JPH09512165A - インターロイキン１５ - Google Patents
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Classifications
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Abstract
(57)【要約】
本明細書中でインターロイキン-15（"IL-15"）と呼ばれている哺乳動物の上皮細胞由来T-細胞因子（"ETF"）ポリペプチド、その誘導体、DNA配列、組換えDNA分子、およびIL-15ポリペプチドを産生するように形質転換された宿主細胞が開示される。より詳しくは、この発明は単離された啼乳動物のIL-15ポリペプチド、およびT-リンパ球の増殖における事象を制御するその誘導体を提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
インターロイキン15
産業上の利用分野
本発明は概ね、哺乳類上皮由来のT細胞因子（“ETF”）ポリペプチド−本明細
書中ではインターロイキン15（“IL-15”）と呼ぶ−に関する。本発明は特に、I
L-15の生物学的活性を持つポリペプチドをコードする単離されたcDNA配列、単離
したIL-15ポリペプチドの配列及び誘導体、組み換えDNA技術を用いてIL-15ポリ
ペプチドを作る方法、T細胞の増殖及び分化を誘導する方法、並びに抗がん及び
抗感染症免疫を形成するIL-15を含む組成物に関する。
背景技術
種々のT細胞はTリンパ球とも言われ、免疫エフェクター細胞の1つのクラスで
ある。その細胞表面のCD4及びCD8分子が相互に排他的に発現することに基づいて
、末梢組織ではT細胞は2つの大きなグループに分けられる。典型的なCD8+T細胞
は活性化すると細胞傷害性T細胞になり、抗原を表示する標的細胞に直接結合し
て破壊する。CD4+T細胞は一般的に正のシグナルを出す。例えばB細胞に対する“
ヘルパー”（Ｂ細胞が分化して抗体産生細胞になるのを可能にする）の機能をす
ることから、ヘルパーT細胞と呼ばれる。
今までに6つのT細胞成長因子が同定されていた。この6つはそれぞれインター
ロイキン（IL）-2、4、7、9、12及び補因子のIL-10である。IL-2のオープンリー
ディングフレームは153アミノ酸からなる15kDaのポリペプチドをコードする。IL
-2はある種のT細胞及び大顆粒リンパ球によって産生される。IL-2は元々、ヒトT
細胞の長期に渡る成長を促進する因子として発見された。T細胞の成長に加え、
その効果は細胞傷害性T細胞（CTL）以外に、ナチュラルキラー（NK）細胞やリン
ポカインに活性化されるキラー（LAK）細胞及びマクロファージを活性化し、B細
胞の成長を促進することも含む。
IL-4は、活性化したT細胞、骨髄間質細胞及びマスト細胞によって産生される1
5から20kDaのタンパク質である。IL-4のオープンリーディングフレームは、マウ
スでは140アミノ酸のIL-4を、ヒトでは153アミノ酸のIL-4をコードする。IL-4は
元々、B細胞の成長と分化を活性化する因子として同定されていた。その効果に
は、マクロファージの活性化とクラスII MHC分子の誘導、ある種のT細胞及びマ
スト細胞の成長、ヒト末梢血T細胞の増殖とCTLの産生、B細胞による免疫グロブ
リンの産生の増強、及び幹細胞からの造血細胞の成長における補因子の機能も含
まれる。IL-4はIL-2によって誘導されたNK細胞及びLAK細胞の活性に対する負の
調節において重要な役割を果たす。ヒトIL-4はマウスの細胞に対しては活性を持
たない。
IL-7は、骨髄及び胸腺間質細胞によって産生される20から25kDaの177アミノ酸
からなるポリペプチドである。IL-7は元々は前B細胞成長因子とされていたが、
前B細胞のみならずB細胞前駆細胞の成長も促進する。また、ヒト末梢血T細胞の
増殖とCTLの産生、IL-2受容体の発現、IL-2の産生、及びCD4+及びCD8+細胞の増
殖を促進する。IL-7はさらに、IL-2を助けて胸腺でのT細胞の増殖を上昇させ、C
D4-及びCD8-胸腺細胞の増殖を誘導する。
IL-9は、活性化したTリンパ球によって産生される、144アミノ酸、30から40kD
aのポリペプチドである。IL-9は最初、ヘルパーT細胞成長因子として同定された
。IL-9は赤血球の発達を促進し、IL-3によって誘導される骨髄由来マスト細胞の
増殖を促進する。また、IL-4存在下でIgE及びIgGのB細胞による産生を調節する
。マウスIL-9はヒト細胞に対して活性を持つが、ヒトIL-9はマウス細胞に作用し
ない。
ヒトIL-10は、マクロファージ及びTH2 Tヘルパー細胞によって産生される（TH
1 Tヘルパー細胞では産生されない）、178アミノ酸、16から20kDaのポリペプチ
ドである。IL-2、IL-4及びIL-7と同じく、IL-10はいくつかの異なった生物活性
を持っている。IL-10は、活性化したT細胞によるサイトカインの産生を阻害する
能力に基づいて発見された。ヒト及びマウスIL-10のどちらも胸腺細胞及びT細胞
の成長促進補因子であり、IL-7と共同または、IL-2＋IL-4と共同で働く。IL-10
は、IL-4と共同または、IL-3＋IL-4と共同で働いてマスト細胞の生存及び成長を
促進する。また、IL-10はIgGの分泌及びB細胞上のMHCクラスII分子の発現を誘導
し、培養液中のB細胞の生存能を上昇させる。
IL-12は、リンパ芽球腫細胞系列中で構成的に発現するか、ホルボールエステ
ル及びカルシウムイオン透過担体によって誘導され、LPS刺激を受けたマクロフ
ァージによって産生される。IL-12の分子量は70kDaであり、ジスルフィド結合し
た2つの糖タンパク質からなる特異なヘテロ2量体構造をとる。2つの糖タンパク
質サブユニットのうち大きい方は328アミノ酸、40kDaのポリペプチドである。小
さい糖タンパク質サブユニットは253アミノ酸、35kDaのポリペプチドである。ど
ちらの糖タンパク質サブユニットも生物活性に必要である。IL-12は、活性化し
たT細胞のうちCD4＋とCD8＋のどちらの増殖もIL-2とは独立に促進する。またIL-
2はNK細胞を介した細胞傷害を活性化し、IL-2を助けてLAK細胞を生成する。IL-2
及びIL-7とは異なり、IL-12は休止中の末梢血単核細胞の増殖はほとんど引き起
こさない（これはIL-4と同様である）。
発明の概要
新規のT細胞成長因子を単離し精製した。以後本明細書中では、これをインタ
ーロイキン15（“IL-15”）と呼称する。サルIL-15ポリペプチドをコードするcD
NA配列を単離した。この配列には、489bpのオープンリーディングフレームと、
その上流の483bpの5'非コーディング領域、303bpの3'非コーディング領域が存在
する。ヒトIL-15をコードするcDNA配列には、489bpのオープンリーディングフレ
ームとその上流の316bpの5'非コーディング領域、397bpの3'非コーディング領域
が存在する。サル及びヒトのオープンリーディングフレームの塩基配列と推定さ
れるアミノ酸配列を配列番号1及び4に開示した。サル及びヒトのオープンリーデ
ィングフレームのどちらも、前駆体ポリペプチドをコードしている（配列番号2
及び5）。それぞれの前駆体は、48アミノ酸のリーダー配列及び成熟サルまたは
ヒトIL-15ポリペプチドをコードする配列からなる。活性型サル及びヒトIL-15ポ
リペプチドを、それぞれ配列番号3及び6に開示した。
さらに本発明には、他のIL-15ポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチ
ドは、配列番号1または4の塩基145から489によって定義される複数のプローブと
、またはこれらのプローブに相補的なDNA鎖またはRNA鎖と緩い条件から厳しい条
件
においてハイブリッド形成する塩基配列によってコードされ、発現に際してはT
リンパ球の増殖及び分化を促進するポリペプチドをコードする塩基配列によって
コードされるものである。さらに本発明には、遺伝コードの縮重のために、上に
記載した塩基配列がコードするIL-15ポリペプチドをコードする塩基配列及びこ
れに相補的な配列も含まれる。
さらに本発明では、前述の塩基配列を含む、IL-15ポリペプチドを産生するの
に有用な組み換えDNA分子−例えば発現ベクターまたはプラスミド及び形質転換
した宿主細胞−並びにそのような分子を用いた組み換えIL-15ポリペプチドを産
生する方法を提供する。
図面の簡単な説明
図1は、サルの活性型IL-15の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。
図2は、ヒトの活性型IL-15の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。
図3は、IL-15ポリペプチドを単離するのに有用な精製法及びタンパク質シーク
エンス決定法を示す。
図4は、ヒト及びサルのIL-15をコードする塩基配列間の相同性を示す。ヒトの
配列をサルの上に示した。
図5は、ヒト及びサルのIL-15のアミノ酸配列間の相同性を示す。ヒトの配列を
サルの上に示した。どちらの配列においても、リーダー配列（アミノ酸1から48
）が前駆体から切断されると成熟したポリペプチド（49から162）が形成される
。
図6は、CTLL-2細胞を用いた試験管内での（in vitro）組み換えIL-15、IL-2及
びIL-4の生物活性を示す。試験管内でのCTLL-2細胞の増殖刺激応答は、組み換え
体サイトカインの濃度の上昇（ng/mlで表す）で計測した。データは取り込まれ
た3H-チミジンのcpm（×10-3）で示した。
図7は、rIL-15及びIL-2によるCTLの細胞溶解活性の誘導を示す。抗原特異的細
胞傷害性Tリンパ球（CTL）を試験管内で確立した。IL-2またはヒトrIL-15を種々
の濃度で含む培地中で、あるドナーからのヒト末梢血単核細胞（PBL）を、異型
のドナーからの放射線照射したPBLで刺激した。この刺激細胞由来の51Cr標識し
た標的に対して、培養液の細胞溶解活性を検定した。特異的に遊離する51Crの最
大値の50%を生成するのに必要であるそれぞれの培養液画分を逆数にしたもので
、細胞溶解単位を表す。
図8は、rIL-15及びIL-2によるLAK細胞の細胞溶解活性の誘導を示す。リンホカ
インによって活性化されるキラー（LAK）細胞を試験管内で確立した。ヒトPBLを
放射線照射した自己由来のPBLで刺激し、Daudiリンパ芽球腫細胞系列に対して細
胞溶解活性を測定した。特異的に遊離する51Crの最大値の30％を生成するのに必
要であるそれぞれの培養液画分を逆数にしたもので、細胞溶解単位を表す。
図9は、rIL-15及びIL-2によるNK細胞の細胞溶解活性の誘導を示す。常磁性マ
イクロスフェアに対する抗体親和性によって単離したヒト全PBLから、CD16に対
する単クローン抗体を用いてナチュラルキラー（NK）細胞を単離した。精製した
NK細胞を3日間培養し、K562赤白血病細胞系列に対して細胞溶解活性を測定した
。
発明の詳細な説明
“インターロイキン15”または“IL-15”とは、本明細書中で開示したポリペ
プチドと類似の構造を有する哺乳類のポリペプチドで、Tリンパ球の増殖及び分
化を促進するものを指す。IL-15は、その構造及び細胞起源において、IL-2、IL-
4、IL-7、IL-9、IL-10及びIL-12と区別される（表1）。霊長類におけるIL-15ポ
リペプチドは、162アミノ酸のIL-15ポリペプチド前駆体として先ず上皮細胞で産
生される。この前駆体には48アミノ酸のリーダー配列が存在し、これが前駆体ポ
リペプチドから切り放されると成熟ポリペプチドができる。成熟IL-15ポリペプ
チドは、T細胞前駆細胞または成熟細胞の増殖及び／または分化のシグナルを出
すことができる。即ち、このタンパク質を用いて、試験管内でTリンパ球及びT細
胞系列を長期間培養することが容易になる。
“sIL-15”とはサルのIL-15を指す。“hIL-15”とはヒトのIL-15を指す。“rI
L-15”とは組み換え体のIL-15を指す。精製したsIL-15及びrIL-15のどちらもCTL
L-2細胞の増殖を促進する（Gillis and Smith,Nature 268:154(1997);ATCC TIB
214）。CTLL-2増殖検定では、組み換え体として発現させた前駆体及び成熟型sIL
-15のフレームを合わせた融合体に感染させた細胞の上清は、CTLL-2細胞の増殖
を誘導した。他の検定では、末梢血T細胞（“PBT”）及び末梢血白血球（“PBL
”）をヒト末梢血から単離した。我々は、予めフィトヘマグルチニン（“PHA”
）を加えて培養したPBT及びPBLの増殖をrIL-15が促進することを発見した。また
rIL-15はPHAによって活性化されたCD4＋及びCD8＋細胞の増殖も活性化する。rIL
-15は抗CD3（Ｔ細胞受容体）抗体の存在下で、休止中のヒトT細胞または休止中
のマウスT細胞クローンの増殖を促進した。PHAによって活性化したPBTの実験に
おい
て、IL-2またはIL-2受容体に対する抗体はIL-15を阻害しないことから、rIL-15
はIL-2とは独立にその成長促進効果を及ぼすということが証明された。
IL-15、sIL-15またはhIL-15という用語には、ある特定の条件において図1及び
2の核酸配列（塩基145から489、配列番号1及び4）に結合する核酸によってコー
ドされる、Tリンパ球の増殖及び分化を誘導し、T細胞系列及び単離したPBTの増
殖を促進する天然の哺乳類ポリペプチドの類似分子（ａｎａｌｏｇ）またはサブ
ユニットが含まれる。
本明細書中で使用する“組み換えDNA技術”または“組み換え”とは、単離ま
たは合成したDNAを形質転換または感染させて、異種構造のポリペプチドを生合
成するようになった微生物（例えば細菌、真菌、または酵母）または哺乳類細胞
または個体（例えば遺伝子組み換え体）から、特定のポリペプチドを生成する技
術及び方法を指す。天然のグリコシル化パターンは、哺乳類細胞発現系でのみ形
成される。酵母では異なったグリコシル化パターンになる。原核細胞（例えば大
腸菌）による発現では、一般的にゴリコシル化されないポリペプチドが生成する
。
“生物活性を持つ”とは、特定のIL-15ポリペプチドがTリンパ球の増殖及び／
または分化を促進することができるということである。sIL-15及びhIL-15の場合
、この生物活性はマウスまたは霊長類（例えばヒト）のT細胞系列またはPBTの増
殖促進にも当てはまる。
“塩基配列”とは、大きいDNA構築物の一部または独立の断片の形のポリヌク
レオチドを指す。このヌクレオチドとは、少なくとも一度は実質的に精製された
形で（例えば、細胞内物質が混在していない形で）、クローニングベクターのよ
うな基本的な生化学的方法（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A La
boratory Manual 第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N
Y(1989)に概略されているような方法）によってその塩基配列を同定、操作、及
び回収しうる量または濃度で単離したDNAに由来するものを指す。そのような配
列は、真核細胞に一般的に存在する内在性の非翻訳領域（即ちイントロン）に分
断されていない1つのオープンリーディングフレームの形で提供されることが望
ましい。オープンリーディングフレームの5'または3'にある非翻訳領域はコーデ
ィ
ング領域の操作または発現に支障ないので、そのまま存在していても良い。
“組み換え発現ベクター”とは、1つの転写単位からなるプラスミドを指す。
この転写単位は、（1）遺伝子発現において制御的な役割をになう単数または複
数の遺伝的要素（例えばプロモーターやエンハンサー）、（2）mRNAに転写され
てIL-15の生物活性を持つポリペプチドに翻訳される構造またはコーディング配
列、及び（3）適当な転写及び翻訳開始及び終結配列、の集合からなる。利用で
きる種々の調節因子については、後述する（組み換えDNA技術参照）。酵母発現
系で利用される構造因子には、翻訳されたポリペプチドを酵母宿主細胞の外に分
泌するためのリーダー配列が含まれていることが望ましい。一方細菌発現系にお
いては、組み換えポリペプチドにはN端メチオニン残基を含んでもよい。このN端
メチオニン残基は発現した組み換えポリペプチドから順次切断され、さらなる精
製に適した産物ができる。
“組み換え微生物発現系”とは、染色体DNAに組み換え転写単位を安定に組み
込むか、または組み換え転写単位を内在性のプラスミドという要素として保持し
ている、適当な宿主微生物（例えば、大腸菌のような細菌、S.cerevisiaeのよう
な酵母）の実質的に均質の単一培養物を指す。一般的に、組み換え微生物発現系
を構成する宿主細胞は、形質転換された1つの親細胞の子孫である。組み換え微
生物発現系は、発現すべき構造塩基配列につながった調節因子の誘導によって、
異種構造のポリペプチドを発現する。
形質転換された宿主細胞とは、組み換え発現ベクターを形質転換または感染さ
せた細胞を言う。発現された哺乳類IL-15は宿主細胞内に存在及び／または培養
上清に分泌されるが、これは宿主細胞及び宿主細胞に導入された遺伝子構築物の
性質による。
緩いハイブリッド形成の条件とは本明細書中で規定する通りであり、当業者に
は周知のことであり、例えばSambrook et al.,supra,Vol.2,pp.8.46-8.49及び9.
47-9.55に記載された条件である。緩い条件とは、Sambrook et al.に規定された
通り、例えば55℃、5×SSC、0.5%SDSでのハイブリッド形成反応一晩、ハイブリ
ッド形成後の洗い等を含む。厳しい条件とは、より高い温度または低い塩濃度で
のハイブリッド形成反応及びハイブリッド形成後の洗い等を含む。IL-15ポリペプチド
我々はサルIL-15（sIL-15）を精製し、成熟sIL-15のN末端ペプチド配列を決定
した。N末端アミノ酸配列及びPCRを用いてsIL-15をコードするcDNAを単離し、成
熟cIL-15の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列（図１）、並びにsIL-15ポリペ
プチドの前駆体の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を決定した（配列番号1
及び配列番号2）。サルにおけるIL-15前駆体ポリペプチドの配列は、成熟した活
性型タンパク質（配列番号3）及びその前にある48アミノ酸のリーダー配列から
なる。このリーダー配列は、配列番号2のアミノ酸1から48である。霊長類IL-15
はマウスT細胞系列（例えばCTLL-2）の増殖を促進し、ヒトPBT細胞の増殖及び分
化を促進する。
また本発明には、IL-15生物活性を有し、配列番号5に規定するプローブと緩い
条件から厳しい条件においてハイブリッド形成する塩基配列によってコードされ
る、他の哺乳類IL-15（ヒトIL-15を含む）が含まれる。特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、1993年2月19日に、ヒトIL-15
cDNAの組み換えクローンを含む1つのプラスミドをAmerican Type Culture Colle
ction,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 USA（“ATCC"）に寄託した。
寄託番号はATCC69245である。この寄託物は“I41-hETF”と名付けられ、プラス
ミドhETF/pDC406を持つ大腸菌からなる。このプラスミドには、SalIアダプター
が両端に付いた、316bpの5'非コーディング領域、続く489bpのオープンリーディ
ングフレーム及び397bpの3'非コーディング領域が含まれる。これらは配列番号7
及び8に示されている。寄託物の一般の利用に関する制限は、特許付与と同時に
完全に撤去される。
本明細書中で開示するIL-15ポリペプチドのアミノ酸構造は、他の化学種（例
えば糖質、脂質、リン酸、アセチル基等）との共有結合または会合による結合体
を作ることによって、またはアミノ酸配列の突然変異によって、変化し得る。哺
乳類IL-15の共有結合による誘導体は、哺乳類IL-15のアミノ酸側鎖またはN末端
またはC末端に特定の官能基を結合させることによって生成する。本発明の範囲
内にある哺乳類IL-15の他の誘導体には、哺乳類IL-15またはその断片と他のタン
パク質またはポリペプチドとの、共有結合または会合による結合体（例えば組み
換え培養によるN端またはC端融合体としての合成によるもの）が含まれる。この
結合したポリペプチドには例えば、哺乳類IL-15ポリペプチドのN端領域のシグナ
ル（またはリーダー）ポリペプチド配列で、IL-15の合成場所から細胞膜または
壁の内または外に輸送させるためのもの（例えば酵母α因子のリーダー）がある
。さらに、慣用された手法を用いて、付帯的なポリペプチド配列（例えばFcまた
は他の免疫グロブリン配列、リンカー配列、またはIL-15ポリペプチドの精製及
び同定を容易にする他の配列）を含む融合ポリペプチドとしてIL-15ポリペプチ
ドを発現させることができる。さらにIL-15融合ポリペプチドには、新規の多機
能体を提供する他のサイトカインとの融合体が含まれる。他のサイトカインには
例えば、インターロイキン1から13、腫瘍壊死因子（TNF）、顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マスト細
胞成長因子（MGF）、及び免疫細胞の成長、分化、機能に影響する他のサイトカ
インが含まれる。
さらに本発明には、グリコシル化の異なるIL-15ポリペプチドが含まれる。酵
母または哺乳類発現系（例えばCOS-7細胞（ATCC CRL 1651））で発現したIL-15
ポリペプチドは、天然のIL-15ポリペプチドに比べてその分子量及びグリコシル
化パターンにおいて類似しているかまたは有意な差異がありうる。これは発現系
の選択による。大腸菌のような細菌発現系でIL-15ポリペプチドを発現すると、
グリコシル化の無い分子が得られる。
ヒトまたは他の哺乳類IL-15の活性型変異体類似物（ａｎａｌｏｇ）は例えば
、オリゴヌクレオチド合成及びライゲーション、または部位特異的突然変異導入
によるN-グリコシル化部位の不活性化によって合成される。酵母発現系を用いて
、低炭水化物型の均質のIL-15ポリペプチド誘導体を発現させることができる。
真核生物のポリペプチドにおけるN-グリコシル化部位は、Asn-φ-Ωという三連
アミノ酸の特徴を持つ。ここでφはPro以外のアミノ酸、ΩはSerまたはThrであ
る。IL-15の変異型誘導体とは、本明細書中で示すように、天然の哺乳類IL-15の
配列と実質的に同質であるが、欠失、挿入、または置換変異のために天然の哺乳
類IL-15ポリペプチドとは異なったアミノ酸配列を持つポリペプチドである。
IL-15ポリペプチドと生物的に同等の変異型IL-15は、生物活性に必須でない、
アミノ酸残基もしくは配列の種々の置換、あるいは末端または内部残基もしくは
配列の欠失によって構築される。例えば、Cys残基を欠失または置換することに
よって、復元に際して誤った分子内ジスルフィド架橋を形成しないようにするこ
とができる。他の突然変異導入の方法には、KEX2プロテアーゼ活性を持つ酵母系
での発現を促進するために二塩基性アミノ酸残基を修飾することが含まれる。一
般的に、天然のアミノ酸残基と類似の物理化学的性質を持つ残基で置換すること
によって、置換を保存的に行うことができる。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドとは、IL-15センスmRNAまたはI
L-15アンチセンスcDNA配列に結合できる一本鎖核酸配列（RNAまたはDNA）を含む
。本発明に関するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドとは、図1また
は2のヌクレオチド配列、または図1または2のヌクレオチド配列の相補DNAまたは
RNAのヌクレオチド配列の断片を含む。そのような断片は少なくとも14ヌクレオ
チドからなり、IL-15DNAに結合することができるものとする。IL-15のcDNA配列
に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを制作する方法につい
ては、例えばStein and Cohen,Cancer Res.48:2659(1988)及びvan der Krol et
al.,Biotechniques 6:958(1988)に記載されている。
非組み換え細胞系からIL-15を単離し同定するには、IL-15を産生する哺乳類細
胞系列及び、IL-15刺激に応答して増殖する、応答細胞系列が必要である。哺乳
類IL-15の生物学的検定では、リンパ球細胞の増殖を誘導する因子の検出用に、
成長因子依存性T細胞系列を使用することができる。また、ヒトまたは他の哺乳
類から得た血液試料から単離したT細胞を用いて、哺乳類IL-15ポリペプチドを検
定できる。
IL-15依存性細胞系列は、マウスCTLL-2細胞から作製できる。この細胞系列は
精製したヒト、マウス、及び組み換えIL-2及びマウスIL-4に応答するが、IL-1、
IL-3、ヒトIL-4、またはその他の既知の成長因子には応答しない。
本明細書中で開示したサルまたはヒトIL-15cDNA配列を利用して、サルまたは
ヒトIL-15の他の哺乳類における相同物（ｈｏｍｏｌｏｇ）を他種間ハイブリッ
ド形成法によって得ることができる。簡潔に述べると、図1または配列番号1に記
載するsIL-15、または図2または配列番号4に記載するhIL-15cDNAのタンパク質コ
ーディング領域の塩基配列からプローブを作製する。このプローブは、Sambrook
et al.前述にあるような一般的な方法によって作製できる。サルまたはヒトの
プローブを用いて、緩い条件下で哺乳類cDNAライブラリーまたは染色体ライブラ
リーでのスクリーニングができる。哺乳類cDNAライブラリーは、例えばマウス末
梢血リンパ球から単離したmRNAから作製できる。あるいは、他のｃＤＮＡライブ
ラリー、または種々の組織もしくは細胞系列から単離したmRNAでノザンハイブリ
ッド形成法によるスクリーニングを行い、哺乳類IL-15DNAまたはRNAの適当な材
料を決定することができる。CV-1/EBNA IL-15の精製
我々は非均質的なタンパク質溶液（例えばIL-15を発現している細胞から回収
した馴化培地）から単離したポリペプチド試料を提供するために、IL-15を精製
した。天然馴化培地試料中のIL-15活性は、現在利用できるIL-15生物検定法を用
いては必ずしも検出できない。本明細書中に記載する生物検定を利用してIL-15
生物活性を検出できるまでには、少なくとも1段階の精製が必要である。
組織培養液中のアフリカミドリザルの腎臓細胞CV-1/EBNA系列（C.J.McMahan e
t al.,EMBO J.,10(10):2821-2832(1991);ATCC CRL 10478）を培養して、非均質
的なタンパク質溶液、例えば馴化培地を調製する。
培地は、高グルコースDulbecco'ｓModified Essential Medium（“DMEM”,Gib
co）が望ましい。増殖培地及び生産培地を用いるのが最も望ましい。本明細書中
に記載するようにsIL-15を単離するにあたって用いた増殖培地は、高グルコース
（4500mg/L）DMEMに7.5%ウシ胎児血清、50μl/mlペニシリン、50μg/mlストレプ
トマイシン、3から4.0mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必
須アミノ酸及び10mM N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン
酸］（“HEPES”）緩衝液を加えたものである。IL-15産生及び精製のため、ＤＭ
ＥＭに50μl/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、3から4.0mM L-グル
タミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸及び10mM HEPESを加え
た、フェノールレッドを抜いた血清を加えない生産培地を開発した。CV-1/EBNA
細胞は付着依存性であり、プレート、フラスコ、ローラーボトル、または微小担
体中で培養できる。
さらに詳しく言うと、制御した生物反応機中の微小担体上でCV-1/EBNA細胞を
培養することによって、IL-15を産生した。細胞のストックをローラーボトルフ
ラスコ中で維持した。産生サイクルの開始に当たって、細胞をトリプシン消化し
、上述した増殖培地及び5g/l Cytodex（登録商標）３微小担体（Pharmacia）を
含むスピナーフラスコに植えた。最初の接種濃度は1.5から3.5×105細胞/mlであ
る。細胞が微小担体に効率的に付着するように、細胞を2から24時間スピナーフ
ラスコ中に置いた。スピナーフラスコ中の培養液を37℃に保温し、25から40RPM
で振とうした。付着期間の後、培養液を制御した生物反応機中に移した。反応機
の温度、ｐＨ、酸素濃度及び振とう設定値はそれぞれ37℃、7.0、20％飽和（対
大気値）、及び75から85RPMである。細胞の増殖及び状態の通常の観察に際して
は、試料を明視野顕微鏡で観察した。細胞増殖の測定は、100mMクエン酸及び0.1
%クリスタルバイオレット溶液で処理した後遊離した核を数えることによって行
った。
培養液のアンモニア値が5.0mMに達する都度、追加の増殖培地を加えた。これ
を、微小担体がコンフルエントになるまで繰り返した。次に培地を前に記載した
無血清生産培地に交換した。この過程は、反応機の底に微小担体を沈降させ、増
殖培地を吸い取り、生産培地を代わりに加えることで行った。これを、約3125倍
希釈になるまで繰り返した。2回から6回の生産が期待できる。1回につき、細胞
を4から7日間生産培地に置き、その後生産培地の80%を回収した。これを、細胞
が微小担体から完全に分離するまで繰り返した。
sIL-15N端アミノ酸配列決定用のタンパク質を精製、提供するために、約64リ
ットルのCV-1/EBNA馴化培地を用いた。図3に示すように、精製法には限外濾過、
疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（RP-HPLC）、及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS-PAGE）が含まれる。タンパク質をSDSゲルからフッ化ポリ
ビニリデン（“PVDF”）膜に吸着させ、PVDF膜から直接エドマン分解してN末端
アミノ酸配列を決定することで、タンパク質の配列を決定した。N末端アミノ酸
配列を決定することで、配列番号3に示す最初の33アミノ酸が明らかになった。
続
いて、CV-1/EBNA cDNAライブラリーから得たcDNAクローンの配列を決定して、配
列番号2のポリペプチドをコードするDNA配列を得た。このクローンには、配列番
号2の比較的短い48アミノ酸のリーダー配列及び配列番号3に示す成熟ポリペプチ
ドが含まれている。組み換えDNA技術
ヒト、サル及び他の哺乳類IL-15ポリペプチドは、好ましくは、組み換えDNA技
術によって産生することができる。そのような技術は、ヒトまたは他の哺乳類IL
-15ポリペプチドまたはその誘導体を発現ベクターに挿入することを含む。
IL-15ポリペプチドまたはその誘導体の組み換えによる発現には先ず、発現に
際してIL-15ポリペプチドまたはその誘導体をコードするDNAクローン（即ちcDNA
）が必要である。cDNAクローンは、哺乳類IL-15ポリペプチドを発現する親細胞
または細胞系列から得られる。先ず細胞全mRNAを単離し、次に逆転写によってmR
NAからcDNAライブラリーを作る。本明細書中で提供するDNA配列の情報を用いて
、前に記載したように他種間ハイブリッド形成用プローブまたはPCRプライマー
を設計し、あるcDNAクローンを単離し同定することができる。
単離したcDNAは、内在性の非翻訳配列（即ちイントロン）によって分断されな
いオープンリーディングフレームの形式であることが望ましい。また、哺乳類IL
-15ポリペプチドの発現をコードする、関連した塩基配列を含むゲノムDNAを用い
て、コーディング配列を構築するのに有用な遺伝情報が得られる。当該技術分野
において周知の方法を用いて、単離したcDNAに突然変異を導入し、IL-15生物活
性を示すIL-15誘導体または類似体を作製することができる。
組み換え発現ベクターは、IL-15または生物活性を持つその誘導体をコードす
る合成またはcDNA由来のDNA断片を含む。IL-15またはその誘導体をコードするDN
Aを、適当な転写または翻訳調節配列または構造塩基配列（例えば哺乳類、微生
物、ウィルスまたは昆虫遺伝子由来のもの）に機能可能なように（ｏｐｅｒａｂ
ｌｙ）つなぐことができる。調節配列の例としては、遺伝子発現において調節的
な役割を持つ遺伝子配列（例えば転写プロモーターまたはエンハンサー）、転写
を調節するための付帯的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部
位をコードする配列、及び転写及び翻訳の開始及び終結を調節する適当な配列が
ある。調節配列が構造遺伝子と機能上の相関を持つ場合、塩基配列が機能可能な
ように結合しているという。あるシグナルペプチド（分泌リーダー）が哺乳類IL
-15またはその誘導体の前駆体アミノ酸配列の一部として発現されその分泌に関
わる場合、シグナルペプチドををコードするDNA配列を、哺乳類IL-15またはその
誘導体をコードする構造遺伝子のDNA配列に機能可能なようにつなぐことができ
る。さらに、あるプロモーターの塩基配列が、つながれたコーディング配列の塩
基配列の転写を調節する場合、プロモーターの塩基配列をコーディング配列（例
えば構造遺伝子DNA）に機能可能なようにつなぐことができる。またさらに、構
造遺伝子コーディング塩基配列（例えば哺乳類IL-15）につないだリボソーム結
合部位が、翻訳を促進するようにベクター内に配置される場合、構造遺伝子コー
ディング塩基配列にリボソーム結合部位を機能可能なようにつなぐことができる
。
哺乳類IL-15またはその誘導体の発現に適した細胞には、適当なプロモーター
の制御下にある原核生物、酵母、または高等真核細胞がある。原核生物にはグラ
ム陰性または陽性生物がある（例えば大腸菌またはバチルス）。形質転換に適し
た宿主原核細胞には、大腸菌、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、
及びPseudomonas、Streptomyces、Staphylococcus属内の他の様々な種が含まれ
る。また、より詳しく後述するように、適した宿主細胞には、S.cerevisiaeのよ
うな酵母、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のような哺乳類細胞系列、
または昆虫細胞がある。また、本明細書中に開示するDNA構築物由来のRNAから、
無細胞翻訳系を用いて哺乳類IL-15またはその誘導体を産生することができる。
細菌、真菌、酵母、及び哺乳類宿主細胞において利用される適当なクローニング
及び発現べクターは、例えばPouwels et al. Cloning vectors:A Laboratory Ma
nual,Elsevier,New York,1985に記載されている。
哺乳類IL-15またはその誘導体を酵母宿主細胞で発現させる場合、哺乳類IL-15
またはその誘導体をコードする塩基配列（例えば構造遺伝子）は、リーダー配列
を含ませることができる。このリーダー配列によって、翻訳されたポリペプチド
は酵母宿主細胞によってより良く細胞外に分泌されるようになる。
哺乳類IL-15を酵母宿主細胞で発現させる場合、Saccharomyces属（例えばS.ce
revisiae）の細胞が望ましい。また、PichiaまたはKluyveromycesのような酵母
の他の属も使用できる。酵母ベクターには、2μ酵母プラスミド由来の複製開始
配列、自己複製配列（ARS）、プロモーター領域、ポリアデニル化部位、及び転
写終結配列が含まれることが多い。酵母ベクターは、複製開始配列及び選択マー
カーを含むのが望ましい。酵母ベクターの適当なプロモーター配列には、メタロ
チオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al.,J. Biol. Chem.
255:2073,1980）、または他の解糖系の酵素（Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg
. 7:149,1968；及びHolland et al.,Biochem. 17:4900,1978）のプロモーターが
含まれる。解糖系の酵素とは、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド三リン
酸脱水酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ
、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ、及びグルコキナーゼなどである。酵母での発現に使用される他の好ま
しいベクター及びプロモーターについては、Hitzeman,EP-A-73,657にさらに詳し
く記載されている。
酵母ベクターの構築に当たっては、例えば大腸菌での選択及び複製のために、
pBR322由来のDNA配列（Ampr遺伝子及び複製開始点）を利用することができる。
酵母用の発現構築物に含まれ得る他の酵母DNA配列には、グルコース抑制性ADH2
プロモーター及びα因子分泌リーダー配列がある。ADH2プロモーターは、Russel
et al.(J. Biol. Chem. 258:2674,1982)及びBeier et al.(Nature 300:724,198
2)によって記載されている。酵母α因子リーダー配列は異種のポリペプチドの分
泌を促進する。α因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列との
間に挿入されることが多い（例えば、Kurjan et al.,Cell 30:933,1982；及びBi
tter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330,1984参照）。リーダー配列
の3'端を改良して、1つ以上の制限酵素部位を加えることができる。これによっ
て、リーダー配列と構造遺伝子との融合が容易になる。
酵母形質転換法は、当該業者には周知である。そのような方法の1つは、Hinne
n et al.,Proc Natl. Acad. Sci. USA 75:1929,1978に記載されている。Hinnen
らの方法は、0.67% yeast nitrogen base、0.5%カザミノ酸、2%グルコース、10m
g/mlアデニン、及び20mg/mlウラシル選択培地でTrp+形質転換体を選択するもの
である。
ADH2プロモーター配列を持つベクターで形質転換した酵母宿主細胞の発現を誘
導するために、栄養培地で培養する。栄養培地とは例えば、1% yeast extract、
2%ペプトン、及び1%グルコースに80mg/mlのアデニン及び80mg/mlのウラシルを加
えたものである。ADH2プロモーターの活性化は、培地中のグルコースが枯渇する
と起こる。
一方大腸菌のような原核宿主細胞では、哺乳類IL-15またはその誘導体は、原
核宿主細胞内での組み換えポリペプチドの発現を促進するN末端メチオニン残基
を持っていてもよい。このN末端Metは、発現した組み換え哺乳類IL-15から切断
される。
組み換え哺乳類IL-15またはその誘導体の構造遺伝子塩基配列を持つ組み換え
発現ベクターは、適当な宿主微生物または哺乳類細胞系列に形質転換または感染
させることができる。
原核宿主細胞に感染した発現ベクターは一般的に1つ以上の表現型選択マーカ
ーを含む。表現型選択マーカーとは例えば抗生物質耐性を与えるタンパク質また
は栄養要求性を補うタンパク質をコードする遺伝子で、宿主内での増幅を確実に
するための、宿主によって認識される複製開始点を含む。原核宿主細胞用のその
他の有用な発現ベクターには、商業的に入手できるプラスミド由来の細菌起源の
選択マーカーが含まれているものがある。この選択マーカーには、クローニング
ベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝要素からなるものがある。pBR322はアンピ
シリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むので、簡単な方法で形質転換した
細胞を同定することができる。pBR322“骨格”部分を、適当なプロモーター及び
哺乳類IL-15構造遺伝子配列と組み合せてある。他の商業的に入手できるベクタ
ーには例えば、pKK223-3（Phamacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）やpGEM1
（Promega Biotec,Madison,WI,USA）がある。
プロモーター配列は、組み換え原核宿主細胞発現ベクターでは一般的に使われ
ている。一般的なプロモーター配列には、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、
ラクトースプロモーター系（Chang et al.,Nature 275:615,1978；及びGoeddel
et al.,Nature 281:544,1979）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Gedde
l et al.,Nucl. Acids Res. 8:4057,1980；及びEPA 36776）及びtacプロモータ
ー（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,(1989)）がある。特に有用な原核宿主細胞発現系では、λファ
ージPLプロモーター及びcI857ts熱不安定性抑制因子の配列が用いられている。A
merican Type Culture Collectionから入手できるλPLプロモーター誘導体を組
み込んだプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2（大腸菌株JMB9(ATCC 37092
)中に入っている）及びpPLc28（大腸菌株RR1(ATCC 53082)中に入っている）があ
る。
また、哺乳類または昆虫宿主細胞系を用いて組み換え哺乳類IL-15またはその
誘導体を発現することができる。適当な哺乳類宿主細胞系列には、サル腎臓細胞
のCOS-7細胞（Gluzman et al.,Cell 23:175(1981)；ATCC CRL 1651）、L細胞、C
127細胞、3T3細胞（ATCC CCL 163）、CHO細胞、Hela細胞（ATCC CCL 2）、及びB
HK（ATCC CRL 10）細胞系列がある。適当な哺乳類発現ベクターに含まれる非転
写要素には、複製開始点、プロモーター配列、構造遺伝子につながったエンハン
サー、その他の5'または3'周辺非転写配列（例えばリボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライシング供与及び受容部位、及び転写終結配列）がある。
哺乳類宿主細胞発現ベクター中の転写及び翻訳調節配列は、ウィルス材料から
得られる。例えば一般的に利用される哺乳類プロモーター配列及びエンハンサー
配列は、ポリオーマ、アデノウィルス2、サルウィルス40（SV40）、及びヒトサ
イトメガロウィルス由来である。SV40ウィルスゲノム由来のDNA配列（例えばSV4
0複製開始点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位
、及びポリアデニル化部位）を用いて、哺乳類宿主細胞で構造遺伝子を発現させ
るのに必要な他の遺伝因子も提供される。ウィルス初期及び後期プロモーターは
ウィルス複製開始点をも含む断片としてウィルスゲノムから容易に得られるので
、特に有用である（Fiers et al.,Nature 273:113,1978）。SV40ウィルス複製開
始点中に位置するHindIII部位からBglI部位の約250bpの配列が含まれていれば、
小さいまたは大きいSV40断片のどちらも利用することができる。
典型的な哺乳類発現ベクターは、Okayama and Berg（Mol. Cell. Biol. 3:280
,1983）によって開示された通りに作ることができる。その他の有用な発現ベク
ターは、1990年2月14日出願の米国特許出願第07/480,694号及び1990年6月5日出
願の米国特許出願第07/543,193号に記述されている。組み換え哺乳類IL-15の精製
IL-15ポリペプチドは、IL-15ポリペプチドまたはその誘導体を発現するのに必
要な培養条件下で形質転換した宿主細胞を培養することによって調製できる。次
に発現産物のポリペプチドを培地または細胞抽出液から精製する。哺乳類IL-15
ポリペプチドまたはその誘導体は、商業的に利用できるタンパク質濃縮フィルタ
ー（例えばAmiconまたはMillipore Pellicon 限外濾過キット）を用いて濃縮で
きる。濃縮工程の有無に関わらず、培養液を精製担体（例えば疎水性クロマトグ
ラフィー担体）にかけることができる。フェニルセファロース（登録商標）CL-4
B（Pharmacia）は、適した媒体である。一方、陰イオン交換樹脂（例えばペンデ
ントなジエチルアミノエチル（DEAE）基を持つ担体または基質）を用いることも
できる。担体はアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、また
はタンパク質精製に用いられる他種のものでも良い。または、ゲルろ過基質を用
いることもできる。組み換えIL-15は酸性の水性緩衝液中では安定なので、陽イ
オン交換樹脂を用いることもできる。
最後に、疎水性RP-HPLC媒体（例えば、ペンデントなメチル基または他の脂肪
族基を持つシリカゲル）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）
を1回または複数回行って、IL-15をさらに精製することができる。前述の精製工
程の一部または全てを種々に組み合せて、実質的に均質の組み換えタンパク質を
提供することができる。あるいは、以前に記載したサルIL-15の精製法に用いた
過程の一部または全てを利用することもできる。
細菌培養液から産生した組み換えタンパク質を単離するには通常、先ず宿主細
胞を破砕し、遠心し、不溶性のポリペプチドならば細胞塊から、可溶性のポリペ
プチドならば上清から抽出し、濃縮、塩析、イオン交換またはサイズ排除クロマ
トグラフィーを1回以上行う。微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波破砕、
機械的な破壊、または細胞溶解試薬の使用などの簡易法によって破砕できる。
形質転換した酵母宿主細胞は、IL-15を分泌タンパク質として発現する目的に
好んで用いられる。これを用いると、精製が簡略化される。酵母から分泌された
組み換えポリペプチドは、Urdal et al.（J. Chromatog. 296:171,1984）に開示
された方法と類似の方法で精製できる。Urdalらは、予備的なHPLCカラムでRP-HP
LCを2回連続して行って組み換えヒトIL-2を精製したと記載している。哺乳類IL-15ポリペプチド及びその誘導体の投与
本発明は、有効量のIL-15を適当な希釈剤または担体中に入れたものを含む、
治療用組成物の使用方法を提供する。治療目的のために、精製したIL-15または
その生物活性を持つ誘導体を、処置に際して兆候に適した方法で罹患者（ヒトで
あることが望ましい）に投与する。例えば、ある種の貧血症を抑制するために投
与するIL-15組成物は、大丸薬の注入、連続的な注射、挿入体からの持続的な放
出、または他の適当な方法によって与えられる。投与は、静脈注射、皮下注射、
または非経口または腹膜内注射によって行うことができる。特に、IL-15治療剤
は、生理的に受容可能な担体、補形薬、または希釈剤と精製したポリペプチドを
組み合せた薬剤組成物の形式で投与することが考えられる。そのような担体は、
使用する量と濃度においては患者に対して無害なものであろう。一般にそのよう
な組成物の調製には、哺乳類IL-15ポリペプチドまたはその誘導体と以下のもの
との組み合せが含まれる。即ち緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分
子量（約10残基以下）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例え
ばグルコース、スクロース、またはデキストランを含む）、EDTAのようなキレー
ト剤、グルタチオン及びその他の安定化剤及び補形薬である。中性に緩衝した塩
水または非特異的な血清アルブミンと混合した塩水は、典型的な適当な希釈剤の
例である。
以下に示す実施例は具体例提示のためであって、これによって本発明の範囲が
限定されるものではない。
実施例１
天然sIL-15の精製と配列決定 限外濾過
限外濾過はIL-15を精製するに際して絶対的に必要なものではない。しかし，
その過程によって確かに、少量混入しているいくつかのタンパク質を除去し、そ
して体積を減少させることができ、よって精製機構の速度を上昇させることがで
きる。限外濾過工程はYM10またはYM30らせん状カートリッジ、空洞状繊維カート
リッジ、または様々な種類の限外濾過装置のディスク膜のいずれかを利用するこ
とによって行うことができる。しかし、Amicon限外濾過装置にYM30らせん状カー
トリッジを使用するのが好ましかった。この工程の前後にはバッファー交換の必
要はなかった。
均質ではないタンパク質溶液、即ち馴化培地を、増殖しているCV-1/EBNA細胞
を血清およびフェノールレッドを欠くDMEMにおいてバイオリアクターで5g/l Cyt
odex(登録商標)3マイクロキャリアーとともに培養することにより得た。8×8リ
ットルのバイオリアクター(合計約64リットル)が収集され，細胞とマイクロキャ
リアーを除去するために遠心し，0.22ミクロンのセルロースアセテート膜フィル
ターを通して濾過し，YM30らせん状カートリッジを用いて最終量を約2リットル
になるように濃縮した。YM30濃縮物は疎水性クロマトグラフィーにかける前に濾
過しておくことが望ましい。この工程でバクテリアや他の微粒子を除去すること
によってコンタミネーションを最小限に抑えることができる。フィルターは小孔
のサイズが0.1から0.45ミクロンでタンパク質を結合しないものであればあらゆ
るフィルターが使用できると思われるが，0.22ミクロンのセルロースアセテート
膜フィルターが望ましい。疎水性クロマトグラフィー
疎水性クロマトグラフィーはタンパク質を陰イオン交換カラムにのせられるよ
うな低塩濃度のバッファーに移すための迅速な方法であった。さらに，これによ
って精製の度合は3倍から6倍になった。そのうえ，この工程の前後にはバッファ
ー交換は一切必要でなかった。様々な疎水性カラムが適している。フェニルセフ
ァロース(登録商標)CL-4Bカラム(Pharmacia)が望ましい。本明細書中に記載され
ている疎水性クロマトグラフィーの工程に代わるものとしては，ジアフィルトレ
ーション(diafiltration)または透析の工程が使用できる。
好ましくは，限外濾過された濃縮物に最終濃度が約0.2Mになるように硫酸アン
モニウムを加えた。限外濾過濃縮物を、pH約8.5のHEPES緩衝液で最終濃度が約20
mMとなるように処理した。この濃縮物をフェニルセファロース(登録商標)CL-4B
カラムに注入し，結合していないタンパク質を除去するために0.2M硫酸アンモニ
ウム10mM HEPES pH約8.5 で洗浄した。結合タンパク質は10mM HEPES pH約8.5 に
よって溶出された。溶出したタンパク質のピーク(IL-15を含む)を陰イオン交換
カラムにかけた。陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製によって，透析またはバッファー
交換を必要とししない、さらなる精製を行うことができた。この工程においては
，フェニルセファロース(登録商標)タンパク質プールを陰イオン交換媒体を含む
カラムに2回通すことが好ましかった。通した後はいずれも結合タンパク質はNaC
lとともにHEPESに溶出された。種々の陰イオン交換媒体および緩衝液系はpHが約
8から約9のものが適しているが，DEAE Sephacel(登録商標)(Pharmacia)および続
くMono Qではバッファー交換または透析を経ずに次の陰イオン交換工程に進むこ
とが可能であった。DEAE Sephacel(登録商標)によって，高解離度Mono Q高速液
体クロマトグラフィー("FPLC," Pharmacia)にのせる前に多少の混入タンパク質
を除去することができた。NaCl濃度は選んだ陰イオン交換体および緩衝液のpHに
依存して使用された。タンパク質を陰イオン交換ゲルから溶出するためにはNaCl
の代替物として他の塩も使用できる。
最も好ましいのは，フェニルセファロースプールに最終伝導率が約1.2ミリシ
ーメンス／センチメートル("mS/cm")(およそ0.1M以下のNaCl)となるようにNaCl
を加えること，およびpH約8.5の約10mM HEPES中の0.1M NaClによって平衡化され
たDEAE Sephacel(登録商標)カラムに注入することであった。結合タンパク質は
，pH約8.5の約10mM HEPESにおけるNaClが約0.1から約0.3Mの範囲で直線勾配で溶
出された。溶出されたタンパク質活性画分(IL-15を含んでいる)を回収し、Mono
Q陰イオン交換カラムにかけた。
活性DEAE Sephacel(登録商標)プールは約10mM HEPESで最終伝導率が1.6mS/cm
以下(0.14M NaCl以下)になるように希釈した。希釈したプールを，pH約8.5の約1
0mM HEPES中の約0.14M NaClによって平衡化されたMono Q FPLC高速液体クロマト
グラフィーカラムに注入した。結合タンパク質はpH約8.5の約10mM HEPES中の約0
.14M から約0.5MのNaClによって勾配的に溶出した。活性画分(IL-15を含む)を回
収して逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)にかけた。RP-HPLC
天然の哺乳類IL-15ポリペプチドはpH約7から約9において，および約pH2.5の０
.１％ トリフルオロ酢酸("TFA")およびアセトニトリル("AcN")溶液において安定
である。IL-15活性は酸性水溶液の緩衝液を使用すると回収されなかった。従っ
て，多くのHPLC緩衝液系は除外され，精製スキームに含まれるべき陽イオン交換
クロマトグラフィーは使用できなかった。C4 RP-HPLCカラム(Vydac(登録商標)0.
46×25cm，5ミクロン)によって最高の精製が供給された。他の逆相カラム(C8ま
たはC18)は機能しなかった。すなわち，タンパク質は高濃度のAcNでC4から溶出
したが、C8またはC18からはまったく回収できなかった。我々が試した他の緩衝
液系(すなわち，酢酸アンモニウム／メタノールpH7 および酢酸ピリジン／プロ
パノール)も成功しなかった。
RP-HPLC精製では，Mono Q活性プールをVydac(商標)C4マトリックスに2回通す
ことが好ましい。最初に通すときは，Mono Q活性プールは約1ml/minでC4 HPLCカ
ラムに注入し，0.1% TFA/H2Oから0.1% TFA/100% AcNへと次に示す勾配をかけて
溶出した。その勾配は以下の通りであった：
0から 45% AcN，1% AcN/分
45から 60% AcN，0.5% AcN/分
60から100% AcN，2% AcN/分
ピークとなる活性画分(IL-15を含む)は約48%から約51%の間に溶出された。バ
イオアッセイによって決定された活性画分を回収し，0.1% TFA/H2Oで希釈してAc
N濃度を低下させ，同じC4カラムにかけた。
C4 TFA/AcNから回収された活性プールを希釈したものをC4カラムに戻し，0.1%
TFA/H2Oで洗浄し，0.1% TFA/H2O(緩衝液A)から0.1% TFA/60% n-プロパノール(
緩衝液B)まで直線勾配によって約0.5ml/minで溶出した。勾配は0.5%B/minでかけ
る。画分をバイオアッセイしてIL-15を含む画分を特定した。IL-15を含む画分を
回収した。SDS-PAGE
精製したIL-15は銀染色SDS-PAGEによって見ることができる。SDS-PAGEによっ
て分離された、精製した哺乳類IL-15タンパク質のバンドを電気ブロットしてN末
端アミノ酸配列の決定解析ができる。IL-15タンパク質バンドはバイオアッセイ
によって特定できる。
C4 TFA/n-プロパノールHPLCを通って精製されたIL-15タンパク質画分を高速吸
引によって乾燥させ，還元SDS試料緩衝液に再懸濁してポリアクリルアミンSDSゲ
ルにかけた。HPLC精製されたIL-15は2本の隣接したレーンでSDS-PAGE(Phastgel(
登録商標)8-25%，Pharmacia)にかけるのが好ましい。固定および染色の前に，約
1mmのゲルの薄片をPhastgel(登録商標)の1つのレーンから切り出し，直接バイオ
アッセイにかけた。残りのゲルは展開して銀染色したバンドをバイオアッセイに
かけた薄片と対応させた。IL-15活性は15-17kDaに対応した。特異活性決定のた
めに，精製したIL-15を還元SDS試料緩衝液に再懸濁し，14% ポリアクリルアミド
SDSゲル(Novex)にかけて銀染色した。15-17kDaに対応するsIL-15ポリペプチドの
純度は精製スキームの始めノCV-1/EBNA馴化培地におけるsIL-15ポリペプチドの
純度の約222,000倍に上昇していた(表2)。純度およびタンパク質のデータに加え
て，表2には精製過程の各工程の後に行ったCTLL-2バイオアッセイ(以下の実施例
2に記載されている)における天然のsIL-15ポリペプチドの活性も示した。
ＰＶＤＦ ブロット
１４％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルを約６０Ｖにセットした定常電流で約１
時間，ＰＶＤＦ膜（Applied Biosystems社のProBlot（登録商標））にブロット
した。タンパク質のバンドはＰＶＤＦ膜をクマシーブルー（０.１％；１０％酢
酸，５０％メタノール）で染色することによって視覚化することができる。タン
パク質のバンドを浮き上がらせるために，クマシーブルーを含まない同溶液を用
いて膜を脱染色してもよい。ＩＬ−１５活性に対応するタンパク質のバンドを切
り出し，ＰＶＤＦ膜から直接タンパク質のＮ末端の配列を決定した。ｓＩＬ−１５ポリペプチド配列決定
前述のＲＰ−ＨＰＬＣ工程によって得られたＩＬ−１５調製物を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって解析した。ゲルを銀染色してタンパク質のバンドの存在を示した
。視覚化されたバンドに対応する未染色ゲルの薄片をバイオアッセイすることに
よって，ＩＬ−１５活性は１５−１７ｋＤａの範囲に分子量を持つタンパク質に
関連していることが示された。ＰＶＤＦ膜にブロットされたその１５−１７ｋＤ
ａポリペプチドのＮ末端をエドマン分解法によってApplied Biosystems社のタン
パク質配列決定装置で配列決定した。結果は配列番号３に示した最初の３３アミ
ノ酸の同一性が示された。サルのライブラリーから得たｃＤＮＡクローンをそれ
に続いて配列決定したところ，配列番号２のポリペプチドをコードする配列が得
られた。配列番号２のポリペプチドは比較的短い４８アミノ酸のリーダー配列お
よび配列番号３に表される成熟ポリペプチドを含む。
実施例２
バイオアッセイ
ＣＴＬＬ−２細胞はＩＬ−１５ポリペプチドの検出のための迅速および感度の
良いバイオアッセイを供給する。ＩＬ−１５に応答して増殖する，様々な感度を
持つその他の細胞系列はＣＴＬＬ−２．４（Valentine et al.，Eur J. Immunol
.，21(4):913(1991)），３２Ｄ（Greenberger,Federation Proceedings 42:2762
(1983)），ＢＡＦ−ＢＯ３（Hatakeyama et al.，Cell，59:837(1989)），ＭＯ
７ｅ（Avanzi et al.，Br. J. Haematol. 69:359(1988)），およびＴＦ１（Kita
mura et al.，J. Cell. Physiol.，140:323(1989)）である。
好ましくは，ＣＴＬＬ−２細胞を，３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２、５％ウシ胎児
血清（ＦＢＳ）、５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌペ
ニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および３−４.０ｍＭ Ｌ−グ
ルタミンを補った高グルコースＤＭＥＭで３７℃，１０％ＣＯ2および湿度９７
％で成長させた。ＣＴＬＬ−２は成長にＩＬ−２を必要とする因子依存性の細胞
系列である。従って，アッセイを行うためには，ＩＬ−２を除去するためにＣＴ
ＬＬ−２細胞を，５％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール，５０
μｇ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン，および３−４.０
ｍＭ Ｌ−グルタミンを補った高グルコースＤＭＥＭで２回洗浄した。アッセイ
するＩＬ−１５サンプルは９６穴平底マイクロタイタープレートの中でＤＭＥＭ
５％ＦＢＳで滴定した。洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を加え（最終アッセイ体積
は１００μｌ，２０００細胞／穴），プレートを約２４時間，３７℃および１０
％ ＣＯ２でインキュベートした。プレートを3Ｈ−チミジン（２５Ｃｉ／ｍモ
ル）によって０.５μＣｉ／穴で５時間パルスし，細胞を回収し（Inotech ９６
穴細胞回収器），ＣＰＭを測定した（Packard Matrix ９６ガス比例計測システ
ム）。ユニットは，１ユニットが５０％最大刺激を与えるマイクロリットル数に
等しいとしてＣＰＭから計算する。
実施例３
ｓＩＬ−１５ ｃＤＮＡクローンの調製
精製したｓＩＬ−１５ポリペプチドのＮ末端３１アミノ酸の配列（配列番号３
のアミノ酸１−３１）を，ＩＬ−１５−特異的なＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲの
ための合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用した。Ｎ末端の
最初の６アミノ酸（Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ）から一
つのプライマーを設計し，最初の６アミノ酸残基に考えられる全てのコドンをコ
ードする混合の縮重混合物は以下の通りである
これは配列番号９に示されているが，ＹはＴまたはＣ，ＨはＡ，ＴまたはＣ，お
よびＮはＡ，Ｃ，Ｇ，またはＴを指す。サルの成熟したＮ末端２６−３１のアミ
ノ酸配列（Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）を第２のプライ
マーの設計に使用し，２６−３１のアミノ酸残基に考えられる、Ｖａｌの３個目
を除く全てのコドンの相補体をコードする縮重混合物は以下の通りである
これはそれぞれ配列番号１０および１１に示されているが，ＹおよびＮは上記の
ように定義され，ＲはＡまたはＧを指す。
１０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（”ＰＭＡ”）に
よって２４時間，３７時間，および７２時間刺激を受けたＣＶ−１／ＥＢＮＡ細
胞から抽出したポリアデニル化されたＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成のための分離
した鋳型鎖として用いた。商業的に入手可能である，オリゴヌクレオチドプライ
マーを含むＰＣＲ反応混合試薬に、第１鎖の反応の部分を加えた。この混合試薬
は標準緩衝液による１００μｌ反応スケールで濃度１μＭのプライマーとともに
３１サイクルのＰＣＲ増幅を行った。サイクルは次のように設定した。すなわち
，９４℃０.５分間の変性，０.５分間のアニーリング工程，および７２℃ ０.
７５分間の伸長工程である。５５℃，５３℃，および５１℃のそれぞれにおける
２サイクルのアニーリングに続き、４９℃のアニーリング温度で２５サイクル行
った。
増幅に続いて，試料を精製してアガロースゲル電気泳動にかけた。これによっ
てＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞に関連した２つの別々の反応から，ゲルのレーンから
切り出した９２塩基対のＤＮＡ断片が生成された。９２塩基対ＤＮＡ断片はＥｌ
ｕｔｉｐ−Ｄカラム（Schleicher & Schuell，Keene NH）を用いて精製し，pBlu
escript SK-（Stratagene，La Jolla，CA）にクローニングし，ジデオキシＤＮ
Ａ配列決定に用いた。
ハイブリダイゼーションのプローブは，サブクローニングされた９２塩基対の
ＤＮＡ断片をランダムプライミングによって標識して調製した。ハイブリダイゼ
ーションのプローブは，ＣＶ−１／ＥＢＮＡのポリアデニル化ＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡを挿入したプラスミドのライブラリーの一部を検索することに用いた
。この結果，C85.sIL-15クローンが単離された。オープンリーディングフレーム
をもつこのクローンは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含んでいる。
ｓＩＬ−１５のコード領域のポリペプチドのヌクレオチド配列は配列番号１に
示してある。この配列はC85.sIL-15挿入配列に由来している。ＳａｌＩリンカー
が付加されたC85.sIL-15を発現ベクターｐＤＣ４０６のＳａｌＩ部位に挿入した
（C.J. McMahan et al.，EMBO J.，10(10):2821-2832(1991)）。ポリアデニル化
ｍＲＮＡはＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系列から調製し，ｃＤＮＡは標準的な技術を
用いて調製した。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系列はｓＩＬ−１５の生産者である。
ｃＤＮＡ末端にはＳａｌＩアダプターを付加した（Haymerle et al., Nucleic A
cid Res，14:8615-24(1986)）。すなわち，
（それぞれ配列番号７および８），そしてベクターｐＤＣ４０６に挿入した。プ
ラスミドをもつ約５００個の独立な単離体をプレートに広げ，ＤＮＡプローブ断
片とハイブリダイゼーションすることによってスクリーニングを行った。ＤＮＡ
プローブ断片はＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系列のｃＤＮＡのｓＩＬ−１５の配列を
ＰＣＲによって調製した。
実施例４
ヒトＩＬ−１５のクローニング
ｓＩＬ−１５プローブは単離，調製，および放射性標識されたＳａｌＩ断片を
含む（約１.３７ｋｂ）ｓＩＬ−１５のｃＤＮＡからランダムプライミング標識
によって調製された。プローブの特異活性は約１×１０6ｃｐｍ／ｎｇであった
。ノーザンブロット解析では，プローブは，ＩＭＴＬＨ細胞系列を含む様々な部
分からのヒトのＲＮＡとハイブリダイズした。ＩＭＴＬＨ細胞系列はヒト骨髄ス
トローマ細胞をｐＳＶ３Ｎｅｏで安定に形質転換したものに由来する。このプロ
ーブは，ヒトＲＮＡと約４０％ホルムアミド中、約４２℃，１８時間でハイブリ
ダイズした。ハイブリダイゼーションに続いて，６ｘＳＳＣで約１０分間洗浄し
，続いて２ｘＳＳＣで４２℃，約３０分間洗浄した。放射線写真によってＩＭＴ
ＬＨのレーンに正のシグナルが確認された。
ヒトＩＬ−１５ ｃＤＮＡを含むプールを同定するために，ＩＭＴＬＨ ｃＤ
ＮＡライブラリーをＳａｌＩ消化した産物についてサザンブロット法によりプロ
ーブ探査をおこなった。前述のＣＶ−１／ＥＢＮＡライブラリーの際に使用した
Haymerle et al.，Nucleic Acid Res，14:8615-24(1986)の方法によってＩＭＬ
ＴＨライブラリーを発現ベクターｐＤＣ４０６に構成した。約１０００の異なる
ｃＤＮＡクローンからなるプールであるプール“１４１"が陽性として同定され
た。“１４１"の約４０００コロニーをプレートに広げ，ヒトＩＬ−１５ ｃＤ
ＮＡを含むコロニーを同定するために，慣用されたコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によってプローブ探査した。唯一のクローン，１４１.ｈＥＴＦのみがヒ
トＩＬ−１５をコードすることが示された。ヒトとサルのＩＬ−１５オープンリ
ーディングフレーム配列の間には約９６％のヌクレオチド配列の同一性，および
約９６％のアミノ酸配列の同一性が確認された（図４および５）。
実施例５
ｒＩＬ−１５によるＣＴＬＬ−２増殖の刺激
ＩＬ−１５の成熟型をコードするｃＤＮＡ（ヌクレオチド１４５から４８９，
配列番号１および４に含まれている）を異種哺乳類分泌シグナルの下流に挿入し
，ｓＩＬ−１５およびｈＩＬ−１５のためのｒＩＬ−１５発現プラスミドを作製
した。分泌シグナルは大部分がアミノ酸の疎水性領域（通常はポリペプチドのＮ
末端）であり，分泌およびシグナルペプチドのＣ末端と成熟な分泌タンパク質の
Ｎ末端との間の切断を調節している（von Heijne，Eur. J. Biochem.，116:419(
1981)）。ここで使用した分泌シグナルはネズミのＩＬ−７シグナル配列である
。生成したプラスミドをＣＯＳ−７細胞に感染させた。トランスフェクションさ
せた細胞培養液の上清はＣＴＬＬ−２の増殖を刺激した。さらに，ｈＩＬ−１５
の前駆体型のコード領域（配列番号３）をｐＤＣ４０６に挿入し，ＣＶ−１／Ｅ
ＢＮＡ細胞にトランスフェクションさせた。ｐＤＣ４０６：ｈＩＬ−１５ （即
ち，ｈＥＴＦ／ｐＤＣ４０６）をトランスフェクションさせた細胞の上清はＣＴ
ＬＬ−２細胞の増殖を刺激したが，空のベクターをトランスフェクションさせた
ものは増殖を刺激しなかった。
実施例６
ｒＩＬ−１５によるＣＴＬＬ−２増殖の誘導
サルＩＬ−１５の組換え体（サルｒＩＬ−１５）は実施例１に記載した精製法
から限外濾過およびイオン交換の工程を省略した方法で，ｓＩＬ−１５ ｃＤＮ
Ａを発現させた酵母の上清から精製した。精製したサルｒＩＬ−１５と，精製し
た組換えＩＬ−２およびＩＬ−４との生物活性を比較した。３つのタンパク質の
それぞれの純度はアミノ酸解析によって確認された。３つの組換えタンパク質の
それぞれの生物活性をＣＴＬＬ−２細胞を用いて試験管内でアッセイした。ＣＴ
ＬＬ−２培養液は１００μｌの補充した培地の中に培養液あたり２０００細胞と
ともに上に示したようなサイトカインを含んでいた。ＣＴＬＬ−２培養液は２４
時間の培養時間の最後の４時間に，培養液当たり０.５μＣｉの［3Ｈ］チミジン
でパルスし，ガラス繊維フィルターの上に回収し，流れ落ちる気体のイオン化に
よって放射活性を決定した。試験管内におけるＣＴＬＬ−２細胞の増殖応答は組
換えサイトカインの濃度の上昇によって測定した（ｎｇ／ｍｌで表される）。デ
ータは図６に取り込まれた3Ｈ−チミジンのｃｐｍ（ｘ１０-3）として表されて
いる。
実施例７
ｒＩＬ−１５によるＣＴＬ，ＬＡＫ，およびＮＫ溶解活性の誘導
抗原特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を試験管内で生成した。一人の
提供者に由来するヒト末梢血液単一核細胞（ＰＢＬ）（５ｘ１０5個／培養液）
を，同種異系の提供者に由来する，様々な濃度のＩＬ−２またはヒトｒＩＬ−１
５を持つか，あるいはサイトカインを持たない非照射ＰＢＬ培養細胞（５ｘ１０5
個／培養液）によって刺激した。培養はM.B. Widmer et al.，J. Exp. Med.，1
66:1447(1987)に記載されている方法に従っておこない，７日後に回収し，元来
の刺激性のドナーに由来する51Ｃｒ標識された標的に対する細胞の溶解活性をア
ッセイした。溶解アッセイは１０００個の標識された標的とともに２００μｌの
培地でＶ型孔で培養された様々な数の応答性ＰＢＬを含んでおり，４時間のイン
キュベーションの後に上清を回収した。溶解単位は特異的51Ｃｒ放出の最大値の
５０％を生成するために必要な応答性培養液に対応する画分の逆数として計算さ
れる。サイトカイン処理したＣＴＬに関するデータは図７にまとめてある。
リンホカインにより活性化されたキラー（ＬＡＫ）細胞は上記のＣＴＬと同一
の培養条件下で産生したが，ヒトＰＢＬは同種異系の提供者に由来するＰＢＬに
よって刺激されない点は除く。そのかわりに，自己由来の非照射ＰＢＬで置き換
え，溶解活性はＤａｕｄｉリンパ芽球様細胞系列に対する活性を測定した。ＬＡ
Ｋアッセイにおいては，溶解単位は，特異的51Ｃｒ放出の最大値の３０％を産生
するために必要な培養液に対応する画分の逆数として計算される。サイトカイン
処理したＬＡＫ細胞に関するデータは図８にまとめてある。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はヒトＰＢＬ全体からＭＡＣＳ（Miltenyi Bio
tec，Sunnyvale CA）とともに常磁性ミクロスフェアに対する抗体の親和性によ
って，抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を使用して単離された。精製されたＮＫ細
胞を３日間培養し，Ｋ６５２赤芽性白血病細胞系列に対する細胞溶解活性を測定
した。ＮＫアッセイにおいては溶解単位は、特異的51Ｃｒ放出の最大値の３０％
を産生するために必要な培養液に対応する画分の逆数として計算される。サイト
カイン処理したＮＫ細胞に関するデータは図９にまとめてある。
本明細書中の実施例６および７におけるＩＬ−２およびＩＬ−１５の活性の類
似性により，当該技術分野において通常の知識を有する者の中には，ＩＬ−１５
がＣＴＬ，ＬＡＫ，およびＮＫ細胞の活性を刺激し，腫瘍細胞およびウイルス感
染細胞を破壊するＴ細胞の数が増加することを期待する者もあろう。ＩＬ−１５
ポリペプチドの投与の項で既に記載されているように，適当な希釈液または担体
に含ませたＩＬ−１５の効果量を以下の患者に投与することが可能である。すな
わち，癌腫，黒色腫，肉腫性白血病，またはリンパ腫の患者，またはサイトメガ
ロウイルスを含むヘルペスウイルス科のウイルス，ポリオーマウイルス，ＨＩＶ
，インフルエンザウイルスを含むレトロウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎
ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，デルタ型肝炎ウイルス，またはＤ型肝炎ウイルス
を含む肝炎ウイルスに感染している患者である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 1/19 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21
1/21 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ
5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ
//(Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｒ 1:85）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:38）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(72)発明者 エイゼンマン，ジューン・アール
アメリカ合衆国ワシントン州98119，シア
トル，サード・アベニュー・ウエスト
2444
(72)発明者 ロウク，チャールズ
アメリカ合衆国ワシントン州98110，ベイ
ンブリッジ・アイランド，ノースイース
ト・ダップル・コート 6455
(72)発明者 ファン，ヴィクター
アメリカ合衆国ワシントン州98053，レッ
ドモンド，ノースイースト・セブンティー
ンス・ストリート 23261
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物のIL-15の生物学的活性を示すポリペプチドをコードしている単 離されたDNA配列であって、以下のもの： （a） 以下の配列 ［配列中、52番目のアミノ酸はLeuまたはHis、57番目のアミノ酸はAlaまたはT hr、58番目のアミノ酸はSerまたはAsp、73番目のアミノ酸はSerまたはIle、およ び80番目のアミノ酸はValまたはIleである］ を含む哺乳動物のIL-15のポリペプチドをコードしているDNA配列；および （b）(a)のDNA配列、またはその相補鎖に高強度の条件下で検出可能な程度に ハイブリダイズし、哺乳動物のIL-15の生物学的活性をもつポリペプチドを発現 するようにコードしているDNA配列 からなるグループから選択される、前記ＤＮＡ配列。 ２．哺乳動物のIL-15の活性を示すポリペプチドをコードしている上述のDNA配 列が、以下のもの （a）配列番号1のDNA配列のヌクレオチド145から489； （b）(a)のDNA配列、またはその相補鎖に高強度の条件下で検出可能な程度に ハイブリダイズし、哺乳動物のIL-15の生物学的活性をもつポリペプチドを発現 するようにコードしているDNA配列； および （c）遺伝暗号の縮重によって前述のDNA配列のいずれかにコードされるポリペ プチドをコードするDNA配列。 からなるグループから選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離され たＤＮＡ配列。 ３．哺乳動物のIL-15の活性を示すポリペプチドをコードしている上述のDNA配 列が、以下のもの （a）配列番号4のDNA配列のヌクレオチド145から489； （b）(a)のDNA配列、またはその相補鎖に高強度の条件下で検出可能な程度に ハイブリダイズし、哺乳動物のIL-15の生物学的活性をもつポリペプチドを発現 するようにコードしているDNA配列； および （c）遺伝暗号の縮重によって前述のDNA配列のいずれかにコードされるポリペ プチドをコードするDNA配列。 からなるグループから選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離され たＤＮＡ配列。 ４．請求項１の哺乳動物のIL-15の生物学的活性をもつポリペプチドをコード しているDNA配列を含む組換え発現ベクター。 ５．哺乳動物のIL-15の活性を示すポリペプチドをコードしている上述のDNA配 列が、以下のもの （a）配列番号1のDNA配列のヌクレオチド145から489； （b）配列番号4のDNA配列のヌクレオチド145から489； （c）(a)のDNA配列、またはその相補鎖に高強度の条件下で検出可能な程度に ハイブリダイズし、哺乳動物のIL-15の生物学的活性をもつポリペプチドを発現 するようにコードしているDNA配列； および （d）遺伝暗号の縮重によって前述のDNA配列のいずれかにコードされるポリペ プチドをコードするDNA配列 からなるグループから選択される、請求項４に記載の組換え発現ベクター。 ６．請求項4の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿 主細胞。 ７．請求項5の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿 主細胞。 ８．宿主細胞がE．coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、酵母、菌類 、昆虫細胞、および哺乳動物細胞よりなるグループから選択される、請求項6の 宿主細胞。 ９．宿主細胞がE．coliである、請求項8の宿主細胞。 １０．宿主細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項8の宿主細胞。 １１．宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項8の宿主細胞。 １２．宿主細胞がチャイニーズハムスターの卵巣である、請求項8の宿主細胞。 １３．宿主細胞がE．coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、酵母、菌類 、昆虫細胞、および哺乳動物細胞よりなるグループから選択される、請求項7の 宿 主細胞。 １４．宿主細胞がE．coliである、請求項13の宿主細胞。 １５．宿主細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項13の宿主細胞。 １６．宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項13の宿主細胞。 １７．宿主細胞がチャイニーズハムスターの卵巣である、請求項13の宿主細胞。 １８．IL-15の生物学的活性を示すポリペプチドの発現を促進し、それを培養液 中から回収するような条件下で、請求項６の宿主細胞を培養することを含む、IL -15のポリペプチドを調製する方法。 １９．IL-15の生物学的活性を示すポリペプチドの発現を促進し、それを培養液 中から回収するような条件下で、請求項７の宿主細胞を培養することを含む、IL -15のポリペプチドを調製する方法。 ２０．請求項1の単離されたDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、 単離された生物学的に活性なIL-15ポリペプチド組成物。 ２１．配列番号3によって定義されるアミノ酸を含む、請求項20に記載の単離さ れた生物学的に活性なIL-15ポリペプチド。 ２２．配列番号2によって定義されるアミノ酸を含む、請求項21に記載の単離さ れた生物学的に活性なIL-15ポリペプチド。 ２３．配列番号6によって定義されるアミノ酸を含む、請求項20に記載の単離さ れた生物学的に活性なIL-15ポリペプチド。 ２４．配列番号5によって定義されるアミノ酸を含む、請求項23に記載の単離さ れた生物学的に活性なIL-15ポリペプチド。 ２５．請求項20の単離されたIL-15ポリペプチドを含む、T-リンパ球の増殖を活 性化するための薬剤組成物。 ２６．請求項25に記載の、単離されたIL-15ポリペプチドを含む、T-リンパ球の 増殖を活性化するための薬剤組成物であって、単離されたIL-15ポリペプチドは 以下のもの： 配列番号3によって定義されるポリペプチド； および 配列番号6によって定義されるポリペプチド からなるグループから選択される、前記薬剤組成物。 ２７．生物学的に活性なIL-15ポリペプチドの前駆体ポリペプチドをコードする 単離されたDNA配列であって、前記DNA配列は以下のもの： 配列番号2によって定義されるポリペプチドを発現するようにコードしてい るDNA配列；および 配列番号5によって定義されるポリペプチドを発現するようにコードしてい るDNA配列 からなるグループから選択される、前記ＤＮＡ配列。 ２８．生物学的に活性なIL-15ポリペプチドの前駆体ポリペプチドをコードする 上述のDNA配列が以下のもの： 配列番号1のDNA配列；および 配列番号4のDNA配列 からなるグループから選択される、請求項２７に記載の単離されたＤＮＡ配列。
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