JPH09511397A - 遺伝子型改変バクテリオファージによる抗菌治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、感染症においてバクテリオファージ数および／またはそのファージの宿主細菌を死滅させる能力を低下させる傾向がある、異物に対する宿主防御系（ＨＤＳ）のあらゆる部分による不活化をバクテリオファージが遅延できる方法を使用するバクテリオファージ療法に関する。抗ＨＤＳの目的に合わせて改変されたバクテリオファージの製造方法が開示され、一つの方法は連続継代による選択であり、また他の方法はバクテリオファージの遺伝子操作であり、それによって改変バクテリオファージは野生型ファージよりも長期間体内で活性を保持する。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子型改変バクテリオファージによる抗菌治療 発明の分野 本発明は、動物の宿主防御系(host defence system)によるバクテリオファー ジの不活化の遅延方法に関する。不活化を遅延させる一つの方法は、ゲノムを改 変した新規なバクテリオファージを使用することである。バクテリオファージの ゲノムを改変するのに有用な方法には連続継代(serial passage)による突然変異 株の選択と遺伝子操作による新規な株の創出が含まれるが、これらに限定されな い。このような新規バクテリオファージは、動物の宿主防御系（ＨＤＳ）の一以 上の過程によって、隔離されたり、取り込まれたり、あるいは不活化されるのを 遅延させる能力を有する。この新しい属性によって、「抗ＨＤＳ改変」バクテリ オファージが、対応する野生型バクテリオファージよりも動物の体内で長い生存 期間を有することができ、従って細菌感染の治療（または治療の補助）に際して 改変されたバクテリオファージを野生型ファージよりも効果的にすることができ る。 また、本発明は感染型細菌疾患にバクテリオファージを使用する特定の方法に も関する。投与の経路は、ファージをエアロゾルによって肺に送達することを含 めて、どんな手段によってもよい。 発明の背景 細菌のウイルス（バクテリオファージ）が発見された少し後の１９２０年代に 、バクテリオファージ療法による細菌性疾患の治療が大々的に追求され始めた。 ファージを感染性細菌疾患の治療法に使用するという考えは、細菌に侵入して破 壊するというバクテリオファージの既知の能力の論理的な応用として、１９１８ 年にデレルによって最初に提唱された。バクテリオファージ療法の初期の報告は 幾分有望であったが、臨床での継続使用によって、この療法は一貫性がなく結果 が予測できないことが明らかになった。治療の手段としてのファージへの失望は 、試験管内(in vitro)で細菌を死滅させるこのウイルスの大きな潜在能力が生体 内(in vivo)で実現されないことから大きくなった。このため、ファージ療法の 臨 床的使用を発展させる試みは減少し、その減少は、１９４０年代および５０年代 に抗生物質が導入され始めると加速された。１９６０年代から現在まで、あるバ クテリオファージを実験道具に採用し、分子生物学の分野を創始した研究者の中 には、なぜファージ療法が失敗したかに関して推測した者もいる。 一般にはファージが治療法として失敗であったのにも関わらず、独立した医師 グループがこの薬剤を感染症に使用する試みを続けていた。この努力の多くは、 抗生物質が高価で入手できないために代替療法を探求することを迫られていたロ シアとインドに集中している。例えば、Ｖogovazova他，"Ｅffectiveness of Ｋ lebsiella pneumoniae Ｂacteriophage in the Ｔreatment of Ｅxperimental Ｋlebshiella Ｉnfection"、Ｚhurnal Ｍikrobiologii．Ｅpidemiologii Ｉmmun obiologii.pp．5-8（1991年4月）およびＶogovazova他，"Ｉmmunological Ｐrop erties and Ｔherapeutic Ｅffectiveness of Ｐreparations of Ｋlebsiella Ｂacteriophages"、Ｚhurnal Ｍikrobiologii.Ｅpidemiologii Ｉmmunobiologii .pp.30-33（1992年3月）を参照のこと。これらの論文は、抗感染症治療法を研究 する研究者によって必要とされる対照の多くを欠いている点でデレルの最初の報 告を含むファージ療法の研究のほとんどと同様である。加えて、これらの研究に は臨床結果の定量化がほとんど、あるいは全くないことが多い。例えば、上に引 用したロシアの２論文の二番目では、クレブシエラ・ファージ療法に関する結果 のセクションに「それを使用すると・・・臭鼻症（３８患者）、鼻洞の化膿（５ 患者）、中耳の化膿（４患者）に効果があった・・・この製剤の投与によって全 症例で副作用がなく肯定的な効果が達成された。」と述べられている。残念なが ら、プラセボ対照や抗生物質対照がなく、「改善」の基準が提供されていない。 １９５０年代に開発され、たとえ限られた程度でも現在なお使用されるが一持 のもう一つの臨床的使用はファージ溶菌物、詳細にはブドウ球菌ファージ溶菌物 （ＳＰＬ）の使用である。この分野の研究者は、ブドウ球菌内毒素に対する非特 異的細胞媒介免疫応答が、要求されるＳＰＬの効能の必要不可欠な部分であると 主張する。（例えば、Ｅsber他，Ｊ.Ｉmmunopharmacol.,Ｖol.3,Ｎo.1,pp.79-92 (1981)、青木他,Ａugumenting Ａgents in Ｃancer Ｔherapy (Ｒaven,Ｎew Ｙo rk),pp.101-112(1981)、Ｍudd他,Ａnn.ＮＹ Ａcad.Ｓci.,Ｖol.236,pp.244-251( 1974)参 照。）この治療においては、それらの著者が超音波処理や他の物理／化学的手段 による溶解より優れていることを見いだしたというふうに、ファージを使用する 目的が、細菌抗原を得るために細菌を特異的に溶菌することであるように思われ る。この場合も、文献中のこれらの報告を評価するのにいくつか困難がある。と いうのは、一般に、報告されたＳＰＬの効能を評価するプラセボ対照と標準抗生 物質対照が無いからである。もっと重要なことに、これらの論文中にはファージ それ自体を細菌感染症の治療に使用することの示唆がない。さらに、それらの論 文は宿主防御系による捕捉／隔離を遅延させるようにファージを改変することを 示唆していない。 多くの患者は感染から自発的に回復するので、研究には新薬剤に効果があるこ とを確認するための注意深く計画された対照と明確な基準がなければならない。 デレル以来のほとんどのファージの報告では定量化と対照を欠いていることから 、ファージ療法が有益な効果を有するかどうかを決定することが不可能ではない までも困難となっている。 ファージ療法の試みの報告は数多いので、効果があったのなら抗生物質が導入 される前に隆盛を極めていたはずだと考えられる。しかし、ファージ療法は上記 の独立したグループを除いて事実上断念された。 上記のように、生命過程の分子的基礎を研究するために特定のファージの使用 を始めた分子生物学の創始者の幾人かは、なぜファージ療法に効果がなかったの かに関して推測した。例えば、Ｇ．Ｓtentはその著書Ｍolecular Ｂiology of Ｂacterial Ｖiruses,ＷＨ Ｆreeman ＆ Co.(1963)pp.8-9の中で次のように述 べた。 「試験管内では抗生作用においてあれほど毒性の強いバクテリオファージが生体 内ではまったく無能力なのはいったいなぜかについては、十分説明されたとは言 えない。おそらく、皮下注射に際してファージタンパク質に対し患者の抗体がす みやかに応答すること、経口投与に際してファージが胃液による不活化に感受性 であること、細菌がファージに対する免疫や変種抵抗を獲得する機構、これらす べてがファージ療法の成功を妨げた可能性がある。」 １９７３年、本発明の発明者の一人、カール・メリル博士は同僚とともに、無 菌で無免疫のマウスに種々の経路（経口、静脈内、筋肉内、腹腔内）で投与した ファージ・ラムダが脾臓、肝臓、骨髄などの細網内皮組織の器官によって血流か ら非常に速やかに排除されることを発見した。（Ｇeier、Ｔrigg及びＭerril，" Ｆate of Ｂacteriophage Ｌambda in Ｎon-Ｉmmune,Ｇerm-Ｆree Ｍice",Ｎatu re,246,pp.221-222（1973）参照。）これらの観察から、メリル博士とその同僚 は（上に引用した同じNatureの論文中で）、コロイド粒子を体内に潅流させて、 ファージが捕捉を免れるように細網内皮組織に粒子を過剰に取り込ませることに よって問題を克服することを提案するようになった。１９７０年代には効き目の ある抗生物質を数多く得ることができたため代替抗菌治療への需要がほとんどな かったので、メリル博士とその同僚はこの時点ではこの手法を追求しなかった。 しかし、その後人類にとって重大な細菌性病原体が多剤耐性（ＭＤＲ）を持つ ようになり、これらＭＤＲ株が世界中に急速に広まった。その結果、ほんの４〜 ５年前には抗生物質による治療が成功していた感染症によって、いまや数十万人 が毎年死亡している。(例えば、Ｃ.Ｋunin,"Ｒesistance to Ａntimicrobial Ｄ rugs-Ａ Ｗorldwide Ｃalamity",Ａnnals of Ｉnternal Ｍedicine,1993;118;55 7-561およびＨ.Ｎeu,"Ｔhe Ｃrisis in Ａntibiotic Ｒesistance",Ｓcience 25 7,21 Aug 1992,pp.1064-73参照。）例えばＭＤＲ結核の場合、１１種類もの抗生 物質を使用しているのにも関わらず、現代において非免疫欠損の患者が免疫欠損 の患者と同様に発症後一ヶ月以内程で死亡している。 結核だけではなく多様な感染症に対して医学の権威者たちが多剤耐性を報告し ている。感染症の専門家の中にはこの状況を「地球規模の危機」と呼ぶ者もある 。これらのＭＤＲ細菌感染症に対する代替法と新機構の探求が進められている。 バクテリオファージ療法は、一つの可能性のある代替治療法である。過去のバ クテリオファージ療法の失敗に学んで、本発明の発明者らはその失敗の原因であ った主要な障害を克服する効果的な方法を発見した。 本発明の目的は、投与されたファージの数や効力をその構成部分のいずれかが 減少させている動物の宿主防御系による不活化を遅延させることができる新規バ クテリオファージを開発することである。 本発明の他の目的は、動物に有効量の新規バクテリオファージを投与すること によって、また適当な投与経路によって、動物の細菌感染症を治療する方法を開 発することである。 発明の概要 本発明では、連続継代または遺伝子操作によって新規なバクテリオファージを 開発して、異物に対する動物の宿主防御系（ＨＤＳ）のいかなる構成部分による 不活化も遅延させることができる能力を持つバクテリオファージを得る。これに よって新規ファージは野生株よりも長期間、循環中と組織中で生存でき、それに よって生存可能性が拡大され、この改変ファージは感染部位の細菌に到達、侵入 するのに一層効果的となる。 連続継代または遺伝子操作によって開発された抗ＨＤＳファージの投与によっ て、被投与動物は対応する細菌性病原体による感染と効果的に闘うことができる 。したがって、本発明のファージ療法は標準抗感染療法の補助もしくは独立した 治療法のいずれかとして役立つであろう。 本発明のファージは、経口、肺（エアロゾルやその他の呼吸器感染症用呼吸機 器による）、鼻腔、静脈内、腹腔内、経膣、経直腸、眼内、腰椎穿刺、髄腔内、 さらに脳脊髄膜に直接注入する必要があれば（例えば重度肥厚迅速致死性結核性 髄膜炎(heavily thickened rapidly fatal tuberculous meningitis)の場合）穿 頭孔や開頭術などにより、あらゆる経路で投与できる。 発明の詳細な説明 バクテリオファージ療法における主要な障害の一つは、ファージを動物に投与 すると動物のＨＤＳによってファージが速やかに消失することである。このこと から、ファージが感染部位に到達して細菌に侵入するのに十分な長い時間その動 物の循環中や組織中に生存できないと考えられる。したがって、本発明の目的は ＨＤＳによる不活化を遅延させることができるバクテリオファージを開発するこ とである。これによって体内でのファージの生存可能性が拡大される。 本明細書で使用する「宿主防御系」の語は、動物が異物を排除するのを助ける 種々の構造と機能のすべてを指す。この防御には、免疫系の形態細胞(formed ce lls)と、補体、リゾチーム及びβ溶解素を含む免疫系の体液成分が含まれるが それだけに限定されない。加えて、「細網内皮系」（脾臓、肝臓、骨髄、リンパ 腺等）としばしば呼ばれる器官も宿主防御系の一部として働く。この「細網内皮 系」内で起こる、すぐ上に記載したすべての現象に加えて、異物（特にバクテリ オファージを含む）が、シュワイゲル−ザイデル毛管鞘によって脾臓内で非食細 胞的、非破壊的に捕捉される隔離作用（抗原捕捉を伴うこともあれば伴わないこ ともある）も報告されている（例えばＮagy,Ｚ.,Ｈorrath,Ｅ.,Ｕrban,Ｚ.,Ｎat ure Ｎew Ｂiology,242:p.241(1973)参照）。 本発明に関して使用される「実質的に消失させる」の句は、動物の宿主防御系 または従来の抗菌療法によって細菌数が完全に消失可能な数まで減少することを 示す。 バクテリオファージがその宿主防御系による不活化を遅延させることができる ようにすることは、どんな場合にそのいずれの構成部分が使用されようとも、そ のバクテリオファージに対して宿主の範囲にある細菌性病原体の生体内殺傷が増 強される結果となるであろう。 一つの実施態様においては、バクテリオファージを連続継代によって選択する 。このファージは生来ＨＤＳによる不活化が遅い。基本的には、この連続継代は ファージを動物に投与して血液試料を長期間にわたって連続的に採取することに よって達成される。最終的に、ＨＤＳによる不活化を遅延させることができる生 存ファージを得る。最初に血中に入れたファージ数の０．０１％〜１．０％、好 ましくは０．１％が血液試料中に残存する時期に達するとき、この残存ファージ 試料は同一種の第二の動物に注入するのに十分に高い力価まで増殖している。（ クローン純化(clonal purification)については、Ｍ．Adams，Bacteriophages, Ｉntersclence Ｐublishers,pp.454-460(1959)参照）。時間に関して連続した血 液試料を再び得、およそ０．１％のファージが残存する度に上記の過程を反復し て繰り返す。各連続継代において投与されたファージの０．１％だけがまだ循環 中に残存する時点に到達するまでにかかる時間がますます長くなる。このクロー ン純化選択法によって、体内で最も長く生存する野生株よりも１５％以上長く生 存できるファージ株が分離されるであろう。 これらの非突然変異バクテリオファージまたは突然変異（下記参照）バクテリ オファージを数回連続継代した後、原型「抗ＨＤＳ改変」バクテリオファージが 得られる。本明細書で使用される「抗ＨＤＳ改変」ファージとは、それが由来し た元の野生型ファージの動物体内での半減期より１５％以上長い半減期を有する あらゆるファージ（改変が連続継代によるものか遺伝子操作によるものかに拘わ らず）であると定義される。半減期とは、一連のｐｆｕ実験によって決定される ように（「ｐｆｕ」とはアッセイされる所与の試料中のファージ存在数の簡便な 測定単位であるプラーク形成単位を意味する）、所与のファージの初期静脈内投 与量（例えば１×１０¹²）のうち、循環中にまだ半数（１×１０⁶）が残存する 時点をいう。１５％長い半減期はＨＤＳによる不活性化の遅延が成功であること を示す。 このＨＤＳ回避ファージが体内で本当に長期間生存し続けるという証拠は、循 環中の残存時間がより長いことだけではなく、所与の時点で循環中に、より多数 が残存していることの証明によっても得られる。このより遅いクリアランス速度 は、１×１０¹²のファージを試験動物に静脈内注入して１０分後に循環中に依然 存在するファージ数（ｐｆｕによって測定）がその時点で対照動物の循環中に依 然存在する対応する野生型ファージ数よりも１０％以上多いという事実によって 証明される。 上記の方法で選択した自然突然変異を待つということの代わりに、宿主細菌中 でファージが増殖する間に突然変異を誘発することもできる。この突然変異によ り、連続継代による選択後に非突然変異ファージよりいっそう効率よく宿主防御 系による不活化を遅延するファージの試料が作成される。突然変異誘発は、ファ ージに、アクリジン化合物、光存在下の臭化エチジウム、放射性リン、及び種々 の形態の放射線（Ｘ線、紫外線等）などの、しかしこれらに限定されない種々の 刺激を与えることによって達成される。上記の反復手順の結果得られる突然変異 体で、野生型ファージよりも長い生存時間を有することが判ったものを、高力価 に増殖させ、動物およびヒトの感染症の治療に使用する。 上記の方法によって得られるファージを「抗ＨＤＳ選択(anti-HDS selected) 」と称する。 所望の結果に到達する異なる方法は、ファージが表面外被上に分子を発現し、 前記分子がそうでなければ投与したファージの生存率を低下させるＨＤＳの作用 を弱め、不活性化し、または他の機作で妨害するようにファージを遺伝子的に操 作することである。これを達成する方法の一つは、補体成分の一つ以上に拮抗す る分子を発現するようにファージを操作することである。補体成分はバクテリオ ファージに付着し、次にこのバクテリオファージは補体受容体を発現するある白 血球（マクロファージなど）に接着する。種々の補体成分の機能に拮抗するペプ チドが数多く合成されている。（例えば、Ｌambris,Ｊ.Ｄ.他，"Ｕse of synthe tic peptides in exploring and modifying complement reactivities"、Ｒ．Ｓ im編Ａctivators and Ｉnhibitors of Ｃomplement,Ｋluwer Ａcademic Ｐublis hers,Ｂoston,1993参照）。Ｌambris他は前掲書中に「古典的経路とオルターナ ティブ経路の両方による補体活性化を阻害することが判ったＣ３中のカバーター ゼ(covertase)切断部位にまたがる一連の合成ペプチド」を記載している。記載 されたペプチドの中には「両方の経路を等しくよく阻害する」６アミノ酸ペプチ ド（ＬＡＲＳＮＬ，Ｃ３の７４６〜７５１残基）がある。 このようなファージを遺伝子操作する一方法において、ペプチドが対象表面タ ンパク質のカルボキシル末端に結合する融合タンパク質が得られる（例えば、Ｓ ambrook,Ｊ.,Ｆritsch,Ｅ.,及びＭaniatis,Ｔ.,Ｍolecular Ｃloning.Ａ Ｌabor atory Ｍanual、2nd Ｅd.,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,ＮＹ，1989参照）。この構築物は、ファージ表面タンパク質遺 伝子をプラスミド・ベクター系にクローン化し、次に対象ペプチドのオリゴヌク レオチドをタンパク質の３’末端におけるインフレーム融合によってこの担持ベ クターにクローン化することによって作成される。次に、ファージ表面タンパク 質遺伝子と補体拮抗ペプチドのオリゴヌクレオチドとの融合体は対象ファージ宿 主中の生体内普遍的組換え系(in vivo generalized recombination system)によ って対象ファージに組込まれる。ゲノム配列がすでに完全に既知であるファージ とゲノム配列が未知であるか部分的に未知であるファージを本発明に使用できる 。 組換え補体拮抗ペプチドの表面発現は、この目的に使用される多くの補体関連 方法の一例にすぎない。もう一つの例は、ヒト補体拮抗タンパク質のファージ表 面での発現である。現在いくつかの移植研究施設ではこのようなヒト補体拮抗タ ンパク質をトランスジェニック動物で発現させており、このトランスジェニック 器官が提供されれば受容者のヒトによって免疫的に拒絶されないことが期待され る。（例えば、Genetic Engineering News，October 15，1993，p．1参照）同様 に、このようなヒト補体拮抗タンパク質のバクテリオファージ表面への発現によ り、ファージが宿主防御系により不活化されるのを遅延させることができる。 補体関連方法に加えて、宿主防御系による不活化を遅延させるためにファージ に遺伝子操作で組込むことができる分子の種類は他に多くある。バクテリオファ ージ表面に発現でき、本発明の範囲に入る他の分子の種類にはインターロイキン 及び他のサイトカイン、オートクリン、種々の細胞活性化または抑制因子の抑制 因子（例えばマクロファージ活性化因子の抑制因子）が含まれるが、これに限定 されない。これらのタンパク質（またはその活性サブユニット）の遺伝子をファ ージ・ゲノムに組込んで表面に発現されるようにすることができる。 加えて、所与の細菌宿主株に組換えタンパク質への糖付加をさせることができ るならば、糖付加タンパク質を発現する遺伝子を導入することは本発明の目的に かなうであろう。このようなタンパク質は、負の電荷によってマクロファージな どの免疫細胞をよせつけないことが知られている。実例としては（１）ヒト絨毛 性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ−サブユニットのＣ末端部分、（２）血液細胞 表面の種々のグリコホリンがあるが、これに限定されない。 このように改変されたファージを「抗ＨＤＳ操作(anti-HDS engineered)」と 称する。 本発明は、ファージ（突然変異株または非突然変異株）の連続継代によっても ファージの遺伝子操作によっても、細菌疾患のスペクトルにわたって適用可能で あり、対象菌株の各々に特異的なファージが開発される。従って、多数の抗ＨＤ Ｓ選択および／または抗ＨＤＳ操作バクテリオファージが、ヒト、そのペット、 家畜及び動物園の動物（ほ乳類、鳥類、養魚）の事実上すべての細菌性（または 他の適用可能な）病原体について開発される。ファージ療法は、 １）多剤耐性の出現によって、もはや静菌的、殺菌的に機能しない抗生物質お よび／または化学療法剤の補助または代替として、 ２）そうでなければ適用である抗生物質および／または化学療法剤に対してア レルギーのある患者の治療として、 ３）そうでなければ所与の感染症に適用の抗生物質および／または化学療法剤 の多数よりも副作用が少ない治療として 利用できる。 本発明の第二の実施態様は、上記の抗ＨＤＳ改変バクテリオファージによるフ ァージ療法を通して動物の細菌感染を治療する方法の開発である。何百ものバク テリオファージとそれが感染する菌種が当技術分野で知られている。本発明は特 定のバクテリオファージや特定の細菌に限定されない。むしろ、本発明はその宿 主細菌に起因するありとあらゆる感染症の治療に使用可能な抗ＨＤＳ改変バクテ リオファージの開発に利用できる。 本発明は動物のあらゆる細菌感染の治療に使用できると考えられるが、特に本 明細書に記載の方法は薬剤耐性菌による感染の治療（補助であれ独立であれ）に 非常に有用であると考えられる。専門家は現在下記一覧に示した薬剤耐性細菌が 人類への最大の脅威であることを報告している（例えば、Ｇibbons，Ａ.，"Ｅxー ploring Ｎew Ｓtrategies to Ｆight Ｄrug-Ｒesistant Ｍicrobes,Ｓcience,2 1Ａug.1993,pp.1036-38参照）。 １．臨床的に重要なすべてのエンテロバクター科に属する菌種、特に以下のもの であるがこれに限定されない。 ａ）エシェリキア（Escherichia）属の臨床的に重要なすべての菌株、特に大腸 菌(E.coli)。これら特定の病原体に対する多数の野生型ファージ候補のなかの一 つで本発明の連続継代および／または遺伝子操作の出発材料として使用可能なも のはATCCファージ#23723-B2である。（注：簡潔のために、下記のすべての病原 体の例において、対応する野生型ファージを以下の表現法によって表記する。 ［対応するファージの例： ］） ｂ）クレブシエラ（Klebsiella）属の臨床的に重要なすべての菌種、特に肺炎杵 菌(K.pneumoniae)［対応するファージの例：ATCCファージ#23356-B1］。 ｃ）シゲラ（Shigella）属の臨床的に重要なすべての菌種、特に志賀赤痢菌(S.d ysenteriae)［対応するファージの例：ATCCファージ#11456a-B1］。 ｄ）サルモネラ（Salmonella）属の臨床的に重要なすべての菌種。例えば、ウマ 流産菌(S.abortus-equi)［対応するファージの例：ATCCファージ#9842-B1］、チ フス菌(S.typhi)［対応するファージの例：ATCCファージ#19937-B1］、ネズミチ フス菌(S.typhimurium)［対応するファージの例：ATCCファージ#19585-B1］、サ ルモネラ・ニューポート(S.newport)［対応するファージの例：ATCCファージ#27 869-B1］、パラチフスＡ菌(S.paratyphi A)［対応するファージの例：ATCCファ ージ#12176-B1］、パラチフスＢ菌(S.paratyphi B)［対応するファージの例：AT CCファージ#19940-B1］、サルモネラ・ポツダム(S.potsdam)［対応するファージ の例：ATCCファージ#25957-B2］、及び鶏白痢菌(S.pollurum)［対応するファー ジの例：ATCCファージ#19945-B1］。 ｅ）セラチア(Serratia)属の臨床的に重要なすべての菌種、特に霊菌(S.marcesc ens）［対応するファージの例：ATCCファージ#14764-B1］。 ｆ）エルジニア(Yersinia)属の臨床的に重要なすべての菌種、特にペスト菌Y.pe stis［対応するファージの例：ATCCファージ#11953-B1］。 ｇ）エンテロバクター(Enterobacter)属の臨床的に重要なすべての菌種、特にエ ンテロバクター・クロアカエ(E.cloacae)［対応するファージの例：ATCCファー ジ#23355-B1］。 ２．臨床的に重要なすべてのエンテロコッカス(Enterococcus)属、特にエンテロ コッカス・ファエカリス(E.faecalis)［対応するファージの例：ATCCファージ#1 9948-Bl］及びエンテロコッカス・ファエシウム(E.faecium)［対応するファージ の例：ATCCファージ#19953-B1］。 ３．ヘモフィルス(Haemophilus)属の臨床的に重要なすべての菌種、特にインフ ルエンザ菌(H.influenzae)［この病原体に対して対応するファージはATCCから入 手できないが、WHOまたは公的に提供しているその他の研究所から数種類が入手 可能］。 ４．臨床的に重要なすべてのマイコバクテリウム（Mycobacterium）属、特にヒ ト結核菌(M.tuberculosis)［対応するファージの例：ATCCファージ#25618-B1］ 、マイコバクテリウム・アビウムイントラセルラーレ(M.avium-intracellulare) 、ウシ結核菌(M.bovis)及びらい菌(M.leprae)［これらの病原体に対応するファ ージはオランダ、ビルトーベンの国立公衆衛生環境保護院を通じてWHOから市販 ］。 ５．淋菌(Neisseria gonorrhoeae)及び髄膜炎菌(N.meningitidis)［両方に対応 するファージはWHOその他の供給源から公的に入手可能］。 ６．臨床的に重要なすべてのシュードモナス（Pseudomonas）属、特に緑濃菌(P. aeuruginosa)［対応するファージの例：ATCCファージ#14203-B1］。 ７．臨床的に重要なすべてのブドウ球菌（Staphylococcus）属、特に黄色ブドウ 球菌(S.aureus)［対応するファージの例：ATCCファージ#27690-B1］及び表皮ブ ドウ球菌(S.epidermitis)［対応するファージはロンドンのコリンデール研究所 を通じてWHOから公的に入手可能］。 ８．臨床的に重要なすべての連鎖球菌（Streptococcus）、特に肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae）［対応するファージはWHOその他の供給源から公的に入手可能］。 ９．コレラ菌(Vibrio cholera)［対応するファージの例：ATCCファージ#14100-B 1］。 現在は抗生物質耐性危機の状態にないにもかかわらず、本発明によってＨＤＳ による不活化を遅延させることができる抗ＨＤＳ改変バクテリオファージによる 治療の優秀な候補となる追加の病原体が言及するにはあまりに数多くある。この ように、対応するファージが存在する細菌に起因するすべての細菌感染症は本発 明を使用して治療できる。 細菌（または他の病原体）を直接間接に害するファージ株は本発明では有用で あると考えられる。したがって、溶菌性のファージ、溶原性であるが後に溶菌性 となり得るファージ、細菌に有害な産物を送達できる非溶菌性ファージはすべて 本発明では有用である。 本発明の方法によって治療する動物には、ヒトその家庭用ペット、家畜、養魚 、動物園と水族館の動物（クジラやイルカなど）が含まれるが、これに限定され ない。 本発明の抗ＨＤＳ改変バクテリオファージは細菌感染症の治療用の独立した治 療法としても補助治療法としても使用できる。細菌感染症の治療用に抗ＨＤＳ改 変バクテリオファージと組合せるのに有用な数多くの抗微生物薬（抗生物質と化 学療法剤を含む）が当技術分野で公知である。適切な抗微生物薬および記載した 抗微生物薬で治療できる細菌感染症を下記一覧に示した。しかしながら、当業者 は抗ＨＤＳ改変バクテリオファージと組合わせるのに有用な他の抗微生物薬を容 易に決定できるので、本発明は下記一覧に示した抗微生物薬に限定されない。病原体 抗微生物薬または抗微生物薬グループ 大腸菌 −併発症を伴わない トリメトプリムースルファメトキサゾール 尿管感染症 （省略形：TMO-SMO）、またはアンピシリン； 第１世代セファロスポリン、シプロフロキサシン −全身感染症 アンピシリン、または第３世代セファロスポリン； アミノグリコシド、アズトレオナム、または ペニシリン＋ペニシリナーゼ阻害剤 肺炎杆菌 第１世代セファロスポリン； 第３世代セファロスポリン、 セフォタキシム、モクサラクタム(moxalactam)、 アミカシン、クロラムフェニコール 赤痢菌（種々） シプロフロキサシン；TMO-SMO、アンピシリン、 クロラムフェニコール サルモネラ属： −チフス菌 クロラムフェニコール；アンピシリンまたはTMO-SMO −非チフス菌 アンピシリン；クロラムフェニコール、 TMO-SMO、シプロフロキサシン ペスト菌 ストレプトマイシン；テトラサイクリン、 クロラムフェニコール エンテロバクター・ 第３世代セファロスポリン、ゲンタマイシン、または クロアカエ トブラマイシン；カルベニシリン、アミカシン、 アズトレオナム、イミペネム インフルエンザ菌： −髄膜菌 クロラムフエニコール、または 第３世代セファロスポリン；アンピシリン −他のインフルエンザ菌 アンピシリン；TMO-SMO、セファクロル、 感染症 セフロキシム、シプロフロキサシン ヒト結核菌及び マイコバクテリウム・ イソニアジド（ＩＮＨ）＋リファンピンまたは アビウムイントラ リファブチン、 セルラーレ 上記とピラジナミド＋／またはエタンブトールの併用 ナイセリア属： −髄膜炎菌 ペニシリンＧ、クロラムフェニコール、または スルホンアミド −淋菌： ペニシリン感受性株 ペニシリンＧ；スペクチノマイシン、 セフトリアキソン ペニシリン耐性株 セフトリアキソン；スペクチノマイシン、 セフロキシムまたはセフォキシチン、 シプロフロキサシン 緑濃菌 トブラマイシンまたはゲンタマイシン （＋／−カルベニシリン、アミノグリコシド）； アミカシン、セフタジジム、アズトレオナム、 イミペネム 黄色ブドウ球菌 −非ペニシリナーゼ ペニシリンＧ；第１世代セファロスポリン、 産生菌 バンコマイシン、イミペネム、エリスロマイシン −ペニシリナーゼ産生菌 ペニシリナーゼ耐性ペニシリン； 第１世代セファロスポリン、 バンコマイシン、イミペネム、エリスロマイシン 肺炎連鎖球菌 ペニシリンＧ；第１世代セファロスポリン、 エリスロマイシン クロラムフェニコール コレラ菌 テトラサイクリン；TMO-SMO 投与経路には、経口、エアロゾルまたは肺への送達のための他の機器、鼻内噴 霧、静脈内、筋肉中、腹腔内、髄腔内、経膣、直腸内、局所、腰椎穿刺、脳およ び／または髄膜への直接適用が含まれるが、これらに限定されない。ファージを 送達するための媒体として使用できる賦形剤は、当業者には明らかであろう。例 えば、遊離ファージを凍結乾燥の形態にして静脈内投与直前に溶解することがで きる。投与量としては約１０⁶〜１０¹³ｐｆｕ／ｋｇ／日、好ましくは約１０¹² ｐｆｕ／ｋｇ／日が考えられる。ファージは病原細菌が完全に消失するまで投与 する。 肺へのエアロゾル投与に関しては、抗ＨＤＳ改変ファージを吸入による肺への 投与用に特に設計された組成物に配合する。当技術分野ではこのような多くの組 成物が公知であり、本発明はどの特定の組成物にも限定されない。このようなエ アロゾルの例はシェーリングプラウ社製のプロベンチル（商標）(Proventil^tm) 吸入液で、プロペラントにはトリクロロモノフルオロメタン、ジクロロジフルオ ロメタンおよびオレイン酸が含まれる。必要に応じ、治療に使用するファージに 基づいてプロペラント成分と乳化剤の濃度を調節する。エアロゾル治療ごとに投 与するファージ数は１０⁶〜１０¹³ｐｆｕの範囲、好ましくは１０¹²ｐｆｕであ ろう。 本発明の前記の実施態様は以下の実施例中でさらに説明する。しかしながら、 本発明はこの実施例によって限定されず、本発明の範囲からはずれることなく改 変できることは当業者にとって明瞭である。特に、いかなる細菌と前記細菌に感 染することが公知であるいかなるファージも下記実施例の実験中で代わりに使用 できる。 実施例 実施例１： マウスにおける連続継代による抗ＨＤＳ選択ファージの選択 第１部 突然変異または非突然変異ラムダ・コリファージ株のストック１０¹²ｐ ｆｕ／ｋｇを無菌生理食塩液５ｃｃに懸濁して実験用マウスの血液中に一回で注 入する。マウス体内におけるファージの生存を追跡するため、マウスから定期的 に採血する。ファージはその実験室宿主である大腸菌上にプレートすることによ ってアッセイする。マウス中のファージ力価が最初に注射した力価の０．０１％ 〜１．０％の範囲、好ましくは０．１％に達したとき、ファージを分離して、プ ラークアイソレーションに供し、そして上記手順を繰り返す。動物−細菌間のラ ムダ・ファージの反復継代によってマウス体内でより長い生存期間を有するファ ージ株がもたらされる。この抗ＨＤＳ選択ファージ株は、次にクローン（プラー ク）純化に供される。 連続継代用に投与されるファージを最初に突然変異させる場合には、突然変異 誘発は当技術分野で公知の手順によって行われる(例えば、Ａdams,Ｍ．Ｂacteri ophages.ＮＹ: Ｗiley Ｉnterscience,1959,pp.310-318 and pp.518-520)。紫外 線照射による突然変異誘発では、潜伏期の最終４０％〜９０％（好ましくは６５ ％）の期間に、ファージ（感染宿主中の）を１平方ｍｍ当たり３，０００〜６， ０００エルグ（好ましくは４，５００エルグ）の紫外線照射に曝す。Ｘ線による 突然変異誘発では、１０〜２５０（好ましくは１５０）キロレントゲンの線量で ０．９５オングストロームの波長を使用する。実施例２： 野生型ファージと比較した抗ＨＤＳ選択ファージのＨＤＳ不活化遅延 の測定 以下のようにマウス群にファージを注射する。第１群： この実験群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の抗Ｈ ＤＳ選択ファージから成る静脈内注射を受ける。第２群： この対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、連 続継代ファージが由来した野生型ファージから成る静脈内注射を受ける。 両群のマウスから定期的に採血し、以下の決定のために血液試料についてファ ージ含量（ｐｆｕアッセイにより）のアッセイを行う。 １）この二種類のファージの半減期のアッセイ マウスの各群に対し、開始時に投与したファージ量の半量だけ（即ち、１×１ ０⁶）が循環中に残存する時点を記録する。抗ＨＤＳ選択ファージの半分が循環 中から消失する時点は、野生型ファージの半分が循環中から消失する時点よりも １５％以上遅い。 ２）絶対数のアッセイ マウスの各群に対して、ファージ投与後ちょうど１時間後に血液試料を採取す る。注射１時間後、抗ＨＤＳ選択ファージの循環中数は、循環中にまだ存在する 野生型ファージよりも１０％以上多い。実施例３： 抗ＨＤＳ選択ファージの野生型ファージよりも高いマウスの致死感染 を予防する能力の測定 第１部 腹膜炎モデル： 大腸菌ＬＤ₅₀量を実験用マウスに腹腔内（ＩＰ）投与する。使用される大腸菌 株は、連続継代によって選択したコリファージ株によって溶菌されることが知ら れている。治療様式(treatment modality)は、細菌の注射の正確に２０分後、た だし発症前の投与である。この治療様式は以下によって構成される。 第１群：この実験群は、滅菌生理食塩液２ｃｃに懸濁した１×１０¹²の抗ＨＤ Ｓ選択ファージ、即ちラムダ・コリファージから成る腹腔内注射を受ける。 第２群：第１対照群は、滅菌生理食塩液２ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、抗Ｈ ＤＳ選択ファージが由来した野生型ファージから成る腹腔内注射を受ける。 第３群：第２対照群は、滅菌生理食塩液２ｃｃの腹腔内注射を受ける。 抗ＨＤＳ選択ファージによる治療が腹膜炎モデル中で致死事象の進展を予防し た証拠は、以下の３基準を使用して測定する。 （１）動物の生存 （２）細菌数：腹水試料を感染マウスの３群から半時間ごとに採取し、３群に おける大腸菌のコロニー数の増減率を記録する。 （３）ファージ制御：感染マウスから採取した腹水試料を用いて抗ＨＤＳ選択 ファージと野生型ファージのｐｆｕ数を記録する。 第２部 菌血症モデル： 大腸菌ＬＤ₅₀量を実験用マウスに静脈内（ＩＶ）投与する。使用される大腸菌 株は連続継代によって選択したコリファージ株によって溶菌されることが知られ ている。治療様式（下記参照）は、細菌の注射の正確に２０分後、ただし発症前 の投与である。この治療様式は以下によって構成される。 第１群：この実験群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の抗 ＨＤＳ選択ラムダ・コリファージから成る静脈内注射を受ける。 第２群：第１対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、 抗ＨＤＳ選択ファージが由来した野生型ファージから成る静脈内注射を受ける。 第３群：第２対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃの静脈内注射を受ける。 抗ＨＤＳ選択ファージによる治療が菌血症モデル中で致死事象の進展を予防し た証拠は、以下の３基準を使用して測定する。 （１）動物の生存 （２）細菌数：血液試料を感染マウスの３群から半時間ごとに採取し、３群の 大腸菌のコロニー数の増減率を記録する。 （３）ファージ制御：感染マウスから採取した血液試料を用いて抗ＨＤＳ選択 ファージと野生型ファージのｐｆｕ数を記録する。実施例４： 宿主防御系と拮抗する分子を発現させ、それによってファージが宿主 防御系による不活化を遅延させるためのファージの遺伝子操作第１部 融合タンパク質の作成 第１段階 標準的な技術を用いて自動オリゴヌクレオチド合成装置で補体拮抗ペ プチドＬＡＲＳＮＬをコードする二重鎖ＤＮＡを合成する。 第２段階 対象ファージ被覆表面タンパク質遺伝子（下記第２部参照）を、当技 術分野で既知の技術によってプラスミド・ベクター系にクローン化する。第１段 階で調製したオリゴヌクレオチドを、表面タンパク質遺伝子の３’末端における インフレーム融合によってプラスミド・ベクター系にクローン化する。 第３段階 次に、ファージの宿主細菌中における生体内普遍的組換え系によって この融合遺伝子をファージに組み込む。その後、このファージは表面に融合タン パク質を発現する。第２部 対象ペプチド／タンパク質との融合用のファージ被覆表面タンパク質の 選択Ａ ．ゲノムの特性がよく判明しているファージへの補体拮抗ペプチド遺伝子の組 み込み ラムダ・コリファージのカルボキシ末端テールタンパク質をコードするｏｒｆ Ｘ遺伝子は、外来ヌクレオチド配列をファージの構造や機能を破壊せずに導入で きることが知られているものである。ｏｒｆＸ遺伝子によって発現されるこのテ ール表面タンパク質は、上記第１部記載のプラスミド・ベクター法によって補体 拮抗ペプチドとの融合タンパク質とされる。Ｂ ．ゲノムの特性がよく判明していないファージへの補体拮抗ペプチド遺伝子の 組み込み 第１段階 補体拮抗ペプチドと融合させるファージ表面タンパク質の選択 ａ）ファージ被覆表面タンパク質の単離と、その抗体の調製 （１）対象ファージの試料を０．１％ＳＤＳ界面活性剤によって９５℃で２分 間処理して分散させる。混合液を冷却して９Ｍ尿素溶液にした後、高分解能二次 元電気泳動によって分離する。次に、タンパク質フラグメントをゲルから単離し 、以下の記載のように処理する。 （２）ゲルからのタンパク質フラグメント試料を動物に注入してポリクローナ ル抗体かモノクローナル抗体のいずれかを作成する。 （３）抗体を単離した後、ウラン標識する。この標識抗体を全ファージに対し て反応させる。電子顕微鏡による視覚化を通じて、抗体が結合したファージ表面 のタンパク質を標識が正確に示す。（例えば、Ｋ.Ｗilliams and Ｍ．Ｃhase,ed .,Ｍethods Ｉn Ｉmmunology and Ｉmmunochemistry,Ｖol.1,1967,Ａcademic Ｐ ress参照）。ウイルス表面から外部に延びている表面タンパク質に対する抗体を その後の使用のために確保しておく。 ｂ）ファージ制限フラグメントの調製 ファージのゲノムを制限酵素によって切断し、その結果得られる制限フラグメ ントを発現ベクター・プラスミドにクローン化する。このプラスミドの各々は対 応するタンパク質を発現し、発現タンパク質のプールを形成する。 ｃ）発現タンパク質と標識抗体との反応 ウイルス表面から外部に延びている表面タンパク質に対する抗体をプラスミド ・ベクターによって発現したタンパク質と反応させる。 ｄ）被覆タンパク質遺伝子を発現するプラスミド・ベクターに対する被覆タンパ ク質抗体の関連づけ 標識抗体の発現タンパク質との反応によって、その封入制限フラグメントが特 定のタンパク質を発現する発現プラスミドが示される。したがって、標識抗体を 使用することにより各被覆表面タンパク質をコードするゲノム・フラグメントが 決定される。 ｅ）完全な遺伝子が得られたことの確認 表面タンパク質遺伝子を含む制限フラグメントについてサンガー法によってマ イクロシークエンシングを行い、（１）被覆表面タンパク質の正確なアミノ酸配 列、（２）開始シグナルと停止シグナルの存在の有無、（遺伝子全体が得られた ことを示す）（３）Ｃ末端アミノ酸かＮ末端アミノ酸のいずれかの存在の有無を 決定する。 第２段階 候補のファージ表面タンパク質と対象補体桔抗ペプチドとの融合 ａ）融合用被覆タンパク質遺伝子の調製 表面タンパク質遺伝子は、そのプラスミド発現ベクターに含まれている。被覆 表面タンパク質の３’末端におけるインフレーム融合によって補体拮抗ペプチド のオリゴヌクレオチドをこのプラスミド発現ベクターに挿入する。 ｂ）対象ファージへの融合遺伝子の組み込み ファージの宿主細菌内における生体内普遍的組換え系によって融合遺伝子をフ ァージに組み込む。 ｃ）ファージが融合タンパク質を発現することの実証 被覆表面タンパク質に対する対応する重金属標識抗体と共にファージをインキ ュベートする。ファージがその表面に融合タンパク質を発現したときに限り電子 顕微鏡によってマーカーが検出される。（例えば、Ｋ.Ｗilliams and Ｍ．Ｃhas e,ed.,Ｍethods Ｉn Ｉmmunology and Ｉmmunochemistry,Ｖol.1，1967,Ａcadem ic Ｐress参照）。実施例５． 遺伝子操作ファージが野生型ファージと比較してＨＤＳによる不活化 を遅延させることの実証 以下のように２つのマウス群にファージを注射する。 第１群：この実験群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の抗 ＨＤＳ選択ファージから成る静脈内注射を受ける。 第２群：この対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、 連続継代ファージが由来した野生型ファージから成る静脈内注射を受ける。 両群のマウスから定期的に採血し、以下の測定のために血液試料についてファ ージ含量（ｐｆｕアッセイにより）のアッセイを行う。 １）この二種類のファージの半減期のアッセイ マウスの各群に対し、開始時に投与したファージ量の半量だけ（即ち、１×１ ０⁶）が循環中に残存する時点を記録する。抗ＨＤＳ選択ファージの半分が循環 中から消失する時点は、野生型ファージの半分が循環中から消失する時点よりも １５％以上遅い。 ２）絶対数のアッセイ マウスの各群に対して、ファージ投与後ちょうど１時間後に血液試料を採取す る。使用する基準は、注射１時間後、ｐｆｕアッセイによって抗ＨＤＳ選択ファ ージの循環中数が対照動物の循環中にまだ存在する野生型ファージよりも１０％ 以上多いことが示されるというものである。実施例６． 遺伝子操作ファージの野生型ファージよりも高いマウス致死感染予防 能力の決定 第１部 腹膜炎モデル： 大腸菌ＬＤ₅₀量を実験用マウスに腹腔内（ＩＰ）投与する。使用される大腸菌 株は遺伝子操作されたコリファージ株によって溶菌されることが知られている。 治療様式は、細菌の注射の正確に２０分後、ただし発症前の投与である。この治 療様式は以下によって構成される。 第１群：この実験群は、滅菌生理食塩液２ｃｃに懸濁した１×１０¹²の遺伝子 操作ラムダ・コリファージから成る腹腔内注射を受ける。 第２群：第１対照群は、滅菌生理食塩液２ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、遺伝 子改変ファージが由来した野生型ファージから成る腹腔内注射を受ける。 第３群：第２対照群は、滅菌生理食塩液の腹腔内注射を受ける。 遺伝子操作ファージによる治療が腹腔炎モデル中で致死事象の進展を予防した 証拠は、以下の３基準を使用して測定する。 （１）動物の生存 （２）細菌数：腹水試料を感染マウスの３群から半時間ごとに採取し、３群の 大腸菌のコロニー数の増減率を記録する。 （３）ファージ制御：感染マウスから採取した腹水試料を用いて遺伝子操作フ ァージと野生型ファージのｐｆｕ数を記録する。 第２部 菌血症モデル： 大腸菌ＬＤ₅₀量を実験用マウスに静脈内（ＩＶ）投与する。使用される大腸菌 株は遺伝子操作されたコリファージ株によって溶菌されることが知られている。 治療様式（下記参照）は、細菌の注射の正確に２０分後、ただし発症前の投与で ある。この治療様式は以下によって構成される。 第１群：この実験群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の遺 伝子操作ラムダ・コリファージから成る静脈内注射を受ける。 第２群：第１対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃに懸濁した１×１０¹²の、 遺伝子操作ファージが由来した野生型ファージから成る静脈内注射を受ける。 第３群：第２対照群は、滅菌生理食塩液０．５ｃｃの静脈内注射を受ける。 遺伝子操作ファージによる治療が菌血症モデル中で致死事象の進展を予防した 証拠は、以下の３基準を使用して測定する。 （１）動物の生存 （２）細菌数：感染マウスの３群から半時間ごとに採取した血液試料中の３群 に対する大腸菌のコロニー絶対数およびその増減率を記録する。 （３）ファージ制御：感染マウスから採取した血液試料を用いて遺伝子操作フ ァージと野生型ファージのｐｆｕ数を記録する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 メリル，カール，アール. アメリカ合衆国，20850 メリーランド, ロックビル，ウィンダー コート ２番地 (72)発明者 アディア，サンカー，エル. アメリカ合衆国，20878 メリーランド, ガイザースバーグ，キングス グラント ストリート 14400番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物における細菌による感染症を治療する方法であって、 このような治療を必要とする動物に、前記細菌を実質的に消失させる量の、前記 細菌に対して特異的な溶菌性または非溶菌性バクテリオファージを投与する段階 を含み、前記バクテリオファージが動物の宿主防御系による不活化を遅延させる 遺伝性の能力を有することを特徴とする方法。 ２．前記細菌が薬剤耐性菌であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方 法。 ３．前記動物がほ乳類ではないことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法 。 ４．前記動物がほ乳類であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．前記動物がヒトであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．前記バクテリオファージが、対応する野生型ファージよりも１５％以上長い 半減期を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．前記バクテリオファージが、対応する野生型バクテリオファージよりも長期 間動物中に生存できる突然変異バクテリオファージまたは非突然変異バクテリオ ファージの抗ＨＤＳ選択（連続継代）によって得られることを特徴とする請求の 範囲第１項に記載の方法。 ８．前記細菌が、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、ビブリオ、エンテロバクタ ー、エンテロコックス、エシェリキア、へモフィルス、ナイセリア、シュードモ ナス、シゲラ、セラチア、サルモネラおよび連鎖球菌から成るグループから選択 され、前記バクテリオファージが効果的にその細菌を溶菌できることを特徴とす る請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．前記細菌が、ヒト結核菌、マイコバクテリウム・アビウムイントラセルラー レおよびウシ結核菌から成るグループから選択されることを特徴とする請求の範 囲第８項に記載の方法。 １０．前記バクテリオファージをエアロゾルによって動物の肺に投与することを 特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 １１．前記バクテリオファージを約１０⁶〜１０¹³ｐｆｕ／ｋｇ／日の投与量で で投与することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 １２．前記バクテリオファージを約１０¹²ｐｆｕ／ｋｇ／日の投与量で投与する ことを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．動物の宿主防御系による不活化を遅延させる遺伝性の能力を有する、単離 精製されたバクテリオファージ。 １４．対応する野生型ファージよりも１５％以上長い半減期を有することを特徴 とする請求の範囲第１３項に記載のバクテリオファージ。 １５．対応する野生型バクテリオファージよりも長く動物体内で生存できるバク テリオファージの抗ＨＤＳ選択によって得られることを特徴とする請求の範囲第 １３項に記載のバクテリオファージ。 １６．対応する野生型バクテリオファージよりも長く動物体内で生存できる抗Ｈ ＤＳバクテリオファージの遺伝子操作によって得られることを特徴とする請求の 範囲第１３項に記載のバクテリオファージ。 １７．エシェリキア、クレブシエラ、シゲラ、サルモネラ、セラチア、エルジニ ア、エンテロバクター、エンテロコックス、ヘモフィルス、マイコバクテリウム 、ナイセリア、シュードモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌およびビブリオから成る グループから選択される細菌群に特異的であることを特徴とする請求の範囲第１ ３項に記載のバクテリオファージ。 １８．異物に対する動物の宿主防御系による不活化を遅延させることができるバ クテリオファージを得る方法であって、 （ａ）バクテリオファージを動物に静脈内注入する段階と、 （ｂ）時間的に連続して試料を採取して、各試料中に存在するバクテリオファー ジを測定する段階と、 （ｃ）約０．１％〜１％のバクテリオファージが前記動物に残存するときに得ら れた試料の一部を宿主細菌中で高力価に増殖させる段階と、 （ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の段階を少なくとも１回反復して動物の宿主 防御系による不活化を遅延させた「抗ＨＤＳ」バクテリオファージを取得する段 階と を含む方法。 １９．前記（ｄ）の段階を、対応する野生型ファージよりも１５％長い半減期を 有するバクテリオファージが得られるまで反復することを特徴とする請求の範囲 第１８項に記載の方法。 ２０．動物の宿主防御系による不活化を遅延させることができるバクテリオファ ージを得る方法であって、バクテリオファージに遺伝子操作を施してその表面被 覆に動物の宿主防御系によるバクテリオファージの不活化を遅延させる分子を発 現させる段階を含む方法。 ２１．前記バクテリオファージを遺伝子操作によって得ることを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の方法。 ２２．前記細菌が、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、ビブリオ、エンテロバク ター、エンテロコックス、エシェリキア、ヘモフィルス、ナイセリア、シュード モナス、シゲラ、セラチア、サルモネラおよび連鎖球菌から成るグループから選 択され、前記バクテリオファージが効果的にその細菌を溶菌できることを特徴と する請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２３．前記細菌が、ヒト結核菌、マイコバクテリウム・アビウムイントラセルラ ーレおよびウシ結核菌から成るグループから選択されることを特徴とする請求の 範囲第２２項に記載の方法。 ２４．前記バクテリオファージをエアロゾルによって動物の肺に投与することを 特徴とする請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２５．前記バクテリオファージを約１０⁶〜１０¹³ｐｆｕ／ｋｇ／日の投与量で 投与することを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２６．バクテリオファージを約１０¹²ｐｆｕ／ｋｇ／日の投与量で投与すること を特徴とする請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．細菌による感染症を治療する方法であって、このような治療を必要とする 動物に、前記細菌を実質的に消失させるのに有効な量の、前記細菌に特異的なバ クテリオファージと組み合わせて抗生物質および／または化学療法剤を投与する 段階を含み、前記バクテリオファージが動物の宿主防御系による不活化を遅延さ せる遺伝性の能力を有することを特徴とする方法。 ２８．動物の宿主防御系による不活化を遅延させる遺伝性の能力を有する単離精 製されたバクテリオファージを医薬的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物。 ２９．動物肺投与用のエアロゾル組成物であることを特徴とする請求の範囲第２ ８項に記載の医薬組成物。 ３０．前記バクテリオファージが凍結乾燥形態であることを特徴とする請求の範 囲第２８項に記載の医薬組成物。