンズアミジン、0.1 mM（PPACK=D-Phe-Pro-Arg クロロメチルケトン； カルビオケム）、25μg/mlのロイペプチン、１mMのPMSF（フェニルメチルスルホ ニルフルオリド；カルビオケム）、pH8.3（溶解緩衝液）を含む緩衝液中で溶解 した。ヨウ素標識された溶解産物を４℃で30分間にわたって14,000 x gで遠心分 離により核及びその他の細胞デブリを除いて清浄し、セファロースCL4B（カルビ オケム）と接合されたヤギ抗マウスIgG + IgM のアリコートで徹底的に前吸着し た。¹²⁵I標識PMN 溶解産物のアリコートを攪拌下で４℃で14時間にわたってmAb 12H1又は60.3とともに別々にインキュベートした。 免疫複合体をセファロースCL4Bと接合されたヤギ抗マウスIgG + IgM の添加に より４℃で更に６時間にわたって沈殿させ、上記溶解緩衝液中で徹底的に洗浄し 、最後に還元剤として50mMの２−ジチオスレイトールを含む２％のSDS 試料緩衝 液、pH6.8 中で再度懸濁させた。試料を直ちに５分間沸騰させ、14,000 x gで５ 分間にわたって遠心分離により清浄し、最後に0.1 ％SDS 中7.5 ％のSDS ポリア クリルアミドスラブゲルで電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーR250中で 染色 し、５％の酢酸中で脱染色し、乾燥させ、そしてコダックX-Omat AR Ｘ線フィル ム及び強化スクリーン（クロネクス、デュポン社、ウィルミントン、DE）を使用 することにより-70℃でオートラジオグラフィーのために露出した。 2.結果 これらの研究の結果は、EPR-1 がCD11b/CD18とは異なることを確かめた。単球 、PMN 、NK細胞、及びＴ細胞のフラクション（これは又主としてCD8 ⁺ である） におけるEPR-1 の発現は、白血球インテグリンCD11b/CD18(Mac-1)(Sanchez Madr id,F.ら，J.Exp.Med．158: 1785(1983))の細胞分布を模擬することが明らかであ る。それ故、追加の研究を、CD11b/CD18及びEPR-1 の相互構造及び機能性を確立 するために設計した。これらの研究に関して、多レベルのCD11b/CD18分子を発現 するPMN の懸濁物(Sanchez Madrid,F.ら，J.Exp.Med．158: 1785(1983))を¹²⁵I で表面標識し、洗剤で可溶化し、そして抗CD18 mAb 60.3 又は抗EPR-1 mAb 12H1 を使用して免疫沈殿にかけた。 ¹²⁵I標識PMN 溶解産物から、mAb 60.3は先の観察(Sanchez Madrid,F.ら，J.Ex p.Med．158: 1785(1983))と一致して、共通のβ−サブユニットCD18と混在した 白血球インテグリンCD11a 、CD11b 、及びCD11c のαサブユニットに相当するポ リペプチドを免疫沈殿した。対照的に、同条件下で、mAb 12H1は約78±4 kDa の 分子量を有する主要表面成分を免疫沈殿させた。機能上、CD11b/CD18及びEPR-1 は異なるリガンド認識特異性を有する。CD11b/CD18はC3bi、フィブリノーゲン、 及び因子Ｘに関してオリゴ特異性受容体として認識されたが(Sanchez Madrid,F. ら，J.Exp.Med.158: 1785(1983); Altieri ら，J.Cell Biol．107: 1893(1988); Wright,S.D．ら，PNAS USA 85: 7734(1988); Altieri ら，J.Biol.Chem．263: 7007(1988))、EPR-1 は活性化セリンプロテアーゼXaを結合する(Altieriら，J.B iol.Chem．264: 2969(1989))。 抗CD11b/CD18 mAb はEPR-1 受容体機能を抑制せず、またその逆がCD11b/CD18 リガンド認識に関してEPR-1 mAb に当てはまる。同様に、可溶性CD11b/CD18リガ ンド、例えば、フィブリノーゲン(Altieriら，J.Cell Biol．107: 1893(1988); Wright,S.D．ら，PNAS USA 85: 7734(1988))、及び因子Ｘ(Altieriら，J.Biol.C hem．263: 7007(1988)はXaのEPR-1 受容体認識を競合又は抑制しない。 C.PBL に関するEPR-1 の動的調節発現 追加の研究を設計して抗原特異性又はマイトジェン誘導のＴ細胞活性化の条件 下でEPR-1 発現の動的調節の可能性を解明した。新たに単離されたPBMCを照射さ れた同種Ｂ細胞、即ち、Raji（誘導されたMHC クラスＩ及びII）又はDauji（誘 導されたMHC クラスII）に対し一方向性混合リンパ球培養(MLC)中で構築した。 培養７日後に、応答Ｔ細胞を回収し、洗浄し、mAb 7G12、9D4 、及び12H1を使用 するFMF により表現型上特性決定した。別の一連の研究において、PBMCを１μg/ mlのポリクローナルアクチベーター(PHA)又はConAの存在下で７日間にわたって 別々に培養し、次いでFMF 分析にかけた。正常なPBMCの同種膨張又はレクチン活 性化の両方が、mAb 12H1により認識されるように、EPR-1 ⁺ Ｔ細胞の一貫した３ 〜４倍の増加をもたらした（示されていない）。 12H1⁺ 細胞の観察された膨張が活性化の際に生じるＴ細胞サブセットの選択的 再分布から生じる可能性を排除するために、ConA刺激PBMCを培養の種々の時間間 隔後にFMF により連続的に分析した。EPR-1 ⁺ サブセットの ConA 媒介定量的膨 張が、増殖している活性化芽細胞に特徴的な前方の光散乱でもって細胞中に生じ た。これらの細胞の数は培養の６日目と７日目の間に約４倍増加し、そしてこれ らの細胞が２色FMF により表現型上特性決定された時に、それらはCD3 ⁺ 、CD4 ^- 、CD8 ⁺ 、CD2 ⁺ であった。 追加の研究を行ってEPR-1 発現に関する長期の同種異系反応性刺激の効果を調 べた。照射されたDauji 細胞に対する一方向性MLC が、10％のＴ細胞成長因子(T CGF)の存在下で週毎の移入で連続培養中に維持された。種々の時間間隔で、応答 Ｔ細胞のアリコートを回収し、フィコールーハイペークによる遠心分離により回 収し、最後にmAb 12H1又はポリクローナル抗血清B78.9 を使用するFMF によりEP R-1 マーカー発現について分析した（データは示されていない）。mAb 12H1によ り検出されたEPR-1 ⁺ 細胞の数は培養の１ケ月後に抗原介在性活性化中に約９倍 に増加した。又、同様の結果がポリクローナル抗血清B78.9 を使用して得られ、 これはこの試薬により検出されたEPR-1 エピトープの更に大きな数と一致する更 に大きな反応性を示す。 EPR-1 ⁺ 細胞の選択的膨張又はポリクローナル刺激もしくは抗原刺激から生じ るこのマーカーのde novo 発現を区別するために、研究の追加の組を行った。新 たに単離されたPBL の懸濁液をmAb 12H1によるFMF 選別によりEPR-1 ⁺ サブセッ ト及びEPR-1 ^- サブセット中で分取分別した。次いでこれらの得られた集団をEP R-1 発現のFMF 分析の前に１μg/mlのConA、５μg/mlのPHA で10日にわたって別 々に培養し、又は10％のTCGFの存在下で混合リンパ球応答において照射Daujiで 刺激した。これらの実験の結果が下記の表３に示される。負に選択されたEPR-1 ^- サブセットのポリクローナル刺激又は抗原刺激の両方はmAb 12H1の結合により 検出されたようにEPR-1 のde novo 発現と関連していた。 D.Ｔ細胞で発現されたEPR-1 は機能活性プロテアーゼ受容体である 別個のリンパ系集団に関する集団のEPR-1 の発現を更に実証するために、幾つ かの形質転換されたin vitroＴ細胞系を、上記mAb のパネルを使用してFMF によ りスクリーニンク化た。分析された種々のＴ細胞系のうち、HuT 78細胞の亜集団 のみがmAb 7G12と反応性であった（示されていない）。これらの細胞を、ポリク ローナル抗血清B78.9 を使用する蛍光選別により90％より高い純度まで単離して 亜集団HuT 78^* を得、次いでこれを限界希釈によりクローン化した。３種のクロ ーンを樹立し、サブクローン化、FMF によりOKT3⁺ 、OKT4⁺ 、OKT8^- 、12H1⁺ 、 B78.9 ⁺ として表現型上特性決定し、それらの一つを更なる研究のために選択し た。 HuT 78^* の懸濁液を2.5 mMのCaCl₂ の存在下で次第に増加する濃度の¹²⁵I-Xa で平衡にした時、これらの細胞は特異的かつ濃度依存性の反応において提供され たリガンドを結合し、添加された¹²⁵I-Xa の30〜36nMで定常飽和に接近した（表 ４）。THP-1 細胞で既に得られた結果(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969(198 9)と定量的に同様に、この反応は10〜20nMのオーダーの見掛Ｋ_d により調節され 、そして¹²⁵I-Xa の194,000 ±26,000の分子が夫々のHuT 78^* 細胞の表面で特異 的に会合された時に飽和された。最後に、飽和量のmAb 9D4 と一緒のHuT 78^*細 胞のプレインキュベーションはこれらの細胞への¹²⁵I-Xa の特異的結合を抑制し た。 ウサギポリクローナル抗血清B78.9 と反応するHuT 78^*細胞を蛍光選別により9 4.2％の純度まで単離し、限界希釈によりクローン化した。３種のクローンを樹 立し、表現型上特性決定し、一種（HuT 78^* -3）を更なる研究のために選択した 。 1 X 10⁷/mlのHuT 78^* -3細胞の懸濁液を対照抗体又は50μg/mlの抗EPR-1 mAb 9D 4とともに室温で30分間にわたって別々にインキュベートし、その後室温で更に2 0分間にわたって次第に増加する濃度の¹²⁵I- 因子Xa(0.45 〜36nM)を添加した。 その反応をシリコーン油の混合物中で遠心分離により停止し、HuT 78^* 細胞に特 異的に結合する¹²⁵I- Xaを抗EPR-1 mAb 9D4 の存在下又は不在下で計算した。 E.検討 幾つかの白血球で発現された細胞表面プロテアーゼ受容体とのmAb のパネルの 反応性が今特性決定された。先の研究において、血漿凝固タンパク質Ｖ(7G12)に 対し最初に産生されたmAb は特異的かつ飽和可能な反応で単球骨髄細胞系THP-1 、U937、及びHL-60 に結合することが示された(Altieriら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989))。更に、血漿タンパク質Va（Nesheim,M.E.ら，J.Biol.Chem．254: 1 0952(1979)）の既知のアクセプター／コファクター機能との類似性により、これ らの細胞でmAb 7G12により認識された分子はセリンプロテアーゼXaに関する特定 の受容体機能にかかわることが明らかであった。 抗Ｖ mAb のパネルが今産生された。これらのmAb を分泌するハイブリドーマ をTHP-1 細胞のFMF 分析により選択し、mAb をプローブとして使用して末梢血細 胞におけるＶ細胞表面交差反応性分子の発現について研究した。 これらの研究から導き得る最初の結論は、EPR-1 として操作により特定された これらのmAb により認識された分子が培養中の形質転換細胞系のみにより不適当 に発現されないことである。むしろ、それは広い細胞分布及び骨髄系列及びリン パ系列の細胞との顕著な会合を有する。試験した種々の集団中のかなりの不均一 性にもかかわららず、EPR-1 を形成するこれらのmAb は末梢血単球、PMN 、及び CD3 ^- CD16⁺ CD56⁺ NK細胞と反応性であることがわかった。 重要なことに、循環Ｔ細胞の小さいフラクションが又EPR-1 ⁺ として同定され た。FMF によるこのサブセットの表現型特性決定は、EPR-1 の発現がT細胞の現 在知られているマーカーにより形成された特異な亜集団に分離されないことが明 らかであることを示唆した。種々のドナーから単離されたEPR-1 ⁺ 細胞の大半が 又CD8 ⁺ 又はα／βTCR ⁺ であったが、CD4 又はγ／δTCR を同時発現する細胞 が同様に同定された。この知見と一致して、in vitroの種々の形質転換Ｔ細胞系 のFMF 分析が、先の観察(Lefranc,M.P．ら，Nature 316: 464(1985); Brenner， M.B.ら，Nature 325: 689(1987))と一致して、夫々CD4 ⁺ 及びTCR γ／δ⁺ とし て更に表現型上樹立されたMOLT13細胞におけるEPR-1 マーカーの発現を明らかに した。 正常なPBL のCD8 ⁺ フラクション内で、EPR-1 発現は、mAb OKM1及びHNK-1 に より同定されたように、CD11b(Leu 15)及びCD57(Leu 7)の同時発現と一貫して関 連した。先の研究において、マーカーのこのパターンがサプレッサー機能(Cl-em ent,L.T.ら，J.Immunol．133: 2461(1984); Fox,E.J．ら，J.Exp.Med．166: 404 (1987); Takeuchi,T．ら，Cell.Immunol．111: 398(1988))及びLAK 活性(Dianza ni ら，Eur.J.Immunol．19: 1037(1989))と関連していた。しかしながら、この Ｔ細胞サブセットの既に報告された不十分な増殖応答(Fox,E.J．ら，J.Exp.Med ．166: 404(1987))と変化して、EPR-1 発現はマイトジェン及び抗原刺激の両方 により強く増大されるものとして観察される。 この知見は同種異系反応性刺激Ｔ細胞の長期培養物を使用する研究において特 に強調されることが明らかであり、この場合、抗EPR-1 ウサギポリクローナル抗 体B78.9 が１ケ月の培養後に実際に全ての応答細胞と反応した。同様に、de nov o EPR-1 発現が分取選別されたEPR-1 ^- 集団の短期のポリクローナル刺激又は抗 原刺激後に又観察された。これらのデータは、EPR-1 が真のＴ細胞活性化応答分 子であるという仮説と適合していることが明らかであるようであるが、単一クロ ーン細胞レベルにおける更なる研究がこの可能性に最終的に取り組むのに必要で ある。最後に、CD4 又はCD8 の両方の発現と一致して、EPR-1 ⁺ 細胞の優先的な 膨張がクラスＩ又はクラスII MHC同種刺激により観察されなかった。 EPR-1 の細胞分布は白血球インテグリンCD11b/CD18(Sanchez Madrid,F．ら，J .Exp.Med．158: 1785(1983))のそれに近似するが、免疫沈殿研究及び¹²⁵I標識リ ガンド結合アッセイにより明らかにされた構造／機能分析は、これらが明確かつ 異なる受容体認識機能(Altieri ら，J.Biol.Chem．264: 2969(1989); Sanc-hez Madrid,F．ら，J.Exp.Med．158: 1785(1983); Altieriら，J.Cell Biol.107: 18 93(1988); Wright,S.D．ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 7734(1988); Altieri ら，J.Biol.Chem．263: 7007(1988))にかかわる２種の異なる分子であ ることを明らかに実証する。 この研究は、細胞EPR-1 と血漿タンパク質Ｖ（これは最初に免疫原として利用 でき、使用される抗EPR-1 mAb を産生した）の相互の関係に取り組むように設計 されなかった。しかしながら、記載された抗EPR-1 mAb パネル（パネルＩ）が因 子Ｖによる免疫化により誘発される抗Ｖハイブリドーマの少量フラクションのみ を構成することを注目することが重要である。実際に、同一プロトコルのもとに 産生され、樹立され、因子Ｖと免疫反応性のmAb の産生のために選択された抗Ｖ mAb の第二パネルはTHP-1 細胞と交差反応性を示さなかった。更に、免疫沈殿研 究で分解されたEPR-1 のサイズ(Mr 62-74 kDa)及び構造編成は血漿タンパク質因 子Va(Nesheim，M.E.ら，J.Biol.Chem．254: 10952(1979))のＬ鎖に対し顕著なサ イズ類似性を示す。これらの考察に基いて、EPR-1 はリガンド認識と機能上関連 する幾つかの保存された免疫反応性エピトープを維持する血漿凝固タンパク質Ｖ に相同の細胞表面分子に相当するものと考えられる。 種々の白血球集団におけるEPR-1 の発現が特定の免疫エフェクター機能におけ るその関与を含むか否かは現在知られていない。しかしながら、NK細胞及びCD8 ⁺ Ｔ細胞が高アフィニティーセリンプロテアーゼを発現するという観察はヒト及 びマウスのNKクローン及びCTL クローン(Masson,D.ら，Cell 49: 679(1987))の 顆粒に含まれる密接に関連したセリンプロテアーゼ（グランザイム）のファミリ ーの同定に鑑みて刺激的である。これらの酵素は幾つかのセリンプロテアーゼ、 特に凝固プロテアーゼ因子IXa 、Xa、及びプラスミンと重要な相同性を共有する (Jenne,D．ら，PNAS USA 85: 4814(1988); Gershenfeld,H.K.ら，Science 232: 854(1986); Jenne,D.ら，J.Immunol．140: 318(1988); Lobe,C.G．ら，Science 232: 858(1986); Gershenfeld,H.K．ら，PNAS USA 85: 1184(1988))。又、グラ ンザイムの遺伝子発現及び分泌の動的調節はin vitroの増大されたEPR-1 発現、 即ち、抗原及びIL-2に対する長期応答と関連する同じ刺激により増大されること は注目に値する(Manyak,C.K.ら，J.Immunol．142: 3707(1989); Masson,D.ら，E MBO J．4: 2533(1985))。NK又はCTL 死滅における細胞グランザイムの役割が依 然として解明されるべき状態であるが(Dennert,G．ら，PNAS USA 84: 5004(1987 ))、溶解プロセスにおけるセリンプロテアーゼに関する推定の役割がセリ ンプロテアーゼインヒビターを使用する実験により示唆されていた(Redelman,D. ら，J.Immunol．124: 870(1980); Chang,T.W.ら，J.Immunol．124: 1028(1980); Suffys,P．ら，Eur.J.Biochem．178: 257(1988); Scuderi,P.，J.Immunol．143 : 168(1989))。 タンパク質分解活性の受容体介在性増幅の一般的な概念(Miles,L.A．ら，Fib- rinolysis 2: 61(1988); Morrissey ら，Cell 50: 129(1987); Nesheim,M.E.ら ，J.Biol.Chem．254: 10952(1979))との類似性により、局所放出されたグランザ イムはエフェクター細胞の膜成分と相互作用して、プロテアーゼインヒビターを 循環することにより中和から保護された、最適の触媒効率を送出し得るものと考 えられる。この状況において、EPR-1 は免疫エフェクター細胞により発現される 表面受容体に関する要件を実現し、プロトタイプの高度に保存されたセリンプロ テアーゼ、例えば、因子Xaに関するリガンド認識を示し、抗原刺激により動的に アップレギュレーションされる。 mAb 選択に関する珍しい戦略を使用することにより、新規な白血球マーカー、 セリンプロテアーゼ受容体、及び血漿凝固タンパク質Ｖの見掛けの細胞表面同族 体が導入された。免疫エフェクター細胞におけるその顕著な分布のために、“EP R-1”という名称がこの分子を暫定的に同定するのに提案される。フィブリンの 細胞介在性の形成のメカニズムにおけるEPR-1 の役割がXaに関するその認識によ り強調されるが(Nesheim,M.E．ら，J.Biol.Chem．254: 10952(1979))、セリンプ ロテアーゼにより媒介される生物活性の広いスペクトルは付加的なリガンドの認 識及び細胞介在性機能におけるEPR-1 の関与を含むものと考えられる。 実施例12 プロテアーゼ依存性Ｔ細胞活性化におけるEPR-1 及び因子Xaの役割 A.物質及び方法 細胞及び細胞培養物を以下のようにして調製した。末梢血単核細胞(PBMC)を同 意を得た後の正常な健康なボランティアから採取されたヘパリン処理された血液 から単離した。血小板に富む血漿を22℃で12分間にわたる800 x g における血液 の遠心分離後に除去した。PBMCを22℃で18分間にわたる400 x g におけるフィコ ールーハイペーク勾配(シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO)(密度=1.077g/ ml)の示差遠心分離により分離し、PBS ＋５mMのEDTA、pH7.2 中で洗浄し、そし て10％の熱不活化ウシ胎児血清(FCS、ウィットテーカー)、２mMのＬ−グルタミ ン（イルビン・サイエンティフィック、カラバサス、CA）、及び25mMのHepes(カ ルビオケム・ベーリンガー・ディアグノスティック、ラ・ジョラ、CA)を含む完 全RPMI 1640 組織培地（M.A.ウィットテーカー、ウォーカーズビル、MD）中で再 度懸濁させた。Ｔリンパ球（>95 ％のOKT3⁺ ）を37℃で１時間にわたるプラスチ ック付着の２回の連続サイクル、続いて22℃で45分間にわたるリボソーム刺激性 (lysosomotropic)化合物ロイシンメチルエステル(Leu- Ome 、シグマ)と一緒の 非付着性集団のインキュベーション(Thiele ら，J.Immunol．131: 2282(1983)) 、そして非付着性細胞の回収を伴う37℃で１時間にわたるナイロンウールカラム による生存集団の濾過によりPBMCから分別した。 この研究に使用した種々の細胞におけるEPR-1 発現を、既に記載されたように して(Altieriら、上記文献(1990); 又、上記実施例３を参照のこと)フローサイ トメトリーにより測定した。 血液プロテアーゼ因子Xaの単離及び精製に使用される実験操作はAltieri ら， J.Biol.Chem．264: 2969(1989))に記載されたとおりであった。抗トロンビンIII (ATIII、シグマ、セントルイス、MO)をリンパ球増殖実験において対照の無関係 のタンパク質として使用した。抗CD3 mAb はOKT3であった。α／βＴ細胞受容体 (WT-31)、IL-2受容体(1HT44H3)、及びCD56(Leu19)の抗体をベクトン・ディキン ソン（マウンテンビュー、CA）から購入した。抗γ／ΔＴ細胞受容体mAb Δ−１ はD.P.Dialynas博士（スクリプス・リサーチ・インスティチュート、ラ・ジョラ 、CA）により寛大に提供された。抗CD20 mAb B-1をAMAC社（ウェストブルーク、 ME）から購入した。増殖実験に使用したイソタイプ適合対照は抗CD57 mAb HNK-1 (IgM)(Abu ら，J.Immunol．129: 1758(1982))、及びW.Ruf 博士（スクリプス・ リサーチ・インスティチュート、ラ・ジョラ、CA）により寛大に提供された２種 の抗組織因子mAb 9C6 及び5G9 であった。(ハイブリドーマ5G9 がEdgington ら の米国特許第5,110,730 号に記載されており、これらの関係する開示が参考とし て本明細書に含まれる。）未知の特異性の非結合性mAb HB3 をフローサイトメト リー実験の対照として使用した。 細胞増殖実験を実質的に既に記載されたようにして（実施例１）行った。完全 RPMI 1640 培地中のPBMCの懸濁液を96ウェル組織培養ミクロタイタプレート（コ スター社、ケンブリッジ、MA）中で3x10⁵/ウェルで三重に接種し、そして非分裂 促進投与量のフォルボールエステル(PMA、シグマ、１ng/ml)の存在下又は不在下 で次第に増加する濃度の因子Xa(1.5-300 nM)、又は対照タンパク質ATIII ととも にインキュベートした。37℃で３日培養した後、細胞を37℃で12時間にわたって １μCi/ ウェルの³HTdR でパルスし、回収し、種々の条件下でとり込まれた放射 能をシンチレーションβカウンター中で測定した。 別の一連の実験において、PBMC（3x10⁵/ウェル）又は精製Ｔ細胞(1.5x10⁵/ ウ ェル)の懸濁物を１μg/mlの可溶性抗CD3 mAb OKT3(Geppertら，J.Immunol.138: 1660(1987))で刺激し、そして37℃で３日間にわたって抗EPR-1 mAb 12H1（1:500 希釈、腹水）もしくは13E5(25μg/ml)、又はイソタイプ適合対照mAb HNK-1 も しくは5G9 と同時に混合した。試験した種々の条件下の細胞増殖を上記のように して³HTdR とり込みにより分析した。EPR-1 刺激リンパ球増殖の経時研究を、高 い応答細胞濃度の1x10⁶ PBMC/ ウェルを対照mAb 9C6（50 μg/ml)、抗CD3 mAb O KT3（1 μg/ml）、又は抗EPR-1 mAb 13E5（50μg/ml）の存在下又は不在下で種 々の時間間隔で37℃で培養することにより行った。夫々の24時間の培養の終了時 に、ウェルを１μCi/ ウェルの³HTdR でパルスし、種々の条件下でとり込まれた 放射能を上記のようにして測定した。別の一連の実験において、精製Ｔ細胞(1.5 x10⁵/ ウェル)又はPBMC（3x10⁵/ウェル）を³HTdR とり込みによる細胞増殖の定 量の前に、次第に増加する濃度のPMA(0.01-2.5 ng/ml)、又は次第に増加する投 与量のIL-2(0.2-16.7 U/ml)とともに25μg/mlの抗EPR-1 mAb 13E5の存在下又は 不在下で37℃で３日間にわたって培養した。 EPR-1 嵌入により膨張されたリンパ球集団の表現型特性決定をフローサイトメ トリーにより行った。完全RPMI 1640 培地中の1x10⁶/mlのPBMCを37℃で７日間に わたって50μg/mlの抗EPR-1 mAb 13E5又は対照mAb 9C6 の存在下で24ウェル組織 培養プレート（コスター）中で培養した。細胞を回収し、PBS、pH7.2 中で洗浄 し、４℃で30分間にわたって20％の正常なヒト血清で前飽和してFc媒介mAb 結合 を防止し、インキュベートして４℃で30分間にわたって系列特異性白血球表面抗 原の種々のmAb とともにインキュベートした。洗浄後、一次mAb の結合を４℃で 更に30分間にわたるFITC接合ヤギ抗マウスF(ab')₂断片（タゴ社、バーリンゲー ム、CA）の1:20希釈液の添加により明らかにした。細胞を洗浄し、直ちにベクト ン・ディキンソンFacScan で分析した。バックグラウンド蛍光を同実験条件下で 非結合性mAb HB3 の存在下で分析した。活発に増殖している芽細胞をサイズ／前 方散乱パラメーター（Darzynnkiewiczら，PNAS USA 77: 6696(1980)）により測 定されるような細胞容積の細胞サイクル依存性変化に基いて分別した。 EPR-1 占有後の細胞内Ca²⁺シグナリングの早期イベントを単一細胞レベルで実 時間蛍光測定で特性決定した(Altieriら，Biochem.J．288: 465(1992))。新たに 単離されたＴリンパ球を細胞Tak-(バイオポリマーズ、ファーミントン、CT)被覆 光学等級ガラスカバースリップ(直径22mm² 及び厚さ<0.16 μm)に付着し、37℃ で45分間にわたって145 mMのNaCl、５mMのKCl 、１mMのNa₂HPO₄ 、2.5 mMのCaCl₂ 、10mMのグルコース、25mMのHEPES 、0.5 mMのMgSO₄ 中の１μM のCa²⁺感受性 蛍光色素Indo-1/AM(Grynkiewiczら，J.Biol.Chem．260: 3440(1985))を細胞内に 負荷した。細胞を同負荷緩衝液中で穏やかに洗浄し、記載されているような(Alt ieriら，上記文献(1992))相互作用レーザーサイトメーターACAS 470を使用する デジタル化画像形成において実時間蛍光測定で分析した。簡単に言えば、50μg/ mlの濃度の対照mAb 9C6 、抗EPR-1 mAb 13E5、又は抗CD3 mAb OKT3を連続横断蛍 光分析中の10〜25の付着Ｔリンパ球のグループの第一スキャン（25秒）後に添加 した。一次mAb の添加から125 秒後に、ヤギ抗マウスF(ab')₂断片の50μg/mlの アリコートを架橋試薬として添加し、標的細胞の蛍光変化を３分間隔中に連続的 に監視した。試験した種々の条件下のシトゾルの遊離［Ca²⁺］_i の変化を検出器 １(遊離Indo-1、波長485nm)/ 検出器２（Indo-1:Ca²⁺ 複合体、波長405 nm）の 比として表す。 B.結果 1.EPR-1 の連結反応がリンパ球増殖を刺激する 初期実験はPBMC増殖に関する次第に増加する濃度の天然EPR-1 リガンド、因子 Xaの効果を分析した。図16に示されるように、因子Xa＋非分裂促進投与量のPMA は投与量依存様式で未分別PBMCのＤＮＡ合成及び及び³HTdR とり込みを刺激した 。 EPR-1 との¹²⁵I- 因子Xa会合の平衡結合パラメーターと一致して、最大増殖応答 が15-75 nMの因子Xa濃度を飽和するのに観察された（図16）。対照的に、匹敵す る濃度の因子Xa単独、又は対照タンパク質ATIII+PMA は同実験条件下でPBMC増殖 に影響しなかった（図16）。 因子Xa介在性PBMC増殖におけるEPR-1 の関与を証明するために、先の研究(A1- tieri ら，上記文献(1989)及び(1990))において特性決定された抗EPR-1 mAb 12H 1又は13E5をリンパ球増殖を同時刺激するための“代理”リガンドとして使用し た。3x10⁵/ウェルのPBMCを抗EPR-1 mAb 12H1又は対照mAb HNK-1(1:500腹水希釈) の存在下又は不在下で１μg/mlの可溶性抗CD3 mAb OKT3で刺激した。細胞増殖を 図16に記載されたようにして37℃で３日培養後に分析した。 次いで、精製Ｔリンパ球の懸濁物（1.5x10⁵/ウェル、>95 ％のOKT3⁺ ）を抗EP R-1 mAb 13E5又は対照mAb 5G9 の存在下で可溶性抗CD3 mAb OKT3とともにインキ ュベートした以外は、実験を繰り返した。細胞増殖を37℃で３日培養後に³HTdR とり込みにより測定した（データは示されない）。最後に、Ｔリンパ球（1.5x10⁵ /ウェル）を細胞増殖の定量の前に37℃で３日間にわたって50μg/mlの抗EPR-1 mAb 13E5の存在下又は不在下で次第に増加する濃度のPMA(0.01-2.5 ng/ml)で培 養した（データは示されない）。 3x10⁵ 応答細胞／ウェルが使用された時（下記を参照のこと）、12H1又は13E5 単独のいずれもがPBMC増殖に影響しなかったが、mAb 12H1又は13E5はPBMC（デー タが示されない）又は可溶性抗CD3 mAb OKT3（示されない）により刺激された精 製Ｔ細胞増殖を約２倍増加した。又、精製Ｔ細胞増殖の同様の２倍の増加が同時 固定mAb OKT3及び13E5による受容体架橋後に観察された（示されない）が、この 増殖応答の大きさは、先の観察(Geppertら，上記文献(1987))と一致して、可溶 性mAb で観察されたものよりも極めて大きかった。又、抗EPR-1 mAb 12H1は３日 の³HTdR とり込みアッセイ中にレクチンConA（１μg/ml）又はPHA(４μg/ml)に より刺激されたポリクローナルPBMC増殖を約２倍増強した（示されない）。最後 に、図16に示されたデータと一致して、抗EPR-1 mAb 13E5は非分裂促進性の次第 に増加する濃度のPMA と組み合わせて精製Ｔ細胞増殖を刺激した（データは示さ れない）。 先に示されたように、循環EPR-1 ⁺ 細胞は５〜10％の静止Ｔ細胞の小さいサブ セットのみを含む(Altieriら，上記文献(1990))。それ故、EPR-1 依存性リンパ 球刺激の速度論／大きさとインキュベーション反応中の潜在的なEPR-1 ⁺ 応答細 胞の数の関係を調べることが重要であった。 これらの実験に関して、高い応答細胞濃度の1x10⁶ PBMC/ ウェル（三重）を37 ℃で種々の時間間隔で飽和投与量の抗EPR-1 mAb 13E5、抗CD3 mAb OKT3、又は対 照mAb 9C6 とともにインキュベートした。夫々の24時間の培養の終了時に、細胞 増殖を図16に記載されたようにして³HTdR とり込みにより測定した。低い応答細 胞濃度（図16）でEPR-1 依存性増殖にかかわるアクセサリー同時刺激シグナルに 関する要件と変化して、抗EPR-1 mAb 13E5は付加的な刺激シグナルの不在下でこ れらの実験条件下で強い一次増殖応答を生じた。mAb 13E5により刺激された一つ 以上のEPR-1 感受性細胞サブセットの最高の膨張が、OKT3介在性応答と比較して 更に遅延された速度論で起こり、37℃で４〜６日の培養後にピークに達した（デ ータは示されない）。 2.EPR-1 介在性リンパ球同時刺激のメカニズム EPR-1 依存性リンパ球刺激におけるIL-2、及びIL-2受容体の役割を、二つの独 立の実験アプローチを使用して調べた。最初に、EPR-1 介在性リンパ球増殖に関 するIL-2の効果を以下のようにして測定した。3x10⁵/ウェルのPBMCを50μg/mlの 抗EPR-1 mAb 13E5の存在下又は不在下で示された濃度のIL-2(0.2-16 U/ml)で37 ℃で３日間培養した。対照培養物を同実験条件下で抗トロンビンIII（ATIII）＋ PMA とともにインキュベートした。細胞増殖を³HTdR とり込みにより定量した。 データ±S.E.M.は二つの独立の実験の代表であった（データは示されない）。低 い応答細胞濃度までの抗EPR-1 mAb 13E5の添加は、同実験条件下でmAb 9C6 とと もにインキュベートされた対照培養物と比較して、非常に低い非分裂促進投与量 のIL-2(0.2-2 U/ml)の存在下でリンパ球増殖の３〜４倍の増加を刺激した（デー タは示されない）。 第二の一連の実験において、低い応答細胞濃度を37℃で24時間にわたって抗EP R-1 mAb 13E5又は対照mAb 9C6 で培養し（プライミング）、続いて37℃で３日間 にわたって次第に増加する投与量のIL-2(0.2-16 U/ml)と混合した。3x10⁵/ウ ェルのPBMCを50μg/mlの対照mAb 9C6 又は抗EPR-1 mAb 13E5の存在下で37℃で24 時間にわたって培養した。インキュベーションの終了時に、細胞を³HTdR とり込 みの定量前に37℃で追加の３日の培養にわたって次第に増加する投与量のIL-2(0 .2-16 U/ml)と混合した（データは示されない）。次に、PBMCを最初に37℃で24 時間にわたってIL-2（2 U/ml）で培養し、続いて37℃で３日間にわたって50μg/ mlの対照mAb 9C6 又は抗EPR-1 mAb 13E5及び次第に増加する投与量のIL-2(0.2-1 6 U/ml)と混合した。データ±S.E.M.は二つの独立の実験の代表であった（示さ れない）。mAb 13E5によるEPR-1 プライミングは、同実験条件下で対照mAb 9C6 でプライミングされた培養物と比較して、非常に低い投与量のIL-2（0.2U/ml） に応答して５〜８倍増加されたPBMC増殖を生じた。フローサイトメトリーにより 測定して、これらの実験条件下のEPR-1 プライミングされた細胞は抗IL-2受容体 mAb 1HT44H3 と強く反応した（以下を参照のこと）。 3.EPR-1 応答細胞の表現型特性決定 これらの実験に関して、EPR-1 嵌入後に膨張された活発に増殖している芽細胞 を細胞容積の細胞−サイクル依存性変化に基いてフローサイトメトリーにより同 定した（Darzynnkiewiczら，上記文献(1980)）。これらの実験の結果は、³HTdR とり込み実験と一致して、EPR-1 とmAb 13E5の連結反応が活発に増殖している芽 細胞のサイズ／前方散乱パラメーターで、小さくかつ不連続の細胞サブセット(1 6 〜20％)の増殖を刺激することを示した（データは示されない）。対照的に、 活性化細胞の数の有意な増加が同実験条件下でmAb 9C6 とともにインキュベート された対照培養物では観察されなかった。 静止PBMCにおけるEPR-1 の表現型上不均一の分布と一致して、EPR-1 応答細胞 はＴ系列及びＢ系列の両方のリンパ球（夫々、WT31⁺ 及びB1⁺ ）を含み、前者は α／β⁺ 細胞及びγ／Δ⁺ 細胞（夫々、WT31⁺ 及びΔ１⁺ ）の両方、CD4 ⁺ 、CD 8 ⁺ 、及びCD11b ⁺ 細胞を含む（示されない）。対照的に、かなり小さい増加が Leu19 ⁺ 、EPR-1 刺激細胞のNKフラクション中で観察された。最後に、EPR-1 介 在性リンパ球増殖の仮定されたIL-2依存性メカニズムと一致して、EPR-1 応答細 胞は、同実験条件下でmAb 9C6 とともにインキュベートされた対照培養物と比較 して、抗IL-2受容体mAb 1HT44H3 と強く反応した。 4.EPR-1 嵌入により開始された細胞内シグナリング 追加の実験は、活性化mAb 13E5によるEPR-1 の占有が単一付着性リンパ球(Ga- rdner,P.，Cell 59: 15(1989))中の細胞内シグナル導入の早期イベントと関連す るか否かを分析した。Ca²⁺感受性蛍光色素Indo-1で細胞内で負荷されたＴ細胞は シトゾル遊離［Ca²⁺］_i の大きくかつ持続された増加でもって７μM のイオノマ イシンに直ちにかつ均一に応答した（示されない）。同様に、mAb OKT3によるCD 3 架橋は又先の観察と一致して、ヤギ抗マウスF(ab')₂ 断片の添加と一時的に同 時に起こる反応において、分析された殆どの細胞中でCa²⁺応答を生じた。 対照的に、対照mAb 9C6 ＋ヤギ抗マウス架橋試薬は標的細胞中でCa²⁺応答を誘 発しなかった。これらの実験条件下で、mAb 13E5＋ヤギ抗マウスF(ab')₂ 断片に よるEPR-1 の架橋は、細胞外Ca²⁺イオンの不在下で部分的に減少されたが、無効 にはされない一次的かつ定量的な不均一なCa²⁺応答を生じた（３mMのEGTAを含む 緩衝液、示されない）。単一細胞レベルで分析されたように、このCa²⁺応答は、 静止Ｔ細胞の小さいサブセットのみにおけるEPR-1 の発現と一致して、分析集団 の約20％中で観察された（上記を参照のこと）。 C.検討 この研究は、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１(EPR-1)と称される新 規なプロテアーゼがＴ細胞活性化に寄与することを示す。凝固／線維素溶解メカ ニズムにおけるそれらの役割に加えて、血液プロテアーゼは特殊細胞応答を誘発 する。これらとして、細胞運動性及び凝集（Ossowski，Cell 52: 321(1988); Sh uman，Ann.N.Y．Acad.Sci．485: 349(1986)）、早期活性化依存性遺伝子の転写( Daniel ら，J.Biol.Chem．261: 9579(1986))、誘発性細胞付着分子の発現(Zimme rmanら，J.Clin.Invest．76: 2235(1985))、細胞活性化の細胞内シグナリング経 路(Vu ら，Cell 64: 1057(1991); Paris ら，J.Bil.Chem．259: 10989(1984); G oldenら，J.Cell Biol．111: 3117(1990))、及び正常な細胞及び形質転換細胞の 両方のＤＮＡ合成及び増殖(Glennら，Nature 278: 711(1979); Kir-chheimerら ，PNAS USA 86: 5424(1989); Ossowskiら，J.Biol.Chem．249: 4312(1974); Sul livanら，Cell 45: 905(1986))が挙げられる。相補細胞表面受容体、の認識特性 及びシグナリング特性により、トロンビン(Vu ら，上記文献(1991)、 ウロキナーゼ(Appellaら，上記文献(1987))、凝固因子XII/XIIa（Schmeidler- S hapiro ら，PNAS USA 88: 4382(19920)、及び因子X/Xa（Gasic ら，上記文献(19 92)）の全てが、血管損傷及びアテローム性動脈硬化症の早期分子イベントに潜 在的に寄与するメカニズムにおいて種々の間葉細胞の増殖を刺激する(Ross，Nat ure 362: 801(1993))。 種々の白血球サブセットにおける血液凝固プロテアーゼ因子Xaのその認識につ いて先に特性決定されたように、EPR-1 は典型的なリンパ球活性化依存性抗原で あり、これは細胞表面におけるトロンビン形成のメカニズムに関与する。ここで 本発明者らは、生理学的濃度の天然EPR-1 リガンド、因子Xaがアクセサリーシグ ナル、即ち、PMA の存在下でリンパ球増殖を刺激することを示す。この分裂促進 応答を反復発生する抗EPR-1 mAb 12H1及び13E5の能力はリンパ球刺激にかかわる 因子Xa受容体としてのEPR-1 の役割を更に証明し、そして因子Xa調製中の潜在的 な分裂促進汚染物質の効果を排除することに協力した。これらの実験条件下で、 EPR-1 のmAb 嵌入は単一付着性Ｔ細胞中のシトゾル遊離［Ca²⁺］_i を増大し、PM A の存在下でＴ細胞増殖を刺激し、そしてmAb OKT3により開始されるクローン型 Ｔ細胞増殖を約２倍増強した。先の研究で示されたように、循環中のEPR-1 ⁺ 細 胞は未分別リンパ球の５〜10％の小さいサブセットを含む(Altieriら，上記文献 (1990))。この相対的に低い細胞再提示と一致して、EPR-1 依存性リンパ球増殖 のメカニズムはインキュベーション反応中に存在するEPR-1 ⁺ 応答細胞の閾値数 に鮮明に依存する。低い応答細胞濃度で、EPR-1 の連結反応はＴ細胞活性化のた めのアクセサリー同時刺激シグナルを導入するが、高い応答細胞濃度におけるEP R-1 嵌入それ自体は付加的なシグナルの不在下でリンパ球増殖を開始するのに充 分である。この状況において、EPR-1 の連結反応は、IL-2受容体の早期の表面発 現により、非常に低い投与量のIL-2（0.2 U/ml）に対する標的細胞の分裂促進応 答能を増大し、そしてOKT3介在性応答と較べて更に遅延された速度論でもって、 Ｂリンパ球及びＴリンパ球の両方を含む別個（16〜20％）の異種集団を膨張する 。 突然変異誘発された因子Xaを使用する更なる研究は、この増殖応答におけるプ ロテアーゼ触媒活性部位の役割を更に解明することを意図されている。しかしな がら、触媒活性の不在下でＴ細胞活性化を刺激する抗EPR-1 mAb 121 又は13E5の 能力は、この増殖応答の分子上の前提条件が局所の受容体タンパク質分解(Vu ら ，上記文献(1991)にあるのではなく、物理的な受容体占有及びリガンド誘導細胞 内シグナリングにあるかもしれないことを示唆する。 ここに記載された分裂促進経路には顕著な病態生理学的インプリケーションが ある。第一に、別個のリンパ球サブセットにおけるプロテアーゼの受容体介在性 集合はリンパ球刺激／同時刺激の新規な調節メカニズムを与えるかもしれない。 Ｔ細胞活性化の現行のモデル(Janewayら，Curr.Opin.Immunol．5: 313(1993); J enkins ら，Curr.Opin.Immunol．5: 361(1993))と一致して、同時刺激シグナル はin vivo の免疫応答の抗原特異性メカニズムを維持するのに重要な役割を果た す(Schwartz，Cell 71: 1065(1992))。この状況において、リンパ球同時刺激はC D28:B7/B7-2受容体−カウンター受容体対(Schwartz ら，上記文献(1992); Freem an ら，Science 262: 909(1993))により主として協調された多重複プロセスとし て機能するが、又インテグリンの付着受容体(van Noesel ら，Nature 333: 850( 1980)、及びIg遺伝子スーパーファミリー(Cerdanら，Cell.Immunol．123: 4579( 1986)、膜エクト−５’−ヌクレオチダーゼ(Thompson ら，J.Immunol．142: 151 8(1989))、及びリンパ球ホーミング受容体(Rothmanら，J.Immunol．147: 2493(1 991))を含む種々の付加的なシグナル導入分子により寄与される多重複プロセス として機能する。ここに提供されたデータに基いて、EPR-1 はリンパ球刺激／同 時刺激(Schwartz ら，上記文献(1992))の新規な局面を提供し得る。プロテアー ゼは、凝固及び線維素溶解メカニズムの活性化(Furieら，上記文献(1988)と不可 避に関連する異種の免疫炎症プロセス中にin vivo で至る所で生成される。EPR- 1 ⁺ 細胞への局所で生じたXaの結合は独立の“アクセサリーシグナル”を生じて 、炎症性病変の細胞微小環境に放出された非常に少量のIL-2に応答してIL-2受容 体発現をアップレギュレーションし、リンパ球増殖を増大し得る。同じ系統とと もに、このメカニズムは又凝固の活性化並びに種々の白血球サブセットの増殖及 び内膜内蓄積(Ross,上記文献(1993); Jonassonら，Arteriosclerosis 6: 131(19 86); Aqel ら，J.Pathol．146: 197(1985))を特徴とする血管損傷及びアテロー ム性動脈硬化症の早期分子イベントに寄与し得る。 EPR-1 の一次構造の解明、及び細胞内シグナリング及びＴ細胞活性化に関与す る一つ以上の機能性ドメインの同定は、リンパ球増殖のこの新規な調節メカニズ ムに識見を与える。 実施例13 物質の寄託 MOLT13 #13を1991年１月11日に米国20852 、メリーランド、ロックビル、パー クローンドライブ12301 にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC)に寄託し、受理番号CRL 10638 を受けた。その寄託はブタペスト条約のあ らゆる適用条項に従ってなされた。 12H1と称されるハイブリドーマを、ブタペスト条約のあらゆる適用条項に従っ て1991年１月11日にATCCに寄託した。そのハイブリドーマは名称ATCC HB 10637 を与えられた。ハイブリドーマ2E1 をブタペスト条約のあらゆる適用条項に従っ て1994年１月27日以前にATCCに寄託した。そのハイブリドーマは名称ATCC HB 11 536 を与えられた。 前記寄託は、寄託の期間が寄託の日から30年もしくは寄託所における寄託の最 後の依頼後の５年又はこの出願から登録された米国特許の存続期間のいずれか長 い方であるべきであるというブタペスト条約の要件に従ってなされた。寄託され た細胞系及びハイブリドーマが寄託所で生存できなくなる場合には、それが補給 される。 本発明が明瞭化の目的で例示及び実施例により若干詳しく記載されるが、或る 種の自明の改良が請求の範囲内で実施し得る。当業者は、種々の改良、変化、省 略及び置換が本発明の精神から逸脱しないでなし得ることを容易に理解するであ ろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 9356−4Ｈ 16/28 16/28 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図1A及び1Bに示され、かつ本明細書中配列番号２として同定されたアミノ酸 残基配列を有するEPR-1 タンパク質。 ２．前記タンパク質が2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる 群から選ばれたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体と免疫反応 できる請求の範囲第１項に記載のタンパク質。 ３．前記タンパク質がTHP-1、好中球、NK細胞、及びMOLT13 #3(ATCC 番号CRL 10 638)からなる群から選ばれた細胞系から単離される請求の範囲第１項に記載のタ ンパク質。 ４．前記タンパク質が発現ベクターでトランスフェクトされた真核細胞中で発現 される請求の範囲第１項に記載のタンパク質。 ５．図1A及び1Bに示され、かつ本明細書中配列番号２として同定されたアミノ酸 残基配列に少なくとも75％相同のアミノ酸残基配列を有するEPR-1 タンパク質で あって、前記タンパク質が因子Xaを結合できることを特徴とするEPR-1 タンパク 質。 ６．一種以上の免疫反応性エピトープを含むEPR-1ポリペプチドであって、前記 ポリペプチドが2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からなる群から 選ばれたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体と免疫反応できる ことを特徴とするEPR-1 ポリペプチド。 ７．前記ポリペプチドが下記の式: により表されるアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第６項に記載のポリペプチ ド。 ８．ハイブリドーマ2E1 により分泌されたモノクローナル抗体と免疫反応できる EPR-1 ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが下記の式: により表されるアミノ酸残基配列に少なくとも75％相同のアミノ酸残基配列を有 することを特徴とするEPR-1 ポリペプチド。 ９．請求の範囲第１項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。 10．図1A及び1Bに示され、かつ本明細書中配列番号1 として同定されたデオキシ リボヌクレオチド配列を含む請求の範囲第９項に記載の分子。 11．配列番号２のシーケンシャルサブセットに相当するアミノ酸残基配列を含む ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。 12．前記シーケンシャルサブセットが配列番号２の残基48-76 を含む請求の範囲 第11項に記載の分子。 13．前記分子が組換えＤＮＡ分子である請求の範囲第９項又は第11項に記載の分 子。 14．EPR-1 タンパク質と免疫反応できるが、因子Ｖとは免疫反応しない抗体結合 部位を含む免疫活性分子。 15．前記分子が抗体分子又はその断片を含む請求の範囲第14項に記載の免疫活性 分子。 16．前記抗体断片がFab、Fab'、F(ab')₂及びFvからなる群から選ばれる請求の範 囲第15項に記載の分子。 17．前記抗体結合部位が2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からな る群から選ばれたハイブリドーマにより生じられる請求の範囲第15項に記載の分 子。 18．a.個体から細胞を含む血液試料を得、 b.前記試料をEPR-1 と免疫反応できる免疫活性分子と混合し、 c.EPR-1 を発現する細胞が前記免疫活性分子と免疫反応して免疫複合体を生 成するのに充分な期間にわたって前記混合物を生物学的アッセイ条件下に保ち、 d.前記免疫複合体を混合物中に存在する未反応の免疫活性分子から分離し、 そして e.それにより生成された免疫反応生成物を測定する諸工程を含むことを特徴 とするリンパ増殖性疾患の特性決定に有益な診断方法。 19．工程e で検出された生成物の量を前記細胞により発現されたEPR-1 の量と相 関させる工程を更に含む請求の範囲第18項に記載の方法。 20．前記免疫活性分子が標識される請求の範囲第18項に記載の方法。 21．前記疾患が慢性リンパ性白血病(CLL)又はEPR-1 ⁺ 型有毛状細胞性白血病(HC L)である請求の範囲第18項に記載の方法。 22．EPR-1 と免疫反応する治療有効量の免疫活性分子を医薬上許される担体又は 賦形剤と混合することを特徴とする、治療を要する個体の抗原特異性Ｔ細胞増殖 を抑制するのに有益な医薬品の製造方法。 23．前記免疫活性分子が2E1 、2C11、2D4 、3H7 、3G8 、3G10、及び6F1 からな る群から選ばれたハイブリドーマにより生じられた抗体結合部位を含む請求の範 囲第22項に記載の方法。