【発明の詳細な説明】
エクイリンの酸異性化によるエクイリン二重結合異性体
本発明は、△９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）(８α-３-ヒドロキ
シエストラ-１,３,５(１０),９(１１)テトラエン-１７-オンと命名することもで
きる)、その製造方法、該△９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）を含有
する医薬組成物、ならびに、骨形成と骨吸収との間の均衡を修正するためのおよ
びヒトを含む宿主動物における抗酸化薬としての該△９(１１)-デヒドロ-８-イ
ソエストロン（VI）の使用に関する。
発明の背景
骨粗鬆症は、全身の骨密度が減少することで明白となる骨格の障害である。実
際のところ、骨塩（「ヒドロキシアパタイト」と呼ばれるリン酸カルシウム）お
よび骨基質（「コラーゲン」と呼ばれる主要なタンパク）がいずれも徐々に失わ
れる。この状態は、ヒトでは３０歳ぐらいの早期から現われ始めることがある。
一般的には、その進行は男性よりも閉経後の女性の方が早い。しかし、８０歳を
越えると、骨粗鬆症の発症率に性差はない。１０〜２０年間にわたって骨損失が
進行するうちに、背中の痛む症状が現れたり、Ｘ線によって脊椎の変形が明白に
なりうる。年齢が高くなるにつれて、近位部の大腿骨（「腰」）が容易に骨折す
ることから、骨の脆さが明白となる。骨粗鬆症は、４５歳以上の人々については
、骨折の最も一般的な原因である。
骨粗鬆症の原因は、充分には理解されていないが、骨形成と骨吸収（骨損傷）
との間に不均衡が存在すると考えられている。骨は、動物の一生を通じて動的な
組織のままである。すなわち、新しい骨が絶えず形成され、かつ、古い骨が絶え
ず吸収されている。しかし、骨粗鬆症の状態にある動物では、正味の骨吸収は骨
形成を上回っている。
ある総説は、合衆国には骨粗鬆症に罹患している人が１５００〜２０００万人
存在することを指摘している［ダブリュー・エイ，ペック（W.A．Peck）(議長)
、
エヌ・アイ・エイチ・オステオポロシス・コンセンサス・カンファレス(NIH Ost
eoporosis Consensus Conference)、ジャーナル・オブ・アメリカン．メディカ
ル・アソシエイション(J．Am．Med．Assoc.)，10，252：799-802(1984)]。
成因であると考えられる特別の状態に従って命名される様々な型の骨粗鬆症が存
在する：老人性（加齢）；閉経後（女性におけるエストロゲン形成の減少）；不
使用（長期の固定化）；ステロイド性(関節炎の場合のような長期にわたるステ
ロイド治療)。骨粗鬆症は、下顎骨が他の骨に比べて急速に骨量を失うようであ
るので、歯科の問題にも現われることがある。かくして、成人の歯の喪失を含む
歯周病は、骨粗鬆症の初期の徴候でありうる。
骨損失の機構は、現在のところ、充分には理解されていない。さらに、現在の
治療方法は、一般的には満足なものではない。これらには、同化薬剤、リンを含
む様々な薬物、ビタミンＤ、カルシウム塩、フッ化物およびカルシトニンが含ま
れる。
エストロゲン置換治療は、閉経後の女性における骨粗鬆症に対して選択される
療法である。
いかなる年齢においても固定化が骨粗鬆症を引き起こし得るので、理学療法は
骨粗鬆症を治療するのに現在用いられている別の方法である。かくして、多くの
医師は、運動と理学療法が初老の患者におけるこの疾患の進行を防止することが
できると考えている。しかし、理学療法は骨折した患者に有害であり、また、重
篤な骨粗鬆症の患者の場合、過度の運動は骨折を引き起こし得る。
他の治療としては、明らかにコラーゲン合成を刺激することによって骨成長を
促進することが臨床的に示されているフッ化ナトリウムなどのフッ化物塩の投与
が挙げられる。しかし、重大な副作用は、カルシウム沈着が不充分で、不規則な
骨成長である。別の治療には、一部の初老の患者に徴候的なカルシウムの欠乏や
カルシウムの吸収減少を中和するためにカルシウムおよびビタミンＤの注入が必
要とされる。しかし、より多くのカルシウム摂取が、骨粗鬆症を予防したり、成
人の骨量を増大させるという証拠は存在しない。
骨粗鬆症の治療への将来最も有望な治療的アプローチは、骨形成率と骨吸収率
との間の均衡を、後者に対する前者の比を増大させ、正味の骨損失を生じない方
式で修正するように設計された薬剤の投与である。これまでに生じた骨損失が回
復した後、骨形成率と骨吸収率とが等しい定常状態に到達する。このような修正
は、骨沈着、すなわち骨形成の生理学的な機構を刺激することによって、または
、骨吸収の機構を遅延させることによって、あるいは、その両方によって、行い
得る。これらの目的を達成するために現在用いられるか、または、実験的な段階
にある薬物としては、ホスホン酸塩、カルシトニンおよびミトラマイシンが挙げ
られる。しかし、これら薬物は、すべて重大な欠点を有する。
抗生物質であるミトラマイシンは、低カルシウム活性と共に、抗腫瘍活性を有
し、血清カルシウムの低下を引き起こすが、これは今度は相対骨吸収率（すなわ
ち、骨形成に対する骨吸収）の減少を示すと考えられる。しかし、副作用として
は、悪心だけでなく、腎臓および肝臓に対する毒性が挙げられる。同様に、有機
ホスホン酸塩は、骨格外のカルシウム沈着、高血圧および腎不全などの副作用を
有する。カルシトニンは、それが一般的にはヒト以外の起源に由来することから
、免疫学的な問題を呈する。上記薬剤のいずれも、現在のところ、骨粗鬆症の治
療に単独で用いるのに適していない。
従来の技術
従来の技術は、エクイリン自体：
ブッダヴァリ・エス（Budavari S）(1989)。ザ・メルク・インデックス（TheM
erck Index）第11版、メルク・アンド・カンパニー・インコーポレイティッド(M
erck & Co Inc.)、ラーウェイ(Rahway)、ニュージャージー州、3582頁；および
マゲルレイン・ビー・ジェイ(Magerlein BJ)、ホッグ・ジェイ・エイ（HoggJA
）（1958）に開示された別の公知のエクイリン異性体である３-ヒドロキシエス
トラ-１,３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン（Ｄ９(１１)-デヒドロエ
ストロン）（II）に関する。１１-置換１,３,５(１０)-エストラトリエンの調製
および反応。Ｉ．１１-酸化エストロンおよびエストラジオール。ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J AmChemSoc）80：2220-2225。
シェリング・アイージー（Schering A-G）（ウェイスク・アール（Weiske R）
による）(1964)。ゲル・オッフェン（Ger Offen）1，177，636。ケミカル・アブ
ストラクツ（Chem Abstr）61：14748h。
J）(1983)。エストロゲンの構造および機能。IV。特に環Ｃが多重水素化された
１７α-エチニルエストラジオールの合成。オーストラリアン・ジャーナル・オ
ブ・ケミストリー（Aust J Chem）36：339-360。
発明の概要
発明の説明
本発明は、式（VI）
で示される化合物またはその医薬上許容される塩に関する。
本発明の化合物（VI）は、式（III）
で示されるエクイリンの二重結合異性体であり、非プロトン性媒体中で強酸を用
いた処理によってエクイリンから調製される。本発明の化合物（VI）は、下記の
ものに有用である。
１）エストロゲン欠乏により誘発される骨損失の治療または防止
２）心臓血管のプラーク形成を減少させ、死亡率を減少させること
３）血管運動神経性のぼせ、うつ病および不眠症など（これらに限定されない
）を含む閉経後エストロゲン欠乏症の症状軽減
４）尿失禁のリヴェンション（revention）
５）歯周病の治療
６）抗酸化薬として
また、本発明の別の目的は、宿主動物における骨沈着率と骨吸収率との間の均
衡を修正し、それによって前者に対する後者の比を減少させるために、骨粗鬆症
に罹患しているヒトを含む宿主動物を治療する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、宿主動物における現在の健康な骨組織の劣化を防
止するために該宿主動物を治療する方法を提供することである。これらの薬剤は
、悪性の高カルシウム血症、パジェット病および関節炎疹の治療にも有用であり
得る。
本発明のさらなる目的は、歯周病の治療方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の化合物（VI）を抗酸化薬として用いるこ
とである。
本発明の詳細な説明
本発明の式（VI）で示される化合物は、単独または医薬上許容される担体と組
み合わせて用いられるが、その割合は、化合物の溶解度や化学的性質、選択され
た投与経路および標準的な医療実務によって決定される。例えば、それらは、カ
プセル剤、錠剤、懸濁剤または液剤の形態で経口的に投与するか、非経口的に注
射してもよい。カプセル剤および錠剤は、好ましい投与様式である。非経口的な
投与の場合、それらは、他の溶質（例えば、液剤を等張性にするのに充分な食塩
水またはグルコース）を含む無菌液剤の形態で用いることができる。
カプセル剤および錠剤組成物は、カプセル剤および錠剤の製造に適することが
知られている非毒性の医薬用賦形剤と混合した活性成分を含有する。適当な医薬
用賦形剤は、例えば、デンプン、乳糖、ある種の粘土などである。錠剤は、コー
ティングしなくてもよいが、胃腸管における崩壊および吸収を遅らせ、それによ
って長期間にわたって持続的作用を与えるように、公知技術によってコーティン
グすることもできる。
式（VI）で示される化合物の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適当であるこ
とが知られている１種またはそれ以上の非毒性の医薬用賦形剤と混合した活性成
分を含有する。適当な賦形剤は、例えば、メチルセルロース、アルギン酸ナトリ
ウム、アラビアゴム、レクチンなどである。水性懸濁液は、１種またはそれ以上
の保存剤、１種またはそれ以上の着色剤、１種またはそれ以上の香味剤、および
、１種またはそれ以上の甘味剤を含有することもできる。
非水性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油
、もしくは、やし油）または鉱油（例えば、液体パラフィン）に懸濁させること
によって処方することができるが、この懸濁液は粘稠剤（例えば、蜜ろう、硬質
パラフィンまたはセチルアルコール）を含有していてもよい。これらの組成物は
、甘味剤、香味剤および抗酸化剤を含有することもできる。
式（VI）で示される化合物の用量は、投与の形態や、選択された特定の化合物
によって変化する。さらに、特定の宿主や、治療中の宿主の年齢、体重および状
態、ならびに、症状の性質および程度によって変化する。一般的に、治療は、こ
の化合物の至適な投与量より実質的に少なく低い用量から開始される。その後、
この用量は、かかる状況下で至適な効果が達成されるまで、少しずつ増大させる
。一般に、本発明の化合物は、有害または有毒な副作用を起こすことなく効果的
な結果を一般的に与える濃度レベルで最も望ましく投与される。例えば、経口投
与する場合に効果的な化合物の量は、上述したように変化するが、通常、一回量
または分割量で約２００ｍｇ〜１２００ｍｇ／日の範囲内とすることができる。
しかし、効果的な結果を達成するために、最も望ましくは、一回量または分割量
で約５００ｍｇ〜９００ｍｇ／日の範囲内である用量レベルが経口投与に採用さ
れる。Δ９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）は、２００ｍｇ〜１２０
０ｍｇの一日量でヒトに投与される。
以下の実施例は、本発明の化合物を調製および試験する方法を例示するために
与えられる。これらの実施例は、いかなる点でも本発明の幅および範囲を限定す
るものであると見なすことを意味しない。これらの実施例で表される温度は、℃
単位である。
実施例１
一般的な方法
融点（ｍｐ）は、トーマス-フーバー（Thomas-Hoover）のキャピラリー型融点
装置を用いて測定したが、補正しなかった。比旋光度[α]Dは、パーキン-エルマ
ー（Perkin-Elmer）の２４１型旋光計およびマイクロセルを用いて、室温で測定
した。濃度は、特に断わらない限り、ジオキサン中で約１％であった。紫外線（
ＵＶ）スペクトルは、ヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）の８４５
２型ダイオードアレイ分光光度計を用いて、ＵＳＰアルコール中で測定した。赤
外（ＩＲ）スペクトルは、ニコレット（Nicolet）の２０ＤＸ ＦＴＩＲ分光計を
用いて、ＫＢｒペレットで測定した。1Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、
特に断わらない限り、ブルーカー（Bruker）のＡＭ４００分光計を用いて、重水
素化クロロホルム中で測定したが、テトラメチルシランから低磁場側へのｐｐｍ
として報告する。質量スペクトル（ＭＳ）は、電子衝撃イオン化による、フィニ
ガン（Finnigan）-ＭＡＴの８２３０型の二重集束磁場セクター型装置またはヒ
ューレット・パッカード（Hewlett Packard）の５９９５型単一四重極装置を用
いて測定した。
Δ８(９)-デヒドロエストロン（Ｉ）の調製
（３-ヒドロキシエストラ-１,３,５(１０),８(９)-テトラエン-１７-オン）
１２５ｍＬの液体フッ化水素を含有するポリエチレン製の反応容器（５００ｍ
Ｌ）に、−５０℃で撹拌しながら、５ｇ（１８．７ミリモル）のエクイリン(III
)を添加した。この混合物を−５０℃で２４時間撹拌した後、２Ｌの氷水に注ぎ
込んだ。得られた固形物を濾過し、水で洗浄し、Ｐ2Ｏ5上の真空下で乾燥させた
。粗生成物（４.８ｇ、収率９６％）をガスクロマトグラフィー（米国薬局方第2
2版、補遺１(1990)、マック(Mack)、イーストン(Easton)、ペンシルベニア州、
第2127頁）に付した。９０％の３-ヒドロキシエストラ-１,３,５(１０),８(９)-
テトラエン-１７-オン（Ｉ）および１０％の別の生成物（VI）であった。熱ベン
ゼンーヘキサン（１：１）から再結晶したが、（VI）を除去できなかった。粗製
２０カラム（５×５０ｃｍ、高さ４７ｃｍまで充填）上でのクロマトグラフィー
に付し、（クロール・ジー・ジェイ(Krol GJ)、マッセラーノ・アール・ピー(Ma
sserano RP)、カーネイ・ジェイ・エフ(Carney JF)、コー・ビー・ティー（Kho
BT）（1970）の方法、液体分割クロマトグラフィーによる遊離エストロゲンの定
量的分離［ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（JPharm S
ci）59：1483-1487］を用いて）シクロヘキサン／ベンゼン／メタノール（５０
０：１５０：７５）で溶出した。流速は４ｍＬ／分であり、溶出液は２７０ｎｍ
でモニターした。いくつかの画分を採取し、ガスクロマトグラフィーによって分
析した。（Ｉ）を含む画分は、約２３５０ｍＬで溶出した。組成および純度が同
様の画分を合わせて蒸発乾固し、他の生成物（VI）を含まない３５０ｍｇの（Ｉ
）を得た。このクロマトグラフィーで得た物質は、熱ベンゼン溶解した後、ヘキ
サンを濁点まで添加することによって、さらに精製した。この溶液を室温まで冷
却した後、４℃で２４時間保持した。生成物を濾過し、風乾し、熱エタノールに
溶解した。この熱溶液に炭を添加した後、濾過し、熱水を濁点まで添加した。室
温まで冷却し、そして４℃で６０時間冷却した後、濾過して風乾し、３００ｍｇ
の純粋な（Ｉ）を得た。融点２２９〜２３０℃（分解、融解までは紫色）。スペ
クトルおよび他のデータは、表１を参照のこと。
生成物（VI）を含む画分は、さらなる処理のために保存した。
△９(１１)-デヒドロエストロン（II）の調製
（３-ヒドロキシエストラ-１,３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン）
１５０ｍＬの液体フッ化水素を含有するポリエチレン製の反応容器（５００ｍ
Ｌ）に、０℃で撹拌しながら、６ｇ（２２．４ミリモル）のエクイリン（III）
を添加した。この混合物を０℃で０.５時間撹拌し、そのうち５０ｍＬ部分を取
り、１Ｌの氷水に注ぎ込んだ。得られた固形物を濾過し、水で洗浄し、Ｐ2Ｏ5上
の真
空下で乾燥させた。粗生成物のガスクロマトグラフィー（米国薬局方第22版、補
遺１(1990)、マック(Mack)、イーストン(Easton)、ペンシルベニア州、第2127頁
の方法を用いた）は、以下の３成分を示した：３８％の３-ヒドロキシエストラ-
１,３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン(II)、５５％の３−ヒドロキシ
エストラ-１,３,５(１０),８(９)-テトラエン-１７-オン(Ｉ)、および（Ｉ）の
合成で得られたものと同じ生成物（VI）７％。残りの反応混合物を０℃でさらに
１時間撹拌し、次の５０ｍＬ部分を取った。これを上記のように処理し、ガスク
ロマトグラフィーに付したところ、同じ３成分を、３-ヒドロキシエストラ-１,
３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン（II）が５５％、３-ヒドロキシエ
ストラ-１,３,５(１０),８(９)-テトラエン-１７-オン（Ｉ）が４０％、および
（Ｉ）の合成で得られたものと同じ生成物（VI）が５％の割合で示した。残りの
混合物５０ｍＬを０℃でさらに２時間撹拌し、反応混合物を上記のように処理し
た。ガスクロマトグラフィーは、粗生成物が１００％の３-ヒドロキシエストラ-
１,３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン（II）であることを示した。こ
の物質（１.６ｇ、収率８０％）は、６０ｍＬの沸騰メタノール／アセトン（２:
１）に溶解し、炭を添加した。この溶液を熱濾過して炭を除去し、１０ｍＬの蒸
留水を沸騰溶液に添加した。この溶液を室温に冷却し、そして４℃で４８時間冷
却した。生成物を濾過して風乾し、１.２ｇの純粋な３-ヒドロキシエストラ-1,
３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オン（II）を得た。融点２５５〜２５
７℃(分解)。スペクトルおよび他のデータは、表１を参照のこと。
△９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）の調製
（８α-３-ヒドロキシエストラ-１,３,５(１０),９(１１)-テトラエン-１７-オ
ン）
（Ｉ）の合成に由来の（VI）を含有する画分を合わせ、同じカラムおよび溶離
液を用いて再度クロマトグラフィーに付した。画分を採取し、ガスクロマトグラ
フィーによって確認した。（VI）の純粋な画分を合わせ、蒸発乾固し、エタノー
ル／水から再結晶し、１２０ｍｇを得た。融点２４３.５〜２４４.５℃(分解)。
スペクトルおよび他のデータは、表１を参照のこと。
結果および考察
ジャッキージィ（Jacquesy）（ジャッキージィ・ジェイ・シー(Jacquesy JC)
、ジョリー・ジー(Joly G)、ゲッソン・ジェイ・ピー(Gesson JP)。過酸性媒体
中における反応。酸性または超酸性媒体中におけるエクイリンの選択異性化。コ
ンプト・レンド・アカド（Compt rend Acad）274：969-971）は、０℃では（II
）
が唯一の生成物であり、−３０℃では（Ｉ）が唯一の生成物であると述べた。設
備の制約により、（Ｉ）の合成は−５０℃で実施した。−５０℃における粗製の
反応生成物の分析は、未知の（VI）に対する（Ｉ）の割合が９：１であることを
示したが、この（VI）は出発物質や（II）および（IV）のいずれでもなかった。
さらに、完結する前に０℃での反応を停止させると、様々な割合の（Ｉ）と（II
）
ＬＨ-２０カラム上での液体分割クロマトグラフィーによって（クロール・ジー
・ジェイ(Krol GJ)、マッセーラーノ・アール・ピー(Masserano RP)、カーネイ
・ジェイ・エフ(Carney JF)、コー・ビー・ティー（Kho BT）（1970）の方法、
液体分割クロマトグラフィーによる遊離エストロゲンの定量的分離［ジャーナル
・ファーマコロジカル・サイエンス（J Pharm Sci）59：1483-1487］を用いて）
分離した。質量分析、ＩＲ、ＵＶおよび1Ｈ ＮＭＲによる（VI）の分析は、それ
がエクイリンの異性体であるという結論に導いた。異性化反応に関するジャッキ
ージィ（Jacquesy）の理論的取扱いに基づけば、（VI）は３-ヒドロキシエスト
ラ-１,３,５(１０),８(１４)-テトラエン-１７-オン（Δ８(１４)-デヒドロエス
トロン）（Ｖ）であると思われた。
しかし、（VI）の核磁気共鳴スペクトルは、ビニルプロトンに特徴的なδ（Ｃ
ＤＣｌ3）６ｐｐｍに１つのプロトン多重項を示した。さらに、（VI）の1Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトルは、（II）のそれと同様である。両方は、δ（ＣＤＣｌ3）６ｐ
ｐｍ近くにビニルプロトン多重項と、同様の芳香族分裂パターンとを有している
。（Ｉ）の芳香族分裂パターンは、（VI）のそれとかなり異なっている。８-１
４位の二重結合異性体は、ビニルプロトンを有さないので、（Ｖ）は除外され、
(II)については、８および／１４位におけるプロトンの配向が逆である９−１１
位の二重結合異性体が好ましい(８位および１４位のみが変化している９(１１)
位の二重結合異性体の構造(VI)、（VII）および（VIII）を参照)。
二重結合が９-１１位に存在することをさらに示すものとして、（VI）のＵＶス
ペクトルは（II）のそれと非常に類似している。
高磁場1Ｈ ＮＭＲの研究は、（VI）がクロロホルム溶液中で自発的に（Ｉ）に
転換することを表しているが、このことは他の全てのエストロゲン様ステロイド
と同様に１４位のプロトンがαであり、反転しているのが８位のプロトンである
ことを示す。
（VI）ならびにエクイリンおよびエクイリン異性体(Ｉ)、（II）および（IV）
の分析データおよびスペクトルデータを表１に示す。
参考文献
１．ブッダヴァリ・エス（Budavari S）(1989)。ザ・メルク・インデックス（
The Merck Index）第11版、メルク・アンド・カンパニー・インコーポレイティ
ッド(Merck & Co Inc)、ラーウェイ（Rahway）、ニュージャージー州、第3582頁
。
２．カウフマン・セント（Kaufmann St）、パタキ・ジェイ(Pataki J)、ロー
ゼンクランツ・ジー(Rosenkranz G)、ロモ・ジェイ(Romo J)、ジェラッシ・シー
（Djerassi C）(1950)。ステロイドVI。ステロイドの１,４-ジエン-３-オンのヴ
ォール-チーグラー（Wohol-Ziegler）臭素化。６-デヒドロエストロンおよびエ
クイレニンの部分合成。ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ
ィ（J Am Chem Soc）72：4531-4534。
３．パールマン・ダブリュー・エイチ（Pearlman WH）、ウィンターシュタイ
ナー・オー（Wintersteiner O）(1940)。環Ｂに酸素を有するエストロゲン。II.
７-ヒドロキシエストロン由来のΔ６-イソエクイリン。ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J Biol Chem）132：605-612。
４．バーンズ・ディー（Banes D）、キャロル・ジェイ（Carol J）(1953)。イ
ソエクイリンＡの構成。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J
Biol Chem）204：509-515。
５．メイジャーライン・ビー・ジェイ(Magerlein BJ)、ホッグ・ジェイ・エイ
（Hogg JA）(1958)。１１-置換１,３,５(１０)-エストラトリエンの調製および
反応。Ｉ．１１-酸素化エストロンおよびエストラジオール。ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J Am Chem Soc）80：2220-2225。
６．シェリング・エイージー（Schering A-G）（ウェイスク・アール(Weiske
R)による）(1964)。ゲル・オッフェン（Ger Offen）1，177，636。ケミカル・ア
ブストラクツ（Chem Abstr）61：14748h。
７．コリンズ・ディー・ジェイ(Collins DJ)、シェーヴァル・ジェイ
素化された１７α-エチニルエストラジオールの合成。オーストラリアン・ジャ
ーナル・オブ・ケミストリー（Aust J Chem）36：339-360。
８．ゼリック・ジェイ・エイ(Zderic JA)、カルピオ・エイチ(Carpio H)、バ
ウアーズ・エイ(Bowers A)、ジェラッシ・シー（Djerassi C）(1963)。ステロイ
ドCCXXVIII。エクイリンの合成。ステロイド(Steroids)１：233-249。
式（VI）で示される化合物の有用な骨粗髭症活性は、標準的な薬理学的試験法
、例えば、骨吸収アッセイ：ラット後肢骨からの45Ｃａ放出と呼ばれる試験法に
よって示される。
このアッセイの目的は、培養物中における基本的または刺激された骨吸収を阻
害する化合物を同定することである。
骨吸収の過程を修正する△９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）の能
力は、本質的にエル・ジー・ライズ（L.G．Raisz）「組織培養物中における骨吸
収。副甲状腺ホルモンに対する応答に影響を与える因子。」、ジャーナル・オブ
・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Invest.）44：103-116（196
5）およびピー・エイチ・ステルン（P.H．Stern）ら、「ラット胎児後肢骨およ
びマウス新生児頭蓋冠の比較：副甲状腺ホルモンおよび１,２５-ジヒドロキシビ
タミンＤ3の効果」、カルシファイド・ティッシュ・インターナショナル（Calci
f.Tissue Int.）35：172-176（1983）に記載されているように評価することがで
きる。
方法：
後肢骨の調製
ズ・リバー(Char1esRiver)）に対し、妊娠１８日目に、１００μｌの０.９％食
塩水中における１００μＣｉ45ＣａＣｌ2（ＮＥＮカルシウム-４５ ＮＥＺ-０１
３）を皮下投与する。翌日、ＣＯ2で窒息させることによって、これらのラット
を死に致らしめる。胎児を取り出し、その右前肢を切除し、１０ｍＭ ＴＥＳを
添加してｐＨ７.３に調節した修正ＢＧＪb-フィットン・ジャクソン（Fitton Ja
ckson）培地（注文処方、ギブコ（Gibco）No.78-0088）からなる氷冷した外植片
培地を含有するペトリ皿に入れる。この修正ＢＧＪb培地は、塩、グルコース
または重炭酸塩を含まないものを入手し、使用前に、０.１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１.
２５ｍＭ ＣａＣｌ2、５.３ｍＭ ＫＣｌ、０.７ ｍＭ ＭｇＳＯ4、１３０ｍＭ
ＮａＣｌ、１.０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌ酢酸Ｎ
ａおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを補足する。この培地は、０.２μＭのフ
ィルター（ナルジェ(Nalge)）に通過させることによって除菌する。解剖顕微鏡
下で、骨に付着している組織を丁寧に掃除し、軟骨の末端を取り出す。
インキョベーションおよび薬物処理
中央骨幹を、各々、０.５ｍＬのプレインキュベーション培地を含有する２４
穴培養プレートの各ウェルに入れたステンレス鋼製スクリーン上に載せた３×３
ｍｍ四方の濾紙（ゲルマン（Gelman）ＧＮ-６測定用フィルター；孔径０.４５μ
Ｍ）上に置く。プレインキュベーション培地は、骨を移す前に３７℃にする。プ
レインキュベーション培地は、２９ｍＭ ＮａＨＣＯ3を含有するｐＨ７.３の修
正ＢＧＪb培地（上記のように塩およびグルコースを含む）からなる。５％ＣＯ2
中、３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、スクリーン／濾紙から
なる支持体上の骨を、骨吸収刺激剤（例えば、副甲状腺ホルモン［ＰＴＨ］また
はインターロイキン-１［ＩＬ-１］）を含む、もしくは、含まない、１５％熱不
活化ウマ血清（ギブコ（Gibco）No.230-6050）を補足したプレインキュベーショ
ン培地（ｐＨ７.３）に希釈した試験化合物を３７℃で０.５ｍＬ／ウェルの合計
容量で含有する新しいプレートに移す。非水性溶媒を必要とする化合物について
は、適当な原液から培地を用いて希釈液を調製する。これらの場合、同じ濃度の
賦形剤に曝露した基礎および骨吸収刺激対照が含まれる。１時間煮沸した別グル
ープの骨（死滅対照）を用いて、非細胞媒介の45Ｃａ交換を表すバックグラウン
ドを確立する。各胎児由来の右尺骨および橈骨を用いる。両方の骨は同じ処理を
行うが、各処理グループは４匹またはそれ以上の胎児由来の骨から構成される。
処理は、前臨床統計プログラム（ＰＳ-ＡＬＬＯＣ）を用いて、無作為に割り当
てる。５％ＣＯ2中、３７℃で４８時間インキュベーションを行った後、これら
の骨を培地から取り出し、０.５ｍＬの０.１Ｎ ＨＣｌで１日間またはそれ以上
にわたって抽出する。インキュベーション培地および骨抽出液の１５０μＬアリ
コット（二重）を、５ｍＬの液体シンチレーションカクテル中の45Ｃａ放射活性
について分析する。
計算：
培地中に放出された骨45Ｃａの百分率（％）は、以下のように決定する：
結果は、普通、適当な賦形剤対照に対する実験グループの45Ｃａ放出率（％）
の比として表す。
式（VI）で示される化合物の有用な骨粗鬆症活性は、さらに、基礎骨吸収アッ セイ
：ラット肢骨からの45Ｃａ放出と呼ばれる試験によって示すことができる。
このアッセイの目的は、骨吸収の刺激物質および阻害物質をインビトロで試験
することである。標識されたネズミ骨外植片から培地へのインビトロ45Ｃａ放出
を、骨吸収の指標として用いる。
骨の標識法
ラット胎児は、妊娠中の母ラット（１８日目）に１００μＣｉの45Ｃａを注射
することによって、インビトロで標識する。
外植片の調製
標識を開始してから２日後に、母ラットをハロタンで麻酔し、頸部脱臼によっ
て死に致らしめる。ラット胎児を切除し、すばやく断頭する。頭蓋冠(前頭骨お
よび頭頂骨)、前肢(橈骨および尺骨を含む)、および後肢（脛骨）を取り出し、
ペトリ皿中の対照培地に入れる。骨膜を破壊しないように注意しながら、鈍い刃
物で切開すること、および、吸収性の紙上でやさしく転がすことの組み合わせに
よって、骨から軟組織を除去する。長い骨から軟骨の端部を切り取る。頭蓋冠は
、正中縫合線に沿って半分に切断する。骨を以下の３つの部類に分離する：半分
にした頭蓋冠、脛骨および尺骨／橈骨。（骨のグループごとに）８つのグループ
を、０.５ｍＬの対照培地を含有する２４穴培養プレートに無作
為に入れる。培養物を、９５％空気：５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中、３
７℃で保持する。
これらの骨を２４時間インキュベートし、骨から培地を吸引し、試験物質を含
有する新鮮な培地で置換する。各骨グループは、８つの対照グループおよび８つ
の死骨グループを有する。培地中の骨を５５℃で６０分間加熱することによって
、失活した培養物を得る。これらの骨を３７℃でさらに７２時間インキュベート
する。この期間の最後に、１００μＬアリコットの培地を取り出し、シンチレー
ションバイアルに入れる。１０ｍＬのアクアゾル（Aquasol）を添加し、シンチ
レーション分析計で45Ｃａを定量分析する。骨を食塩水ですすぎ、シンチレーシ
ョンバイアルに入れ、０.７５ｍＬの６Ｎ ＨＣｌ中、室温で一晩加水分解する。
２.２５ｍＬの２Ｎ ＮａＯＨを添加することによって、加水分解した骨溶液を中
和した後、１０ｍＬのアクアゾル（Aquasol）を添加し、45Ｃａ含量をシンチレ
ーション分析法によって決定する。
分析：
ダンネット（Dunnett）の試験法によって、２４〜９６時間にわたる培養液中
への45Ｃａ放出を、対照培養物の45Ｃａ放出および失活した骨と、個々に比較す
る。
式（VI）で示される化合物の有用な骨粗鬆症活性は、ラットにおける神経除去 から誘発される骨減少症
と呼ばれる試験法によって、さらに示すことができる。
このアッセイの目的は、座骨神経の外科的な切断（神経除去）から生ずる固定
化によって誘発される骨量の減少（骨減少症）に対する薬剤のラットにおける効
果を評価する。
チャールズ・リバー（Charles River）から得た卵巣除去または無処理の雌
を用いる。これらの動物をプラスチック製のカゴ（４または５匹／カゴ）に入れ
、餌（ラット用のプリナ（Purina）５００チャウ(Chow)）および水を絶やすこと
なく、１４／１０（日／夜）周期で飼育する。
カゴの中で１週間環境順化させた後、動物を無作為に６〜１０ラット／グルー
プのグループに分割する。各ラットの体重を測り、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン
（ketamine）（ブリストル・ラボラトリーズ(Bristol Laboratories)、シラキュ
ーズ、ニューヨーク州）および０.７５ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン（Acepromaz
ine）（アヴェコ(Aveko)、エフ・ティー・ドッジ(Ft．Dodge)、アイオワ州）を
腹腔内投与することによって麻酔する。左後肢を剃毛し、大腿骨に平衡に横方向
に切開し、尾方大腿筋（caudofemoralis）および短内転筋に隣接する座骨神経を
０.５ｃｍ外科的に取り出すことによって、神経除去する。切開部は創傷クリッ
プで閉じる。外科手術後、これらのラットは、固定化した肢にさらに外傷が発生
するのを最小限にするために、綿のベットを用いたカゴで飼育する。薬物処理を
開始する前に、手術後の回復期間として２４時間を与える。
薬物ストックの濃度は、０.１ｍＬ／体重１００ｇの容量で送達されるように
計算する。薬物の溶剤または均一な懸濁液は、通常生理食塩水溶液中の１％ツイ
ーン８０で調製する。薬物は、４週間にわたり毎日(１週間に５回)、経口または
非経口経路によって投与する。
無機質化した組織の連続三重標識を用いて、骨変化（特に、骨形成）および無
機質化率を決定する。各動物に、９０ｍｇ／ｋｇのキシレノール・オレンジ(Xyl
enol orange)(フィシャー・サイエンティフィック・カンパニー(FisherScientif
ic Company)、エス・シー(S.C.)、１５ｍｇ／ｋｇのカルセイン（Calcein）（シ
グマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Company))、エス・シー(S.C.)、
および１５ｍｇ／ｋｇのデメクロサイクリン（Demeclocycline）（シグマ・ケミ
カル・カンパニー(Sigma Chemical Company)）を、各々、研究の終了する約２１
日前、１０日前および２日前に腹腔内投与する。
４週間に終わりに、各ラットの体重を測定し、０.７５ｍｇ／ｋｇのアセプロ
マジン（Acepromazine）と共に１００ｍｌ／ｋｇのケタミン（ketamine）を腹腔
内投与することによって麻酔し、約４ｍＬの血液を心臓穿刺によって採取する。
麻酔したラットを二酸化炭素に曝露することによって安楽死させる。両
肢の大腿骨および頚骨を軟組織から切除する。
（ｉ）マッフル炉を用いて、大腿骨を約１１００℃で１６時間かけて灰にする
。（ｉｉ）近位部の頚骨を固定し、脱水し、脱灰しないようにメチルメタクリレ
ート-グリコールメタクリレート混合物中に包埋する。ポリカット・エス・ミク
ロトーム（Polycut S Microtome）（ライフェルト(Reihert)）上で縦方向の組織
切片（１０ミクロン）を調製する。修正ゴールドナー染色法（modified Goldner
's stain）を用いて、自由に浮遊する切片を染色した後、載置してカバーガラス
をかける。
イメージ分析処理装置（ソフトウェアは、ドルクセル（Drexel）大学で開発さ
れた）を用いて、近位部の頚骨における海綿骨含量を（二次元の骨塩面積［Ｂ.
Ａｒ］として）定量する。
海綿骨含量の評価用に選択した頚骨の領域は、１次および２次の海綿状部分で
ある。この領域を評価用に選択して標準化するために、骨端成長板-骨幹端連結
部を、数値化スクリーンの横軸に対して平行に配向させる。次いで、成長板から
１.７ｍｍ（２次海綿状部分）および０.２ｍｍ（１次海綿状部分）離れ、かつ、
側面の皮質要素から等距離にある骨要素を上記のように定量する。評価した合計
の領域は、幅２.３０ｍｍおよび深さ１.４５ｍｍであり、面積は３.３４ｍｍ2と
なる。
体重、大腿骨量（乾燥時および灰化時）ならびに骨粱（海綿状）の骨塩面積（
Ｂ.Ａｒ）を測定する。
ダンネット（Dunnett）の試験法による一方向分散分析または他の多重比較法
を用いて、治療グループの無処理（対照）肢と脱神経肢との間における大腿骨量
および骨塩面積の差（絶対的な変化および変化率の両方）を、賦形剤グループの
ものと比較する。
骨は骨吸収の過程の間に分解し、これは引き続いて骨粗鬆症の発症をもたらす
。本発明は、宿主動物における骨吸収率と骨沈着率との間の均衡を修正し、それ
によって該骨沈着率に対する該骨吸収率の比を減少させるために宿主動物を治療
する方法であって、該均衡を修正し、該比を減少させるのに充分な量の
Δ９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）を該宿主動物に投与することか
らなる。
本発明によるΔ９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）の投与は、骨粗
鬆症または歯周炎を治療するための他の治療計画を補足することができる。例え
ば、Δ９(１１)-デヒドロ-８-イソエストロン（VI）の投与は、カルシウムをリ
ン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムとして毎日６００ｍｇ〜１２００ｍｇ摂取
することを補足することができる。また、Δ９(１１)-デヒドロ-８-イソエスト
ロン（VI）の投与は、複合エクインエストロゲンを毎日０.６２５ｍｇなどのエ
ストロゲン置換治療を補足することができる。
本発明の化合物（VI）は、抗酸化薬としても有用である。この有用性によって
、化合物（VI）は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、心血管疾患、再狭
窄（特に、バルーンカテーテル血管形成法により生ずる）、皮膚の老化やしわ、
および、アルツハイマー病を、治療、阻害または改善するのに用いることができ
る。その抗酸化性によって、本発明の化合物（VI）は、癌腫の治療にも有用であ
る。その抗酸化性によって、本発明の化合物（VI）は、遊離ラジカルの発生を防
止するのにも有用であり、それによって遊離ラジカルによって引き起こされる細
胞障害の予防および遅延に有用である。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
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ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ
Ｚ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ
，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，
ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ
(72)発明者 オーゼック，チェスター・ユージーン
アメリカ合衆国12979ニューヨーク州 ラ
ウゼス・ポイント、スミス・ストリート20
番
(72)発明者 アデルマン，スティーブン・ジェイ
アメリカ合衆国18901ペンシルベニア州
ドイルスタウン、ウィンディ・ラン・ドラ
イブ342番