JPH09511400A

JPH09511400A - 交互スプライシングによって生成されるヒトインターロイキン変異体

Info

Publication number: JPH09511400A
Application number: JP7525900A
Authority: JP
Inventors: アルムス，ウィリアム; ホワイト，バーバラ
Original assignee: ユニバーシティオブメリーランドアットボルティモア
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1997-11-18
Also published as: EP0775202A4; AU2237395A; EP0775202A1; WO1995027052A1; CA2186854A1

Abstract

(57)【要約】全長mRNAのエキソン１，３及び４を含むもののエキソン２が欠失しているインターロイキン−２及び４のスプライス突然変異体が開示されている。これらのスプライス突然変異体の発現の結果として得られるタンパク質は全長インターロイキンの活性を調節する上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】交互スプライシングによって生成されるヒトインターロイキン変異体発明の背景発明の分野本発明は、単数又は複数のエキソンの欠失を含み、その発現の結果としてそれらの全長対応物の作用を調節するのに有用である切形タンパク質をもたらすようなインターロイキンの新しいスプライス突然変異体に関する。関連技術の説明インターロイキン−４は、造血細胞及び非造血細胞内の幅広い細胞機能を調節する、活性化Ｔ細胞(Howard et al．(1982)J.Exp.Med．155 ：914)、マスト細胞 (Brown et al．(1987)Cell．50：809)及び好塩基球によって分泌される 15kDaの糖タンパク質である。IL-4の配列は、米国特許第 5017691号に開示されている。近年になってIL-4の３次元構造が解明された（Powers et al.(1992)Science 2 56 ：1673）。このタンパク質は４つの左手αらせんと２つのβシートを含んでいる。この構造モチーフは、一次配列の相同性を共有しない増々大きくなる成長因子グループによって共有されている。Powers et al（Powers et al.(1992)Sci ence 256 ：1673）は、成長ホルモン／成長ホルモンレセプタ系に対する類比(De Vos et al.(1992)Science 255 ：306)に基づき、IL-4がそのレセプタのための２つの結合部位を含んでいることを推測した。第１の部位にはIL-4らせんα_A 及びα_C が関与するものと予測され、一方、第２の部位にはらせんα_D 、ストランドＢ_A 及びストランドＢ_A とらせんα_B の間の連結ループが関与するものと予測されている（Powers et al.(1992)Sci ence 256 ：1673）。１つの予測されたIL-4／IL-4レセプタ相互作用部位 Asp³¹ は、エキソン２のストランドＢ_A 内にある。エキソン２は同様にCys⁶⁵と分子内ジスルフィド結合を形成する Cys²⁴をも含んでいる。IL-4δ2 内で発生するこのジスルフィド結合の分断は、突然変異体IL-4分子の生物活性にとって重要ではない（Kruse et al.(1991)FEBS Letters 286 ：58）。 IL-4は、染色体の場所並びに分子の組織及び構造を共有するサイトカインの多重遺伝子族に属する(Bovlay et al．(1992)J.Biol.Chem．267 ：20525)。この遺伝子族の構成員としては、IL-2，IL-3，IL-4，IL-5及びGM-CSFが含まれる。 IL-4遺伝子と同様に、IL-2遺伝子は４つのエキソンから成り、エキソン２は60 bpで最も短かい（Fujita et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 80 ：7437）。 IL-2分子がIL-4のものに似た左手アルファらせんとＢシートの構成をもつことが示唆されてきた(Bazan（1992）Science 257 ：410)。IL-2のエキソン２（アミノ酸残基31〜50）は、βシート、短かいαらせん及び、IL-4のエキソン２によってコードされるものに類似した領域であるらせんα_A 及びα_B を連結するループ(B azan（1992）Science 257 ：410)をコードする（Powers et al.(1992)Science 2 56 ：1673）。IL-2のエキソン２はIL-2分子のうちIL-2レセプタのα鎖（ｐ55）を結合する部分である（Sauve et al．(1991)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 88：463 6）。 IL-4は、抗 IgM抗体と休止Ｂ細胞との増殖を同時刺激し(Howardet al．(1982) J.Exp.Med．155 ：914)、休止Ｂ細胞をアポプトシス（細胞自滅）から救い（Ill era et al．(1993)J.Immunol．151 ：3521）、活性化されたＢ細胞によるIg産生を誘発し（Defiance e t al．(1988)J.Immunol．141 ：2000）、そしてマウス内でIgG₁及び IgEへのアイソタイプスイッチ(Coffman et al．(1986)J.Immunol．136 ：4538)(Vitetta e t al.(1985)J.Exp.Med．162 ：1726)並びにヒトにおけるIgG₄及びIgE(Lundgren et al.(1989)Eur.J.Immunol．13：131)へのアイソタイプスイッチを調節するものであることが立証されてきた。又、IL-4への露呈が、Ｂ細胞の表面上でIgM(Sh ields et al（1989）Immunology 66：224)，CD23(10-12)、 MHCクラスII分子(Ro usset et al.(1988)J.Immunol．140 ：2625)(Roehm et al.(1984)J.Exp.Med．16 0 ：679)、 LFA-1及びLFA-3（Rousset et al.(1989)J.Immunol．143：1490）及びIL-4レセプタ（IL-4R)(Renz et al．(1991)J.Immunol．146：3049）分子の数を増大させることが実証されてきた。Ｔ細胞内では、IL-4は、増殖（Fernandez- Botran et al．(1986)J.Exp.Med．164 ：580)(Mosmann et al.(1986)Proc.Natl. Acad.Sci．USA 83：5654)(Mitchell et al．(1989)J.Immunol．142 ：1548)、 T h₂表現型の生成(Fernande z-Botran et al．(1986)J.Exp.Med．164 ：580)(Le G ros et al. (1990)J.Exp.Med．172 ：921)及び IL-4Rの発現（Renz et al．(199 1)J.Immunol．146 ：3049）を促進することが示されてきた。IL-4は、マスト細胞の成長を促進する上でIL-3と相乗効果を示す（Mosmann et al．(1986)Proc.Na tl.Acad.Sci．USA 83：5654）。IL-4はマクロファージを活性化して、殺腫瘍活性、 MHCクラスII発現及び IgG免疫複合体の結合を増大させる(Crawford et al ．(1987)J.Immunol．139 ：135)。赤血球細胞、巨核球及び顆粒球の前駆体…マクロファージをIL-4で同時刺激してコロニー形成を増大させることができる(Pes chell et al.(1987)Blood 70：254)。IL-4は同様に増殖(Feghali et al.(1982)C lin.Immunol.Immunopathol．63：182)、化学定性（Postlethewaite et al．(199 1)J.Clin.Invest．87 ：2147）、細胞外基質の産生（Postlethewaite et al．(1992)J.Clin.Invest ．90：1479）、及び線維芽細胞による細胞間粘着分子−１（ICAM-1）の発現（Pi ela-Smith et al．(1992)J.Immunol 148 ：1375）をも刺激する。インターロイキン−２（IL-2）は、細胞毒性Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激するＴ細胞（Ｔ_A）を増幅することによって分泌されるＴ細胞成長因子である。Ｔ_C 芽球は、IL-2のための表面レセプタを発現する。IL-2レセプタ（IL-2）は３つの別々のタンパク質ｐ55（α鎖）、ｐ75（β鎖）、及びｐ65（δ鎖）から成る、様々なる組合せの中で、これらの鎖は、異なる親和力及び増殖性シグナルの形質導入能力をもつさまざまな形の IL-2Rを発生させる（タニグチ et al．(1993)Cell 73：５）。同様にして、 IL-4Rは少なくとも２つの鎖で構成されている。すでに記述された第１の IL-4R鎖は、 IL-2R及び成長因子レセプタ超科のその他の構成員に対する著しい相同性を共有している(Idzerda et al.(1990)J.Exp.Med．17 1 ：861)。かなり近年になって、 IL-2Rのδ_C 鎖である第２の IL-4R鎖が同定された（Russell et al．(1993)Science 262 ：1877）。 IL-4Rは IL-2Rと同様に、いくつかの機能的形態を有する可能性がある(Rigley et al．(1991)Int.Immun ol．３：197)。 IL-4は広範な効果をもつため、IL-4活性の調節が或る種の疾患の結果を決定する上での要となると言っても驚くべきことではない。 (Scott et al.(1988)J.Ex p.Med．168 ：1675)(Heinzel et al.(1989)J.Exp.Med．169 ：59)(Yamamura et al.(1991)Science 254 ：277)(Zwingenberger et al. (1991)Scand.J.Immunol.3 4 ：243)(Wierenga et al.(1990)J.Immunol．144 ：465)。マウスリーシュマニア症（Heinzet et al（1989）J.Exp.Med．169 ：59）、ヒトらい病(ヤマムラ et a l．(1991)Science 254：277)及びヒト住血吸虫症(Zwingenberger et al.(1991)Scand.J.Immunol. 34：243)においては、IL-4 の産生は、慢性感染と結びつけられる。アレルゲンに応答してのIL-4の産生増加が、ヒトのアトピー性応答を特徴づけている(Wierenga et al. (1990)J.Immunol . 144 ：465)。IL-4活性の分子調節の研究はこれまで、IL-4遺伝子内でのプロモータ、エンハンサ及び負の調節要素の効果に焦点をあてていた。(Henkel et al ．(1992)J.Immunol．149 ：3239)(Li-Weber et al.,(1992)J.Immunol．148 ：19 13)(Abe et al.(1992)Proc.Natl.Acad．Sci. USA 89：2864)(Li-Weber et al．( 1993)J.Immunol．151 ：1371)(Szabo et al.(1993)Mol.Cell.Biol．13：4793)。発明の要約従って本発明の主な目的はヒトIL-4のエキソン１，３、及び４を含む単離した核酸を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、ヒトIL-2のエキソン１，３及び４を含む単離した核酸を提供することにある。本発明のもう１つの目的はヒトIL-2及び４のエキソン１，３及び４を含む単離した核酸についての発現を提供することにある。本発明のさらにもう１つの目的は、ヒトIL-2及び４のエキソン１，３及び４を含む単離した核酸の発現の結果としてもたらされるポリペプチドを提供することにある。本発明のさらにもう１つの目的は、ヒトIL-2及び４のエキソン１，３及び４を含む単離した核酸の発現の結果もたらされるポリペプチドに対する抗体を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、それぞれヒトIL-2及び４のエキソン１，３及び４を含む単離した核酸の発現の結果としてもたらされるポリペプチドを、それぞれヒトIL-2及び４の生物学的効果を低下させるのに有効な量だけ投与することによって、ヒトIL-2及び４の活性を調節する方法を提供することにある。以下で明らかとなる本発明の前述の及びその他の目的利点及び特長に基づき、本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な説明及び添付のクレームを参照することによって本発明の性質をより明確に理解することができる。図面の簡単な説明図１は、２つの IL-4 mRNA種の検出を示す。抗−CD3 MAb 、OKT3で６時間刺激を受けたヒト末梢血単核細胞（PBMC）から全細胞 RNAを抽出し、次にヒトIL-2のエキソン１及び４、ヒトIL-4のエキソン１及び４、並びにインターフェロン−δ (IFN−γ)に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写酵素連鎖反応（RT-PCR）に付した。同じ反応試験管の中でIL-2，IL-4及び IFN−γのcRNAの内部標準を同時増幅した。RT-PCR増幅産物を６％のポリアクリルアミドゲル内でゲル電気泳動に付した。各対内の５′PCR オリゴヌクレオチドプライマを³²Ｐで末端標識付けし、増幅産物をオートラジオグラム上で検出できるようにした。レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２はIL-2増幅産物を含み、レーン３はIL -4増幅産物を含み、レーン４は IFN-γ増幅産物を含む。図２は、HincIIではなく PstＩを用いたIL-4δ2 DNA の消化を示す。抗 CD3 M Ab、OKT3で６時間刺激を受けたヒトPBMCから全細胞 RNAを抽出し、その後、ヒト IL-4のエキソン１及び４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-P CRに付した。５′−PCR オリゴヌクレオチドプライマーを³²Ｐで末端標識付けした。RT-PCR混合物のアリコートは不消化であるか（レーン１）又は、それぞれIL -4エキソン２及び３を消化するHincII（レーン２）又は PstＩ（レーン３）で消化された。次にRT-PCR増幅産物を６％のポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムは、HincIIが 362bpの IL- 4 RT-PCT産物を分割するものの 314bpのIL-4δ2 RT-PCR産物を不消化の状態に残すことを示した。 PstＩはIL-4及びIL-4δ2 の両方のRT-PCR産物を分割した。図３は、IL-4のcDNAとエキソン２が欠如したIL-4のcDNA(IL-4δ2)の配列分析を示す。IL-4及びIL-4δ2 のRT-PCR増幅産物をPCR(商標)11ベクター内にクローニングしその DNA配列をジデオキシ媒介チェーンターミネーター法（41）を用いて決定した。IL-4δ2 のcDNAの配列分析は、エキソンＩが枠内で直接エキソン３にスプライシングされた状態でIL-4エキソン１，３及び４の存在を実証した。IL -4δ２のcDNAと平行して単離、クローニング及び配列決定されたIL４のcDNAの配列分析は、エキソン１，２，３及び４の予想通りの存在を実証した。IL-4δ2 エキソン１−エキソン３スプライス接合部の領域における配列決定ゲルのオートラジオグラムが示されている。図４は、IL-4及びIL-4δ2 RNA の RNase防御を示す。IL-4エキソン１−エキソン３接合部を含む放射能標識付けされたIL-4δ2 プローブを精製し、活性化されたPBMC又は酵母tRNAからの未変性合計細胞RNA 15〜20μｇに対しハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成しなかった RNAを RNaseIIで消化し、防御された R NAフラグメントを６％の変性ポリアクリルアミドゲル内でサイズ分離し、オートラジオグラフィに付した。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２は精製されたIL-4δ2 プローブを示し、レーン３は活性化されたPBMCからの全細胞 RNAの防御を示し、レーン４は負の対照としてのtRNAの防御を示す。レーン２内の 342bpのバンドは防御された IL-4δ2 の RNAを表わし、ぼんやりした 279bpのバンドは防御されたIL-4の RNAを表わす。図５は異なる健康なドナー中の異なる比率のIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を示す。３人の健康な個体からのPBMCを６時間抗−CD3 MAb で刺激した。IL-4及び IL-4δ2 のmRNAの発現を、IL-4エキソン１及びエキソン４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRでテストした。５′−PCR オリゴヌクレオチドプライマーを³²Ｐで末端標識付けし、オートラジオグラムで増幅産物を検出できるようにした。次にRT-PCR増幅産物を６％のポリアクリルアミドゲル中でゲル電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムは、IL-4対IL-4δ2 mRNAの比率が、個体１では約２：１（レーン１）、個体２では１：１（レーン２）、個体３では１：２（レーン３）であることを示した。レーン４は分子量マーカーを含み、レーン４は負の対照RT-PCR産物を含む。図６は、ヒトＴ細胞クローンによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を示す。γ ／δ Ｔ細胞クローン GIL及びα／β CD4＋Ｔ細胞クローン CASを各々６時間抗 −CD3 mAb で刺激した。各クローンによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現について、IL-4エキソン１及びエキソン４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRでテストした。RT-PCR産物をアガロースゲルの臭化エチジウム染色により検出した。クローンGIL(レーン１)及びクローンCAS(レーン２)は両方共、異なる比率ではあるがIL-4及びIL-4δ2 のmRNAを産生した。図７は、活性化されたPBMCによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現の動態を示す。PBMCをOKT3 MAbで刺激し、表示の時点で RNAを抽出した。各々のクローンによるIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現について、IL-4エキソン１及びエキソン４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRでテストした。５′−PCR オリゴヌクレオチドプライマーを³²Ｐで末端標識付けした。RT-PCR増幅産物を６％のポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動に付した。ゲルのオートラジオグラムが示されており、ここでレーン１＝０時間、レーン２＝３時間、レーン３＝６時間、レーン４＝８時間、レーン５＝12時間、及びレーン６＝負の対照RT-PCR産物である。図８は、マウスがIL-4δ2 のmRNAを産生しないことを示す。BALB／ｃマウスからの脾細胞を24時間 PMA及びイオノマイシンで刺激した。 RNAを抽出し、マウス IL-4エキソン１−及びエキソン４−特異的プライマーを用いてRT-PCRに付した。ヒトIL-4エキソン１及びエキソン４に特異的なプライマーを用いて抗−CD3 MAb の刺激を受けたPBMCから並行してヒトIL-4及びIL-4δ2 のmRNAの発現を検定した。RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により検出した。IL-4δ2 ではなくIL-4のmRNA発現がマウス脾細胞内で観察され（レーン２）、一方ヒトPBMCはIL-4とIL-4δ2 のmRNAを両方共発現した（レーン２）。レーンＭは分子量マーカーを含んでいる。図９は、２つの IL-2 mRNA種の検出を示す。抗−CD3 MAb 、OKT3の刺激を６時間受けたヒトPBMCから全細胞 RNAを抽出し、次にヒトIL-2のエキソン１及び４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRに付した。パネルＡでは、５′PCR オリゴヌクレオチドプライマーを³²Ｐで末端標識付けさせており、RT -PCR増幅産物を６％のポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動に付した。２つのRT-PCR産物が同定された。パネルＢでは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりRT-PCR産物をサイズ分離し、ブロット法によりナイロン膜に移し、IL-2エキソン３特異的プローブ（第１のオートラジオグラム）又はIL-2エキソン２−特異的プローブ（第２のオートラジオグラム）でハイブリッド形成させた。レーンＭは各ゲル中の分子量マーカーを含んでいる。レーン１及び３はRT-PCR産物を含み、レーン２及び４は負の対照RT-PCR産物を含んでいる。２つのバンドはエキソン３に特異的なプローブでハイブリッド形成し（第１のオートラジオグラム）、一方さらに大きいバンドのみがエキソン２に特異的なプローブでハイブリッド形成した（第２のオートラジオグラム）。パネルＣに示された類似の実施態様においては、RT-PCR 産物を、IL-2エキソン１／エキソン３接合部特異的プローブでハイブリッド形成した。レーンＭは分子量マーカーを含み、レーン２はRT-PCR産物を含んでいる。２つのバンドがこのプローブでハイブリッド形成し、より大きいバンド（未変性 IL-2）に比べたより小さなバンド(IL-2δ2)の相対的強度は、パネルＡ又はＢで見られるものよりもはるかに大きいものであった。図10は、IL-4遺伝子（配列番号23）の完全な配列を示す（Arai et al，J.Immu nol.，第 142巻 p0274〜p0282(1989)）。本発明のIL-4δ2(配列番号24)は、エキソン１，３及び４によりコードされるがエキソン２にはコードされない配列を含む。図11は、IL-2遺伝子の完全な配列を示す(配列番号25)(Fujita et al，Proc.Na tl.Acad.Sci．第80巻 p7437〜7441(1983))。本発明のIL-2δ2(配列番号26)は、エキソン１，３及び４によりコードされるもののエキソン２にはコードされない配列を含む。発明の好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、交互スプライシングによってIL-4遺伝子から転写される第２のmRNA イソ型タンパク質であるIL-4δ2 の発現を実証するものである。交互スプライシングは、多数のイソ型タンパク質を単一の遺伝子座から生成できる効率の良いメカニズムである。この調節メカニズムにより生成されるイソ型タンパク質は、機能、細胞局在化又は発生上の発現パターンに関してさまざまである可能性がある。(Smith et al．(1989)Annu.Rev.Genet．23：527)。交互スプライシングは、細胞の遺伝的内容を変えることなくタンパク質の発現を可逆的に修飾するために末端分化した細胞内で使用される(Smith et al．(1989)Annu.Rev.Genet．23：527)。 IL-4δ2 はまず最初に、サイトカイン遺伝子発現の分析中に付加的なRT-PCR増幅産物として観察された。cDNAのクローニング及び配列決定により、IL-4δ2 が IL-4遺伝子のエキソン１，３及び４から成るもののエキソン２では構成されていないことが実証された。エキソン１からエキソン３へのスプライシングは、読取り枠を変えることなくIL-4δ2 内で起こる：エキソン１及び３は、 IL-4 mRNAによって使用されるものとは異なるスプライス供与体又は受容体部位を用いることなくスプライス接合部において直接相対している。エキソン２が削除されること以外、IL-4δ2 及びIL-4のmRNAを比較した時点で全タンパク質コーディング領域内にはその他の変化は全く見られない。今日まで、テストされた全ての人間がIL -4及びIL-4δ2 のmRNAを両方共発現している。IL-4及びIL-4δ2 のmRNAは両方共、Ｔ細胞活性化と共に増大し、IL-4：IL-4，δ2 のmRNAの比率は増大する。場合によってはわずかな健康な人間が IL-4 mRNAよりも多くのIL-4δ2(mRNA)を発現したが、この発見事実はこれらの同じ個体において経時的に維持されなかった。本発明は同様に、外部事象がIL-4対IL-4δ2 のmRNAの比率を変更しうるということをも実証している。本発明のIL-4δ2 は、あらゆるヒト免疫細胞から、好ましくは末梢血単核細胞（PBMC）及びＴ細胞から単離され得る。ヒトドナーから得た細胞は、当該技術分野において既知のあらゆる方法を用いて、つまり好ましくは密度勾配遠心分離法により、そして好ましくは Histopagueといった（ただしこれに限られるわけではない）培地を用いて、血液及びその他の細胞から分離できる。Ｔ細胞サブセット、好ましくはCD4⁺ α／β Ｔ細胞及びγ／δ Ｔ細胞を含む適切な表面マーカーを伴った細胞を、このような細胞サブセットを分離するための当該技術分野における既知の任意の技術を用いて分離することが可能である。特に好ましい方法は、特異的モノクローナル抗体を介しての正の選択を用いることである。特に好ましいモノクローナル抗体としては、CD4 に特異的な抗−Le u3a 及びＶδ１−Ｊδ１及びＶδ１−Ｊδ２に特異的なδTCS1がある。細胞に対する MAbの結合に続いて、分離培地にカップリングされているか又はビオチン−アビジンリンケージなどといった特殊なリンケージを介して分離培地にカップリングされ得る第１の抗体に特異的な第２の抗体を用いて、細胞を処理することができる。本発明にとって特に好ましいのは、Dynabeads M-450（Dynal ）といった支持体にカップリングされたヒツジ−抗マウス IgGである。細胞は、ひとたび分離されると、マイトジェン、成長因子及び／又は養育細胞の存在下でクローニングされる。好ましいマイトジェンとしては、1 −100 μｇ／ml好ましくは10μｇ／mlの濃度のフィトヘマグルチニン(PHA)があるがこれに限られるわけではない。好ましい成長因子としては、1 −100 Ｕ／ml好ましくは約50Ｕ／mlの濃度のIL-2があるが、これに限られるわけではない。好ましい養育細胞には、好ましくは1000−10,000ラド、好ましくは約3000ラドで照射された同種異系PBMCがあるが、これに限られるわけではない。細胞は同様に、Ｔ細胞の増殖を刺激しうるハイブリドーマ細胞系統、好ましくはOKT3からの上清で処理することもできる。細胞は任意の適切な培地内で成長させることができるが、RPMIが好ましい。培地には好ましくは、ヒト血清好ましくはヒト男性AB血清及び／又はウシ胎児血清(FCS)といった血清が補足される。血清含有量は3 〜12％、最も好ましくは全血清の10％である。ヒト男性AB血清及び FCSを最も好ましくは各々5 ％ずつの混合で組合せて用いることが、特に好ましい。その後、細胞を、好ましくはマイトジェン、養育細胞及び成長因子での隔週の刺激によって拡張させる。表面マーカーの発現は、フローサイトメトリー、螢光活性化セルソーター (FACS)、免疫組織化学などを用いて確認することができる。好ましくは、細胞は標準的な技術を用いてFITC接合抗体で処理される。 RNAは当該技術分野において既知のあらゆる手段、好ましくはチオシアン酸グアニジニウムを用いて、細胞から抽出され得る。次に既知の方法を用いて好ましくは M-MLV逆転写酵素及びランダムヘキサマープライマーでcDNAへと RNAを逆転写することができる。 RNAの逆転写により生成されたcDNAをこのとき、さらなる使用のために増幅させることができる。このような増幅スキームにはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)及びその変形態様が含まれるが、それらに制限されるわけではない。このような手順のための条件は、当該技術分野において周知のものである。このようにして生成された増幅産物を次に、当該技術分野において周知のものであるあらゆる技術により分離することができる。特に好ましい方法は、アガロースゲル上の分離及びDEAE紙上への産物の電気溶出とそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によるものである。このとき、分離され増幅された DNAを配列決定のために適したベクターへと連結させ、コンピテント細胞へと形質転換させ、そこから DNAを調製することができる。このようなプラスミドの分離は、当該技術分野において周知の技術によるものである。このとき、 Maxam-Gilbert 配列決定を含む当該技術分野において既知の方法を用いて、又は好ましくはSang er et alのジデオキシチェーンターミネーション反応によって、 DNAインサートを配列決定することができる。問題の RNAは、当該技術分野において既知のあらゆる手段を用いて同定できるが、特に好ましいのは、 RNA防御検定である。この方法に従うと、問題の RNAに結合することになる放射能標識付けされたプローブが作られる。放射能標識付けされたプローブは全細胞 RNAを用いてインキュベートされ、ハイブリッド形成しなかった RNAは RNaseを用いて消化される。問題の RNAに対する標識づけされたプローブのハイブリダイゼーションの時点で、問題の RNAは RNaseから防御され、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動及びそれに続くオートラジオグラフィにより同定され得る。同様にして、問題の DNAをアガロースゲル上で泳動させ、ゲル上の核酸をナイロン又はニトロセルロース膜に移し、 DNAの特徴づけを助けるプローブで膜をハイブリッド形成させるサザンブロット法によって、調製されたcDNAを特徴づけすることができる。本発明にとって特に好ましいのはインターロイキンのエキソン／エキソン接合部に広がるプローブである。このようなプローブは、このとき、交互スプライス突然変異体を同定することができる。上述の方法は、さまざまなドナー及びそれから得られたさまざまな細胞内の発現を検出する上で使用するのに適したものである。さらに、スプライス変異体が細胞の刺激の時点で野生型ポリペプチドと同じ程度まで発現されるか否かを見極めるため発現の動態を分析することができる。本発明の交互スプライス変異体は、制限的な意味をもたない例として（１）アナフィラキシーショック、ぜん息及び湿疹を含む（ただしこれらに限られるわけではない）アレルギー反応；（２）リーシュマニア症を含む（ただしこれに限られるわけではない）感染症、及び後天性免疫不全症候群（AIDS）に対するヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗体陽性からの臨床的移行の遅延；（３）全身性硬化症及び糖尿病を含む（ただしこれらに限られるわけではない）自己免疫障害；（４）過剰はん痕組織形成、過剰細胞外基質形成、過剰創傷治癒、及び熱傷治療を含む（ただしこれに限られるわけではない）繊維形成疾患、並びに（５）内皮細胞が関与する障害（IL-4がこのような細胞の形態を変えることが立証されているため）が挙げられるさまざまな条件を治療するのに使用することができる。さらに本発明のスプライス変異体は、全長ポリペプチドの過剰発現から発生するあらゆる条件の治療においても有用であり得る。本発明は、IL-4プライマーによるRT-PCRを用いて第２のバンドを増幅するばかりでなく、独立した１つの方法すなわち RNase防御検定を用いて第２のバンドが IL-4に関係していることも実証する。本発明は又、分子がエキソン２の削除を除いてIL-4と同一であることを決定的に示すため、全タンパク質コーディング領域についての配列データも提供する。本書に開示された配列データは、IL-4エキソン２がカセットエキソンとして機能すること(Smith et al．(1989)Annu.Rev.Genet. 23：527)、そしてそれが削除されたときに読取り枠中でいかなるシフトも起こらないことを示している。 RNa se防御検定は、防御のためにアンチセンスプローブが用いられたことから、IL-4 δ2 写しがIL-4写しと同じセンス配位で発現されることを実証している。同様に決定されたのは、エキソン２の交互スプライシングが IL-4 mRNAに独特のものであるか又はサイトカインにとってのより一般的な調節メカニズムの一部であるのかということである。テストされたサイトカインは、IL-4とタンパク質折りたたみモチーフ、ゲノム組織及びレセプタ細胞外結合ドメインを共有するIL-2，-3，-5及びGM-CSFであった(Bovlay et al．(1992 )J.Biol.Chem．267 ：20525)。本発明は同様に、IL-2もエキソン２の交互スプライシングを使用するもののIL-3，IL-5又はGM-CSFはこれを使用しないことも実証している。IL-2及びIL-4のスプライス変異体は両方共エキソン２を削除し、これらは二次構造の類似の領域をコードし、各々の分子についてのレセプタ結合に参与する。交互スプライシングは、人間において、細胞上のレセプタの数及びタイプに応じて未変性サイトカインのアゴニスト又はアンタゴニストとして機能するIL-4及びIL-2の変異体を提供するのに使用することができる。規定のアミノ酸置換（57 ）を伴うIL-2分子に対する類推によると、IL-2δ2 はなおも中間親和力のIL-2R( β／δ鎖)に結合し、細胞応答を発生させることになる。α鎖に結合する能力の喪失が高親和力三分子α／β δ複合体を通して細胞を活性化するIL-2δ2 の能力を低下させる場合、その原因は、この複合体の構築の無効な開始又は低減のいずれかにある。このような場合IL-2δ2 は、高親和力 IL-2Rを通してのIL-2の活性化の競合的阻害物質である。同様にして、 IL-4Rは、低い方（従来の IL-4R鎖単独）及び高い方（従来の IL-4R鎖プラスδＣ）の親和力をもつ少なくとも２つの形態を有する(Russell et al．(1993)Science 262 ：1877)(Kondo et al．(19 93)Science 262 ：1874)。IL-4δ2 は従来の IL-4R鎖に結合し、低い方の親和力の IL-4Rを通してアゴニストとして役立ち、しかもなお、従来の IL-4R鎖及びδ Ｃのヘテロダイマー化を遮断することにより高親和力 IL-4Rを通しての細胞活性化を拮抗することになる。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応及び RNase防御検定の両方を用いて、 IL-4 mRNAの第２の種を同定することができる。この新しい IL-4 mRNAは、 IL-4 mRNA よりも、IL-4エキソン２のサイズである48塩基対だけ小さい。クローニングされたcDNAの配列データは、この変異体がIL-4エキソン１，３及び４を含み、エキソン１が１つの読取り枠内でエキソン３に直接スプライシングされていることを実証している。IL-4δ2 と呼ばれるこの変異体の全タンパク質コーディング領域は、エキソン２が削除されている点を除いてIL-4と同一である。IL-4δ2 のmRNAは、テストされた全てのヒトPBMC及びＴ細胞クローン内で検出されるが、マウス脾細胞には存在しない。IL-4及びIL-4δ2 のmRNAの両方の量が、Ｔ細胞の活性化時点で増大するが、 IL-4 mRNAはIL-4δ2 mRNAよりも大幅に増大する。同様の実験は、エキソン２が交互スプライシングによって欠失させられているIL-2のmRNAの変異体をもヒトが発現するということを示唆している。ヒトIL-3，IL-5及びGM-C SFはエキソン２を欠失させるのに交互スプライシングを使用しない。かくして、 mRNAの交互スプライシングにより各分子の類似の構造的領域が削除されているような、ヒトIL-4及びIL-2の両方の変異体が存在する。発明の好ましい実施態様をさらに詳細に例示する目的で、以下の例を紹介する。しかしながらこれらの例は、いかなる形であれ、本発明の広い範囲を制限するものとしてみなされるべきものではない。例１細胞の分離及びＴ細胞クローニング Histopague 1077(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)を用いて密度勾配遠心分離により、健康なドナーからヒトPBMCを分離した。CD4 に特異的な MAb抗Leu3 a（Becton Dickinson，Mountain View， CA）、及びＶδ１−Ｊδ１−（36）及びＶδ１−Ｊδ２−（Konig et al.(1989) Eur.J.Immunol．19：2099）でコードされたエピトープを用いて、正の選択を通してヒトPBMCからCD4 ＋α／β Ｔ細胞クローン CaS、及びγ／δ Ｔ細胞クローン GILを分離した。次に続く、Dynabeads M-450(Dynal Inc.，Great Neck，NY )にカップリングされたヒツジ抗マウス IgGでの処理及び磁気ビーズ分離をメーカーの指示に従って実施した。 10μｇ／mlのPHA(Sigma Chemical Co.)、50Ｕ／mlのγヒトIL-2(Hoffman-La R oche Inc.，Nutley，NJ)及び養育細胞としての照射済み（3000ラド）同種異系PB MCの存在下で、限界希釈法により、正に選択された細胞を直ちにクローニングした。完全組織培地は、５％の熱不活性化されたヒト男性AB血清、５％の熱不活性化されたＦCS、10mMの Hepes、pH 7.4、2 mMのＬ−グルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウム、 0.1mMの非必須アミノ酸混合物、5 ×10^ー5Ｍの2-ME及び5 μｇ／ mlの硫酸ゲンタマイシンを含む RPMI-1640であった。Ｔ細胞クローンを、 PHA及び付加的養育細胞での隔週の刺激により2 mlの培養内で拡張させた。同じ濃度の付加的なγヒトIL-2を4 日に一度添加した。標準的な技術を用いFITC接合された Leu3a MAb又はFITC接合されたδTC S1 MAb 及びPE接合された抗ヒトLeu-4（CD3 ）MAb(Becton Dickinson)での２色フローサイトメトリ分析を用いて、それぞれＴ細胞クローン CAS及び GILによるCD4 及びＶδ１の発現を確認した。例２Ｔ細胞刺激抗 CD3 MAb分泌ハイブリドーマOKT3(American Type Culture Collection，Roc kville，MD)の上清で最終濃度10％となるまで補足された完全組織培地中の2 ml の培養内で、PBMC(5 ×10⁶)又は5 ×10 ⁶ のクローニングされたＴ細胞と 2.5×10⁶ の照射（3000ラド）された同種異系P BMCを刺激した。OKT3上清のこの濃度は、以前に、Ｔ細胞増殖を最適に刺激するものであることが以前に確認されている。例３ RNAの分離とRT-PCR 酸性チオシアン酸グアニジニウム−フェノールクロロホルム抽出により、PBMC 、Ｔ細胞クローン及びBALB／ｃ脾細胞から全細胞 RNAを単離した（Chomczynski et al．(1987)Anal.Biochem．162，156）。65℃で5 分間１μｇの RNAを変性させ、次に、 200Ｕの M-MLV逆転写酵素（Bethesda Research Labs（BRL），Bethe sda，MD）、50mMのトリス−HCl 、pH 8.3、75mMの KCl、8 mMの DTT、3 mMの Mg Cl₂、各々 0.5mMのdATP，dCTP，dGTP，dTTP(Pharmacia LKB Biotechnology，Pis cataway，NY)、１Ｕ／mMのRNasin（Promege，Madison，WI）及びランダムヘキサマープライマー(BRL)を含む15μＭの反応混合物を用いて、cDNAへと逆転写させた。この反応混合物を１時間37℃でインキュベートした。2.5μｌのcDNA混合物、50mMのトリス−HCl 、pH 8.8、50mMの KCl、4 mMの MgCl₂、各々 0.2mMのdATP ，dCTP，dGTP，dTTP、各々 0.4mMの３′及び５′PCRオリゴヌクレオチドプライマー、及び0.625Ｕの Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)を含む25μｌの PCR反応混合物を作った。５′PCR オリゴヌクレオチドプライマーを、 USBプロトコルに従って、〔γ−³²Ｐ〕−ATP（Amersham Corporation，Arlin gton Heights，IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ〔United States Bioche mical(USB)，Cleveland，OH〕で５′末端標識づけをした。 PCR混合物を以下の通りに増幅させた：すなわち、95℃で30秒間の変性、2 分間60℃でのプライマーアニーリング及び３分間72℃でのプライマー伸長（15〜30サイクル）とそれに続く最後の７分間の72℃での伸長。10回の PCR産物を、 2.5％のアガロース又は６％のポリアクリルアミドゲルを通してゲル電気泳動に付した。 RNAに代わって H₂Oが添加されたモック逆転写酵素反応の産物を、全ての実験において負の対照増幅として用いた。これらの実験の中で用いた PCRオリゴヌクレオチドプライマー対は、ヒトIL-2 エキソン１順方向５′−ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT−３′〔配列番号１〕及びエキソン４逆方向５′GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC−３′〔配列番号２〕；ヒトI L-3エキソン１順方向５′TCCTGCTCCAACTCCTGG−３′〔配列番号３〕及びエキソン４逆方向５′−GCTCAAAGTCGTCTGTTG−３′〔配列番号４〕；ヒトIL-4対Ａエキソン１順方向５′−TCTTCCTGCTAGCATGTGC−３′〔配列番号５〕及びエキソン４逆方向５′−CGTACTCTGGTTGGCTTTCC−３′〔配列番号６〕−ヒトIL-4対Ｂエキソン１順方向５′−AAGCTTATGGGTCTCACCTCCCAAC−３′〔配列番号７〕及びエキソン４逆方向５′−GGATCCTCATCAGCTCGAACACTTTGA−３′〔配列番号８〕；マウスI L-4エキソン１順方向５′−AGCCATATCCACGGATGCGAC−３′〔配列番号９〕及びエキソン４逆方向５′−CTCAGTACTACGAGTAATCCAT−３′〔配列番号10〕；ヒトIL-5 エキソン１順方向５′−CTTTTTGCAAAAGCCTTGGCCTCCAAAAAAGC−３′〔配列番号11 〕及びエキソン４逆方向５′−CCATTCTCCGCCCCAAGGCTGACTAATTTTT−３′〔配列番号12〕；ヒトGM-CSFエキソン１順方向５′−ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTC−３′ 〔配列番号13〕及びエキソン４逆方向５′TCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCA−３′〔配列番号14〕；及びヒト IFN−γ順方向５′CAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCT−３′〔配列番号15〕及び逆方向５′−TGCTCTTCGACCTTGAAACAGCAT−３′〔配列番号16〕であった。BamHＩ及びHindIII制限酵素認識配列は、ヒトIL-4対Ｂプライマの中で下線がほどこされている。 IL-2，IL-4及び IFN−γのcRNA内部標準の構築については、本書にその全体が参考として内含されている Alms，W.J．et al.の中で記述されている。例４ RT-PCR産物のクローニング及び DNA配列決定 IL-4及びIL-4δ2 に対する相補的 DNAを生成し、BamHＩ及びHindIII制限エンドヌクレアーゼのための消化部位を含むIL-4エキソン１及び４に特異的なプライマを用いてRT-PCRにより増幅した。IL-4及びIL-4δ2 についての増幅産物をDEAE 紙を用いて 2.5％のアガロースゲルから分離した(本書にその全体が参考として内含されているSambrook，J．et al．(1989)「分子クローニング；実験室マニュアル」Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。２回のフェノール／クロロホルム抽出の後、cDNA産物を pCR^TMIIベクター（Invitrogen Corp，San Diego，CA）内へ連結させ、次にメーカーの指示に従って INVαＦ′コンピテント細胞を形質転換するためにこれを用いた。IL-4及びIL-4δ2 のcDNAインサートを含むプラスミドを従来の技術によって分離し(本書にその全体が参考として内含されているSambrook，J et al.(1989)「分子クローニング；実験室マニュアル」Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)、これを配列分析において使用した。IL-4δ2 cDNAインサートを、Ｍ13（−20）順方向プライマ（５′−GT AAAACGACGGCCAGT−３′〔配列番号17〕及び Sequenase^TM(USB)を用いて、ジデオキシ媒介のチェーンターミネーション法（本書にその全体が参考として内含されているSanger et al．(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463）によって配列決定し、７％のLong Range^TM(AT Biochem，Malvern．PA)ゲル内での電気泳動により分析した。その後、 RNase防御検定のために、 Taqポリメラーゼにより誘発された配列エラーの無いIL-4 及びIL-4δ2 cDNAを用いた。例５ RNase防御検定エキソン１−３接合部を伴ってIL-4エキソン１からエキソン４まで広がる 362 bpのIL-4δ2 RT-PCRフラグメントを pCR^TMIIベクター内にクローニングした。配列分析によりインサートの配位を決定した。メーカーのプロトコルに従ってAmbi on RPAII^TM（Ambion Inc.,Austin，TX）を用いて RNase防御検定を行なった。簡単に言うと、 100ngの SpeＩ線形化されたIL-4δ2 を含有するプラスミドを、５ユニットのT7 RNAポリメラーゼ(BRL)、各々 0.5mMのATP，CTP及び GTP、12μＭの UTP及び６μＭの 400Ci／mmolの５′〔α＝³²Ｐ〕−UTP(Dupont NEN，Boston ，MA)と45分間37℃でインキュベートすることによって、放射能標識付けされたI L-4δ２プローブを生成した。IL-4δ２プローブの最終的比活性は、１×10⁹cpm ／μｇ DNAであった。放射能標識付けされたプローブを６％の変性ポリアクリルアミドゲルの中でのゲル電気泳動に付し、全長IL-4δ2 プローブをオートラジオグラフィによって同定した。プローブを含むバンドをゲルから切除し、２Ｍの酢酸アンモニウム、１％の SDS及び25μｇ／mlの酵母トランスファRNA(tRNA)を含む 400μｌの緩衝液中で37℃でIL-4δ2 プローブを溶出した。80％のホルムアミド、40mMの PIPES、pH 6.4、 400mMのNaCl及び１mMのEDTA緩衝液の中で37℃で16 時間15〜20μｇの変性全細胞 RNA又はtRNAを用いて、放射能標識付けされたIL-4 δ2 プローブ (１×10⁶cpm) をハイブリッド形成させた。4000Ｕ／ml RNase Tl （BRL）を含む 200μｌの RNase消化緩衝液(Ambion Inc.)を用いて30分間30℃で、ハイブリッド形成されていない RNAを消化した。 RNaseを不活性化させ、防御された RNAフラグメントを６％の変性ポリアクリルアミドゲル内でサイズ分離し、オートラジオグラフィに付した。ヒトPBMC内のIL-4δ2 mRNAの存在を確認するため RNase防御分析を使用した。エキソン１−エキソン３スプライス接合部を含むIL-4エキソン１，３及び４を含む 464bpのIL-4δ2 プローブを放射能標識付けした。このプローブはIL-4δ2 mR NAの 342bpのフラグメント〔エキソン１のヌクレオチド＋136 〜＋198 及びエキソン３及び４のヌクレオチド＋247 〜＋525 〕とハイブリッド形成しこれを防御すると予想される。さらに、このプローブは、IL-4δ2 及びIL-4がエキソン１，３及び４を共有することから、 IL-4 mRNAのエキソン１の63bpのフラグメント〔ヌクレオチド＋136 〜＋198 〕及び IL-4 mRNAのエキソン３及び４の 279bpのフラグメント（ヌクレオチド＋247 〜＋525 〕を防御するはずである。抗−CD３刺激PBMCからの全細胞 RNAの RNase防御により、IL-4δ2（342bp）及びIL-4(279bp 及び63bp)のフラグメントの両方の存在が確認された（図４）。例６オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアガロースゲル電気泳動によりRT-PCR増幅産物をサイズ分離した。30分間、各々、変性溶液(1.5ＭのNaCl、 0.5ＭのNaOH)及び中和溶液(1.5ＭのNaCl、１Ｍのトリス−HCl 、pH 7.4)内で30分間、ゲルを順次浸漬させた。次に20×SSC 緩衝液内で一晩ブロッティングすることによりナイロン膜にRT-PCR増幅産物を移した。紫外線照射により膜に対して DNA試料を架橋結合させた。42℃で少なくとも１時間、６×SSC 、10×Denhardt溶液、 0.1％の SDS及び50μｇ／mlの精液 DNAの中で膜を予備ハイブリダイゼーションに付し、次に６×SSC 及び１％のSDS内で4 9℃で 0.2μｇの³²Ｐ５′末端標識づけされたオリゴヌクレオチドプローブで一晩ハイブリッド形成させた。10分間室温で６×SSC 及び１％の SDSの中で３回、膜を洗浄し、その後最終的に49℃で洗浄した。次に、膜を Phosphor Imager分析(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)に付すか又はオートラジオグラフィに付した。サイトカイン特異的オリゴヌクレオチドプローブの配列は、ヒトIL-2エキソン２特異的５′−CTCACCAGGATGCTCACA−３′〔配列番号18〕；ヒトIL-2エキソン３特異的５′−CCTCTGGAGGAAGTGCTA−３′〔配列番号19〕；ヒトIL-3エキソン１／エキソン３接合部特異的５′−CCTTTGCTGGAAAATAACC−３′〔配列番号20〕；ヒトIL-5 エキソン１／エキソン３接合部特異的５′−GCCAATGAGCACCAACTG−３′〔配列番号21〕及びヒトGM-CSFエキソン１／エキソン３接合部特異的５′−GCTGAGATGGAG CCGACC−３′〔配列番号22〕であった。テストされた全ての供与体から２つの IL-4 mRNA種が検出された（図１）。大きい方の IL-4 RT-PCR増幅産物は 362bpで、これは IL-4 mRNAの予想されたサイズに対応していた。IL-4δ2 と呼ばれる第２の小さい方のRT-PCR増幅産物は、 3 14bpの見かけのサイズで移動した。 PCR緩衝液のMgCl濃度、プライマーアニーリング温度、及びIL-4エキソン１−及び４−特異的 PCRプライマーの対を変更することで小さい方のRT-PCR産物を削除することはできなかった（データ図示せず）。全細胞 RNAがRT-PCRに付された時点での小さい方の 314bpのフラグメントの一貫性ある発現及び IL-4 cRNAが同様にRT-PCRに付された時点の対応する産物の欠如（図１）は、このフラグメントがIL-4遺伝子写しの交互スプライシングの結果としての特異的RT-PCR増幅産物であることを示唆していた。IL-4遺伝子は４つのエキソンと３つのイントロンを内含する(Arai et al．(1989)J.Immunol．142 ： 274)。 IL-4 mRNAのRT-PCR産物とIL-4δ2 のRT-PCR産物の間の見かけのサイズ差は48bpであった。これはIL-4エキソン２のサイズである。 314bpのIL-4δ2 のRT -PCR産物がIL-4エキソン２を内含せず一方大きい方の 362bpのIL-4のRT-PCR産物がこれを含んでいたかどうかをテストするため、それぞれIL-4エキソン２及び３を消化するHincII及び P stＩで両方の産物を消化させた。HincIIはIL-4のRT-PCR産物を分割したが、IL-4 δ2 のRT-PCR産物を未消化のままに残した（図２）。これとは対照的に、 PstＩはIL-4及びIL-4δ２の両方のRT-PCR産物を分割した（図２）。例７ IL-4δ２の配列分析次にIL-4及びIL-4δ2 のRT-PCR増幅産物を pCR^TMIIベクター内にクローニングさせ、その DNA配列を決定した（図３）。IL-4δ2 cDNAの配列分析は、エキソン１が直接エキソン３にスプライシングされた状態で、IL-4エキソン１，３及び４の存在を実証した。IL-4δ２cDNAと並行して分離、クローニング及び配列決定されたIL-4のcDNAの配列分析は、エキソン２〜エキソン３の枠内スプライス接合部を伴って、エキソン１，２，３及び４が予想通り存在することを実証した。IL-4 及びIL-4δ2 が両方共、それぞれエキソン２−エキソン３及びエキソン１−エキソン３スプライスにおいて gaa残基５′を含むことに留意されたい。IL-4δ2 の全タンパク質コーディング領域を通して、その他の配列変更は全く見られなかった。例８健康な人間及びヒトＴ細胞クローン内のIL-4δ2 のmRNAの発現 25名の健康な人間からのPBMC内で、IL-4及びIL-4δ2 のmRNA発現を分析した。 IL-4及びIL-4δ2 のmRNAは、テストした供与体全ての中で同時発現されたが、相対比は個体によって異なっていた。この可変性の例が図５に示されている。この実験においては、３人の個体からのPBMCを６時間抗−CD3 MAb で刺激した。IL-4 対IL-4δ2 のmRNAの相対的発現を、 PCR産物が対数的に増幅された条件を用いて RT-PCRにより測定した（25サイクル）。IL-4：IL-4δ2 のmRNAの比率は、個体１における約２：１から個体３における１：２まで変動した。個体２はほぼ等量の IL-4及びIL-4δ2 のmRNAを発現した。IL-4δ2 mRNAに比べて高いか又は等しいレベルのIL-4の発現が優勢な表現型であり、16：１から１：１の範囲で、テストした25人の個体のうち22人に存在した。しかしながら３人の個体が、少なくとも１回、IL-4のmRNAよりも高いIL-4δ2 のmRNAを発現した。Ｔ細胞がPBMCの中のIL-4δ2 mRNA発現源であったことを確認するため、クローニングしたＴ細胞をテストした。α／β CD4＋Ｔ細胞クローン CAS及びα／β Ｔ細胞クローン GILを各々６時間、抗 CD3 MAbで刺激した。クローニングされたＴ細胞は両方共IL-4及びIL-4δ2 のmRNAを産生した（図６）。例９ IL-4δ2 発現の動態抗−CD3 MAb によるＴ細胞の刺激の結果IL-4及びIL-4δ2 のmRNAレベルの両方がアップレギュレーションを受けるか、並びにIL-4δ2 のmRNAがIL-4のmRNAと独立して調節されるかを見極めるために実験が行なわれた。PBMCをOKT3 MAbで刺激し、異なる時点でIL-4δ2 のmRNA対IL-4のmRNAの比率を測定した（図７）。IL-4 δ2 及びIL-4のmRNAは両方共これらのPBMC内で自発的に発現され、この特定の実験においてIL-4のmRNAはIL-4δ2 のmRNAの 3.5倍であった。IL-4及びIL-4δ2 の mRNAは両方共PBMC活性化と共に増大したがIL-4のmRNAはIL-4δ2 のmRNAよりもさらに増大した。８時間目で、IL-4δ2 のmRNAに比べ７倍のIL-4のmRNAが存在していたが、12時間目までに比率はベースラインに戻った。24時間目及び48時間目で、 IL-4 mRNA対IL-4δ2 mRNAの比率は、約４対１のベースラインにとどまっていた（データ示さず）。例 10 マウス内のIL-4δ2 のmRNAの不在。ヒト及びマウスのIL-4遺伝子は各々、共に48bpのエキソン２を伴って、４つのエキソンと３つのイントロンで構成されている。マウスが、エキソン２が欠失した状態でIL-4の交互スプライシングされた変異体を同様に発現するか否かを決定するため、BALB／ｃマウスからの脾細胞を24時間 PMA及びイオノマイシンで刺激した。 RNAを抽出し、マウスのIL-4エキソン１−及びエキソン４に特異的なプライマを用いてRT-PCRに付した。抗−CD3 MAb で刺激されたPBMCから並行してヒト IL-4δ2 のmRNAの発現が検定された。刺激を受けたマウス脾細胞内ではIL-4のmR NAの発現が見られたがIL-4δ2 のmRNAの発現は見られず、一方ヒトPBMCは、IL-4 及びIL-4δ2 の両方がmRNAを発現した（図８）。例 11 ヒトIL-2のmRNAについてはエキソン２の交互スプライシングが見られるがヒト IL-3，IL-5及びGM-CSPのmRNAについては見られない。 IL-4はサイトカインの多重遺伝子族に属することから、エキソン２が欠如している変異体を産生するのに交互スプライシングが使用されるか否かを決定するべく、IL-2，IL-3，IL-5及びGM-CSFのmRNAを検査した。抗−CD3 MAb OKT3で６時間刺激したヒトPBMCから分離した全ての RNAを問題のサイトカインのためのエキソン１及びエキソン４特異的 PCRプライマーを用いてRT-PCR増幅に付した。IL-2について２つのRT-PCR増幅産物が同定された（図９Ａ）。大きい方の増幅産物は 4 58bpでありこれは、未変性 IL-2 mRNAのサイズに対応していた（Fujita et al． (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：7437）。小さい方の増幅産物は約 398bpであり、これはエキソン２を削除したIL-2の交互スプライシングされた変異体と一貫性あるサイズであった。IL-2についての発見事実とは対照的に、IL-3，IL-5、及びGM-CSFについては各々１つのRT-PCR増幅産物しか同定されなかった（データ図示せず）。エキソン２が関与する交互スプライス変異体の存在についてさらにテストするため、 IL-2 RT-PCR産物をゲル電気泳動により分離し、ナイロン膜に移送し、IL -2エキソン２又はエキソン３特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成させた。２つの IL-2 RT-PCR産物がIL-2エキソン３特異的オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成した（図９Ｂ）。これとは対照的に、小さい方の 398bpの産物はエキソン２特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成せず、一方、より大きな 458bp産物はハイブリッド形成した。このことはすなわち、小さい方の 398bpの産物がエキソン２の欠如したIL-2の交互スプライス変異体であることを示唆している。全ての実験においてIL-2δ2 ：IL-2のmRNAの比率は IL-4δ2 ：IL-4のmRNAの通常の比率よりはるかに低く、IL-2δ2 のmRNAを検出し難いものにしていた。IL-2δ2 のmRNAの検出を改善するため、RT-PCR産物をIL-2 エキソン１／エキソン３接合プローブでハイブリッド形成させた（パネルＣ）。プローブの各部分はエキソン１又はエキソン３と相同であったことから、オートラジオグラム上で大きい方の 458bpバンドとして、未変性 IL-2 cDNAをこのプローブで検出した。しかしながら、このプローブがエキソン１／エキソン３接合部を含んでいたことから、IL-2δ2 のmRNAは、小さい方の 398bpのバンドとして容易に識別された。類似の研究において、IL-3，IL-5及びGM-CSFについてのRT-PCR産物を電気泳動によりサイズ分離し、ナイロン膜へ移送し、それぞれIL-3，IL-5及びGM-CSFについてエキソン１／エキソン３接合配列をコードするオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成させた。いかなるRT-PCR産物も、IL-3，IL-5又はGM-CSFエキソン１／エキソン３特異的プローブでハイブリッド形成しなかった（データ示さず）。例 12 IL-4δ2 タンパク質に特異的なウサギ抗血清合成16-merペプチドLNSLTEQKNTTEKETF（配列番号27）を作った。このペプチドは、IL-4δ2 内のエキソン１−エキソン３接合部に特異的であり、IL-4内には存在しない。このペプチドを、MAPs樹脂へのカップリングを通して多量体にした。２匹のウサギを免疫化し追加免疫するのに、精製された多量体ペプチドを用いた（合計３回の注射）。各々のウサギからの免疫化前血清ではなく免疫化後血清は、ウェスタンブロット法においてIL-4δ２合成ペプチドを結合するものの、組換え型ヒトIL-4又はIL-2を結合しない。例 13 IL-4δ2 タンパク質の存在についての活性化されたヒトＴ細胞クローンからの上清の分析活性化されたヒトＴ細胞クローンからの上清を獲得し、その中のタンパク質を SDS-PAGE上に走らせた。SDS-PAGEにより分離されたタンパク質上の例12で得られた抗血清を用いて、ウェスタンブロットを実施した。IL-4δ2 −特異的抗血清が、テストしたすべてとはいわないまでも一部の上清上に見られるIL-4δ2 に結合した。本発明についてさまざまな特異的材料、手順及び例を基準にして本書で記述及び例示してきたが、本発明は、その目的で選択された特定の材料組合せ及び手順に制限されるものでない。当業者であれば評価できるように、このような詳細の数多くのバリエーションが関与する可能性もある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹＣ０７Ｈ 21/04 ＡＣＤＣ０７Ｋ 14/54 ＡＤＤ 16/24 ＡＤＳＣ１２Ｎ 1/21 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホワイト，バーバラアメリカ合衆国，メリーランド 21042, エリコットシティ，ロックミードウドライブ 9316

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトインターロイキン−４のエキソン１，３及び４を含んで成る単離した核酸。２．核酸が RNAである、請求の範囲第１項に記載の単離した核酸。３．核酸が DNAである、請求の範囲第１項に記載の単離した核酸。４．請求の範囲第３項に記載の単離した核酸を含んで成る発現ベクター。５．請求の範囲第４項のベクターを含んで成る形質転換された細胞。６．請求の範囲第４項に記載の発現ベクターにより発現されたポリペプチド。７．請求の範囲第６項に記載のポリペプチドに対して特異的な抗体。８．ヒトインターロイキン−２のエキソン１，３、及び４を含んで成る単離した核酸。９．核酸が RNAである、請求の範囲第８項に記載の単離した核酸。 10．核酸が DNAである、請求の範囲第８項に記載の単離した核酸。 11．請求の範囲第10項に記載の単離した核酸を含んで成る発現ベクター。 12．請求の範囲第11項に記載のベクターを含んで成る、形質転換された細胞。 13．請求の範囲第12項に記載の発現ベクターにより発現されるポリペプチド。 14．請求の範囲第13項に記載のポリペプチドに対し特異的な抗体。 15．インターロイキン−４の生物学的効果を減少させるのに有効な量だけ請求の範囲第６項に記載のポリペプチドをヒトに投与することを含んで成る、インターロイキン−４の活性を調節する方法。 16．インターロイキン−２の生物学的効果を減少させるのに有効な量だけ請求の範囲第13項に記載のポリペプチドをヒトに投与することを含んで成る、インターロイキン−２の活性を調節する方法。