JPH09511389A

JPH09511389A - 腫瘍拒絶抗原先駆体ｍａｇｅ−１に結合するモノクローナル抗体、組換え体ｍａｇｅ−１、及びｍａｇｅ−１派生免疫原ペプチド

Info

Publication number: JPH09511389A
Application number: JP7520611A
Authority: JP
Inventors: チェン，ヤオ−ツェン; ストッカート，エリザベス; チェン，ヤチ; ギャリン−チェサ，ピラー; レティッヒ，ヴォルフガング，ジェイ; ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; ブーン−ファラー，ティエリー; オールド，ロイド，ジェイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ; スローン‐ケッタリング・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 1997-11-18
Also published as: US5843448A; CA2182369A1; US5541104A; DE69526339T2; CN1145032A; DK0752876T3; WO1995020974A1; DE69526339D1; ES2174931T3; EP0752876B1; FI963033L; PT752876E; AU686314B2; AU1597995A; NZ279377A; NO963120D0; FI963033A0; ZA95786B; EP0752876A4; NO963120L

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体と、これらの抗体を生成するハイブリドーマ、およびそれらの利用方法に関する。更に、ＭＡＧＥ−１の組換え体と、免疫原として有益なペプチド、及び、これらのペプチドとアジュバントとを含む免疫原的組成物とも記載される。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１に結合するモノクローナル抗体、組換え体ＭＡＧＥ−１、及びＭＡＧＥ−１派生免疫原ペプチド関連出願本出願は、既に放棄された１９９１年５月２３日出願の一部継続出願第７０５，７０２号の、１９９１年７月９日出願の一部継続出願第７２８，８３８号の、１９９１年９月２３日出願の一部継続出願第７６４，３６５号の、１９９１年１２月１２日出願の一部継続出願第８０７，０４３号である、米国を指定国とする１９９２年５月２２日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４号の一部継続出願の、１９９３年３月２６日出願の第０３７，２３０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、概して腫瘍学の研究に適用された免疫遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍が、いわゆる腫瘍拒絶抗原の提示や、後にここで” 腫瘍拒絶抗原先駆体”又は、”ＴＲＡＰｓ”と称するものの発現などを通じて、腫瘍が生体組織の免疫システムによって認識されるメカニズムの研究および分析に関する。最も具体的には、本発明は、組換え製造されたＴＲＡＰの１つ、即ち、ＭＡＧＥ−１と、モノクローナル抗体と、ＭＡＧＥ−１に抗して作用する抗血清と、それらの使用に関する。背景と従来技術宿主細胞による癌細胞の認識または認識の欠如の研究は、数多くの方向で行われてきた。この分野の理解には、基礎免疫学と腫瘍学との両方についていくらか理解していることが前提となる。マウス腫瘍に関する初期の研究によって、これらの腫瘍が同系の動物に移植された時に腫瘍細胞の拒絶に導く分子を示すことが判った。これらの分子は、受容側の動物のＴ細胞によって”認識”され、移植された細胞の溶解を伴う細胞溶解Ｔ細胞反応を誘発する。その最初の証拠は、メチルコラントレン等の化学的発癌物質によって誘導された腫瘍によって得られた。腫瘍によって発現されＴ細胞応答を導出する抗原は、腫瘍によって異なることが判った。化学的発癌物質による腫瘍の誘発と細胞表面抗原の相違に関する一般的教示内容に関してはプレーン（Ｐｒｅｈｎ）他、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．１８：７６９−７７８（１９５７）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０：１５６１−１５７２（１９６０）；グロス（Ｇｒｏｓｓ），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３：３２６−３３３（１９４３），ベイソンブリオ（Ｂａｓｏｍｂｒｉｏ），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３０：２４５８−２４６２（１９７０）を参照。この種の抗原は、”腫瘍特異性移植抗原”即ち”ＴＳＴＡｓ”として知られるようになった。化学的発癌物質によって誘発された時におけるそのような抗原の発現が観察された後、腫瘍が生体外で紫外線照射によって誘発された場合にも類似の結果が得られた。クリプケ（Ｋｒｉｐｋｅ），Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．５３：３３３−１３３６（１９７４）参照。上述のタイプの腫瘍に関してはＴ細胞を介した免疫反応が観察されたが、一方、自然発生性腫瘍は一般的に非−免疫原性であると教示された。従って、これらは、腫瘍を有する対象体の腫瘍に対する反応を誘発する抗原を提示するものではないと考えられた。ヒューイット（Ｈｅｗｉｔｔ）他，，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３３：２４１−２５９（１９７６）参照。ここに参考文献としてその開示内容を添付するブーン（Ｂｏｏｎ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０）に記載されているように、ｔｕｍ^- 抗原提示細胞種のファミリは、マウス腫瘍細胞または細胞系の突然変異によって得られる免疫原性変異体である。詳述すると、ｔｕｍ^-抗原は、同系のマウス中において免疫反応を起こさず腫瘍を形成する腫瘍細胞（即ち、”ｔｕｍ⁺”細胞）を突然変異させることによって得られる。これらのｔｕｍ⁺細胞が突然変異されたとき、これらは同系マウスによって拒絶され、腫瘍を形成することができない（従って、”ｔｕｍ^-”）。ここにその開示内容を参考文献として添付するブーン（Ｂｏｏｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：２７２（１９７７）参照。これまで多くのタイプの腫瘍がこの現象を示すことが証明されている。例えば、フロスト（Ｆｒｏｓｔ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４３：１２５（１９８３）参照。ｔｕｍ^-変異体は、免疫拒絶システムを導出させるので進行性腫瘍を形成することができないと考えられる。この仮説を支持する証拠として、ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：５２８２−５２８５（１９７９）による、通常は腫瘍を形成することがない ”ｔｕｍ^-”変異体が、致死下の照射によってその免疫システムを抑制した場合に、マウス内において腫瘍を形成することができるという観察、および肥満細胞腫Ｐ８１５の腹膜注入ｔｕｍ^-細胞が１２−１５日間指数関数的に増殖し、その後、リンパ球とマクロファージの導入によって僅か数日中に除去されるという観察、ウィッテンホーブ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１７５−１１８３（１９８０））等がある。更に別の証拠として、マウスが、後に免疫抑制的な量の照射を受けてその細胞が攻撃されても、その後の同じｔｕｍ^-変異体に対する攻撃に耐えることができる免疫記憶を得るという観察がある（ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：２７２−２７５（１９７７）；前述のファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他、前述のウィッテンホーヴ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）他）。その後の研究によって、自然発生性腫瘍が突然変異を受けた時に、免疫原性変異体を産生し、これが反応を起こすことが判った。事実、これらの変異体は、元の腫瘍に対する免疫防御反応を導出することができた。ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：１９９２−２００１（１９８３）参照。従って、同系拒絶反応の標的である腫瘍において、いわゆる”腫瘍拒絶抗原”の提示を導出することが可能であることが示された。異質の遺伝子が自然発生性腫瘍にトランスフェクションされた場合にも類似の結果が得られた。この点に関しては、フィアソン（Ｆｅａｒｓｏｎ）他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２９７５−１９８０（１９８８）を参照。腫瘍細胞の表面に提示され、細胞障害Ｔ細胞に認識され溶解を起こす１つのクラスの抗原が認識された。この類の抗原を、以下、”腫瘍拒絶抗原”又は”ＴＲＡ（ｓ）”という。ＴＲＡｓには、抗原反応を導出するものもあるし、導出しないものもある。これらの抗原は、これまで、生体外での細胞溶解Ｔ細胞特性研究、即ち、特定の細胞溶解Ｔ細胞（以下、ＣＴＬ）サブセットによる抗原の同定の研究、を通じて行われてきた。このサブセットは、提示された腫瘍拒絶抗原の認識後に増殖し、そして、その抗原を発現している細胞が溶解される。特性研究によって、前記抗原を発現する細胞を特異的に溶解するＣＴＬクローンが同定された。この研究の具体例としては、レヴィ（Ｌｅｖｙ）他，Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２４：１−５９（１９７７）；ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０）；ブルナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７−１６３４（１９８０）；マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７−１６３４（１９８０）：マリャンスキー（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４０６−４１２（１９８２）；パッラディーノ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ）他，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：５０７４−５０７９（１９８７）が挙げられる。このタイプの分析は、マイナー組織適合性抗原、雄特異的Ｈ−Ｙ抗原、”ｔｕｍ^-”抗原と称され、ここに記載の抗原などの、ＣＴＬｓによって認識される他のタイプの抗原に必要である。上述の課題の一例である腫瘍は、Ｐ８１５として知られている。ここに、その開示内容を参考文献として添付するデ・プレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４−２２７８（１９８８）；スジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）他，ＥＭＢＯＪ９：１０４１−１０５０（１９９０）及びシビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：３５−４５（１９９０）参照。このＰ８１５腫瘍は、メチルコラントレンによってＤＢＡ／２マウス内で誘発され、生体外腫瘍と細胞系の両方として培養される肥満細胞腫である。Ｐ８１５系は、突然変異後において、Ｐ９１Ａ（前記デ・プレーン（ＤｅＰｌｅａｎ））、３５Ｂ（前記スジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ））及びＰ１９８（前記シビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ））と呼ばれる変異体など、これまで数多くのｔｕｍ^-変異体を産生してきた。腫瘍拒絶抗原とは異なり、そしてこれが重要な相違点であるが、ｔｕｍ^-抗原は、腫瘍細胞が突然変異した後でしか存在しない。腫瘍拒絶抗原は、突然変異が無くても、特定の腫瘍の細胞上に存在する。従って、上記参考文献によれば、ある細胞種が、”Ｐ１”と呼ばれる系のようなｔｕｍ⁺であり、これを刺激してｔｕｍ^-変異体を産生することができる。ｔｕｍ^- 表現体はその親細胞系の表現体と異なっているので、ｔｕｍ^-細胞系とそのｔｕｍ⁺の親の系のＤＮＡの相違が予想でき、そしてその相違はｔｕｍ^-細胞中における目的の遺伝子の位置を特定することに利用できる。その結果、Ｐ９１Ａ，３５Ｂ及びＰ１９８等のｔｕｍ^-変異体の遺伝子が、遺伝子の遺伝コード化領域における点突然変異によってその正常な対立遺伝子と異なっていることが発見された。前述のスジコーラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）及びシビル（Ｓｉｂｉｌｌｅ）及びラークウィン（Ｌｕｒｑｕｉｎ）他，Ｃｅｌｌ５８：２９３−３０３（１９８９）参照。しかし、これは本発明のＴＲＡｓには当てはまらないことが判った。これらの参考文献は、更に、前記ｔｕｍ^-抗原から誘導されたペプチドが、ＣＴＬｓによって認識されるＬ^d分子によって提示されるものであることを示した。Ｐ９１Ａは、Ｌ^dによって提示され，Ｐ３５はＤ^dによって、そしてＰ１９８はＫ^d によって、それぞれ提示される。ここに参考文献として全部を添付する先行特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４，米国特許出願第８０７，０４３；７６４，３６４；７２８，８３８；及び７０７，７０２は、腫瘍拒絶抗原または”ＴＲＡｓ”にプロセッシングされる様々なＴＲＡＰｓをコード化する遺伝子および他の核酸分子に関係する発明が記載されている。前記遺伝子は、分離、精製された腫瘍拒絶抗原のソース又はＴＲＡ自身として有用であり、後述するように、これらはいずれも、前記抗原がその”マーカー” となる癌を治療する薬剤として、あるいは、腫瘍学における様々な診断および調査方法に利用できる。例えば、ｔｕｍ^-細胞を使用して、様々なｔｕｍ⁺抗原やｔｕｍ^-細胞を提示する細胞を溶解するＣＴＬｓを発生させることができることが知られている。例えば、ここに参考文献として添付する、マリャンスキー（Ｍｕｒｙａｎｓｋｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１２：４０１（１９８２）；及びファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，ＭｏｄｅｒｎＴｒｅｎｄｓｉｎＬｕｅｋｅｍｉａＩＸ（１９９０年６月）を参照。前記腫瘍拒絶抗原先駆体を、前記遺伝子によってトランスフェクションされた細胞中で発現させ、目的の腫瘍に対する免疫応答を発生させることができる。ヒト新生生物（腫瘍）のパラレルな例において、自己由来混合リンパ球−腫瘍細胞培養（以下”ＭＬＴＣ”）が、しばしば、自己由来腫瘍細胞を溶解し、かつ、天然キラー標的、自己由来ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞や自己由来線維芽細胞は溶解しない応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）リンパ球を生産することが観察されている（アニキーニ（Ａｎｉｃｈｉｎｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ８：３８５−３８９（１９８７）参照）。この応答は、メラノーマに関して特によく研究されており、ＭＬＴＣは、末梢血液細胞または腫瘍浸潤リンパ球のいずれかによって行われてきた。この分野に関する文献としては、クナス（Ｋｎｕｔｈ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２８０４−２８０２（１９８４）；ムカールジ（Ｍｕｋｈｅｒｊｉ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２４０（１９８３）；ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．３９：３９０−３９６（１９８７）；トパリアン（Ｔｏｐａｌｉａｎ）他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ６：８３９−８５３（１９８８）等がある。安定な細胞障害Ｔ細胞クローン（以後、ＣＴＬｓ）がＭＬＴＣ応答細胞から誘導され、これらのクローンは、腫瘍細胞に対する特異性を有する。前記ムカールジ（Ｍｕｋｈｅｒｊｉ）他、前記ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，前記クナス（Ｋｎｕｔｈ）他，参照。腫瘍細胞上において、これらの自己由来ＣＴＬｓによって認識される抗原は、人為構造を表すものではないと考えられる。というのは、これらは新生の腫瘍細胞に観察されるからである。前記トパリアン（Ｔｏｐａｌｉａｎ）他，デジョヴァンニ（Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１８６５−１８６８（１９９０）。これらの観察と、本出願において特定のハツカネズミ腫瘍拒絶抗原先駆体の遺伝子の分離に使用された技術との組合せによって、ヒトの腫瘍に提示されたＴＲＡｓの腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸配列が分離された。従って、いま、以下に記載のその派生効果とともに、特定の腫瘍に最も特徴的なものを非限定的に含む、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する前記核酸配列の分離が可能となった。更に、ヒト白血球抗原または”ＨＬＡｓ”として知られている分子のクラスによるＴＲＡｓの提示に関して集中的に研究が行われた。この研究によって、該分野に関していくつかの意外な発見がなされた。特に、ここにその開示を参考文献として添付の米国特許出願第９３８，３３４号において、前記ＨＬＡ−Ａｌ分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対して特定のペプチドが特異性を有することが既知であれば、ある特定のペプチドが１つのＨＬＡ分子に結合し、他とは結合しないということが予測される、ということを教示している。これは重要である。というのは、ヒトそれぞれによって保有するＨＬＡ表現型は異なるからである。その結果、ある特定のペプチドがある特定のＨＬＡ分子に対する結合パートナーであることが同定されることによって、それから診断的および治療的な派生効果が得られるとしても、これらはその特定のＨＬＡ表現型を有する個人だけにしか関係しない。細胞異常は１つの特定ＨＬＡ表現型に限られないので、この分野において更に研究する必要があり、標的治療には、対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、前記ＭＡＧＥ−１発現産生物が第２ＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２ＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃ１０−分子によって提示されるものである。この開示には、あるＴＲＡＰが複数のＴＲＡｓを産生できることが示されている。ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号には、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この参考文献は、いくらかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって生産される分子が腫瘍細胞中でプロセッシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を産生する、と記載されている。上述した先行出願は、腫瘍拒絶先駆体一般に対する抗体を記載したものであった。本発明者らは、組換え体ＭＡＧＥ−１タンパク質と、それから派生するペプチドとを製造するのに、ＭＡＧＥ−１をコード化する前記分離核酸分子を利用した。これらは、ＭＡＧＥ−１に特異的に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を製造するのに利用された。これらの抗体と、その利用方法とがここに記載し請求項に記載された本発明を構成する。図面の簡単な説明図１は、ＭＡＧＥ−１遺伝子、組換えＭＡＧＥ−１タンパク質から派生するオリゴヌクレオチドと、ＭＡＧＥ−２及びＭＡＧＥ−３派生アミノ酸配列中の対応配列との比較を略示する。図２Ａは、親和純化されたＭＡＧＥ−１組換えタンパク質の銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを示す。図２Ｂは、ＭＡＧＥ−１タンパク質を、３つのペプチド（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：２，３及び４）から派生したラビット抗血清に対して使用した。イムノブロッティング操作は１：１０００希釈比で行った。コントロールとして、組換えマウスｐ５３を使用した。図３Ａは、６つの黒色腫（メラノーマ）系に対するｍＡｂＭＡ４５４の反応パターンを示す。図３Ｂは、同じ系に対してラビットのポリクローナル抗血清を使用した結果を示す。図３Ｃは、ＭＡＧＥ−１トランスフェクション細胞系（ＭＺ２−ＭＥＬ２．２−ＥＴ．１）と、その親（ＭＺ２−ＭＥＬ２．２）によって得られた結果を示す。図４は、組織溶解物に対して抗体を使用したイムノブロッティング分析を示す。好適実施例の詳細説明上述した出願および参考文献から理解されるように、大きく異なった”ＭＡＧＥ”遺伝子が同定された。本件においては、ＭＡＧＥ−１が課題とされ、これが唯一ここで記載される。便宜上、これをここで配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１として示す。ここで”ＭＡＧＥ”とは、ヒト細胞から分離された核酸配列をいう。”ＴＲＡＰ”又は”ＴＲＡｓ”がある腫瘍タイプに特異性を有するものと記載されるとき、これは、そこで考慮されている分子が、そのタイプの腫瘍に関連していることを意味するが、必ずしも他のタイプの腫瘍を除外するものではない。例１ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４４：６３４−６４０（１９８９）に記載され、先出願において前述したＭＡＧＥ−１を発現することが観察された細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．１をトータルＲＮＡとして使用した。このトータルＲＮＡを前記細胞が抽出し、これに対して、ここに参考文献として添付するファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７（１９９１年１２月）に記載されたプライマＣＨＯ８及びＣＨＯ９を使用して、逆トランスフェクション／ポリメラーゼを行った。この文献は、ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５２：８３９−８４１（１９９２）と同様、”ＲＴ−ＰＣＲ”技術について記載している。但し、ＭＡＧＥ−１の配列は公知であり、ＣＨＯ８，ＣＨＯ９以外のプライマを使用することも可能である。ＲＴ−ＰＣＲプロトコルの完了後、その生成物を、周知技術である製造業者の指示に従って、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）に直接クローン化した。このクローン化後、その組換えプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼで処理して、ＭＡＧＥ−１遺伝子を含むフラグメントを有するフラグメントを作った。前述のファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、参照。適当なｃＤＮＡインサートを、ｐＴ７ＢｌｕｅにＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、プラスミドｐＱＥ９，ｐＱＥ１０，ｐＱＥ１１に一方向にサブクローン化した。これらのプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にトランスフェクションし、宿主プラスミドがｌａｃオペロンを有しているので、組換えタンパク質の製造をＩＰＴＧを介して誘発した。これによって、ＭＡＧＥ−１ポリペプチド配列を有する融合タンパク質が生成され、これは、Ｎｉ²⁺イオン親和クロマトグラフィによって純化することができた。前記組換えクローンのＤＮＡ配列を得て、これが予想ＭＡＧＥ−１アミノ配列の導出アミノ酸５７−２１９と、前記プラスミド自身の３０の残基とに対応する１６３のアミノ酸をコード化することを確認した。図１はこれを示している。予想分子量は、約２０−２２ｋＤａであった。ｐＱＥ１０中のクローンを調べたところ、事実、ＩＰＴＧ誘導後、約２０ｋＤａの組換えタンパク質が産生されていた。図２Ａに示すように、その他の７０ｋＤａ，４３ｋＤａ，１７ｋＤａ及び１５ｋＤａのマイナーなタンパク質種も見つかった。例２以下は、ＭＡＧＥ−１に対する抗体を製造するのに使用した手順を示す。前記予想ＭＡＧＥ−１アミノ酸配列に基づき、３つのオリゴペプチドを準備した。上記ペプチドによってラビットを免疫化し、次に、処理して抗血清を収集した。これらの３種類のペプチドに対して準備した抗血清を、次に、イムノプロッチング実験において、Ｅ．ｃｏｌｉ産生組換えＭＡＧＥ−１タンパク質と使用した。その結果は、図２Ｂに示すように、これらのペプチドの最初のもの、即ち、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２に対して生成した抗血清のみが強く反応したことを示している。前記２０ｋＤａ融合タンパク質と共に純化した別のタンパク質種も反応を示したという事実は、これらが前記融合タンパク質の集合物であることを示唆している。使用したペプチドは、前記予想ＭＡＧＥ−１タンパク質のＭＡＧＥ−１の導出アミノ酸６８−８１に対応している。黒色腫細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．１の溶解物を使用してイムノブロッティングを行ったところ、ＭＡＧＥタンパク質は検出されなかった。例３次に、モノクローナル抗体を作った。上述したように作った純化組換えタンパク質を使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した。ハイブリドーマを生成し、クローン化した。使用したプロトコルは、ここに参考文献として添付するディポルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：６１１４−６１１８（１９８０）に記載されているものであった。もちろん、重要な相違は、免疫化に使用した免疫原であった。ハイブリドーマが生成されると、その上清を、前記免疫化融合タンパク質を標的抗原として使用し、ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートに標準式の固相ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。５つのクローンが、反応性であることがわかった。更に、これらの全部がイムノブロットにおいて中庸から強度の反応性を示した。コントロールとして、同じプラスミド・ベクタにおいて発現したマウスｐ５３タンパク質もテストした。反応性は見られなかった。これらの結果を、次の表１にまとめる。例４次に、前述のｍＡｂｓを、黒色腫細胞系の溶解物に対してテストした。テストした細胞系、即ち、ＭＺ２−ＭＥＬ３．１，ＭＺ２−ＭＥＬ２．２，及びＳＫ−ＭＥＬ−１８７はすべて周知である。ＭＺ２−ＭＥＬ２．２は、ＣＴＬセレクションによってＭＡＧＥ−１ポジティブ親ＭＺ２−ＭＥＬ３．１から派生したＭＡＧＥ−１欠失変異体である（ファンデアブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４４：６３４−６４０（１９８９））。これらの細胞は、ＰＴ−ＰＣＲによって、それぞれＭＡＧＥ−１⁺ ２⁺３⁺（ＭＺ２−ＭＥＬ３．１）、ＭＡＧＥ−１^-２⁺３⁺（ＭＺ２−ＭＥＬ２．２）及びＭＡＧＥ−１^-２^-３^-（ＳＫＭＥＬ−１８７）として”タイプ分け”されていた。これらの細胞を、ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ＮＰ−４０）緩衝液（１％ＮＰ−４０，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ）中にて均質化することによって溶解物を作った。その結果を図３Ａに示す。モノクローナル抗体ＭＡ４５４は、ＭＺ２−ＭＥＬ３．１溶解物中に存在する４６ｋＤａのタンパク質とは反応したが、その他の２つの細胞系のいずれの溶解物とも反応しなかった。更に、３つの黒色腫細胞系をテストしたところ、ＭＡＧＥ− １ポジティブとしてタイプ分けされたもののみがｍＡｂと反応した。ＭＡＧＥ− ２又はＭＡＧＥ−３の発現は無関係であった。上述したポリクローナル抗血清も、これらの溶解物に対してテストした。その結果を図３Ｂに示す。これは、ＭＺ２−ＭＥＬ３．１及び、ＭＡＧＥ−１トランスフェクション細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ２．２−ＥＴ．１に対してポジティブであったが、親系ＭＺ２−ＭＥＬ２．２に対してはネガティブであった。例５肝臓、腎臓および精巣組織と、１つのＭＡＧＥ−１⁺２⁺３⁺系、２つのＭＡＧＥ−１^-２⁺３⁺系および１つのＭＡＧＥ−１^-２^-３^-系とから溶解物を作った。これらの溶解物は上述した手順で作った。イムノブロッティングを行ったところ、精巣溶解物は、ｍＡｂ４５４に対してポジティブであり、ＭＡＧＥ−１ポジティブ黒色腫も同様であった。その他の溶解物は、いずれもポジティブではなく、これはｍＲＮＡ発現データと完全に一致している。ポリクローナル抗血清を使用して同じ実験を行ったところ、その結果は、モノクローナル抗体の結果と同じであった。図４は、これらの結果を示している。以上の実験は、腫瘍拒絶抗原先駆体ＴＲＡＰに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造を説明するものである。これらの研究は、”野生タイプ”のＭＡＧＥ−１分子と、組換え体との両方に対しては結合するが、ＭＡＧＥ−２とＭＡＧＥ−３とのいずれにも結合しないことを示すものである。ＭＡＧＥ−１結合ｍＡｂの特に好適な種、即ち、ＭＡ４５４は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号ＨＢ１１５４０を得ている。従って、本発明はＭＡＧＥ−１特異性モノクローナル抗体と、これらを産生するハイブリドーマとに関する。前記ｍＡｂｓは、細胞溶解物中におけるＭＡＧＥ −１の発現の検出に有用であることが判った。具体的には、ｍＡｂｓを、例えばラベル化した状態で添加し、固相に結合させるか、あるいはその他の処理を行って、ＭＡＧＥ−１検出の感度を増大させることができる。ｍＡｂｓの利用可能性として、ＥＬＩＳＡｓ、ＲＩＡｓ、競合アッセイ、凝集アッセイ等を含むすべての標準タイプのイムノアッセイが含まれる。ここで言う”細胞溶解物”とは、明確に溶解されるサンプルだけでなく、生体内で溶解された細胞を含むサンプルや、通常、その細胞に内在する物質を含むすべてのサンプルをも含むものである。ＭＡＧＥ−１発現生成物の検出は、例えば、癌の存在または進行の診断またはモニタに有用である。前記分離組換えＭＡＧＥ−１タンパク質も、本発明の一特徴である。この分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が約２０−２２ｋＤａで、免疫原的であることが示された前記例の配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：２，３及び４のペプチドと同様に、免疫原として有効である。好ましくは、これらは、適当なアジュバントと併用される。非組換え手段を介して得られる前記分離状分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による約４３ｋｄの分子量を有し、前記組換えタンパク質と同様に有効である。前記組換え状のものは、前述したように、ＭＡＧＥ−１の配列のアミノ酸５７−２１９のみから構成されたものであってもよい。ＳＤＳ −ＰＡＧＥ測定による分子量が約３４．３ｋｄで、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド３９３１−４７６１によってコード化されるアミノ酸配列からなる全長分離組換えＭＡＧＥ−１タンパク質も本発明の一部である。本発明のその他の特徴構成は、当業者においては明白であろう。したがって、ここで繰り返すことは避ける。これまで使用した用語および表現は記載のための用語であって、限定のための用語ではなく、これらの用語および表現の使用にあたっては図示され記載された特徴構成の均等物を除外する意図はなく、本発明の範囲内においてその他の種々の改変が可能であると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年５月９日【補正内容】１．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体。２．ＭＡ４５４として指定された請求項１のモノクローナル抗体。３．請求項１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。４．請求項３のハイブリドーマ細胞系であって、前記モノクローナル抗体はＭＡ４５４である。５．サンプル中において腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１を検出する方法であって、前記サンプルを請求項１のモノクローナル抗体と接触させる工程と、前記モノクローナル抗体の前記サンプル中の成分に対する結合を、前記サンプル中におけるＭＡＧＥ−１の検出として検出する工程とを有する方法。６．請求項５の方法であって、前記モノクローナル抗体は固相に結合する。７．請求項５の方法であって、前記モノクローナル抗体は、検出可能なラベルによってラベル化されている。８．約２０キロダルトン〜約２２キロダルトンの分子量を有するタンパク質である分離ＭＡＧＥ−１腫瘍拒絶抗原先駆体派生物。９．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ．）：１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９３１−４７６１によってコード化されるアミノ酸５７−２１９からなる分離タンパク質。１０．以下のグループから選ばれた分離ペプチド、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３、そして配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４。１１．請求項８の少なくとも１つの分離タンパク質と、アジュバントとを有する免疫原的組成物。１２．請求項９の少なくとも１つの分離タンパク質と、アジュバントとを有する免疫原的組成物。１３．請求項１０の少なくとも１つの分離ペプチドと、アジュバントとを有する免疫原的組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＣＣ１２Ｐ 21/08 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者チェン，ヤオ−ツェンアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1315 コーネル・メディカル・センター (72)発明者ストッカート，エリザベスアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者チェン，ヤチアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者ギャリン−チェサ，ピラーアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1315 (72)発明者レティッヒ，ヴォルフガング，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨークヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者ファン・デア・ブルッゲン，ピエールベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン−ファラー，ティエリーベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体。２．ＭＡ４５４として指定された請求項１のモノクローナル抗体。３．請求項１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。４．請求項３のハイブリドーマ細胞系であって、前記モノクローナル抗体はＭＡ４５４である。５．サンプル中において腫瘍拒絶抗原先駆体ＭＡＧＥ−１を検出する方法であって、前記サンプルを請求項１のモノクローナル抗体と接触させる工程と、前記モノクローナル抗体の前記サンプル中の成分に対する結合を、前記サンプル中におけるＭＡＧＥ−１の検出として検出する工程とを有する方法。６．請求項５の方法であって、前記モノクローナル抗体は固相に結合する。７．請求項５の方法であって、前記モノクローナル抗体は、検出可能なラベルによってラベル化されている。８．分離ＭＡＧＥ−１腫瘍拒絶抗原先駆体。９．請求項８の分離ＭＡＧＥ−１腫瘍拒絶抗原先駆体であって、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が約４６キロダルトンの糖タンパク質である。１０．請求項８の分離ＭＡＧＥ−１腫瘍拒絶抗原先駆体であって、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による約３４．３キロダルトンの分子量を有する組換えによって作られたタンパク質である。１１．配列認識番号（ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ．）：１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９３１−４７６１によってコード化されるアミノ酸５７−２１９からなる分離タンパク質。１２．以下のグループから選ばれた分離ペプチド、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３、そして配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４。１３．請求項９の少なくとも１つの分離タンパク質と、アジュバントとを有する免疫原的組成物。１４．請求項１０の少なくとも１つの分離タンパク質と、アジュバントとを有する免疫原的組成物。１５．請求項１１の少なくとも１つの分離タンパク質と、アジュバントとを有する免疫原的組成物。１６．請求項１２の少なくとも１つのペプチドと、アジュバントとを有する免疫原的組成物。