JPH09511656A

JPH09511656A - ヒト心筋ミオグロビンに対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH09511656A
Application number: JP8511567A
Authority: JP
Inventors: カルドーン，ベアトリーチェ; ジャックオースキー，ジョージ
Original assignee: Spectral Diagnostics Inc Canada
Current assignee: Spectral Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1995-09-28
Publication date: 1997-11-25
Anticipated expiration: 2015-09-28
Also published as: WO1996010077A1; AU697522B2; CA2201153C; AU3483595A; JP3108103B2; US5573957A; CA2201153A1; EP0783569A1; MX9702388A

Abstract

(57)【要約】他の分子に対する分子の結合の結果生じた立体構造変化を受けたヒト心筋ミオグロビンに高親和性を有するモノクローナル抗体を記載する。このモノクローナル抗体は心筋ミオグロビンの血液、血清または血漿レベルを同定するために、急速フォーマット二重抗体免疫測定系において使用することができる。そのような免疫測定系は心筋の壊死および梗塞を診断し、定量化するために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト心筋ミオグロビンに対するモノクローナル抗体発明の分野本発明はヒト心筋ミオグロビンに特異的に結合を示すモノクローナル抗体に関する。特に詳しくは、本発明は分子が他の分子に結合した結果起こった立体構造の変化によりのみ露出されるミオグロビン分子のエピトープを認識するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株、5Ｍb-64と称する、およびそれにより産生されるモノクローナル抗体に関する。さらに本発明は、ミオグロビンの血液、血清あるいは血漿レベルで検出するためのサンドイッチ法における抗体としての、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64から得られるモノクローナル抗体を使用した診断システムに関する。本抗体は迅速な定型的測定システムにおいて特に有用である。背景および先行技術ミオグロビンは骨格筋および心筋における主要なタンパク質の一つである。この酸素結合ヘムタンパク質は 17.8kＤaと報告されている分子量を有する単一ポリペプチド鎖からなりたっている。ミオグロビンの三次構造は広範に研究されており、主鎖の75％はアルファらせん構造内に折りたたまれている、と報告されている。（Edmundson A.B.，Biochem Prep．1968; 12，41-52; Kagen L.J．(1973) In: F．Borek (Ed)，Myoglobin，Biochemical，Physiological and Clinical A spects，Columbia University Press, NewYork）。その精密な生理的機能は議論のあるところではあるが、酸素に可逆的に結合する作用は筋肉細胞に酸素を運搬する役割を反映していることが知られている。正常人の血液中のミオグロビンレベルは０から70ng／mlである。筋肉が障害を受けると、心筋および骨格筋のミオグロビンの血清レベルは劇的に上昇する。その小さな分子のサイズを反映して、ミオグロビンはリンパ系のプロセッシングを受けないで脈管系に移行することができる。ある種の健康障害および／または疾病において、血清ミオグロビンが上昇することが知られている。この上昇は、障害を受けたまたは壊死した筋肉細胞からミオグロビンが遊離することによると考えられている。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は毎年多くの人がり患しており、その多くは救命に間に合うように診断や治療ができなかったために死亡している。もし、正確なＡＭＩの診断と適切な治療介入が胸痛の発症後最初の６時間以内に行われていれば、生存の可能性は大きく増えることが研究の結果示されている。それゆえ、医学研究者の最終の目標はこのような条件で早期の指標を同定するような分析系を開発することにある。ＭＩ患者において、血液、血清および血漿の心筋ミオグロビンレベルは胸痛の発作後30分より早く正常より高くなっていることが知られている。事実、いく人かのＭＩ患者において、心筋のミオグロビンレベルはＭＩの経過中にわたって正常人のそれの10倍も増加している。ミオグロビンは循環系の中に一時的に遊離されるものとされている。ＭＩ患者において、ミオグロビンレベルは胸痛の発作後、２時間以内に正常値以上になり、６- ９時間で最大血清レベルに達し、そして24ないし36時間に正常値に戻る（vaidya H.C.，Laboratory Medicine，1992; 23:306-310）。それゆえ、心筋のミオグロビンの急速な遊離をモニタリングすることはＭＩの指示標として使用することができる。病状の初期の段階（６時間以下）のＭＩ患者は非常にしばしばストレプトキナーゼあるいはＴＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）を投与する再灌流処置を受けている。これらの血栓溶解剤は閉塞した血管において血流が復活するように作用する。ミオグロビンは再灌流が成功した後およそ45分で最高になるから、ミオグロビンの連続した測定はそのような治療のモニタリングにおいて有用であることが証明されたのである（Ellis A.K.，et al.，Circulation，1985; 7 2:639-647）。いくつかのミオグロビン検出法が確立されているが、しかし各方法には臨床応用に直接影響する限度がある。ミオグロビン検出法の非侵襲法に対する要望は25 年以上も前に実現した、そして開発された初期の検査はラジオイムノアッセイであった（stone M.J.，et al.，J.Clin.Invest.，1975; 56:1334-1339）。これらの測定法では、血清試料は放射性同位元素で標識したミオグロビンおよび抗ミオグロビンポリクローナル抗体と結合された。抗体はそして第２の放射性同位元素で標識したポリクローナル抗体と沈澱する。試料中のミオグロビンの濃度は沈澱した放射能の量の逆数を基にして計算される。この方法は非常に熟練した技術者を必要とするので限定的であり、大変時間を要し、放射線の危険性があった。ミオグロビン検出のラテックス凝集法は、ラテックス粒子上に不溶化された、ミオグロビンに対するモノクローナル抗体を利用している（Chappelle J.P.，et al．Clin．Chim．Acta，1985; 145:143-150）。これらのモノクローナル抗体は血清ミオグロビンと結合し、凝集体を形成する。凝集の定量化はミオグロビン濃度に比例する。この測定はＲＩＡよりもより速くそして実用的であるが、しかし半定性的結果が得られるのみである。この方法は最近、比濁分析法（Turbitimer ，Behring，ドイツ国，Tuengler P.，et al.，Behring Inst．Mitt.，1988; 82: 282-308）および免疫比濁法（NA Latex Myoqlobin，Behring,ドイツ国,massoubr e，C.，Clin．Chim．Acta．1991; 201:223-230）。これらの方法の両者とも測定内部および測定相互間の測定変位が低いと報告されている。これらの方法は、しかし、限度がある、なぜなら分析時間が必要とされるし、不十分な特異性があり、高価な分析機械を必要とするからである。それゆえに、心筋障害（例えば心筋梗塞）の患者における血液、血清または血漿のミオグロビンレベルを測定する免疫システムの試薬として使用される、ヒトミオグロビンに対する高い親和性と特異性を示すモノクローナル抗体に対する要望が残されている。そのようなイムノアッセイシステムは、米国特許第5,290,67 8号に開示されている高速判定手順に従って心筋壊死および梗塞を診断ならびに測定するために使用することができる。発明の要約本発明においては、公知技術の欠点について、ヒト心筋ミオグロビンに対し特異性と高い親和性を有するモノクローナル抗体を提供することによって、対処している。特に本発明は、ミオグロビン分子が他の分子、例えば抗体、と結合することによって立体構造的変化を受けた結果としてのみ露出されるヒト心筋ミオグロビンの独特のエピトープまたは領域を認識するモノクローナル抗体に関する。このモノクローナル抗体はヒトの血液、血清または血漿中のミオグロビンタンパク質の迅速かつ特異的同定において使用することができる。従って、本発明によれば、ミオグロビン分子が他の分子に結合して立体構造変化を受けた結果としてのみ露出される、ヒト心筋ミオグロビンのエピトープを認識する、モノクローナル抗体が提供される。更に本発明によれば、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。この実施態様としては、ハイブリドーマ細胞株は5Ｍb-64であり、American Type Culture Collectionに、寄託番号ＨＢ11708として1994年8月25 日に寄託された。更に本発明の実施態様によれば、Amerrcan Type Culture Collection に、寄託番号ＨＢ11708として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64から産生されるモノクローナル抗体を使用して試料中のミオグロビンを検出する方法が提供される。そのような方法は、試料を抗ミオグロビンウサギポリクローナル抗体と接触させポリクローナル抗体ミオグロビン複合体を産生し；複合体をモノクローナル抗体と接触させポリクローナル抗体・ミオグロビン・モノクローナル抗体複合体を産生し；そしてポリクローナル抗体・ミオグロビン・モノクローナル抗体複合体を検出することよりなる。図面の簡単な説明第１図は半サンドイッチ法における5Ｍb-64抗体の３つの異なった純度のロットの滴定を示す。ここにおいて、ミオグロビンはポリスチレンプレート上に直接被覆されている。第２図は捕捉体としてウサギ抗ミオグロビン抗体を、検出体として5Ｍb-64を使用したミオグロビンイムノアッセイにおける5Ｍb-64の活性を示す。第３図はＢＩＡcoreを使用した会合／解離曲線を示す。第４図（Ａ）はα-ヒトミオグロビンモノクローナル抗体5Ｍb-64のＳＤＳ-ＰＡＧＥ、（Ｃ）は5Ｍb-64のミオグロビンに対する免疫特異性を示す、ヒトミオグロビンα−ヒトミオグロビンモノクローナル抗体5Ｍb-64と5Ｍb-64のウエスタンブロット、（Ｂ）はクロセインスカーレット染色等電点電気泳動により決定されたpＩ値6.6。第５図は5Ｍb-64抗体と心筋および非心筋タンパク質のパネルとの交又反応性がないことを示す。第６図はＢＩＡcoreの慨要であって：（ａ）5Ｍb-64はミオグロビンのみと会合する、抗体は抗原の18ＲＵsのみと結合する、（ｂ）抗体が5Ｍb-64に提示される前にウサギポリクローナル抗体に結合するＭb に提示されたとき5Ｍb-64（154ＲＵs）の活性が増強される。発明の詳細な説明本発明のモノクローナルは、ヒト心筋ミオグロビンに対する特異性、感受性および高い親和性によって診断学的価値の点において公知の抗体と区別することができる。診断イムノアッセイにおいて高感度を達成するために使われる抗体は抗原に対する高い親和性および良好な結合動態を有していなければならない。モノクローナル抗体と抗原の至適相互作用が感度の必要なレベルを達成するのに必須であるから、選択する系は測定の成功に決定的である。しかし、モノクローナル抗体の免疫活性は基質（matrix）に結合（coupled）したときや、標識分子に結合（conjugate）したときに劇的に変化し得るものである。同様に、抗体とその相当する抗原の間に生じる結合は事実立体構造の変化あるいは化学量論的再配列された抗原を生じ得る。この立体構造の変化は抗原に結合するための第２の抗体の能力に大きく影響する。この化学量論的障害あるいは増強は、それが同定されたとき、測定の感度の成功、不成功に大きく影響する（Johne B.，et al.，J.Immunol．Methods，1993，160:191-198）。本発明のモノクローナル抗体は、他の分子に対して結合することの結果として、もし分子の構造が変化したならば、抗体、ミオグロビン、のみに結合することができたのであった。本発明の実施例によれば、この立体構造変化は、ミオグロビンがポリスチレンプレートあるいは抗ミオグロビンウサギポリクロナール抗体への結合に起因することができる。本発明のモノクローナル抗体の免疫活性は、ミオグロビンが始めに抗ウサギポリクローナル抗体に結合したときに増強された。通常のELISAにおいては、捕捉抗体はマイクロタイタープレート、または他の固体支持マトリックス上に被覆される。この固体支持捕捉抗体複合体に対して抗原が加えられ、そこに標識された検出抗体が加えられる。検出抗体上の標識分子が抗体−抗原相互作用を可視化する。それゆえ、本実施態様においては、本発明のモノクローナル抗体は検出抗体であり、それは最初の抗体（捕捉抗体）に対する分子の結合に由来する分子内における立体構造変化の結果としてのみ露出される、ミオグロビンのエピトープを認識する。本実施態様においては、抗ミオグロビンウサギポリクロナール抗体が、ミオグロビン分子がポリクロナール抗体に結合したとき、ミオグロビン分子の立体構造変化を引き起こす。ミオグロビンに対してつくられるポリクロナール抗体は公知の方法により調製することができる。典型的な方法では、5ないし6匹の大動物が使われ、例えばウサギ、ヒツジまたはヤギに、ウサギの場合は足跳あるいは筋肉内に複数箇所、総量0.25ないし0.5ml をフロインド完全アジュバント１ないし5mgと共に、注射する。小動物、例えばマウスおよびモルモットでは、ミクログラム量（0.02ないし2.0ml中１ないし100 μg）を足蹠に皮下注射または腹腔内注射する。動物は免疫後約3週間から毎週4 ないし6週間採血する。血清を分離し、抗体の産生を検査する。ウサギおよび大動物では後足の血管あるいは頚静脈穿刺によって採血する。マウス血清は血液の眼窩後の穿刺により得ることができる。必要により、追加抗原注射を行う。一般に高い親和性の抗体は抗原の低投与量で免疫したときに得られ、ウサギにおける最良の血清は免疫後約3ないし5月で得ることができる。抗体−抗原相互作用を評価あるいは解析する方法はいくつかある。最も一般的に使用され受け入れられている方法は半サンドイッチＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）、全サンドイッチＥＬＩＳＡおよびイムノブロットである。最近、新しい分析機器が導入され、研究者は抗体−抗原会合を実際的で有用な時間枠内で観察することができるようになった。ＢＩＡcore^TMシステム（Biospecific Intera ction Analysis System，Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.）は表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance，(SPR)）の量子力学的現象を使って生体分子の相互作用を検出あるいは解析するバイオセンサーである。生体反応体（例えば、抗体あるいは抗原）は金／ガラスセンサーチップインターフェースの表面にあるデキストランマトリックスに共有的に接触している。センサーチップの表面の反対側に向けた近赤外線が反射され、そして、それは次に共鳴角として知られる特定の角度で反射光に強度傾斜を生じ、金膜上に一過性の波を誘導する。もしセンサーチップ表面の反射係数が変化すると（例えば、抗体に抗原が結合することによって）、共鳴角度に変化が生じる。この角度変化は測定可能であり、共鳴単位（resonance Units，RUs）で表わされる、ちなみに1000ＲＵsは表面タンパク質１ng/mm²の変化に相当する。これらの変化は生体反応（この場合は抗体と抗原）の会合や解離を描く感度図（sensogram）に記録される。本発明のモノクローナル抗体は通常の方法、一般的にはKohlersおよびMilstei nの方法（Nature 256，495-497,1975; Eur.J.Immunol.6，511-519,1976）により調製される。この方法によると、組織培養に適合したマウスミエローマ細胞を、単一抗体分子を大量に産生するハイブリッド細胞を得るために、免疫マウスから得た抗体産生細胞に融合させる。一般的に、抗体産生細胞は動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマまたはウシを抗原で免疫することによって調製される。懸濁液中の抗原の免疫スケジュールおよび濃度は適当に準俯された抗体産生細胞の有用な量が得られるようにすればよい。これら抗体産生細胞は脾臓細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞および／または末梢血リンパ球のいずれかである。抗体産生細胞は次にミエローマ細胞、種々の動物例えばマウス、ラット、ウサギおよびヒト由来の細胞株が使用可能である、と適当な融合促進剤を用いて融合される。多くのマウスミエローマ細胞が知られており、一般に学術団体や種々の寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection，Rockville，Marylandから入手可能である。使用されるミエローマ細胞株は好ましくは培地感受性であればよい、そうすれば未融合ミエローマ細胞は選択培地中で生存できないで、ハイブリッド細胞は生存できる。最も普通に使用される細胞株は8アザグアニン抵抗性細胞株であり、酵素ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルートランスフェラーゼを欠如しているので、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地により保持されない。一般的に、細胞株は、また好ましくは、「非分泌型」がよく、それは抗体を産生しない。好ましい融合促進剤は平均分子量約1000から4000を有するポリエチレングリコールである。その他の融合促進剤例えばポリビニルアルコール、ウイルスあるいは電場もまた使用可能である。固定化細胞（ハイブリドーマ）は正確な特異性の抗体を分泌するものを選別しなければならない。始めの選別は一般的に固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で行われる。特に、ハイブリドーマ培養上清が、前以て抗原、この場合ミオグロビン、で被覆されたミクロタイタープレートに加えられる。培養上清からの結合特異抗体は標識第２抗体、例えば、市販品のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩ gＧを使用して検出できる。抗原に対し陽性の培養物は特定の希釈法によりクローニングに付される。第２のハイブリドーマ培養は上記したようにして再選別され、更に陽性の培養をＢＩＡcoreシステム（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala ，スエーデン国）を用いて試験する。培養は抗体が抗原を結合しているかどうか、および抗原結合の動態状態を評価する。これらの結果を基にして選択した培養を更に培養の安定性およびクローン性が得られるまでクローニングを行う。ハイブリダイゼーション直後、融合産物は約80染色体を有しており、これらの細胞は分裂を行うので、それらの染色体のいくつかを不規則に失っていく。クローニング処理はこれら抗体産生のための染色体コーディングを保持している細胞を選択するためである。クローニング処理は、ハイブリドーマの「安定性」の指標である特異性抗体の産生を、特定集団が100％示すまで繰り返される。さらに、ハイブリドーマ培養ウエルはしばしば複数のコロニーを有しているが、それらのいくつかは抗体非産生である。クローニング処理は単一細胞から誘導された陽性のハイブリッドの選択を可能にする。本発明のモノクローナル抗体はバイオリアクターを使用しても、あるいは腹水からでも産生され得、両者の方法は公知である。本発明のモノクローナル抗体はミオグロビンの血液、血清あるいは血漿レベルを検出するための免疫測定系として使用することができる。現時点のイムノアッセイは分析体の存在を検出するために２抗体法を利用している。これらの技術は "Basic Principals of Antigen-Antibody Reaction" Elv in A．Labat，(Methods in Enzymology，70，3-70，1980)に総説がある。そのようなシステムはしばしば分析体の存在を急速に検出するのに適しているから高速フォーマットシステム（fast format systems）と称される。このシステムは抗体と分析体との間の高い親和性を必要とする。本発明の一実施態様によれば、心筋ミオグロビンの存在は、各々ミオグロビンに特異性のある、そして少なくとも心筋ミオグロビンに対し特異性のある一つの抗体の、一対の抗体を使用して、検出される。該一対の抗体の一つは、ここにおいて「検出抗体」と称し、該一対の抗体の他の一つは、ここにおいて「捕捉抗体」と称する。本発明のモノクローナル抗体は検出抗体として使用可能であり、ミオグロビンは既に捕捉抗体に結合されている。本発明の一実施態様では生体体液試料中の心筋ミオグロビンを検出するために二抗体サンドイッチ法が使用される。この方法では、分析物（心筋ミオグロビン）は検出抗体と捕捉抗体の間にサンドイッチされ、捕捉抗体は固体支持体上に不可逆的に固定化されている。検出抗体は、抗体−分析物−抗原サンドイッチの存在、即ち分析物の存在を同定するために、検出可能な標識を含んでいる。通常の固体支持体の初期の形はプレート、管あるいはビーズであり、これらはラジオイムノアッセイおよび酵素免疫測定法の分野で公知である。最近では、多くの多孔性物質、例えばナイロン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維およびその他の多孔性ポリマーが固体支持体として使われている。本発明の一実施態様では流動−通過型免疫測定法（flow-through type immuno assay）装置を使用している。Valkirsら（米国特許第4,632,901号）は、抗原分析物に特異的な、多孔性膜またはフィルター、これには液体試料が加えられる、に結合した抗体からなる装置を開示している。液体が膜を通って流れるので、標的の分析物は抗体に結合する。試料の添加は標識抗体の添加に続いて行われる。標識抗体の可視検出は試料中の標的分折物の存在の支持となる。他の流動-通過型装置の例はKromerら（ヨーロッパ特許第0229359号）に開示されている。これにはマトリックスの下に位置する反応マトリックスに対する、運搬試薬の溶解速度を制御するための水可溶性ポリマー中に分散された試薬またはその成分で飽和された、マトリックスからなる試薬運搬システムが記載されている。移動型測定においては、膜は測定に必要な試薬で浸漬されている。分析物検出領域は、分析物が結合し、測定指示が読まれる。例えば、Tomeら（米国特許第4, 366,241号）、およびzuk（ヨーロッパ特許第0143574号）を見よ。移動型測定装置は通常着色試薬に付属した試薬が取り込まれており、更に物質を加えなくても測定結果の可視検出が可能である。例えば、Bernstein（米国特許第4.770,853号）、Mayら（ＷＯ88/08534）およびChingら（ヨーロッパ特許第0299428号）を見よ。本発明のモノクローナル抗体はこれらの全ての流動−通過型装置において使用可能である。直接標識は本発明によって使用することができる標識の一例である。直接標識は、その自然の状態で、実体が肉眼あるいは光学フィルターおよび／または蛍光を促進する紫外線などの刺激によって、見ることができるものとして定義される。本発明において使用することができる着色標識の例としては、金属ゾル粒子、例えばLeuveringにより記載された金ゾル粒子（米国特許第4,313,734号）：Grib nauら（米国特許第4,373,932号）およびMayら（ＷＯ88/08534）により記載された色素ゾル粒子; May、上記、Snyder（ヨーロッパ特許第0280559号および第0281 327号）；またはCampbellらによって記載されたリポソームにカプセル化された色素（米国特許第4,703,017号）がある。その他の直接標識は放射性ヌクレオチド、蛍光体あるいはルミネセンスを含む。これら直接標識装置に加えるに、酵素からなる間接標識も本発明において使用することができる。種々の型の酵素結合イムノアッセイは公知である、例えばアルカリ性ホスファターゼと西洋ワサビパーオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸脱水素酵素、これらおよびその他は Eva Envall により Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymo logy，70．419-439,1980 および米国特許第4,857,453号において詳細に記載されている。本発明のモノクローナル抗体を使用して、心筋ミオグロビンの検出に使用することのできる生体診断装置のその他の例は、米国特許第4,906,439号および第4,9 18,025号においてG.Grenner，P.B．Diagnostics Systems，Inc.により記載されたものを含む。本発明の一実施態様においては、患者から血液を引き抜くのに使用される通常の血液試料チューブを診断試験に使用する。このチューブの内壁はモノクローナルまたはポリクローナル抗体の担体として作用し、測定し得る信号を産出するために必要な検出用試薬を必要とする。この実施態様において、捕捉抗体は試験管の壁に固定化されている。患者から試料を採取した後、使用者は試料を単にチューブ内で検出抗体と振盪することにより、検出抗体は血中の心筋ミオグロビンと反応する。この例において、本発明のモノクローナル抗体は検出抗体である。赤血球細胞を除去した試料を使う必要があるが、それにより赤血球細胞は分析結果に影響しない。もし分析物が血液中に存在すれば、捕捉抗体と、直接検出のための適当な標識を含むか、あるいは間接測定における試薬と反応する検出抗体の間にサンドイッチされる。固体支持体（試験管）は次いで非結合標識物質を除くために洗滌される。この方法では、種々の固体支持体を使用することができる、例えば試験管壁、プラスチックキャップ、ビーズ、プラスチックボールおよびミクロタイタープレート、紙およびガラス繊維を含むシリンダー。現時点で使用し得る、多くの試料を同時に高速フォーマットアッセイができる幾種類かの自動測定装置がある。これらの自動測定装置は連続／ランダムアクセス測定装置を含む。そのようなシステムの例は、PB Diagnostic Systems，Inc. のopus^TMおよびAbbott Laboratories of North Chicago，Illinoisにより1988年に導入されたIMX^TMAnalyzerがある。一般的に、試験検液の試料は試料容器に供給され、測定試験要素への試料のピペッティング、培養および得られた信号の読みを含む全ての操作工程が自動的に行われる。自動化測定システムは一般的に、試験行程の一段階を行う夫々の一連のワークステーションを含む。測定要素は一つのワークステーションから次へ種々の手段、例えば連続的に試験段階が完成するように回転ラック（Carousel）や移動棚により運搬される。測定要素は試薬貯蔵受け器、混合液、希釈試料等を含む。測定要素はまた試験液の前以て定められた量を投与できる開口部、そしてもし必要ならば多孔性物に必要な他の試薬を含む。試料要素は、行程の結果として得られた信号、典型的には多孔性物に存在する試薬中での蛍光または色調の変化を、例えば分光学的または蛍光光度計、これらは測定系に含まれているが、で読み取ることができるような窓を含む。 PB Diagnositic Systems，Inc.の自動測定機は米国特許第5,051,237号；第5,1 38,868号；第5,141,871号および第5,147,609号に記載されている。 IMX Analyzerの記載はFiore，M．et al.，Clinical Chemistry，35，No.9，19 88の "Abott IMX Automated Bench Top Immunoachemistry Analyzer System" に含まれている。更にこれら分析器の例は米国特許第4,956,148号「自動棚および使い捨て試料カートリッジ」C.J.Grandone、1990年9月1日、Abbott Laboratorie sに譲渡、これにはAbbott IMX^TMsystemに関して使用される複数の反応セルを運ぶ回転ラックが記載されている。更なる改良はカナダ特許出願第2,069,531号、C hadwick M．Dunn et al．Abbott Laboratories に譲渡、に記載されている。これには、先行特許出願に記載されている免疫化学分析系が、現時点で得られる装置を使って一回の行程操作で３ないし４分析物を試験する能力があることを記載している。上記したカナダ特願に記載されたシステムは使用者が３つの別々の分析を行うよりも３つの小単位の測定をまとめて行うことができる。本発明のモノクローナル抗体はこれらの自動化分析器において使用することができる。本発明のモノクローナル抗体が使用可能な更に別の免疫化学分析システムはバイオセンサーあるいは光学免疫センサーシステムである。一般的に、光学バイオセンサーは、光学原理を使って定量的に問題とする化学的あるいは生化学的濃度または活性を電気信号に変換する装置である。これらのシステムは４つの主なカテゴリーに群分けできる：反射技術：表面プラズモン共鳴；光ファイバー技術および集積光学装置。反射技術は楕円偏光法、多重積分反射分光法（ multiple integral reflection spectroscopy）および蛍光キャピラリー充填装置（fluorescent capillary fill devices）を含む。光ファイバー技術は一過性フィールド蛍光（evanescent field fluorescence）、光ファイバー毛管（optic al fiber capillary tube）、および光ファイバー蛍光センサーを含む。集積光学装置はプラナー・エバンセント・フィールドフルオレッセンス（planer evane scent field fluorescence）、インプット・グレーディング・カプラー・イムノセンサー（input grading coupler immunosensor）、Mach-Zehnder干渉計、Hart man干渉計および示差干渉計センサー（diference interferometer sensors）を含む。これらの光学イムノセンサーの例は一般的にG.A．Robins（Advances in B iosensors），vol.1，pp.229-256,1991の総説に記載されている。これらの装置のより特定の記載は例えば米国特許第4,810,658号;第4,978,503号;第5,186,897 号;R.A．Brady et al．（phil.Trans.R.Soc.Land．B316，143-160,1987）および G.A．Robinson et al.，（in Sensors and Actuators，Elsevier，1992）に記載されている。本発明の一実施態様においては、心筋ミオグロビンは血液、血清または血漿の試料で、本発明のモノクローナル抗体を使用して、検出部および捕捉部を有するフィルター膜または固体支持体からなる装置において検出される。検出部はミオグロビンと反応する抗体（検出抗体）を含んでいる。検出抗体は固体支持体上に可逆的に固相化されており、使用時に試料と共に移動する。検出抗体は、例えば公知技術に記載され、上記で論じたような、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光体、ルミネセントあるいは色素体で、標識されていることが好ましい。捕捉部は固体支持体に不可逆的に固相化された捕捉抗体からなっている。抗体、捕捉および検出抗体、および必要な試薬は、既に論じた流動−通過型免疫測定装置で開示したような、標準的既知技術を用いて固体支持体上に固相化されている。一般的に、抗体は非極性タンパク質と非極性支持マトリックスの間の疎水性反応の結果として、固体支持体上に吸収される。本発明のこの実施態様においては、もし心筋ミオグロビンが試料中に存在するならば、検出部の検出抗体と反応し、捕捉部のフィルター膜の方に移動し、そこで分析物は捕捉抗体と結合する。かくして、心筋ミオグロビンは捕捉抗体と適当な標識を有する検出抗体の間にサンドイッチされる。本発明のこの実施例において、もし検出抗体が色素標識または色素標識を生じる酵素で標識されていれば、患者の血液は赤血球を除去するため最初遠心または前ろ過を行うことにより、赤血球の色が色素標識を妨害することはない。もし、放射性標識または蛍光標識が使われるならば、前ろ過または遠心は不要である。この実施態様において、試料は最初検出抗体を含んでいるから、本発明のモノクローナル抗体は捕捉抗体であり、ウサギポリクロナール抗体は検出抗体である。この免疫測定システムは一般的に米国特許5、290、678に記載されている。本発明のモノクローナル抗体は心筋ミオグロビンに高い親和性と特異性があるから本システムにおいて特に有用である。以下の詳細な実施例は更に本発明を説明するものであるが、制限的に解釈されるべきではない。実施例実施例１：ヒト心筋ミオグロビンに対するモノクローナル抗体の調製免疫処置ヒト心筋ミオグロビンは以下の方法によりヒト心室から精製された。ヒト心臓のホモジネートを始め(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄沈澱（40％）次いで6000×ｇで20分間４℃ にて遠心分離した。上清を更に１Ｍ酢酸で沈澱させ、得られた上清を12,000×ｇ（20分間４℃）で遠心分離して集めた。上清のpＨを7.0に調節し、更に(ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄分画（80％飽和）した。得られた上清を50mＭリン酸-ホウ酸緩衝液pＨ8.0 に対して透析した。ミオグロビンはBio-Gel P-60カラム（Bio-Rad，Hercules，C alifornia，Cat.#150-4160）で粗製まで精製した。ミオグロビンは更にAffi-Blu e Bio-Gel Affinity Column（Bio-Rad，Hercules，California，Cat.#153-7302 ）で均一に精製した。Ｂalb/cマウス、系統Ｈ-^dハプロタイプ、Charles River Canada，St．Contant ，Quebec，Canada，雌、７-９週令、に、首の基にミオグロビンとフロインド完全アジュバント１：１の混合物50μgを初期免疫として皮下に投与した。二次免疫として、４週間後にミオグロビンとフロインド不完全アジュバント１：１の混合物50μgを腹腔内（i.p .）投与した。４週間後、更にリン酸生理食塩緩街液（ＰＢＳpＨ7.4）のミオグロビン100μgを第３回追加免疫としてi.p.投与した。融合の４日前、更にＰＢＳ pＨ7.4、のミオグロビン100μgをi.p.投与した。マウスを屠殺し、脾臓を摘出した。ハイブリドーマと抗体の調製 5Ｍb-64のハイブリドーマ細胞株を、免疫したＢalb/cマウスの脾臓から得た免疫細胞とSp2/0ネズミミエローマ細胞を融合させて、Fuller S.A.，Takahashi M. ，and Hurrell J.G.R.，(Preparation of Monoclonal Antibodies; In Ausubel F.，Brent B.，Kingston R.，et al．eds．，Current Protocls in Molecular B iology，New York: Green Publishing Associates，1987: Unit 11)の記載に従って製造した。得られた融合細胞はＨＡＴ選択培地に懸濁し、Fullerら（上記文献を見よ）により記載された支持細胞PＥＣ（腹腔滲出細胞）を前以て植えた96 ウエルプレートに蒔いた。新鮮なＨＡＴ培地を７目目に加え、９日目に培地の50 ％を除き新鮮なＨＡＴ培地で置き換えた。ハイブリドーマ培養をミオグロビンに高度に免疫活性な抗体の産生で選別した。これは間接ＥＬＩＳＡにより残りの培養上清を分析することにより行った。ポリスチレン製96ウエルミクロタイタープレート（Immunolon-4，Dynatech Labs， Chantilly，VA）を100mＭ炭酸／重炭酸緩衝液、pＨ9.6のヒト心筋ミオグロビン２μg／mlで４℃にて一夜被覆した。過剰の結合部位はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。プレートはＰＢＳ／0.05％Ｔween-20で４回洗滌した。ハイブリドーマ培養上清をウエルに加え（100μl）、1時間37℃にて炭酸ガスインキュベーター中でインキュベートした。プレートはＰＢS／Ｔween-20（pＨ7.2）で４回洗滌した。ウエルはヤギおよび抗マウスＩgＧＦc-ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch Lab，Inc.，west Grove，penn.）100μlを0.5μg／mlで37℃にて60分間インキュベートした。プレートはＰＢＳ／Ｔween-20（pＨ7.2）で４回洗滌した。基質溶液（0.5mg／mlのＯ−フェニレンジアミン、ＯＰＤ（sigma Chemicals，St.Louis Missouri）、および0.1Ｍクエン酸リン酸緩衝液中0.03％Ｈ₂Ｏ₂pＨ5.0）を100μl／ウエル加え、暗所で30分間展開させた。反応は４ＮＨ₂ＳＯ₄25μl／ウエルを加え停止させた。プレートはBIORAD Microplate Reader（Bio-Rad，Hercules，California）で490nmで読んだ。特定の細胞株、5Ｍb-64（マウス＃5，マイクロタイターウエル＃64）を単離した。これは上記したシステムで使用した培養上清のＯ.Ｄ.≧2.0を示す非常に免疫活性な細胞株であった。免疫活性は種々のクローニングおよび選別の段階で高い再現性および一貫性を保持していた。例えば、第１図は、ミオグロビンが直接ポリスチレンプレートに被覆されている半サンドイッチアッセイにおける、5 Ｍb-64抗体の３つの異なった適定を示す。この細胞株は、抗体捕捉体（固相化またはアンカー抗体）としてウサギポリクローナル抗体、および抗原検出体（標識またはタグ抗体）として5Ｍb-64、およびその反対、を用いて完全サンドイッチＥＬＩＳＡアッヤイで試験した。このアッセイにおいて、5Ｍb-64を捕捉抗体として使用したとき活性は観察されず、ミオグロビンの結合も記録されなかった。しかし、抗体を逆にすると、即ちウサギポリクローナル捕捉体および5Ｍb-64検出体感度は0.5ng／ml以下が達成された、第２図を見よ。このハイブリドーマ細胞株はAmerican Type Culture Co llection に1994年8月25日寄託番号ＨＢ11708で寄託された。上記で記載したように、プリスタン0.5mlで前処置したＢalb/cマウスにリン酸緩街生理食塩液（ＰＢＳ）、pＨ7.4、0.5ml中1-5×10⁶クローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内に投与した。およそ２週間後、腹水を採取し、モノクローナル抗体を、公知の方法で、プロテインＡまたはプロテインＧでアフィニティ精製した。本発明の精製モノクローナル抗体を種々の免疫化学的研究に使用した。 Fullerらの記載した方法（上記を見よ）を使用して測定した、5Ｍb-64ハイブリドーマ細胞株のいくつかの性質は以下の通りである。（１）細胞倍加時間 12.06時間（２）生産された平均腹水ml 3-5ml／マウス（３）抗体の平均収量 1.2mg/ml腹水（４）安定性 25継代以上実施例２：物理化学的性状抗体クラスおよびサブクラス抗体クラスおよびサブクラスをＥＬＩＳＡで市販キット（Bio-Rad，Hercules California，Cat.#172-2055）により製造者の記載方法に従って決定した。細胞株5Ｍb-64はこの測定系でＩgＧl、χイソタイプと決定された。等電点（pＩ）等電点はＭodel III Ｍini ＩＥＦ細胞（Bio-Rad,Hercules California，Cat. #170-2975）により製造者の記載方法に従って決定した。細胞株5Ｍb-64のpＩは6 .6と決定された。速度定数および親和定数Ａ）会合速度定数（ka）会合速度またはモノクローナルおよびその抗原が結合する速度はＢＩＡcoreで生じる結合曲線を用いて決定することができる。システムは表面プラズモン共鳴、これはガラス支持体上の薄い金膜の表面の光学的性質の変化を検出する。詳細な理論的背景および製造者はR.Karlsson，et al．（J.Immunol.Methods，145,22 9，1991）により記載されている。カイネティクスランは以下によりなされた：一定濃度、10mＭＨepes,0.15ＭＮaＣl,3.4mＭエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩、0.05％サーファクタント20（ＨＢＳ、pＨ7.4）中30μg／ml、のモノクローナル抗体を、ウサギ抗マウスＩgＧ_Fc（ Jackson ImmunoResearch lab,Inc.）が固相化されているセンサー表面に作用させる。抗原、ミオグロビン、を、1.25μg／mlから20μg／mlの範囲の濃度で結合モノクローナル抗体に作用させる。ランは25℃、流速5μl／分で6分間（30μl注入）、全24点報告、で行った。抗原の注入が完成した後、抗体から抗原の解離を 18報告点をモニターした。ランの後、表面を1分間かけて、1Ｍギ酸を注入して（ 5μl注入）再生した。機器のソフトウエアでプロッティングプログラム（Micros oft Excel）に直接使用できるdＲ_A/dtおよびＲ_A値を出した。５つの異なった抗原の濃度におけるグラフdＲ/dt対Ｒをプロットすることにより、そして次にこれらラインの傾斜対抗原の濃度をプロットすることにより、この第２のグラフの傾斜は会合速度定数ka（Ｍ^-1,s^-1）となる。ここで、 dＲ/dtは抗原抗体複合体の生成速度、即ち結合曲線の微分係数：およびＲはＢＩＡcoreにより共鳴単位で測定された抗原／抗体複合体。Ｂ）解離速度定数（kd）解離速度またはモノクローナルおよびその抗原が解離する速度はＢＩＡcoreで生じる解離曲線を用いて決定することができる。反応対時間曲線における降下の対数の傾斜をプロットし決定することによって、解離速度定数kd（s^-1）を測ることができる。Ｃ）親和または平衡定数（ＫaまたはＫd）親和または平衡定数は会合と解離速度定数の比である。ここに、Ｋa＝ka/kd Ｋd＝kd/ka 典型的な会合と解離曲線は第３図に示す。親和定数は２つの方法で決定された。実験は抗原のみを使用し、またウサギ抗ミオグロビンポリクローナル抗体に結合した抗原を使用して行われた。これらの結果は表１に示す。前に論じたように、本発明のモノクローナル抗体を結合ミオグロビンに対し直接試験するとき結合は観察されない。しかし本発明のモノクローナル抗体を、ウサギポリクローナル抗体に既に結合したミオグロビンに対し試験するとき結合は起こる。実施例３：抗原特異性 5Ｍb-64抗体の特異性を、公知の方法、例えばTsang，V.C.W．et al．Methods in Enzymol．Vol.92,377,1983に記載された方法を用いてイムノブロットによび評価した。精製ヒト心筋ミオグロビンをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに転移した。ニトロセルロースを、非特異的結合をブロックするためにＴween-20（ＴＴＢＳ），pＨ7.5、入りのＴrisで緩衝した生理食塩水中5 ％スキムミルク溶液でインキュベートした。これに次いでＴＴＢＳ中5Ｍb-64モノクローナル1ないし10μg／mlを1時間インキュベートした。ニトロセルロースをＴＴＢＳ,pＨ7.4で洗滌し、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ抗マウスＩgＧ（Bio-Rad，Hercules，California，Cat.#170-6516）でインキュベートした。ＨＲＰ結合抗体は、前に記載したように、4−クロロ−1−ナフトール色展開試薬でインキュベートすることによって可視化した。色展開は蒸留水で洗滌することによって停止した。イムノブロットを第４図に示す。これは明らかにミオグロビンの単一タンパクバンドに対する5Ｍb-64の免疫特異性を示している。 5Ｍb-64の特異性を確認するために、この抗体を心筋および非心筋タンパク質のパネルと共に固相ＥＬＩＳＡテストに使用した。これらのタンパク質は、既に記したように、２μg／mlでポリスチレンＥＬＩＳＡプレートに被覆した。モノクローナル抗体をこれらの抗体に対して、濃度4μg／mlから0.004μg／mlまでの範囲で、50％ずつの段階で下げていき、テストした。結合抗体はヤギ抗マウスＦc抗体（Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.）0.5μg／mlで検出し、既に記したように、ＯＰＤ基質を用いて可視化した。結果は第５図に示す。モノクローナル抗体5Ｍb-64はミオグロビンを除き試験したいかなるタンパク質との交又反応しなかった。実施例４：生体試料中の心筋ミオグロビンの検出血液中のミオグロビンの正常レベルとして、血清または血漿では70ng／mlであるが、本発明測定では血清ミオグロビンレベル80ng／mlまたはそれ以上が検出される。これは検出抗体としてウサギポリクロナール抗体を使用し、捕捉抗体として5Ｍb-64を使用することにより達成された。5Ｍb-64モノクローナルはミオグロビンが他の抗体と結合したとき最も効率的にミオグロビンを認識する独特の可能性を演じる。前記したように、ＢＩＡcoreシステムを使用して、この反応を非常に明瞭に観察できる。5Ｍb-64モノクローナル抗体をセンサーチップに共有結合させ、フリーのヒト心筋ミオグロビンを導入すると、非常に小さな（18ＲＵ）の抗原結合が観察された。しかし、抗原をウサギポリクロナール抗体と前混合したミオグロビンを存在させると、抗原会合は５倍以上増加した。それゆえ、5Ｍb-6 4は他の分子、例えば、他の抗体と結合した結果立体構造変化が起こった結果としてのみ露出されたミオグロビン分子のエピトープを認識するように思える。（第６図を見よ）。更に、結合動態の解析および親和定数の決定（表１）は、測定できないような遊離ミオグロビンの低い親和性を5Ｍb-64が有していることを示している。抗体結合ミオグロビンの露出したエピトープに対する 5Ｍb-64の親和性は3.01×10⁶Ｍ^-1であった。モノクローナルおよびポリクロナール抗体のパネルでの広範な組み合わせの実験で、至適感度、特異性および必要時間（即ち、2-3秒）を達成する抗体の最も感度のよい組み合わせは、抗ミオグロビンウサギポリクロナール抗体と5Ｍb-64 であることが示された。従って、5Ｍb-64は、ミオグロビンが他の分子、例えば、抗ミオグロビンウサギポリクロナール抗体、との結合により生じる立体構造変化の結果としてのみ露出されたミオグロビン分子上のエピトープまたは抗原決定基を認識する。5Ｍb-64抗体のイムノアッセイはこの立体構造変化により劇的に増強される。この実施例においては、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64により産生されるモノクローナル抗体は、二抗体サンドイッチアッセイを基にした流動通過アッセイシステム（flow through assay system）における捕捉抗体として使用された。患者血清の試料（50μlから150μl）を試料口から測定系に加える、試料口は標識抗ミオグロビンウサギポリクロナール検出抗体を含む試薬パッドと液体で連絡している。もし、試料の量が小さければ試料を加えた後にキャリアー液が加えられる。キャリアー液は適当な緩衝液である；例えばリン酸緩衝液、生理食塩水、Ｔris-ＨＣlまたは水である。もし、試料が心筋ミオグロビンを含むならば、試薬パッド内の検出抗体と結合する。検出抗体は可逆的に固相化され、試料と共に移動する。試料は試薬パッドから流出しフィルター膜へと続く、その上には本発明のモノクローナル抗体が不可逆的に固相化されている（捕捉抗体）。標識検出抗体-心筋ミオグロビン複合体は、もし存在するなら、フィルター膜上の捕捉抗体と結合する。分析物、それは標識された検出抗体により標識されている、の存在は捕捉抗体の場所に配置され、それは一般的に測定系の標示窓の位置に一致している。ここに挙げた全ての文献は引用文献として取り入れられる。本開示は本発明の好ましい実施態様を記載し例示しているが、本発明はこれらの特定の実施態様に限定されないと解釈されるべきである。多くの変形や修飾は当業者によって行われる。本発明の定義のために、付録する請求範囲が参照される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者ジャックオースキー，ジョージカナダ国、エル０エヌ１ケイ０オンタリオ、イングレウッド、マックロウリンロード 16098番地、アール．アール．シャープ１

Claims

【特許請求の範囲】１． American Type Culture Collectionに寄託番号ＨＢ11708として寄託された、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64。２． American Type Culture Collectionに寄託番号ＨＢ11708として寄託された、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64により製造されるモノクローナル抗体。３． American Type Culture Collectionに寄託番号ＨＢ11708として寄託された、ハイブリドーマ細胞株5Ｍb-64により製造されるモノクローナル抗体を使用して試料中のミオグロビンを検出する方法であって、試料を抗ミオグロビンウサギポリクローナル抗体と接触させ、ポリクローナル抗体−ミオグロビン複合体を産生させ；複合体をモノクローナル抗体と接触させてポリクローナル抗体−ミオグロビン−モノクローナル抗体複合体を産生させ；そしてポリクローナル抗体− ミオグロビン−モノクローナル抗体複合体を検出する、ことよりなる方法。