JPH09512177A

JPH09512177A - ネコ免疫不全ウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH09512177A
Application number: JP7528228A
Authority: JP
Inventors: ワードレー，リチャード・シイ; ロワリー，デビッド・イー
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-05
Publication date: 1997-12-09
Also published as: WO1995030019A1; ES2267101T3; EP1679377A1; US5833993A; EP0758396A1; AU2234995A; DE69535125T2; EP0758396B1; ATE334216T1; DE69535125D1

Abstract

(57)【要約】ＦＩＶｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含有するワクチンを開示する。好ましくは、該ｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質は、ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むバキュロウイルス発現系によって発現されるか、または、ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むネコヘルペスウイルスベクター中で発現される。また、組合せ粘膜／非経口、粘膜／粘膜および非経口／非経口接種法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ネコ免疫不全ウイルスワクチン発明の分野本発明は、一般に、免疫学および組換え遺伝学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、ネコ免疫不全ウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質およびｇａｇ蛋白質をコードする両方のＤＮＡ配列を含む組換えワクチン、ならびにこれらのコードＤＮＡ配列に基づくワクチンの使用方法に関する。発明の背景ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)は、以前はネコＴリンパ球親和性レンチウイルスと呼称され、カリフォルニア州ピータルマ(Ｐetaluma,Ｃalifornia)の大きな複数のネコ世帯から１９８６年に最初に単離された(Ｐedersonら，Ｓcience(198 7)235:790)。ＦＩＶは、レトロウイルス科のレンチウイルス亜科のメンバーとして分類されている。これは、ヒトおよびサルの免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血症、ヒツジの慢性進行性肺炎ビスナ、およびヤギ-関節炎脳炎ウイルス(ＣＡＥＶ)を包含する科である。ＦＩＶのゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに対応する３個の長いオープンリーディングフレームを有する他のレンチウイルス同様に組織化されている(Talbottら,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:5743;Ｏlm stedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:2448)。ｇａｇ遺伝子はウイルスの主要な構造要素をコードし、ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖蛋白質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はポリメラーゼ蛋白質をコードしている。ｇａｇ遺伝子は、５０ｋＤポリ蛋白質として発現され、これは３種のサブユニット：ｐ１５マトリックス蛋白質、ｐ２４キャプシド蛋白質、およびｐ１０ヌクレオキャプシド蛋白質にプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、３種の蛋白質：プロテアーゼ、逆転写酵素、および機能が知られていないｐ１４.６蛋白質をコードしている。遺伝子のプロテアーゼ部による自己プロセシングにより、該ｐｏｌ領域の３種すべての蛋白質が生じる。加えて、該プロテアーゼはｇａｇ前駆体のプロセシングにも関与している。ｐｏｌ遺伝子はｇａｇ-ｐｏｌ融合蛋白質として発現される。エンベロープ遺伝子は１６０ｋＤ糖蛋白質、ｇｐ１６０として発現される。ＦＩＶコア蛋白質の抗原性は他のレンチウイルスと同様である。調査によれば、一般集団におけるＦＩＶ感染ネコの中央値年齢が約３歳であるのに対して、臨床的に発病させたＦＩＶ感染ネコの中央値年齢は約１０歳であることが示されている(Ｓheltonら，J.Am.Anim.Hosp.Assoc.(1989)25:7)。ネコにおけるＦＩＶ感染の臨床的続発症は、５ステージに分けられている。第一フェーズであるステージＩは、種々の程度の発熱、好中球減少症、一般的なリンパ節疾患、下痢およびうつ病を示す数種の動物により極めて変動する。このステージの動物は、通常、持主によって疾病であるとは認識されず、前掲の兆候は実験的な感染で変動的に認められた。このフェーズからの回復にもかかわらず死亡率は低く、実質的にすべてのネコが長寿のキャリアーとなる。ウイルス血症は、現在までで常にこのフェーズに関連する最も一貫した兆候である。ステージIIの間に、ウイルスはまだネコ血中に認めることができ、現在それはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の循環数で生じる主な異常である。再発性発熱、体重損失および食欲不振のような漠然とした臨床病徴から、慢性口腔感染症、慢性腸炎、慢性呼吸器系感染症、慢性結腸炎および尿路および皮膚の細菌性感染症を包含し得る慢性二次または日和見感染の明白な徴候を示すまでの動物までの範囲の症候を有するとして数多くのネコが獣医に最初に示されるのがステージIII である。ステージIVは、さらなる体重損失および血液学的異常を伴う、ステージ IIIに記載した慢性二次感染によって特色づけられる。最後に、ステージＶにおいは、ネコの健康が数ヶ月ないし数年にわたってさらに衰退し、少数の生存動物は複数の体サイトに日和見感染を伴うヒト後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)に類似する状態を発症し得る。該ウイルスは血液単核細胞で最適に複製し、Ｔリンパ球、腹膜マクロファージ、脳マクロファージおよび星状細胞に対してウイルス親和性を有する。他のレトロウイルスと共通して、ＦＩＶの遺伝物質はＲＮＡよりなり、ウイルスＲＮＡのＤＮＡコピーの産生は宿主内におけるＦＩＶの複製に必須の工程である。この工程には、侵入ウイルスによって宿主内に運搬された逆転写酵素を要する。ウイルスゲノムのＤＮＡバージョンは、感染した宿主細胞の遺伝物質に挿入され、その中でプロウイルスとして存在し続ける。このプロウイルスは細胞が分割する時に毎回複製し、新たなウイルス粒子の産生をコードし得る。ＦＩＶに感染した細胞は、その寿命の間感染したままである。該ウイルスは、垂直伝播、主に、唾液中に相当量のウイルスを発するこれらの動物としての感染ネコからの噛傷によって拡範されるようである(Ｙamamotoら，Ａm.Ｊ.Ｖet.Ｒes.(1988)8:1246)。水平伝播も報告されているが、まれである。この伝播モードによれば、抗体での保護を測定することが理論的に可能である。現時点では、ＦＩＶによる感染に対して保護を供する販売されているワクチンは存在しない。最近の研究により、全感染細胞または細胞フリーウイルスで免疫化したネコが、攻撃に対して保護され、その保護が血清中和抗体の存在に大きな程度で関連するということが示唆されている(Ｙamamotoら，Ｊ.Ｖirol.(1993)67 :601；Ｙamamotoら，ＡＩＤＳＲes.Ｈum.Ｒetroviruses(1991)7:911)。しかしながら、この系の利点は不活化ワクチンの使用ではＦＩＶの医原性伝播を完全に除外しない。不活化調製物を使用するもう１つの利点は、これが、細胞毒性Ｔ細胞発達のための正確なＦＩＶ抗原提示が供されないことである。他の研究者達は、サブユニットまたはウイルスベクター化ワクチンのいずれかの形態で組換えアプローチに焦点をあててきた。ＰＣＴ特許出願 WO92/15684号はかかる努力を示している。ＰＣＴ国際公開WO 92/15684号は、糖蛋白質(ｇｐ)１６０エンベロープ蛋白質、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質およびｐ２４ｇａｇ蛋白質のＦＩＶからのクローニングおよび発現を報告しており、これらの蛋白質がＦＩＶの診断、治療および予防に有用となりことを示唆している。詳細には、ｇｐ１６０エンベロープ蛋白質またはｇａｇ蛋白質からの組換え蛋白質を使用してワクチンを開発する。WO 92/15684号の発明者または彼らの共同研究者により行われた提示の要約書は、１９９３年１０月６-９日、Ｆeline Ｒetrovir us Ｒesearch、合衆国ノースカロライナ州トライアングルパークによっては、その組換えＦＩＶｅｎｖ遺伝子産物が高血糖症ＥＬＩＳＡ抗体価を誘導するが、これらの高抗体価は、ＦＩＶ感染からのウイルス中和または保護と関係がない。かくして、非感染性ＦＩＶ産物が得られ、ＦＩＶ-感染全細胞ワクチンを不活化する必要性を取り除く組換えワクチンの続けた要望がある。この予防的用途の加えて、ワクチンは暴露後免疫療法にも有用となり得る。例えば、最近のラビエスワクチンは、ラビエスワクチンに潜在的に暴露した後に、個人に投与される。ＦＩＶは感染および病気進行の間に長期間の潜伏期を有するため、感染ネコにおけるＦＩＶ疾病を拘束するのに価値となり得る。本発者らは、ＦＩＶのｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスおよび組換えネコヘルペスウイルス、ならびにＦＩＶのｇａｇおよびｅｎｖの構築をここに記載する。加えて、本発明は、これらの組換えウイルスに基づくＦＩＶワクチンの製造手段を提供する。また、本発明は、天然ウイルス宿主の粘膜および非経口サイトの両方にワクチンを投与し、持続ウイルス血症に対して実質的に十分な保護を達成することによって哺乳動物をワクチン接種する方法を包含する。情報の開示 Cole GEら，J.Viol.(1990)64:4930は、組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコ白血病ウイルスのエンベロープおよびｇａｇ蛋白質の発現を報告している。Ｏlmstedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:2448は、ネコ免疫不全ウイルスの分子クローニングを報告している。Ｏlmstedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ(1989)86:8088は、ネコ免疫不全ウイルスのヌクレオチド配列分析を報告しており、他のレンチウイルスに対するＦＩＶのゲノム組織および関係を論じている。Ｐedersonら，Ｓcience(1987)235:790は、免疫不全-様症候群を有する家畜ネコからのＴリンパ球親和性ウイルスの単離を報告している。Ｓheltonら，Ｊ.Ａm.Ａnim.Ｈosp.Ａssoc.(1989)25:7は、ペットネコにおけるネコ免疫不全ウイルスおよびネコ白血病ウイルスの有病率を報告している。Ｔalbottら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:5743は、ネコ免疫不全ウイルスのヌクレオチド配列およびゲノム組織を報告している。Ｙamamotoら，Ｊ.Ｖirol.(1993)67:601は、ネコ免疫不全ウイルスの同種および異種株に対する実験的保護を報告している。Ｙamamotoら，ＡＩＤＳＲes.Ｈum.Ｒetroviruses(1991)7:911は、ネコ免疫不全ウイルスに対する実験的ワクチン保護を報告している。Ｎunbergら，Ｊ.Ｖirol.(1989)63:3240は、ネコヘルペスウイルス(ＦＨＶ)チミジンキナーゼ欠失ベクターの創製を報告している。Ｈuら，Ｓcience(1992)255:456は、ＳＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１６０のサブユニットワクチンによるＳＩＶ感染に対するカニクイザルの保護を報告している。Ｌutzら，1993年10月6-9日「Ｖaccination of Ｃats with Ｒecombinant FIV env-gene Ｐroducts」Ｉnternational Ｓymposium on Ｆeline Ｒetrovirus Ｒe search，Ｒesearch Ｔriangle Ｐark，合衆国ノースカロライナ州は、組換えｅｎｖ遺伝子産物(バキュロウイルスおよびイー・コリ(Ｅ.coli))を使用して高ＥＬＩＳＡ抗体価を誘導することは比較的容易であるが、ＥＬＩＳＡ抗体価はウイルス-中和および保護とは関係しないことを報告している。Ｍorikawaら，Ｖirology(1991)183:288は、バキュロウイルス発現系におけるＦＩＶｇａｇ蛋白質の発現を報告している。発明の概要ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含む組換えＦＩＶワクチンを開示する。一つの具体例において、該ワクチンは、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列からＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質を発現させるための遺伝子発現系を含んでいる。遺伝子発現系の中で利用可能なものは、イー・コリ(Ｅ.coli)、酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびバキュロウイルス発現系であるが、バキュロウイルスが好ましい。もう一つの具体例において、該ワクチンは、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列からＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質を発現させるための複製性ベクターを含んでいる。複製性ベクターの中で利用可能なものは、ヘルペス、ポックス、アデノ、レトロおよびパラミキソウイルスであるが、ネコヘルペスウイルスが複製性ベクターとして好ましい。他の利用可能な複製性ベクターはサルモネラ細菌である。また、組合せ粘膜／非経口、粘膜／粘膜および非経口／非経口接種法を開示する。本発明は、各々バキュロウイルス発現系によって発現されるＦＩＶｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含む組換えワクチンで動物をワクチン接種することによって、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)感染症からその動物を保護するワクチンおよび方法を提供する。組合せ非経口／非経口接種法を提供する。本発明は、各々がネコヘルペスウイルス(ＦＨＶ)ベクターによって発現されるＦＩＶｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含む組換えワクチンと結合した、各々がバキュロウイルス発現系によって発現されるＦＩＶｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含む組換えワクチンで動物をワクチン接種することによって、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)感染症からその動物を保護するワクチンおよび方法を提供する。また、第一接種がＦＨＶＦＩｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇワクチンの粘膜投与を介し、つづく第二接種が組換えバキュロウイルスワクチンの非経口投与を介する組合せ粘膜／非経口接種法も提供する。本発明は、各々がネコヘルペスウイルス(ＰＨＶ)ベクターによって発現されるＦＩＶｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の両方を含む組換えワクチンで動物をワクチン接種することによってネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)感染症からその動物を保護するワクチンおよび方法を提供する。第一接種がＦＨＶＦＩｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇワクチンの粘膜投与を介し、つづく第二接種がＦＨＶＦＩｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇワクチンの粘膜投与を介する組合せ粘膜／粘膜接種法を提供する。さらに特には、本発明のこの態様は、第一接種が鼻腔であって、第二接種が筋肉内である組合せ粘膜／非経口接種を提供する。最も特には、本発明は、ネコへのＦＨＶベクターを介したｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の粘膜投与につづく、組換えバキュロウイルスにより産生されたｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の皮下投与を提供する。また、本発明の方法における用途に適した免疫化キットも提供する。図面の詳細な説明図１はＦＩＶｇａｇ遺伝子産物のバキュロウイルス発現に使用したベクターである、ｐＶＬＦＩｇａｇ構築の模式図を示し；図２はＦＩＶｅｎｖ遺伝子産物のバキュロウイルス発現に使用したベクターである、ｐＶＬＦＩｅｎｖ構築の模式図を示し；図３はｇａｇ遺伝子産物(ＦＨＶ-ＦＩｇａｇ)を発現する生ネコヘルペスウイルスを作製するのに使用したベクターである、ｐＧＣＦＩｇａｇの構築工程を示し；図４はｅｎｖ遺伝子産物(ＦＨＶ-ＦＩｅｎｖ)を発現する生ネコヘルペスウイルスを作製するのに使用したベクターである、ｐＧＣＦＩｅｎｖの構築工程を示し；図５はバキュロウイルス発現系を使用したＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の発現を示すウェスタンブロットを示し；図６は組換えネコヘルペスウイルスによるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の発現を示すウェスタンブロットを示す。発明の詳細な説明組換えバキュロウイルスの構築に使用したＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ配列は両方とも、ネコ免疫不全ウイルスＦＩＶ-１４の感染性プロウイルスクローンから得た。このクローンは、元々は野生型ペタルマ(Ｐetaluma)株由来である。ＦＩＶのｇａｇおよびｅｎｖをコードする遺伝子の位置および配列、ならびにそれらによってコードされている蛋白質配列は公知であり、当該分野でよく知られている技術(例えば、Ｔalbottら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:5743；Ｏlms tedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:2448参照)に従って単離し得る。配列の番号付けは、Ｏlmsted ＲＡら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ(1989)86:808 8に記載されている(GeneBank受託番号M25381)。別法として、公開されたｇａｇおよびｅｎｖ配列を使用し、当該分野でよく知られている技術に従ってこの目的に設計された装置を使用して該遺伝子を化学的に合成することもできる。組換え技術を用いることにより、ＦＩＶのｇａｇおよびｅｎｖをコードする遺伝子、またはその免疫性部分をプラスミドに形質転換することができ、よって好ましくは本発明のトランスファーベクター中において該遺伝子をかかる源から容易に得ることができる。例示的なプラスミドは(ｇａｇ遺伝子をコードする)ｐＶＬＦＩｇａｇ*(図２)および(エンベロープ遺伝子をコードする)ｐＶＬＦＩｅｎｖ(図１)である。一般的なサブクローニング操作は、Ｓambrookら，「Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual(第2版,1989)」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborat ory Ｐressの記載に従った。バキュロウイルス発現ベクター系(ＢＥＶＳ)は、大量の異種蛋白質を産生することが幾つかの場合に示されている簡便な組換え遺伝子発現系として、当該分野でよく知られている。簡単には、ＢＥＶＳは、発現ベクターを使用して異種遺伝子をバキュロウイスルゲノムに該遺伝子がバキュロウイルス調節発現エレメントの制御下で発現するような位置に挿入する。組換えバキュロウイルスを培養昆虫細胞系に感染させ、ここで異種蛋白質を発現させる。ＢＥＶＳを用いた幾つかのグループは、２種のレトロウイルスの表面糖蛋白質を発現した。加えて、Ｍorikawaら，Ｖirology(1991)183:288-297はバキュロウイルス系におけるＦＩＶｇａｇの発現を報告している。ＢＥＶＳは、(出典明示して本明細書の一部とみなす)Ｃ.Ｈo，Ａ.ＰrokopおよびＲ.Ｂajpai(1990)編、ＭcＧraw-Ｈill，Ｎew Ｙork「Ｒecombinant ＤＮＡＴechnology and Ａpplica tions」におけるＬuckow，Ｖ.Ａ.「Ｃloning and expression of heterologous genes in insect cells with baculovirus vectors」、ならびにＬuckow，Ｖ.Ａ .およびＳummers，Ｍ.Ｄ.，Ｂio/Ｔechnology 6:47-55(1988)によって詳細に概説されている。本発明の組換えバキュロウイルスを構築するために、本発明者らは後者刊行物に詳記されている方法を用いる。多数のバキュロウイルス種が知られているが、ＢＥＶＳにおいて使用する好ましいビリオンは、ＡｃＮＰＶまたはＡｃＭＮＰＶとしても知られているオートグラファ・カリフォルニカ(Ａutographa californica)核多核体病ウイルスである。ＡｃＮＰＶは、３０種を超えるレピドプテラ(Ｌepidoptera)細胞に感染し、好ましい宿主はスポドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)細胞系Ｓｆ９である。バキュロウイルスに挿入すべき外来遺伝子は、バキュロウイルスＤＮＡに隣接してクローニングサイトを含むプラスミドを使用する。培養宿主細胞を、このプラスミドおよびゲノミック野生型バキュロウイルスＤＮＡで同時感染し、これを再度結合して異種遺伝子を運搬するウイルスゲノムを作製する。同時感染を起こす方法および条件は当該分野でよく知られている。例には、リン酸カルシウム共沈法(Ｇraham,Ｆ.Ｌ.およびvan der Ｅb，Ａ.Ｊ.，Ｖirology52:456-467(1973)) 、プロタミン(Ｗienhues，Ｕ.ら，ＤＮＡ(ＮＹ)6:81-89(1987))、リポフェクチン(Ｂiotechniques 11:310-312)およびエレクトロポレーション(Ｍann，Ｓ.Ｇ. およびＫing，Ｌ.Ａ.，Ｊ.Ｇen.Ｖirology 70:3501-3505(1989))が含まれる。本発明者らは、以下により詳細に概説するリン酸カルシウム共沈法を用い、これは本発明の組換えバキュロウイルスを作製する好ましいトランスフェクション法である。典型的には、複製または細胞外ウイルスの産生に必須でない遺伝子である多核体遺伝子に挿入するために、異種遺伝子を標的化する。このことは、一般的に、多角体プロモーターをコードするバキュロウイルスＤＮＡ、および多角体プロモーター側面の３'および５'ＤＮＡの配列がプラスミドトランスファーベクターに含まれることによって達成される。ついで、当該分野で知られている組換えＤＮＡ技術を用いて、外来遺伝子をプロモーターの下流に、該トランスファーベクターに挿入する。広範は適当なトランスファーベクターが知られており、本発明の具体例における用途に適当であろう。これらの中ではｐＡＣＹＭＩ、ｐＥＶ５５、ｐＡＣ３７３、ｐＡＣＲＰ、ｐＥＶＩＶ、ｐＥＶ５１およびｐＶＬ９４１があるが；好ましいベクターはｐＶＬ９４１である。さらに、ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子は両方とも、入手可能な数種の複数クローニングサイトベクターを用いて、一本鎖ウイルスに挿入し得る。適当な複数サイトベクターの例には、ｐ２ＸＩＶＶＩ^-Ｘ３、ｐＸＩＶＶＩ^-、(Ｇene 100:131-137(1991)に記載されている)ｐＳｙｎｎＷＴＶＩ^-、または(Ｐrotein Ｅngineering 1:359-366(1987)に記載されている)ｐＡＣＶＣ２が含まれる。本発明の組換えバキュロウイルスは、ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーション後の目視スクリーニング、細胞親和性技術、プラークハイブリダイゼーション、または当該分野で知られている他の技術によって同定し得る。また、本発明の組換えバキュロウイルスには、同定および精製が容易なように発色性および／または酵素基質となる蛋白質も含まれ得る。組換え体は野生型バキュロウイルスに特徴的な吸蔵体(occlusion body)を欠いているため、好ましい方法は、組換え体の視覚スクリーニングである；視覚スクリーニングは当該分野でよく知られている技術である。ついで、吸蔵体を欠く表現形を取り出し、ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーション用に９６-ウェルプレートに入れる。このハイブリダイゼーション技術は、組換えＤＮＡ技術の分野でよく知られており、特別な説明を要しない。最強のハイブリダイゼーションシグナルに相当する幾つかのウイルスを精製し、より十分に特徴付けするのが好ましい。本発明の組換えバキュロウイルスは、多数の連続培養した昆虫細胞系、最も典型的には、アンチカルサ・ジェミタリス(Ａnticarsa gemmitalis)(ダイズイモムシ)、ボムビクス・モリ(Ｂombyx mori)(カイコ)、エスチグメーネ・アクレア(Ｅ stigmene acrea)(アメリカヒトリガ幼虫)、ヘリオシス・ウィレッセンス(Ｈelio this virescens)(タバコアオムシ)、ルーカニア・セパラータ(Ｌeucania separata)、リマントリア・ディスパー(Ｌymantria dispar)(マイマイガ)、マラカソーマ・ディストリア(Ｍalacasoma disstria)(テンマクケムシ)、マンメストラ・ブラシカ(Ｍammestra brassicae)(アオムシ)、マンデューカ・セクスタ(Ｍa nduca sexta)(タバコイモムシ)、プルテラ・ザイロステラ(Ｐulutella zylostel la)(コナガ)、スポドプテラ・エクジグア(Ｓpodpptera exigua)(シロイチモンジョトウガの幼虫)、およびスポドプテラ・リトルリス(Ｓpodoptera littorlis)中で増殖させ得る。本発明の組換えバキュロウイルスの増殖に好ましい昆虫細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)Ｓｆ-９である。バキュロウイルス発現系に加えて、本発明で用いることができる他の遺伝子発現系には、イー・コリ(Ｅ.coli)、酵母およびＣＨＯ発現系が含まれる。宿主に免疫原を導入する別の系は、ネコヘルペスウイルスのごときよく知られている複製性ベクターである。ネコヘルペスウイルス中で発現すべき遺伝子を異種プロモーターの制御下に置き、ヘルペスウイルスゲノムに挿入する。典型的には、発現すべき遺伝子をチミジンキナーゼ座に挿入し、チミジンキナーゼ機能の欠失により組換えウイルスの選抜を行うであろう。ついで、組換えネコヘルペスウイルスを用いて直接動物を感染させ、ここで複製することにより挿入遺伝子が発現される。用い得る別の複製性ウイルスには、ポックス-、アデノ-、パラミキソ-およびレトロウイルスが含まれる。加えて、サルモネラ細菌も複製性ベクターとして用い得る。免疫原は、免疫原をコードするＤＮＡを含むプラスミドの直接接種(「生ＤＮＡワクチン(naked ＤＮＡ vaccine)」)を包含するよく知られている操作によってワクチン用量形に調製し得る。本発明の糖蛋白質を利用して調製したワクチンは、固定化宿主細胞、宿主細胞抽出物、または宿主細胞からの部分的もしくは完全に精製したか、もしくは化学合成によって生成したＦＩＶ糖蛋白質調製物よりなり得る。本発明により調製したＦＩＶ糖蛋白質免疫原は、好ましくは生ＦＩＶウイルスを含んでいない。かくして、本発明のワクチン免疫原は、ＦＩＶ抗原性を示す所望の免疫原性ＦＩＶポリペプチドの実質的に全体よりなる。ついで、該ワクチンは、非経口または粘膜投与し得る。筋肉内または皮下注射のごとき非経口投与には、免疫原を適当な担体と結合し得、例えば、それは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム硫酸カリウム(アルム)、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミルペプチド、細菌エンドトキシン、リピッドＸ、コリネバクテリウム・パルバム(Ｃorynebacterium parvum)(プロピオニバクテリウム・アクネス(Ｐropionibacterium acnes))、ボルデテラ・パーチューシス(Bordetel la pertussis)、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ-デキストラン、ブロック化コポリマーまたは他の合成アジュバントを含有するか、しない水、セーラインまたは緩衝化ビヒクルで投与し得る。かかるアジュバントは種々の供給源から入手可能である。例えば、Ｍerck Ａdjuvant65(Ｍerck and Ｃompany，Ｉnc.，ニュージャージー州ラーウェイ)。他の適当なアジュバントは、フロイント不完全アジュバント(Ｄifco Ｌaboratories，ミシガン州デトロイト)である。他のワクチンは、記載の分野の当業者によく知られた方法、例えば、(出典明示して本明細書の一部とみなす)Ｉ.Ｔizard，「Ａn Ｉntroduction to Ｖeterinary Ｉmmunology第２版(1982)」に従って調製し得る。非経口投与には、免疫原およびアジュバントの比率を、両者が有効量の範囲内で存在する限りにおいて広範にわたって変動させ得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約０.５％量(Ａl₂Ｏ₃ベースで)で存在させ得る。用量当たりをベースとし、抗原の純度および免疫原性に依存して、該免疫原濃度は、ネコ当たり約１.０μｇ〜約１００ｍｇの範囲とし得る。投与すべき好ましい免疫原濃度および容量は、宿主の年齢および体重、ならびにワクチン接種の当業者によって知られている他の要素に依存して変動するであろう。例えば、ネコにおいては、好ましい範囲は約１０μｇ〜約１.０ｍｇで；適当な用量サイズは約０. ５-５ｍl、好ましくは約１.０ｍlである。したがって、接種用用量は、例えば、０.５％水酸化アルミニウムを入れた混合物の免疫原１.０ｍｇを含有する１ｍl よりなるであろう。また、未成熟哺乳動物への非経口投与用には和合性用量形を調製し得るが、用量当たりの免疫原量は、より少量とし得、例えば、子ネコにおいては、用量当たり約０.２５〜約１.０ｍlである。粘膜投与には、該免疫原を適当な担体、例えば、水、セーラインまたは緩衝化ビヒクルと結合し得る。加えて、当該分野で知られている種々の免疫調節剤を添加して、粘膜免疫応答性を特に向上することもできる。かかる剤には、コレラ毒もしくはその一部分、ＤＥＡＥ-デキストラン、インターロイキン(例えば、ＩＬ -５)、イー・コリ(Ｅ.coli)のＬＴトキシン、およびグラム-陰性菌生物からの他のトキシンが含まれる。処方化したら、かかるワクチンは、いずれの粘膜表面にでも導入し得、典型的かつ最も簡便には、この目的に適当な装置を用いて鼻孔および／または中咽頭へ導入し得る。免疫原濃度ならびに粘膜投与用の用量サイズは、非経口投与に用いたものと同様である。ワクチン接種は、(出典明示して本明細書の一部とみなす)同時継続出願で、同様に譲渡された特許出願WO 9208427号に開示されているごとき２用量様式に従ってなし得る。WO 9208427号に開示のごとく、第一の具体例において、２用量様式は、前記に概説した粘膜に投与する第一用量につづく、非経口的に投与する第二用量よりなる。本発明のこの態様に従って、第二用量は、第一の粘膜接種の後しばらくしてから第二用量を投与する。該第一粘膜接種としばらく後の第二非経口接種との間に遅らせる時間は、宿主の年齢、体重、健康状態等、それに対する保護を求めるウイルス、各々のワクチンの免疫原性等に依存する。通常条件下においては、該粘膜投与は通常でろうが、しばしばそれは、複製性の剤、すなわち抗原が免疫系に接近し得る生組換えウイルスまたは細菌よりなる。加えて、第二非経口接種は、複製性または非複製性の剤のいずれかより得る。しかしながら、このプロトコールは、例えば、抗原をカプセル封入したマイクロスフェアによって、非-複製性抗原が粘膜免疫系にデリバリーされ得るような、抗原をデリバリーする排他的様式ではない。これらおよび他の因子は当該分野でよく知られており、これらのいずれの因子の重量および相対的重要性の決定は、当業者の日常の考えの範囲内である。該二重法は、区画化された免疫応答を示すウイルス、すなわち、粘膜サイトを介して宿主に侵入したが全身的にも複製するウイルスに対して有効である。また、該二重法は、粘膜サイトまたは非経口サイトのいずれかで優勢的に複製する、ネコ免疫不全ウイルスのごとき生物に対しても有効である。本発明のこの二重用量様式は、２種のワクチン成分をそれらに適したサイトに同時に投与することによってもなし得る。当業者により認識される両サイトへの投与を正確に同時間とすることはありそうにもないので、同時投与の時間には、例えば、第二用量のために宿主を調製し、投与するために第二用量を調製し、第一用量を投与した後の衰弱の兆候について宿主を観察する等のごとき経験し得る遅れが含まれる。かくして、本発明の同時投与法に従う場合、例えば、ネコは、適当な用量の適当なワクチン処方を鼻腔内的および／または口腔的に受けると同時に、適当なワクチンで筋肉内ワクチン接種されるであろう。本発明の二重法に従ってワクチンを投与する場合、該ワクチンには、同一または異なるベクターで製造または提示された、あるいは同一または異なるビヒクルに処方化した同一の免疫原を含有し得る。直前に記載した同時二重投与が両方の免疫区画に刺激を供し、よってしばらくしての第二用量の必要性が減じられることは理解される。第二の具体例において、本発明のＦＩＶワクチンでのワクチン接種は、以下の伝統的様式でもなし得る。典型的には、第一用量は、非経口サイト、または数種のワクチンのより稀な場合においては粘膜サイトに投与する。第一接種サイトの選択は、治療すべき動物、ならびにそのサイトに対するアベイラビリティーおよび適当性に依存する。適応な時間の後に、第二用量を投与する。伝統的には、該第二用量は、第一用量と同一のサイトに投与され、すなわち、第一用量が粘膜であれば第二も粘膜である。最初の投与にはいずれのサイトが適当であるか、第二用量の必要性およびその前の時間、投与すべき用量等の決定は、哺乳動物ワクチン接種の当業者によって知られかつ理解されている全因子である。例えば、ネコをワクチン接種する場合、該第一用量は６-１０週齢で投与し得る。ついで、第二用量のワクチンは、第一用量の数週間後、例えば、約２〜４週間後に投与しなければならない。別法として、該ワクチンは、単一の１ｍl用量を、例えば、約６-１０週齢で投与し得る。しかしながら、２用量様式は、ネコの最も有効な免疫化に好ましいと考えられる。毎年、再ワクチン化することを推奨する。成体は何時でも再ワクチン接種し得る。未ワクチン接種成体に生まれた子ネコは、約３-１０日にワクチン接種し、４-６ヶ月後に再ワクチン接種し、その後は毎年再ワクチン接種し得る。本発明のＦＩＶワクチン、ならびに公知のワクチンは、伝統的な技術にしたがって投与する場合、または同時継続特許出願WO 9208427号の二重法に従って投与する場合には、他の疾病用の他のワクチンと結合して多価ワクチンとし得る。加えて、本発明のワクチン、ならびに公知のワクチンは、伝統的な技術に従って投与する場合、あるいは本発明の二重法に従って投与する場合には、他の医薬、例えば、抗生物質と結合し得る。「ウイルス-様粒子」とは、バキュロウイルス感染昆虫細胞によって産生された粒子で、これは、(クロマトグラフィー上の)密度およびサイズ、形および(ＥＭ分析上の)環構造で未成熟ＦＩＶ粒子に似ている。ネコ免疫不全抗原を発現する組換えバキュロウイルスおよび組換えネコヘルペスウイルスの両方の構築に記載した分子生物学的、ウイルス学的、および細胞培養学的技術は、当該分野の範囲内にある。これらの技術を記載する刊行物には、 (すべて出典明示して本明細書の一部とみなす)Ｓambrookら，「Ｍolecular Ｃlo ning:ＡＬaboratory Ｍanual(第2版、1989)」、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabo ratory，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ａusubelら，「Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology(1987)」；Ｏ'Ｒeillyら，「Ｂaculovirus Ｅxpression Ｖectors：ＡＬaboratory Ｍanual(1992)」；「Ｐractical Ｍol ecular Ｖirology(Ｃollins編,1991)」;「Ｃulture of Ａnimal Ｃells：ＡＭa nual of Ｂasic Ｔechnique(Ｆreshneyら編,第２版,1989)」；Ｊ.Ｍiller，「Ｅ xperiments in Ｍolecular Ｇenetics」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory(1972)；Ｄ.Ａ.Ｍorrison，「Ｔrans formation and Ｐreservation of Ｃompetent Ｂacterial Ｃells by Ｆreezing 」，Ｍethods Ｅnzymol.68:326-331(1979)；Ｊ.Ｐerbal，「ＡＰractical Ｇuide to Ｍolecular Ｃloning」Ｊohn Ｗiley & Ｓons(1984 )、ならびにＭ.Ｄ.ＳummersおよびＧ.Ｅ.Ｓmith，「Ｔexas Ａgricultural Ｅxp erimental Ｂulletin Ｎo.1555(1987)」が含まれよう。注記する場合を除き、すべての制限酵素、化学剤および化学材料、またはそれらの相等物は商業的な販売業者から入手可能である。エンドヌクレアーゼ制限は、製造業者の推奨に従う。さらに説明しなくても、当業者であれば、前記説明を用いて本発明をその最大限の範囲で実施し得ると考えられる。以下の詳細な例は、本発明の種々の組換えワクチンをいかに構築するか、および／または本発明の種々のプロセスをいかに行うかを記載しており、単なる説明を意図するものであって、いかなる場合においても前記した開示に限定されるものではない。当業者であれば、反応物および反応条件および技術としての両方の方法から適当な変形を直ちに認識するであろう。材料および方法細胞、ウイルスおよびプラスミド親バキュロウイルスＡutographica californica核多核体ウイルス(ＡｃＮＰＶ )Ｅ２株は、Ｍax Ｓummers(Ｔexas Ａ＆ＭＵniversity)から得る。Ｓpodoptera frugiperda細胞系Ｓｆ-９はＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＣＲＬ1711 )から得る。プラスミドｐＳＰ72は、Ｐromega Ｂiotec社から得る。プラスミドｐ3ＣＬ-ＤＨＦＲはFred Homa社(Ｔhe Ｕpjohn Ｃompany)から得た。プラスミドｐＧＣ113はＪack Ｎunbergから得たものであり、Ｎunbergら，Ｊ.Ｖirol.(1989 )63:3240によって記載されている。プラスミドｐ３ＣＬ-ＤＨＦＲは真核生物細胞で異種遺伝子を発現させるために構築されたｐＵＣ18-ベースのベクターである。それは、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)中間プロモーターおよびリーダー配列(転写出発サイトに対して- 1140〜+74の配列)を用いて転写させる。ウシ成長ホルモン配列を含む５５０塩基対のＢamＨＩ-ＢglＩＩフラグメントを用いてポリアデニル化機能を供する。該ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびｂＧＨポリアデニル化配列の間に、外来遺伝子を挿入するためのユニークＨindＩＩＩおよびＳalＩサイトを含んでいる。細胞系ＦＩＶ-１４は、野生型Ｐetaluma株(Ｏlmstedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.(ＵＳＡ)86:8088(1989))由来であった。細胞、親ウイルスおよび組換えウイルスは、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｂulletin Ｎo.1555(1987)に詳記されている方法によって増殖させる。プラスミドｐＶＬ941は、Ｌuckow，Ｖ.Ｅ.およびＭ.Ｄ.Ｓummers，Ｖirology 170:31-39(1989)によって記載されている。動物特異的病原菌フリーな約１２週齢のネコ１８匹をすべての実験に用いる。動物は、各６匹動物の３群のいずれかで封じ込め容易性で飼育し、キャットフードおよび水を自由に摂取させた。ウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析には、グラジエントの各フラクションからのアリコットを標準ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて分離する。電気泳動後に、Ｔowbin，Ｈ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 76:4350-4354(1979)の方法に従って、蛋白質を０.２２μｍニトロセルロース上にエレクトロブロットする。ニトロセルロース上の非占有サイトは、５％脱脂粉乳(ＮＦＤＭ)を含有するＰＢＳ中で逐次インキュベートすることによってブロッキングする。ブロットを一次抗体とインキュベートし、発色はＨink，Ｗ.Ｆ.ら，Ｂiotechnology Ｐrogress 7:9-14(1991)により記載されているごとく行う。実験的にＦＩＶに感染させたネコから回復期ネコ血清を用いて、ウェスタンブロット上のｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質を検出した。ワクチンとして用いる抗原の調製スピナーフラスコ中のＳpodoptera frugiperda(Ｓｆ-９)細胞は、５プラーク形成能(pfu)/細胞の感染の多重度の１×１０⁶細胞/ｍlの細胞密度で感染させる。細胞は、以下の組換えウイルス：ＡcＮＰＶＦＩｇａｇ*もしくはＡcＮＰＶＦＩｅｎｖのいずれか、またはＡｃＮＰＶＦＩｇａｇ*およびＡｃＮＰＶＦＩｅｎｖの同時感染で感染させる。各培養物は感染６６時間後に採取する。感染細胞を、低速遠心によって培養物から分離し、使用するまで凍結して保存する。ＦＩＶｇａｇまたはｅｎｖのいずれかを発現するＦＨＶ組換え体はＣＲＦＫ細胞で増殖させ、感染３日後に採取する。細胞夾雑物を除去して清澄化した後に、上清流体を力価測定(titer)し、使用する前に-７０℃にて保存する。ワクチンは、１０⁵-１０⁷ｐｆｕ/ｍlを含有するように処方化する。研究室アッセイネコにおけるｐ２４レベルは、販売されているキット(ＩＤＥＸＸ社、メイン州ポートランド)を用いて測定する。ＦＩＶの群-特異的抗原であるｐ２４は、持続感染動物の血中で見出され、よってウイルス血症を試験する場合に用い得る。本発明者らの研究室における標準化は、既知の陽性および陰性血清の事情内では、０.２５＞のＯ.Ｄ.値はウイルス血症について陽性であることを示している。ネコＰＢＭＣのＰＣＲ分析は、サーマルサイクラー(Ｐerkin-Ｅlmer Ｃetus社，コネチカット州ノルウォーク)上の増幅の２つのラウンドの間に２ペアのネスティッドプライマー(nested primer)を使用して行った。ＰＣＲで、およびサザンブロット用のプローブとして用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、ＦＩＶ配列データから選択した(Ｔalbottら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86 :5743およびＯlmstedら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86:2448)。増幅の各ラウンドは、ラウンド１がゲノムＤＮＡで開始され、ラウンド２が第１ラウンドの各反応物からの０.０１ｍl試料を増幅させる３０サイクルよりなる(ラウンド１：９４℃にて１分間、５５℃にて１.５分間、７２℃にて２分間、最終サイクル容量０.１ｍl；ラウンド２；９４℃にて１分間、５５℃にて１.５分間、７２℃ にて１分間、最終サイクル容量０.０５ｍl)。ついで、ＰＣＲラウンド２産物０.０５ｍlを負荷することによって、ＴＢＥ緩衝液中の０.９％アガロースゲル上で試料を分析する。８０４ｂｐのＤＮＡ産物を、エチジウムブロマイド染色によって視覚化し、サザンブロットによって確認する。電気泳動後に、ニトロセルロースへのＤＮＡの移行は、標準的な方法に従って行った(Ｓambrook,Ｊ.,Ｅ.Ｆ.ＦritschおよびＴ.Ｍaniatis，(1989)「Ｍolecula r Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual(第２版)」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)。フィルターハイブリダイゼーションは、向上させた化学ルミネセンス(ＥＣＬ)を用いたＡmersha m社の非放射性検出３'-オリゴラベリング系を用いて行った。ＥＣＬ反応においては、西洋ワサビペルオキシダーゼがルミノールの酸化を触媒して、フルオレセイン-ｄＵＴＰで３'-末端標識したプローブを検出し、フィルター上の標的配列にハイブリダイズさせる。１０ｎｇ/ｍl濃度のプローブＰＪＤ 83: 5'-ACA TCC CCC TGA TGC TCC CAG ACC ATT ACC-3'(Ｔalbottら，Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci.(1989)86:5743)[配列番号：３]を用いて、該膜を５５℃にて２時間ハイブリダイズさせた。実施例１ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の発現Ａ．ｇａｇ遺伝子の組換えバキュロウイルス発現ベクターへのクローニングＦＩＶｇａｇ遺伝子産物を発現する組換えバキュロウイルスを構築するために、感染性プロウイルスクローンｐＦＩＶ１４をＨincＩＩおよびＥco ＲＶで消化して、ｇａｇ遺伝子を含む１４５０塩基フラグメント(塩基５９９-２０４９) を放出させる。このフラグメントを、ＳmaＩで消化し子ウシ腸ホスファターゼ( ＣＩＰ)で脱ホスホリル化したベクターｐＳＰ７２にサブクローニングする。ついで、得られた中間プラスミド(消化Ｄ４)をＢglＩＩおよびＢamＨＩで消化して、ｇａｇを含む１４５０塩基フラグメントを放出させ、ついでこれを、ＢamＨＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで脱ホスホリル化したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ９４１(Ｔalbottら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(1989)86：5743) に連結する。得られたベクターはｐＶＬＦＩｇａｇと命名する(図１参照)。ｐＶＬＦＩｇａｇの設計は、天然に生じるＦＩＶｇａｇ-ｐｏｌフレームシフトを生じてバキュロウイルス多角体遺伝子産物に結合したＦＩＶｇａｇよりなる融合蛋白質を産生するような配置になった。このフレームシフト産物を除去するために、３種すべての読み枠中の終止コドンをｇａｇ読み枠の直後に挿入する。ＰＣＲを用いて、所望の終止コドンを含むｇａｇ遺伝子の「置換」３'末端を作製する。ＰＣＲプライマー (DAD-1:5'-CCATGGAATTCTACCTATTTATAAATCCAATAGTTCTCCTC-3'[配列番号：１]、DA D-2:5'-GCAATGGCCACCTTAAGCCAGAAAG-3'[配列番号：２])を用いて、設計終止コドンを含むＦＩＶ-１４の389塩基部を増幅する。該ＰＣＲフラグメントをＥcoＲＩで消化し、「置換」ｇａｇ３'末端を含む１２５塩基フラグメントを単離する。ついで、このフラグメントを、ＥcoＲＩで消化し(脱ホスホリル化し)て天然の３ '末端を含むフラグメントを除去したｇａｇ-含有Ｄ４プラスミドに連結する。ついで、Ｄ４*と命名した得られたプラスミドを、Ｄ４につき前記したのと同様にして、ｐＶＬ９４１に入れて(図１参照)、バキュロウイルスベクターｐＶＬＦＩｇａｇ*を得る。ＰＣＲ-増幅した遺伝子区画を配列決定して、所望の終止コドンの存在を確認する。Ｂ．ｅｎｖ遺伝子の組換えバキュロウイルス発現ベクターへのクローニングバキュロウイルスにおいてＦＩＶｅｎｖを発現するベクターは、ｐＦＩＶ-１４をＡseＩおよびＮdeＩで最初に消化して、ＦＩＶｅｎｖ遺伝子を含む２６４９塩基フラグメント(塩基6257-8906)を除去することによって構築する。クレノーで処理した後に、末端を埋め、該フラグメントを、ＳamＩで消化し脱ホスホリル化したｐＳＰ７２にサブクローニングする。Ｂ１と命名したこの中間プラスミドを、ＢamＨＩおよびＢglＩＩ(部分消化)で消化して、〜2660塩基フラグメントを除去し、これをＢamＨＩで消化し脱ホスホリル化したｐＶＬ941に連結する。得られたプラスミドは、ｐＶＬＦＩｅｎｖと命名する(図２参照)。Ｃ．バキュロウイルス形質転換プラスミドｐＶＬＦＩｇａｇ*およびｐＶＬＦＩｅｎｖを、標準的なバキュロウイルス発現ベクター技術(Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂu lletin Ｎo.1555(1987))を用いて、野生型バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ９細胞に同時感染させる。組換えウイルスは、その吸蔵-陰性発現型に基づいて選抜する。各構築物につき５個の個別のプラークを採取し、５回プラーク-精製する。保存ウイルスは、概算１０の感染の多重度でＳｆ９細胞の６０ｍｍ皿に最初に感染させることによって、異種ＦＩＶ遺伝子の発現について試験する。感染６０時間後に、条件培地および細胞を採取し、ウェスタンブロット分析によってＦＩＶ蛋白質の発現性につき試験する。実験的にＦＩＶで感染させたネコからの血清を用いて、ウェスタンブロットを探索する。最高レベルの蛋白質を産生する陽性クローンを選抜して、保存ウイルスを作製する。Ｄ．ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ発現(バキュロウイルス) 懸濁培地で増殖させたＳｆ９細胞を用いて、動物実験用の大量の蛋白質を産生させる。懸濁細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有する補充グレース(Ｇrace)の培地(Ｇibco ＢＲＬ社)よりなる培地にて、スピナーフラスコ中で増殖させる。また、該培地はアンフォテリシンＢ(２.５μｇ/ｍl)、ペニシリン(１０Ｕ/ｍl)およびストレプトマイシン(１０μｇ/ｍl)でも補充する。細胞は、１０のｍ.ｏ.ｉ .を有する１×１０⁶細胞/ｍlの密度で感染させる。感染６６時間後に、遠心によって細胞を回収する。発現は、使用する前にウェスタンブロット分析によって確認する。図５は、１）ＦＨＶＦＩｇａｇで感染させたＣＲＦＫ細胞(比較用)(レーン１)、２）非感染Ｓｆ９細胞(陰性対照)(レーン２)、３）ＡｃＮＰＶＦＩｅｎｖで感染させたＳｆ９細胞(レーン３)、４）ＡｃＮＰＶｇａｇ*で感染させたＳｆ９細胞(レーン４)、５）ＡｃＮＰＶｇａｇで感染させたＳｆ９細胞(レーン５)を示す。ブロットは、実験的に感染させたネコからのＦＩＶ-反応性の抗血清で探索する。感染細胞は、-２０℃にて凍結させて保存する。Ｅ．組換えネコヘルペスウイルスへのｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子のクローニングバキュロウイルスにおけるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の発現に用いたのと同一のＦＩＶ配列を用いて、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産物を発現する組換えネコヘルペスウイルスを構築する。ＨincＩＩおよびＥcoＲＶで消化することによって、ＦＩＶｇａｇコード配列を含む遺伝子をＦＩＶプロウイルスクローンＦＩＶ-14から取り出す(図３参照) 。ＨindＩＩＩで予め消化し、クレノーで末端を埋め、脱ホスホリル化したベクターｐ３ＣＬ-ＤＨＦＲに、この１４５０塩基フラグメントをサブクローニングする。ついで、得られたプラスミドp３ＣＬＦＩｇａｇをＥcoＲＩ(部分)およびＢglＩＩで消化して、ＣＭＶ中初期プロモーター、ＦＩＶｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルよりなる転写ユニット全体を含むフラグメントを遊離させる。このフラグメントをＨindＩＩＩサイト(クレノーで挿入およびベクター平滑-末端化の両方をしたもの)でプラスミドｐＧＣ１１３(Ｎunb erg ＪＨら，Ｊ.Ｖirol.(1989)63:3240)にサブクローニングして、プラスミドｐＧＣＦＩｇａｇを得る。転写ユニットは、ＦＨＶゲノムへの相同性組換えを起こさせるようにＦＨＶチミジンキナーゼ遺伝子配列の横につなげられており、ウイルスを弱毒化させるためにチミジンキナーゼ遺伝子の中間から〜４５０塩基を欠いている(Ｎunbrg ＪＨら,Ｊ.Ｖirol.(1989)63:3240記載のごとくｐＧＣ１１３から欠く)。同様の戦略を用いて、ＦＩＶｅｎｖを発現させるためのトランスファープラスミドを作製する(図４参照)。ＡseＩおよびＮdeＩで消化することによってＦＩＶｅｎｖのコード配列をＦＩＶ-１４から取り出し、ＰvuＩで消化し脱ホスホリル化したｐＳＰ７２にサブクローニングして、Ｆ５と命名するプラスミドを作製する。ＨindＩＩＩおよびＸhoＩでプラスミドＦ５からｅｎｖ遺伝子を取り出し、ＨindＩＩＩおよびＳalＩで消化したｐ３ＣＬ-ＤＨＦＲにサブクローニングして、プラスミドｐ３ＣＬＦＩｅｎｖを得る。ＣＭＶプロモーター、ＦＩＶｅｎｖ遺伝子およびｂＧＨポリアデニル化配列を含むフラグメントを、ＥcoＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化することによって取り出し、クレノーで平滑末端化し、ＰＧＣ１１３のＨindＩＩＩサイトにサブクローニング(クレノーで埋める)してプラスミドｐＧＣＦＩｅｎｖを得る。Ｆ．ＦＩＶｅｎｖおよびｇａｇ発現(ＦＨＶ) 組換えＦＨＶが発現するＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖは、実質的に、Ｎunberg ＪＨら，Ｊ.Ｖirol.(1989)63:3240に記載されているごとく作製する。これには、天然のチミジンキナーゼ遺伝子を、FIV遺伝子転写ユニットを含む欠失チミジンキナーゼ遺伝子で置き換えるために相同性組換えを用いることが含まれる。ＣＲＦＫ細胞は、標準的なリン酸カルシウム沈殿トランスフェクションプロトコールを用いて、等量のｐＧＣＦＩｇａｇまたはｐＧＣＦＩｅｎｖのいずれか、および精製ＦＨＶ(ＵＴ８８)ＤＮＡで同時感染させる。１００％ＣＰＥが達成された (３-５日)後に、得られたウイルス保存液を連続的に希釈し、１００μｇ/ｍlチミジンアラビノシド(ａｒａＴ)存在下のＣＲＦＫ細胞に再平板し、チミジンキナーゼ-陰性ウイルスにつき選抜する。各トランスフェクションから８個のプラークを採取し、ＣＲＦＫ細胞で増殖させ、ウイルスＤＮＡを調製する。ウイルスＤＮＡは、ＥcoＲＩでの制限消化、およびつづくＦＩＶ-特異的およびｔｋ-特異的なＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析によって分析する。ＤＮＡ-陽性クローンは、感染細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって、ＦＩＶ蛋白質の発現性につき分析する。図６は、組換えネコヘルペスウイルスによるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の発現性を示す。ＣＲＦＫ細胞は、３種の異なるＦＨＶＦＩｇａｇクローン( レーン１、２、３)、４種の異なるＦＨＶＦＩｅｎｖクローン(レーン５、６、７、８)、または陰性対照としての親ＵＴ８８ウイルス(レーン４、９)で感染させる。細胞溶解物は、実験的に感染させたネコからのＦＩＶ-反応性抗血清を用いたウェスタンブロット分析によって分析する。ＦＩＶｇａｇまたはｅｎｖを発現する組換えＦＨＶを最大蛋白質発現性に基づいて選抜し、さらに２回プラーク -精製し、それを用いて保存ウイルスを作製する。実施例２ワクチン接種および攻撃実験特異的病原菌フリーな約１２週齢のネコ１８匹をこの実験では用いる。各６匹の３群で封じ込め容易に飼育し、自由に乾燥キャットフードおよび水を摂取させる。Ａ．ワクチン接種群１．結合粘膜／非経口ワクチン接種順化期間後に、群Ｉ(ｎ＝６)の動物に、ＦＨＶＦＩｇａｇ０.５ｍlおよびＦＨＶＦＩｅｎｖ０.５ｍl(合計１ｍl)を鼻腔内接種する。これは、小鼻カニューレを結合させたシリンジを用いることによって行う。動物を温和に拘束し、約０. ２５ｍlを各鼻孔に滴下し、０.５ｍlを中咽頭の背後に向けて置く。各分離した調製物には、１ｍl当たり１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀が含まれる。約３週間後に、該動物を、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ挿入を有する組換えバキュロウイルスで、１のＭＯＩにて７２時間前に感染させた、セーラインに懸濁した、１０^6.5Ｓｆ９細胞で皮下的に再ワクチン接種する。２．結合非経口／非経口ワクチン接種群ＩＩ(ｎ＝６)の動物を、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ挿入を有する組換えバキュロウイルスで、１のＭＯＩにて７２時間前に感染させた、セーラインに懸濁した、１０^6.5Ｓｆ９細胞で皮下接種する。約３週間後に、これらの動物を同様な組換えバキュロウイルス調製物で再ワクチン接種する。３．結合粘膜／粘膜ワクチン接種順化期間後に、動物に、ＦＨＶＦＩｇａｇ０.５ｍlおよびＦＨＶＦＩｅｎｖ０ .５ｍl(合計１ｍl)を鼻腔内接種する。これは、小鼻カニューレを結合させたシリンジによって行う。動物を温和に拘束し、約０.２５ｍlを各鼻孔に滴下し、０ .５ｍlを中咽頭の背後に向けて置く。各分離した調製物には、１ｍl当たり１０⁶ ^.5 ＴＣＩＤ₅₀が含まれる。約３週間後に、該動物を、同一の用量で同様にして再ワクチン接種する。４．対照群ＩＩＩ(ｎ＝６)の動物は、非ワクチン接種対照として残す。Ｂ．攻撃最後のワクチン接種から約２週間後に、各３群の動物をＦＩＶのＰetaluma単離株のクローン化ウイルス保存液の１０^-3希釈の１ｍl用量で鼻腔内的に攻撃する。免疫抑制の兆候は全くなかった。同様の投与経路および接種量を用いた、感受性ネコにおけるこの保存液の力価測定は、それが１００００ＩＤ₅₀の力価を有することを示す。攻撃２４週後にこれらのネコから採取した血液をＦicolグラジエントで分離して単核細胞リッチとする。これらの細胞は、１ｍl当たりにＣon Ａ２μｇおよび１００ＩＵ組換えヒトＩＬ-２存在下、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ1640中、１ｍl当たり１０⁵で培養する。３日後に細胞を遠心で沈殿させ、１ｍ l当たりに１０％ウシ胎児血清および１００ＩＵ組換えヒトＩＬ-２を含む、ＲＰＭＩ1640中に再懸濁する。培養２１日後に、細胞をＰＣＲ分析用に分離する。培養２１日目に、ネコ末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を１５００×ｇの遠心によって採取する。ついで、細胞をハンクバランス塩溶液(ＨＢＳＳ)で洗浄する。Ｔ urbogen Ｋit(Ｉnvitrogen Ｃorporation社，カリフォルニア州サンジエゴ)を用いて約１０⁷細胞からゲノムＤＮＡを単離する。簡単には、変性カチオン性界面活性剤を用いて細胞を溶解する。ついで、界面活性剤および変性した蛋白質をクロロホルム抽出を介して除去する。ゲノムＤＮＡを低塩緩衝液およびエタノールで水相から沈殿させ、ついでＴＢＥ緩衝液に溶解し、(研究室アッセイで記載した)ＰＣＲによる分析まで４℃に保存する。Ｃ．結果表１は、対照群の６匹の動物のうちの４匹が２４時間後にウイルス血症になっているのに対して、非経口/非経口または粘膜/非経口接種した動物は、ＥＬＩＳＡ抗原アッセイまたはＰＣＲのいずれにおいても全く陽性となっていないことを示している。このことは、これらのワクチン接種スケジュールが首尾よくＦＩＶによる持続性ウイルス血症を予防することを示している。粘膜／粘膜ワクチン接種も同様な結果を達成するであろうことが期待される。実施例４ワクチン接種キット本明細書記載のごとき、投与用のワクチンおよび該ワクチンの二重粘膜／非経口投与、該ワクチンの非経口／非経口または粘膜／粘膜投与の教示書を含むキットは、ワクチンを供給する安全かつコスト的に有効な手段で製造し得る。ワクチン接種キットには、一回または複数回使用のバイアル、アンプルまたは他の適当な容器にワクチンを含んでいる。粘膜投与には、処方化ワクチンを容器中またはエアロゾール形とし得る。非経口使用には、簡便かつ迅速に投与が行われる、宿主哺乳動物に適当な有効用量を含有する単一用量シリンジが象徴する。別法として、該キットには、複数-使用バイアルまたは他の適当な容器の粘膜および非経口ワクチンが含まれ得、携帯で供給し得、あるいは使用する前に数種のさらなる調製物を要するか、混合を要し得る。教示シートには、投与すべき内容ワクチン (群)およびそれらの処方、接種の順序および時期、ならびに実践者に関するさらなる因子がより十分すぎるくらい記載されている。ネコには、例えば、かかるワクチン接種キットは、各鼻孔に投与すべきＦＨＶＦｌｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇ(２×１０⁵ｐｆｕ/ワクチン)０.５ｍlを含有する１ｍlの単一用量の粘膜処方が含まれ得る。非経口処方には、筋肉内投与用のＡｃＮＰＶｅｎｖおよびＡｃＮＰＶｇａｇ(２×１０⁵ｐｆｕ/ワクチン)１ｍl が含まれる。前記に詳記した説明は、理解を明白とするためだけであって、当業者に自明であろう本発明の範囲内の修飾のごとく、そこから不必要な限定を推論する必要は全くない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなることを特徴とする組換えネコ免疫不全ウイルスワクチン。２．さらに、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードする該ＤＮＡ配列からＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質を発現させるための遺伝子発現系を含む請求項１記載のワクチン。３．該遺伝子発現系が、イー・コリ(Ｅ.coli)、酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびバキュロウイルスよりなる群から選択される請求項２記載のワクチン。４．該遺伝子発現系がバキュロウイルス発現系である請求項３記載のワクチン。５．さらに、ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードする該ＤＮＡ配列からＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質を発現させるための複製性ベクターを含む請求項１記載のワクチン。６．該複製性ベクターが、ヘルペス、ポックス、アデノ、レトロおよびパラミキソウイルスならびにサルモネラ細菌よりなる群から選択される請求項５記載のワクチン。７．該組換え複製性ベクターがネコヘルペスウイルスである請求項６記載のワクチン。８．ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、ここにＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードする該ＤＮＡ配列が遺伝子発現系および複製性ベクターの両方によって発現される組換えＦＩＶワクチン。９．該遺伝子発現系が、イー・コリ(Ｅ.coli)、酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびバキュロウイルスよりなる群から選択され、かつ、該複製性ベクターがヘルペス、ポックス、アデノ、レトロおよびパラミキソウイルスならびにサルモネラ細菌よりなる群から選択される請求項８記載のワクチン。１０．該遺伝子発現系がバキュロウイルス発現系であって、該複製性ベクターがネコヘルペスウイルスである請求項９記載のワクチン。１１．ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる組換えネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ワクチンをネコに投与することを特徴とする、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)に対してネコをワクチン接種する方法。１２．該ワクチンが、遺伝子発現系によって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる請求項１１記載の方法。１３．該遺伝子発現系が、イー・コリ(Ｅ.coli)、酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびバキュロウイルスよりなる群から選択される請求項１２記載の方法。１４．該遺伝子発現系がバキュロウイルス発現系である請求項１３記載の方法。１５．該ワクチンが、複製性ベクターによって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる請求項１１記載の方法。１６．該複製性ベクターが、ヘルペス、ポックス、アデノ、レトロおよびパラミキソウイルスならびにサルモネラ細菌よりなる群から選択される請求項１５記載の方法。１７．該組換え複製性ベクターがネコヘルペスウイルスである請求項１６記載の方法。１８．該ワクチンの第一用量につづいて該ワクチンの第二用量を投与することを特徴とする請求項１１記載の方法。１９．該ワクチンの該第一および該第二用量を非経口投与する請求項１８記載の方法。２０．該ワクチンの該第一および第二用量が、バキュロウイルス発現系によって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる請求項１９記載の方法。２１．該ワクチンの該第一および該第二用量を粘膜投与する請求項１８記載の方法。２２．該ワクチンの該第一および第二用量が、ＦＨＶＦＩｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇによって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる請求項２１記載の方法。２３．該ワクチンの該第一用量を粘膜投与し、該第二ワクチンの該第二用量を非経口投与する請求項１８記載の方法。２４．該ワクチンの該第一用量がＦＨＶＦＩｅｎｖおよびＦＨＶＦＩｇａｇによって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなり、該ワクチンの該第二用量がバキュロウイルス発現系によって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる請求項２３記載の方法。２５．(ａ)ネコヘルペスウイルス(ＦＨＶ)によって発現されるネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の両方をコードするＤＮＡ配列よりなる粘膜投与用の組換えワクチン；および (ｂ)バキュロウイルス発現系によって発現されるネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりなる非経口投与用の組換えＦＩＶワクチン接種キット。２６．バキュロウイルス発現系によって発現される、ネコ免疫不全ウイルス( ＦＩＶ)ｇａｇ蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびＦＩＶｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなる非経口投与用の組換えネコ免疫不全ウイルスワクチンよりなるワクチン接種キット。２７．ＦＨＶによって発現されるＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ蛋白質の両方をコードするＤＮＡ配列からなる組換えワクチンよりなる粘膜投与用のワクチン接種キット。