JPH09512171A - 無血清培地添加物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は無血清真核細胞培地添加物に関する。該添加物は炭素源、ビタミン類、無機塩類、アミノ酸および蛋白消化物からなる。本発明培地添加物は、寿命および生産性を増大させつつ、バッチ培養法で得られるのと同等またはそれ以上の細胞密度に哺乳動物細胞を維持することを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 無血清培地添加物 発明の背景 哺乳動物細胞のインビトロ培養の開発以来、これらの細胞が産生する多くの生 成物の診断および治療有効性のために、これらの細胞の大規模生産に対する要求 が増大してきた。これらの有用な薬剤は、モノクローナル抗体、ヒト・成長ホル モン、リンホカイン類、エリスロポエチン、血液凝固因子および組織プラスミノ ゲンアクチベータを包含する。 多くのこれらの細胞性薬剤について、哺乳動物細胞の培養は生きた生産源だけ を提供する。哺乳動物細胞は、正しい配置、正しいジスルフィド結合ならびに糖 鎖配列を有するかかる薬剤を合成する能力があり、それらすべてが天然に存在す る薬剤の望ましい活性を生じる。それゆえ、哺乳動物細胞由来の多くの薬剤は、 細菌または酵母の醗酵により発現された場合、より有効である可能性があり、標 的哺乳動物において、より免疫原性でない可能性がある。 生産性を改善するために、哺乳動物培養に栄養分供給するための多くの培地処 方が示唆されている（ファイク（Fike）ら、バイオファーマ（BioPharm.）１０ 月号：４９〜５４頁、１９９３年）。いくつかの示唆された培地処方は、最終培 養体積を有意に増加させる未濃縮栄養物を用いるものであり、そのため回収プロ セスを複雑化させる（リューベンリー（Reuvenry）ら、ディベロップ・バイオロ ・スタンダード（Develp.Biol.Standard）第６０巻：１８５〜１９７頁、１９８ ５年）。 濃縮栄養物の供給（すなわち、添加）はインビトロ培養法において好ましい。 なぜなら、より小さな体積の液体、すなわち、より濃縮された液体から生成物を より経済的に回収できるからである。添加方法には、基本処方中の栄養物濃度を 増加させること、あるいは添加物を培養物に供給することのいずれかを用いる（ ジョー イー・シー（Jo E.C.）ら、英国特許出願２２５１２４９Ａ、 １９９２年；ジョー イー・シーら、バイオテクノロジー・アンド・バイオエン ジニアリング（Biotechno1.& Bioeng.）第４２巻：１２２９〜１２３７頁、１９ ９３年；ルアン ワイ・ティー（LuanY.T.）、バイオテクノロジー・レターズ（ Biotechnol.Letters）第９巻：６９１〜６９６頁、１９８７年）。かかる供給法 に関してはごくわずかしか報告がない。しかしながら、供給培地中に血清が存在 しなくてはならず、それにより後の精製工程が複雑化し、生産コストが高くなる 。 哺乳動物細胞培養において使用する無血清添加物の開発に対する必要性が存在 する。 発明の概要 本発明は、無血清真核細胞培地添加物に関する。該添加物は炭素源、ビタミン 類、無機塩類、アミノ酸および蛋白消化物からなる。 本発明培地添加物は、寿命および生産性を増大しつつ、バッチ培養法で得られ るのと同等またはそれ以上の細胞密度に噛乳動物細胞培養を維持することを可能 にする。 図面の簡単な説明 図１は、本発明培地添加物を供給した場合と供給なしの同じ培地の場合とにお ける、モノクローナル抗体産生およびハイブリドーマ細胞系の細胞密度を示す棒 グラフである。 図２は、バッチ培養（すなわち、添加物供給なし）による抗体産生に対して、 本発明培地添加物を添加するフェドバッチ（fed-batch）法細胞培養を用いる１ ６種の異なるハイブリドーマの最終的なモノクローナル抗体産生を示すグラフで ある。 図３は、バッチ法の細胞培養に対して、本発明培地添加物を用いる添加による フェドーバッチ法における１６種のハイブリドーマの最大生細胞数を示すグラフ である。 図４は、バッチ法に対して、本発明培地添加物を添加するフェドーバッチ法に おける１６種のハイブリドーマの寿命を示すグラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、細胞培養中の真核細胞系を生きた状態に維持するために用いること のできる無血清培地添加物を見いだしたことに基づく。該添加物は炭素源、ビタ ミン類、無機塩類、アミノ酸および蛋白消化物からなる。 用語「添加物」は、濃縮された一定量の栄養分を含有する緩衝化溶液であって 、インビトロ真核細胞系に添加された場合、生育力を維持する緩衝化溶液を意味 する。古い培地または使用済み培地を除去する必要なく、本発明添加物をインビ トロ真核細胞培地に添加することができる。 本明細書の用語「バッチ法の細胞培養」は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を 含有するダルベッコの改変イーグルズ培地（ＤＭＥＭ）または無蛋白ハイブリド ーマ培地（ＰＦＨＭ−II）のような初期体積の栄養培地中に細胞を撒種する細胞 培養法であって、初期体積の栄養培地にはいかなる培地も補足しない培養法をい う。 本明細書の用語「フェドーバッチ法の細胞培養」は、初期体積の栄養培地中に 細胞を撒種する細胞培養法であって、連続的または半連続的に添加物を培地に添 加する培養法をいう。 本発明培地は炭素源を含む。適当な炭素源はＬ−グルタミンおよびＤ−グルコ ースを包含する。１リットルあたり約７．３グラム（ｇ／Ｌ）のＬ−グルタミン および２５ｇ／Ｌの濃度のＤ−グルコースを含有する炭素源が好ましい。 さらに、本発明培地はビタミン類からなる。適当なビタミン類は、ビオチン、 塩化コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシンアミド、安息香酸、パントテン酸 、ピリドキシン、リボフラビン、チアミンおよびＢ群ビタミンまたはそれらの混 合物を包含する。下表１に掲載するビタミン類を含有する混合物が好ましい。 さらにそのうえ、本発明培地は無機塩類からなる。適当な無機塩類は、塩化カ リウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムまたは混合物 を包含する。下表２に掲載する無機塩類を含有する混合物が好ましい。 さらに本発明培地はアミノ酸からなる。適当なアミノ酸は、アラニン、アルギ ニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒ スチジン、プロリン、イソロイシン、リジン、メチオニン、セリン、スレオニン 、トリプトファン、チロシンおよびバリンまたはそれらの混合物を包含する。下 表３に掲載するアミノ酸を含有する混合物が好ましい。 さらに、本発明培地は蛋白消化物からなる。適当な蛋白消化物は、プリマトン （primatone）ＣＬＴ、カゼインまたは酵素加水分解物を包含する。好ましい具 体例において、培地は、培地水分１リットルあたり２５ｇの量のプリマトンＲＬ からなる。 適例 材料および方法： 培養の維持、増殖および供給 凍結ハイブリドーマ細胞（１６種の異なる細胞系）を３７℃ですばやく融解し 、１０％ウシ胎児含有ＤＭＥＭまたはＰＦＨＭ（ニューヨーク州のギブコ(Gibco )製）中に移し、ｔ−フラスコで増殖させた。培養が最大生細胞密度の４０〜７ ０％になるまで細胞をｔ−フラスコ中、３７℃かつ５〜１０％ＣＯ₂に維持した 。 次いで、血球係数盤およびトリパンブルー染色により決定された少なくとも１ ０万〜２０万個／ｍｌの生細胞密度から、１、２または８リットルスピンナーフ ラスコ中で細胞を増殖させた。１リットルおよび３リットルのフラスコを３７± １℃に維持し、１０〜２０ｍｌ／分／Ｌの混合ガス（５％ＣＯ₂、２０〜４０％ ０₂、バランスＮ₂）を重層しながら５０〜８０ｒｐｍで撹拌した（撹拌バーで） 。１０ｍｌ／分／リットルで同じガス混合物を重層しオーバーヘッドドライブ（ overhead drive）を用いて８〜１０リットルのフラスコを５０ｒｐｍで撹拌した 。生細胞数、細胞生育力、グルコース濃度、アンモニア濃度、および乳酸濃度に ついて培養を毎日モニターした。 生細胞密度がピーク密度の５０％±２０％に達した時点で、２０ｍｌ／Ｌの無 血清培地添加物（成分を下表４に示す）を培養物に添加した。 供給を毎日継続し（４５％Ｄ−グルコース溶液）、生細胞密度が３０万個／ｍ ｌ未満に低下するまでＤ−グルコースを約１ｇ／Ｌ以上に維持した。培養物を集 め、細胞を取り、適当な精製手順で生産物を培養物から精製した。生細胞の計数 ラミナー・フロー・フード（laminar flow hood）中で培養物の０．５ないし １．０ｍｌの試料を無菌的に培養物から取り、マイクロフュージ・チューブ（mi crofuge tube）に入れた。 細胞懸濁液をトリパンブルー／ＰＢＳ（０．４％）で希釈し、十分に混合した 。カバースリップを血球計数盤上に置き、少量の細胞混合物をチャンバー中に入 れた。チャンバーを毛細管現象により満たした。１０Ｘ１０倍の顕微鏡で血球計 数盤を観察し、全部で８個の外側のボックス中の細胞を計数し記録した。生細胞 （明るい白色）および死細胞（青）を計数した。 ＥＬＩＳＡアッセイ ポリスチレンプレート（カタログ番号２５８０１〜９６ 高結合、平底、ニュ ーヨーク州コーニング（Corning）のコーニング製）中のウェルを、０．１Ｍ炭 酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中１：２００希釈したヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋ Ｌ）（カタログ番号１１５−００５−００３、ペンシルベニア州ウェスト・グロ ーブ（West Grove）のジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch） 製）１００μ１で、４℃において一晩被覆した。一晩インキュベーション後、液 体を除去し、０．０５％ツイン２０を含有するリン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ ）（ｐＨ７．４）でプレートを４回洗浄した。０．０５％ツイン２０を含有する ２％ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｐＨ７．４）２００μ１でウェルを満た して残存する結合部位をブロックした。室温（ＲＴ）で３０分インキュベーショ ン後、ブロッキング剤を除去し、１００μ１の希釈された培養物上清（０．０５ ％ツイン２０および０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈）または標準抗体標品（０ 〜２０ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。ＲＴで３０分インキュベーション後 、プレートを洗浄溶液で４回洗浄し、０．０５％ツイン２０および０．５％ＢＳ Ａを含有するＰＢＳ中１：２０００希釈された１００μ１のペルオキシダーゼ結 合ヤギ・抗マウスＩｇＧ（カタログ番号１１５−０３５−０６２、ジャクソン・ イムノリサーチ製）を各ウェルに添加した。ＲＴで３０分インキュベーション後 、プレートを洗浄溶液で４回洗浄し、１００μｌのＯＰＤ基質（カタログ番号Ｃ ＩＮ４９０５／ＣＩＮ４８０５、カリフォルニア州フォスター・シティー（Fost er City,CA）のメディックス・バイオテック，インコーポレイテッド（Medix Bi otech,Inc.）製）を各ウェルに添加した。ＲＴで５分インキュベーション後、１ ００μｌの０.２Ｎ硫酸を各ウェルに添加した。４９２ｎｍの吸光度をＥＬＩＳ Ａリーダーで測定し、直線状標準カーブから濃度を決定した。グルコース、乳酸、およびアンモニアの分析 培養試料中のグルコース、乳酸、およびアンモニア濃度をIBI Bio1yzer（コネ チカット州ニュー・ヘブン（New Haven,CT）のインターナショナル・バイオテク ノロジーズ，インコーポレイテッド（International Biotechnologies,Inc.）製 ）により、添付説明書に従って測定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ.炭素源； ｂ.ビタミン類； ｃ.無機塩類； ｄ.アミノ酸；および ｅ.蛋白消化物 からなる無血清真核細胞培地添加物。 ２．炭素源がグルタミンおよびグルコースを含有している請求項１の無血清真 核細胞培地添加物。 ３．ビタミン類が表１に掲載されたビタミン類を含有する混合物である請求項 １の無血清真核細胞培地添加物。 ４．無機塩類が表２に掲載された無機塩類を含有する混合物である請求項１の 無血清真核細胞培地添加物。 ５．アミノ酸が表３に掲載されたアミノ酸を含有する混合物である請求項１の 無血清真核細胞培地添加物。 ６．蛋白消化物がプリマトンＲＬである請求項１の無血清真核細胞培地添加物 。 ７．ａ.炭素源； ｂ.ビタミン類； ｃ.無機塩類； ｄ.アミノ酸；および ｅ.蛋白消化物 からなる培地添加物であって、培地に添加されると真核細胞の生育力を維持する 添加物を添加することからなる真核細胞系の培養方法。 ８．炭素源がグルタミンおよびグルコースを含有する混合物である請求項７の 無血清真核細胞培地添加物。 ９．ビタミン類が表１に掲載されたビタミン類を含有する混合物である請求項 ７の無血清真核細胞培地添加物。 １０．無機塩類が表２に掲載された無機塩類を含有する混合物である請求項７ の無血清真核細胞培地添加物。 １１．アミノ酸が表３に掲載されたアミノ酸を含有する混合物である請求項７ の無血清真核細胞培地添加物。 １２．蛋白消化物がプリマトンＲＬである請求項７の無血清真核細胞培地添加 物。