JPH09512184A

JPH09512184A - 内皮下細胞外基質上の内皮を利用する改善された血液接触表面

Info

Publication number: JPH09512184A
Application number: JP7527213A
Authority: JP
Inventors: シー．ブルックマン，ウィリアム; シー．ベゴバック，ポール
Original assignee: WL Gore and Associates Inc
Current assignee: WL Gore and Associates Inc
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1997-12-09
Also published as: EP0757562A1; WO1995029713A1; US5879383A; AU2399495A; CA2186375A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、適当な内皮下基質上で増殖させた受容体の内皮細胞を利用することによって抗血栓性となった血管補てつ物の如き改善された血液接触装置に関する。内皮細胞の増殖のための支持体を担うこの内皮下基質層は天然ドナー血管又は生体外組織培養起源のいづれかより得られうる。この内皮下基質はドナー血管の上でその場で使用されるか、又は合成構成物、好ましくは多孔質延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン上で増殖又は適用される。この内皮下基質が調製できたら、受容体の内皮細胞をこの基質支持体の上に植えつける。この基質支持体はこれにより直接血液接触表面を担う。内皮細胞は手術内手順として適用するか、又は細胞が集密単層をつくりあげるまで内皮下基質支持体上で生体外増殖させてよい。本発明の重要な観点は、生きている受容体内皮細胞を適当な内皮下基質支持体上で増殖させ、これにより実質的に非血栓形成性である血液接触表面を提供することにある。更に、受容体の免疫応答の可能性は最小限となる。本発明は６mm以下の直径を必要とする人工バイパスに極めて有用な血管補てつ物をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】内皮下細胞外基質上の内皮を利用する改善された血液接触表面発明の背景１．発明の分野本発明は人工血管及びその他の移植可能な器具の如きの装置において利用するための改善された血液接触表面並びにかかる血液接触表面を製造するための方法に関する。２．関連技術の説明合成材料はヒト心臓血管系の疾病にかかった又は損傷した部分に置き代わるものとして広く利用されている。ポリエチレンテレフタレート及び延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）の如きの合成品より成る移植片の利用は大動脈、腸骨又は大腿動脈の如きの大型血管の代用において有効な結果を収めている。しかしながら、冠状動脈バイパス又は膝窩動脈より下の末梢動脈バイパスにおけるような小直径動脈へのこのような合成品の適用は往々にして、開存性を高める薬理学的手段にもかかわらず、血栓をもたらしてしまう。凝血形成が頻繁に問題となっている合成品のその他の用途には静脈、心臓弁及び人工心臓の代用が含まれる。組織ベース補てつ物は、ある用途においては認容できる機能を有するが、しかしその他の用途においてはいまだ血栓形成の併発を伴ってしまい、合成品に類似の性能を供する。このような血栓形成の問題は組織ベース及び合成品の器具の双方の有用性を、特に需要の高まっている用途において制約してしまう。従って、長年の研究者の目標は血栓症の抑制又は排除を供する血液接触表面を開発することにある。例えば血管内において見い出せるような天然血液接触表面はその表面伝いの正常な血液の流れの際に血液の凝固を防ぐメカニズムをもっている。哺乳動物動脈の場合、直接血液接触表面は非血栓形成性内皮細胞（ECs）の層を含んで成る。この内皮細胞層のすぐ外側にあるのは内膜の残り、即ち基底膜とその下に広がる糖タンパク質担持細胞外基質との内皮下基質層、及び内部弾性板である。この内膜層のまわりは平滑筋細胞（SMCs）及びエラスチンを含む多層中膜構造があり、そしてこの中膜のまわりには、線維芽細胞と接続組織とを含んで成る最外層である外膜がある。内皮下層及び中膜は一般に、血管が負傷したときに止血を維持するようにもとから血栓形成性であると考えられる。無傷の内皮層は負傷していない限り非血栓形成性であると考えられる。その血液接触箇所を理由に、内皮細胞はその抗血栓機能に関して徹底的に調べられている。内皮細胞は硫酸ヘパラン（heparan sulfate)／アンチトロンビンIII、硫酸デルマタン（dermatan sulfate）／ヘパリン補助因子II、トロンボモジュリン／プロテインＣ／プロテインＳ、プロスタサイクリン及び組織タイププラスミノーゲンアクチベーターを含む凝血阻止又はフィブリン溶解機能をもついくつかの物質を合成又はそれと結合することで知られている。更に、疾病血管をバイパスするために個体の一つの部位から別の部位へと移植した内皮担持自己由来血管の切片は、同じ用途において用いられた合成品のそれと比べて実質的に低い血栓症発生率を示す。このような理由のため、内皮細胞は血管の非血栓活性の原因であると推定されてきた。この推定に従い、天然血管構造と類似に血栓抑制可能な合成血液接触装置は内皮細胞の血液接触表面を必要とするであろう。内皮細胞層を含む又はそれを発育させる補てつ物表面、そして特に血管移植片を提供する数多くの試みがなされている。これらの試みの圧倒的大多数は手術内（intraoperative）細胞播種法として実施されている。手術内細胞播種は一般に、手術中に受容体から内皮細胞を獲得し、そして直ちにこれらの集めた細胞を、内皮細胞付着性を高めるための支持体により予備処理しておいた血管移植片上に播種することを含む。合成表面にしばしば適用される支持体は、患者から採取した事前凝固した血液又は細胞外基質タンパク質、例えばフィブロネクチン、コラーゲンもしくはラミニンの単独もしくは組合せ物を含んでいる。この手法は最初M.B.Herringらの「A single staged technigue for s eeding vascular grafts with autogenous endothelium」Surgery 84：498-504 (1978)により報告されている。この方法においては、自己由来細胞を事前凝血させたDACRON（登録商標）移植片の上に播種された。これらの播種を施した移植片は、内皮細胞をもたないコントロール移植片と比べて低い血栓形成率を示した。このような様々な支持体の利用を通じて達成される合成表面に対する細胞の改善された初期付着力にもかかわらず、血流に由来する剪断力はそれでも適用細胞の大部分の損失を招いてしまう。上記の変法において、Smithの米国特許第 4,960,423号には内皮細胞付着力を強めるためのエラスチン誘導型ペプチドの利用が記載されている。いくつかの研究は、内皮細胞の付着及び増殖のための支持体を供するため、細胞外基質分子と細胞との組合せを利用している。例えば、Bellの米国特許第 4,539,716号及び 4 ,546,500号には、内皮細胞を生きた平滑筋細胞−コラーゲン格子の上で増殖させる手段が記載されている。更に、Carabasiらの米国特許第 4,883,755号には、負傷した血管表層上への内皮細胞の播種のための技術方法が記載されている。血管移植片の上で内皮細胞を増殖させる別の手段も報告されている。例えば、移植片表面に内皮細胞を適用するための物理的な力の利用がMuller らの米国特許第 5,037,378号に記載されている。別の例において、Turina及びBr ittmanの米国特許第 4,804,382号には半透過性膜への内皮細胞の適用が記載されており、その膜における孔は内皮細胞被覆ができるよう水性ゲルで満たされている。別の手法は、生物学的に誘導された表面、例えば心膜、心臓弁小葉、羊膜及び動脈上への内皮細胞の播種である。これらの研究はJ.Hochら「In vitro endothe lialization of an aldehyde-stabilized native vessel」J.Surg.Res． 44：54 5-554(1988)に由来すると思われ、それではその著者は、フィシンで消化し、ジアルデヒドで安定化したウシ動脈上での内皮の増殖を試みている。ヒト静脈内皮細胞はこのような酵素で消化した移植片の残留コラーゲン表面に付着してその上で広がることが見い出されたが、移植研究は行われていない。J.Hochらは、ヒト羊膜上、機械的削り落としを施した生きたヒト動脈上、及びここでもフィシンで消化し、なめしたウシ動脈上での内皮の増殖も調べている。（J.Hochら、「Endo thelial cell interactions with native surfaces」Ann.Vasc.Surg. 2：153-15 9(1989)）。２時間でこれらの表面上での内皮細胞付着が観察されたが、これらの表面上でのECs の長期持続は検討されず、そして従来の研究における通り、これらの内皮化材料のどれも血管代用品として移植されていない。P.A.Schneider らは、内皮細胞を、内膜の除去された狒々血管の残留コラーゲン質表面上に成功裡に植え付けることができることを示した(P.A.Schneiderら、「Confluent dura ble endothelialization of endarterectomized baboon aorta by early attach ment of cultured endothelial cells」J.Vasc.Surg. 11：365-372(1990)）。S. G.Lalkaらは、ヒトの臍静脈内皮細胞をその上に生体外で成功裡に播種することのできるエタノール固定化無細胞血管基質を作るためのイヌ動脈の洗剤抽出を利用している（S.G.Lalk aら、「Acellular vascular matrix：A natural endothelial cell substrate」Ann.Vasc.Surg. 2：108-117(1989)）。 HochらのJ.Surg.Res．（前掲）のそれと類似の研究において、L.Bengtssonらは、内皮及び内皮下層をはいだ失活血管切片の管腔面上でのヒト静脈内皮の増殖の成功を収めている。(L.Bengtssonら「Lining of viable and nonviable allog eneic and xenogeneic cardiovascular tissue with cultured adult human ven ous endothelium」J.Thorac.Cardiovasc.Surg． 106：434-443(1993)）。以上の研究のどれも無傷な内皮下層を有する組織上で生物組織への内皮層の提供の試みを行っていないことを強調する。更に、どのこれらの試みにおいても、組織は内皮化後に長期間持続する血管代用品として試験されていない。移植用途のための生物組織は一般に固定剤、例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ジアルデヒドデンプン類、ポリエポキシ化合物又はアルコール類を採用する保存処理にかけられる。グルタルアルデヒドが最も一般的に利用される架橋剤であり、その理由はそれが低い免疫原性、優れた組織保存及び移植環境の中での安定性を供するからである。生物組織に由来する移植のために適当な製品を製造するための試薬としてのグルタルアルデヒドの利用はいくつかの米国特許、例えばBraunの第 3,562,820号、Hancockらの第 3,966,401号、Dardikの第 3 ,988,782号、Hancockらの第 4,050,893号、Miyataらの第 4,098,571号、Lentzらの第 4,323,358号及び Nimniらの第 4,378,224号に記載されている。グルタルアルデヒド処理した組織は一般に良好な移植結果を供するが、未反応の残留グルタルアルデヒドは固定化組織と接触して増殖した細胞の阻害又は死をもたらしうる。従来の研究者（例えばL.Bengtssonら（前掲）を参照のこと）は、固定化組織上での内皮増殖が残留グルタルアルデヒドにより阻害されうることを示している。残留グルタルアルデヒドの問題は、このアルデヒド基上の反応部位をブロッキングすることにより対処されてきた。残留又は遊離アルデヒド基はアミノ酸又はタンパク質の如きのアミノ基含有化合物を用いて効果的にブロッキングできうる。Grimmら（「Glutaraldehyde affects biocompatibility of bioprosthetic he art valves」Surgery 111：74-78(1992)）は、反応性アルデヒド基を不活性化させることのできる固定後処理を述べている。内皮細胞を播種したグルタルアルデヒド固定化組織は８％のＬ−グルタミン酸への48時間の曝露を経て、阻害されない細胞増殖を示した。Nashefらは米国特許第 4,786,287号において、遊離アルデヒドの濃度を低く保つことによって、固定化組織からのアルデヒドの拡散速度を高めるための過剰のアルデヒド反応性アミン含有溶液の利用を述べている。De wanjeeの米国特許第 4,553,974号には、界面活性剤−洗剤処理、その後のグルタルアルデヒド固定及び抗カルシウム沈着処理を利用する、内皮化のためのコラーゲン性組織を調製するための別の方法が記載されている。内皮は組織表面の上で以前から増殖されているが、これらの処理は例えばフィシンによる消化、洗剤処理及び機械的除去を採用しており、それぞれ内皮下基質層を崩壊してしまい、高まった血栓形成性をもたらしている。更に、組織、例えば心膜又は羊膜は天然状態では必須の内皮下基質をもたない。移植片表面上に内皮細胞層を支持する支持体を提供するための近年の研究には生体外で培養した細胞外基質の利用が含まれる。Schneiderらは ePTFE血管移植片上で細胞外基質を生成するために角膜内皮細胞を利用している（A.Schneider ら、「An improved method of endothelial seeding on small caliber prosthe tic vascular g rafts coated with natural extracellular matrix」Clin.Mat． 13：51-55(199 3)）。細胞外基質の生成後、これらオリジナル細胞をトリトン X-100及び NH₄OH を用いて除去し、そしてこのチューブに再びウシの大動脈内皮を播種している。この手法は、内皮が ePTFE移植片を覆っている細胞外基質の上で成功裡に増殖できることを示しているが、しかしながら移植研究は行われていない。Y.S.Leeらによる別の手法は、ポリウレタンチューブの上で細胞外基質を分泌させるための培養胎児ヒト線維芽細胞を採用している。線維芽細胞をいくつかの方法のうちの１つにより除去し、そして残留基質にヒト大網内皮細胞を播種している。この方法はラット大動脈に移植後５週目において開存している移植片をもたらした(Y.S .Leeら、「Endothelial cell seeding onto the extracellular matrix of fibr oblasts for the development of a small diameter polyurethane vessel」ASA IO Journal 39：M740-M745(1993)）。 H.Miwaら「Development of a hierarchically structured hybrid vascular g raft biomimicking natural arteries」ASAIO Journal 39：M273-77(1993)によっても類似の手法がなされている。この場合においては、平滑筋細胞をDARCON （登録商標）移植片の上にＩ型コラーゲン及び硫酸デルマタングルコサミノグリカン（dermatan sulfate glycosaminoglycan）の適用人工基質において積層している。次いで内皮細胞の層を血液接触表面として担うように人工基質上で増殖させている。内皮は正常な血管構造の抗血栓挙動の既知の起源であるため、内皮被覆は心臓血管移植片の改善された抗血栓性を達成せしめる手段として広く認められている。しかしながら実際の試験では複雑な結果を供している。数多くの研究が動物で行われており、そのうちのいくつかは内皮化の結果としての開存性の明瞭な改善を報告している。併しいくつかの研究は、殆んど改善が認められないあいまいな結果を報じている。（P.Zillaら、「The endothelium：A key to the future」J.Card.Surg. 8:32-60(1993)）。例えばP.Ortenwallらは、羊及び犬の両者において播種を施した移植片とコントロール移植片との間で類似の開存性結果を示した(P.Ortenwall ら、「Seeding of ePTFE carotid interposition grafts in sheep and dogs：s pecies dependent results」Surgery 103：199-205(1988)）。動物で行なった実験的播種研究の総合的な結果は受容体の内皮細胞の付加に基づく性能向上を暗示しているが、このデーターは自己由来血管の利用により期待されるレベルに至るほどの性能向上を示していない。例えば、羊で行った試験において、N.L.Jamesらは、内皮細胞を播種した移植片６個のうち１個（１／６）のみが開存性であり、それに比して自己由来動脈移植片では６個のうち６個（６／６）が開存性であったことを報告している。(N.L.Jamesら、「In vivo patenc y of endothelial cell-lined expanded polytetrafluoroethylene prostheses in an ovine model」Artif.Org. 16：346-53(1992))。同様に、ヒトにおける合成血管移植片への上記の内皮化方法の適用は、少なくとも数例においては受容体の細胞の播種された移植片が内皮化されているという観察にもかかわらず、開存性において実証可能な向上がほとんどないことを示している。（P.Zillaら、「T he endothelium：A key to the future」J.Card.Surg. 8：32-60(1993)）。従って、内皮被覆合成品により達成される実際の臨床結果は、動物研究によりふくらまされた期待と一致するものではなかった。発明の概要本発明は人工血管及びその他の移植可能な血液接触器具において使用するのに適切な改善された血液接触表面に関する。本発明の重要な要素は、複合体を形成するよう適当な内皮下基質に付着された血管起源の生きた内皮細胞の組合せにある。この複合体は、特に小直径用途における現存の血管移植片補てつ物と比べて改善された開存性能を提供する。血管内皮細胞の除去されたドナー心臓血管組織は本発明における用途にとって適当な内皮下基質を担うように利用できうる。他方、適当な内皮下基質層が、天然血管表面から内皮下基質層を取外し、そしてそれを合成構成物に移すことにより獲得できる。更なる別の方法において、適当な内皮下基質層は、平滑筋細胞を組合せて内皮細胞を利用することによって生体外で増殖させることができる。どのケースにおいても、オリジナルの内皮は除去され、受容体の血管内皮細胞をその後播種するために内皮下基質層が露出されている。自己由来血管内皮細胞が本発明の内皮下基質層への播種のために好ましい。免疫原性細胞表層因子の除去された遺伝的に操作された内皮細胞も本発明における利用にとって適当でありうる。任意の処理において、内皮下基質層を、血管内皮細胞の播種に先だって保存することができる。本明細書における「保存内皮下基質層」なる用語は、内皮下基質層であって、固定溶液、例えばグルタルアルデヒドにより、その基質を化学的に安定化させ、それ故血管内皮細胞が付着して直接血液接触表面を形成するように増殖するような表面としてこの内皮下基質層を保存せしめるように処理された層を意味する。適当な内皮下基質層を単離し、そして任意的に保存せしめたら、生きた血管内皮細胞をこの基質の上に植え付け、そして集密となるまで増殖させて直接血液接触表面を形成させる。保存又は非保存の本発明の内皮下基質層も、その内皮下基質層に付着し、且つその上で増殖する受容体の血管内皮細胞がない場合、直接血液接触表面を担う。即ち、この最終血液接触表面は内皮下基質支持体を含んで成り、好ましくは内皮細胞がその支持体に付着している。完全な受容体の内皮細胞被覆がないとき、この内皮下基質自体も血液接触表面を担う。従って本発明は、適用心臓血管内皮細胞の付着及び増殖を支持する内皮下基質層、この内皮下基質層に付着した適用心臓血管内皮細胞層を含んで成る支持体を含んで成る血液接触表面を含んで成り、ここでこの心臓血管内皮細胞は直接血液接触表面を担い、そしてここで前記支持体に細胞が付着していないとき、この支持体が直接血液接触表面を担う。本発明は血管及び類似の器具に特に適用可能であるが、それは実質的に非血栓形成性の血液接触表面が供されなければならない数多くの領域に適用されうる。本発明に従って作ることのできうるその他の器具の例には、限定することなく、柔軟シート、心臓弁、人工心臓、人工器官、例えば移植可能な人工腎臓等が含まれる。図面の説明本発明の実施は、添付図面と一緒に考慮しながら下記の説明より明らかとなるであろう。図１は哺乳動物の動脈の透視断面図である。図２は哺乳動物の動脈の縦軸伝いの断面図であり、内皮細胞層が除去されて内皮下層（14）が露出している。図３は本発明の一態様の断面図であり、生きた内皮細胞（24）が図２の哺乳動物動脈構造（26）の表面に適用されている。図４は本発明の管状血管移植片の態様の図である。図５は合成構成物（32）上の平滑筋細胞の層（20）に直接適用された内皮細胞の層（12）の断面図である。図６は内皮下基質層（14）が内皮細胞（12）と平滑筋細胞（20）との間に作られた図５に示す構造の断面図である。図７は内皮細胞層（12）が除去されて内皮下基質層（14）の露出した図６の構造の断面図である。図８は受容体の内皮細胞（24）が図７の構造に示す内皮下基質層（14）に適用されている本発明の一態様の断面図である。図９は図８に示す構造が平らなシート状の合成ベース材料（28）の上で増殖した本発明の一態様の図である。図10は図８の構造を採用した心臓弁器具（30）の図である。発明の詳細な説明まず最初に、図１は典型的な哺乳動物動脈（10）の構造を示す。動脈（10）の構造は、内皮細胞の最内層（12）、基底膜とその他の細胞外基質成分とより成る内皮下基質層（14）、及び内部弾性板（16）を有する内膜層より成る。内膜の外側には平滑筋細胞（SMC）（20）より成る中膜層（18）があり、そして最後に線維状接続組織又は外膜層（22）がある。本発明は人工血管及びその他の血液接触器具において利用されるものの如きの改善された血液接触表面に関する。内皮は天然血管構造の表面に主要な抗血栓性を供するものと認識されている。それにもかかわらず移植試験は、内皮被覆補てつ物は非内皮化補てつ物のみで達成される結果と比べ、ヒトにおける開存性において不確定的な改善しか発揮しないことを示している。内皮が抗血栓特性の唯一の起源であると考えられているため、ヒトにおいて開存性の向上がないことは驚くべきことである。補てつ物の表面上の内皮の抗血栓特性を具現化するためには更なる要素が必要であることが発見された。内皮化表面の抗血栓機能は適当な生物支持体、特に内皮下細胞外基質層の存在に依存することが見出された。内皮下基質は高度に血栓形成性であると広く信じられているが、この層がないと、内皮被覆は血液接触表面に対してぎりぎりの性能利点しか供さない。本発明において、その上で血管内皮細胞増殖が達成されうる適当な内皮下基質層を得るための３通りの一般的な方法論が開発された。第一の方法は、オリジナル内皮が除去されているが無傷の内皮下基質がその場に保存されているドナー心臓血管組織を利用する。第二の方法においては、内皮下層をドナー心臓血管組織から取り外し、そして合成構成物に適用することができる。第三の方法においては、所望の内皮下層を生体外細胞培養技術を利用して適当な表面の上に直接合成することができる。この第三の方法では、平滑筋細胞及び内皮細胞の双方が同時培養法により適当な細胞外基質を作るのに必要とされる。内皮下基質表面がこれら３つの手段のいづれかにより調製できたら、受容体の内皮細胞を移植の前に集密となるまでその表面の上で増殖させるか又は移植の時にその表面の上に播種して直接血液接触表面を形成させ、これにより改善された開存性能を有する内皮化移植片を提供することができる。どの上記の供給元を利用しようと関係なく、本発明の内皮下基質は従来使用されている表面に勝るいくつかの利点を有する。第一に、内皮下基質表面上で増殖する内皮細胞はしっかりと付着しており、細胞損失の問題を少なくする。その結果、内皮細胞はその他の表面と比べて迅速に集密に達し、且つそれを維持する傾向にある。第二に、内皮下基質と内皮細胞との組合せは内皮下基質を欠く内皮層よりもはるかに血栓形成しにくい。第三に、反対の結果の多数の論文の発見にもかかわらず、内皮下基質自体が抗血栓特性を有し、そして直接血液接触表面を担うことができる。これは本発明を手術内細胞播種により実施したときに特に価値を有する。これらの条件下で、この移植片に受容体の内皮細胞を播種することができ、細胞が集密となるまで増殖する前に移植片の機能を損わせてしまいうる血栓沈着についての問題が少なくなる。更に、この血栓自体、その後の表面の細胞被覆を妨害しうる。抗血栓表面を供するために内皮細胞を採用する従来の試みは本発明のように内皮細胞と内皮下基質との組合せの必要性を認識していない。本発明の重要な要素は従って最終内皮細胞層を適当な基質の上で増殖させることにある。本発明により考慮される適当な基質は、心臓血管系において見い出せる天然内皮下基質であるか、又は内皮細胞及び平滑筋細胞の適当な同時培養により作られる基質のいづれかである。内皮下基質層は機械、酵素又はある化学処理による損傷を受け易いため、その非血栓特性を保存するために適宜調製すべきである。本発明の重要な要件の一つは内皮下基質を無傷な状態で維持することにある。天然内皮下基質の調製及び利用移植片の作製のための出発材料は、脊椎動物の種、好ましくは哺乳動物の種、例えば、限定することなく、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長類、例えばヒトの供給元から獲得されるドナー心臓血管組織である。同様に鳥類供給元も使用できうる。心臓血管組織は心臓、動脈血管、静脈血管及び／又は毛細血管床から獲得できうる。例えば、動脈血管は四肢を無傷のまま凍結することにより又は適当なサイズの血管の即時的な切開により得られうる。もし四肢切片を最初に凍結するなら、四肢はまず解凍しておくべきである。次いで、血管を切除し、そして更なる処理のため４℃の生理学的pHの食塩水緩衝液の中に入れる。適当な食塩水溶液には任意の数の生理学的平衡塩溶液、例えば、限定することなく、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、アールの平衡塩溶液、ハンクスの平衡塩溶液（HBSS）又はリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。処理は、外生外膜組織の切除及びポリマー製縫合材料による任意の枝状切片の結紮を包括する。これらの段階を踏んで血管切片は内皮細胞層を除去する更なる処理の用意が整う。内皮下層からの内皮細胞層の除去は、内皮下基質を無傷に保ち、且つ内皮下基質層の非血栓形成特性を保持させるために慎重に行わなければならない。過度に苛酷な技術、例えば洗剤剥離の利用は内皮下基質を傷つけてしまうことが見い出されている。内皮下基質に悪影響を及ぼすことなく内皮細胞層を除去する多くの比較的簡単な試薬及び方法がある。内皮下層は例えば温和な化学剥離溶液、例えば水酸化アンモニウム(NH₄OH)により処理してよい。一つのかかる処理は血管腔を約0.01Ｍ〜約 0.5Ｍの濃度のNH₄OH水溶液の中で約30秒〜約60分インキュベートし、次いで血管腔に緩衝溶液をフラッシングすることを含みうる。好適な態様において、この処理は血管を約0.25Ｍの濃度のNH₄OH溶液で約３〜約５分処理することを含む。得られる動脈構造を図２に示す。内皮細胞除去のための別の適当な技術は管腔表面の風乾の利用である。一つの考慮される風乾処理は、血管腔に緩衝液をフラッシングし、次いで内径４mmの血管に対しては約５〜約10分間にわたり約 500〜約2,000cc／minの流速で風乾することを包括する。流速は約 1,000cc／minであることが好ましい。風乾の後、血管腔に内皮細胞を除去するために緩衝液をフラッシングし、次いで更なる処理の前に内皮下基質層を再水和させておく。本発明の別の態様において、内皮細胞は、動脈を一連の凍結−融解サイクル（好ましくは２サイクルより多く）にかけ、次いで動脈腔に適当な溶液、際えばHB SS(1.3mMの CaCl₂、5 mMの KCl、0.3mM のKH₂PO₄、0.5mMの MgCl₂、0.4mMの MgSO₄、138mMのNaCl、4 mMのNaHCO₃、0.3mM のNaHPO₄、5.6mMのグルコース)をフラッシングすることにより除去される。内皮下基質表面を上記の通りにして内皮細胞除去により調製したら、移植した血管組織のカルシウム沈着を防止又は最小限とする処理工程が採用される。この技術は主に脂質成分を抽出する溶媒溶液を利用する。一つの効果的な処理は、動脈を例えば２：１の容量：容量の比のクロロホルムとメタノール(CHCl₃／CH₃OH) との溶液の中に約15〜約60分間浸しておくことを含み、約20〜約40分の処理時間が好ましい。次いで動脈を取り出し、そして食塩水溶液への浸漬を介して再水和させる。再水和させたら、移植片を下記のようにして保存する。クロロホルムとメタノールとの処理は内皮下基質を損傷せず、しかも移植した後の動脈のカルシウム沈着を抑制する。その他のカルシウム沈着防止処理も同様に採用できることが知られている。再水和の後、内皮下基質を保存するため、免疫原性を下げるため及び血管切片を滅菌するために固定剤で処理する。適当な固定剤には、限定することなく、例えばアルコール類、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ジアルデヒドデンプン類又はポリエポキシ化合物が含まれる。好適な形態において、血管を加圧下で固定する。これは血管を適当な内径を供するチューブに入れ、その血管を固定溶液で充填し、そして約21〜約35kPa に加圧することにより成し遂げられる。適当な直径を供するのに適当なチューブには、限定することなく、例えばW.L.Gore & Associates，Inc.（アリゾナ州，フラグスタッフ）より商標GORE-TEX（登録商標）血管移植片のもとで入手できる ePTFE移植片が含まれる。加圧固定時間は採用する固定剤及び濃度に依存する。例えば、もしグルタルアルデヒドを固定剤として選ぶなら、適当な溶液は適当な緩衝液中で約 0.1〜2.5 ％の濃度のそれを含むであろう。加圧固定時間は選んだグルタルアルデヒドの濃度に依存して約１時間〜約72時間であろう。この用途に適当な緩衝液には、限定することなく、例えばＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸(HEPES) 、酢酸塩、２（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(MES)、３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸（MOPS）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、リン酸塩等が含まれる。好適な態様においては、血管を 100％のエタノールの中で約２〜72時間加圧固定し、その後一連の段階式に濃度の下降していくエタノールを用いて再水和させる。更なる固定を供するため又は滅菌剤としての用途のため、その他の試薬、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを使用することが可能でありうる。しかしながら、もしこれらの試薬を使用すると、表面上でのその後の細胞増殖が阻害されないよう、任意の残留アルデヒドをブロッキングする追加の処理工程が必要である。このブロッキング工程にとって適当なアミノ基含有溶液には例えば 0.1Ｍのグリシン、メディウム 199又はダルベッコの改良イーグル培地が含まれる。固定後、又は固定／ブロッキング処理後、血管をすすぎ、そして移植又は更なる使用まで４℃の無菌標準食塩水溶液の中で保存する。上記の本発明の態様に加えて、本発明のその他の２通りの態様は血管に由来し且つ合成表面に移された天然内皮下層、又は生体外細胞培養を通じて合成表面上で増殖された内皮下層の類似体のいづれかを採用する。任意的な工程において、両方の方法の内皮下層はグルタルアルデヒドの如きの固定剤で処理されうる。アルデヒドで固定した血管と比べ、これらの非常に薄い層の軽くなった質量及び減少した拡散距離は残留アルデヒドの存在の可能性を低める。しかしながら、血管のための上記の如きのブロッキング工程が、細胞増殖阻害がないことを確実にするためにいまだ推奨される。上記の処理により保存された内皮下基質層は数多くの細胞外基質成分を含む。免疫細胞化学アッセイを利用し、この内皮下基質層は硫酸コンドロイチンプロテオグルカン類(chondroitin sulfate proteoglycans)、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン及びエラスチンを含むことが決定された。内皮下基質層が調製できると、基質層14は、その上に受容体内皮細胞24を播種し、そしてその上でその細胞を図３に示すような構造を帯びる構造体ができるように増殖させることのできる支持体を担うようになる。内皮細胞は様々な方法で適用できうる。例えば、内皮細胞を手術内手順として移植片受容体から獲得し、そして直ちに内皮下基質支持体に適用することができる。他方、内皮細胞を未来の受容体から単離し、内皮下基質支持体の上で集密となるまで生体外で増殖させ、その後患者に移植することができる。直接誘導型又は生体外処理された内皮下基質層を採用する本発明の二通りの態様において、この複合体の非血栓特性は生物学的成分により供され、一方その必須の機械特性は合成構成物により供される。これらの態様のうちの一つにおいては、内皮下層をドナー組織から取り出し、そして合成構成物の上に載せる。この場合、合成構成物は必須の機械的な支持の全てを供する。本発明の別の態様において、この合成構成物はドナー血管組織のまわりに配置される外側のさやより成り、それ故その支持体はドナー組織と外側のさやとにより供されるものの複合体である。生物学的組織はその用途にとって必要な強度よりもその強度を弱めてしまいうる分解処理にかけられるが、その合成部分は適切なポリマー及び組立を選定したならその処理に耐えうる。当業者は、血液器具の用途それぞれにとって最低限の機械的保全要件があることを認識しているであろう。一つの最低限の要件は、その器具が一定の用途の意図している期間にわたって血圧により強いられる力に耐えることにある。従ってその形態は破裂又は脈瘤形成することなく血圧により誘発されるフープ応力に耐えねばならず、そして同様に破裂、過剰な縫合穴拡張又は疑似脈瘤形成することなく吻合部において誘発される応力に耐えなければならない。機械的強度を供するため及び周辺組織からの細胞浸潤を阻止するために血管の外面にさや材料を適用することが好ましい。さやの厚みを通る細胞通過を阻止するのに有効な気孔サイズは壁自体の厚み及びさやの外面と内面とを連結せしめる気孔のくねり性に依存する。厚さ約10〜20μｍの薄い構築体中の規則的な均質な気孔の場合、さやの厚みを通る細胞通過を阻止するために気孔は直径約３μｍ未満となるように選定せねばならない。この値は、まっすぐで均質な気孔を通る線維芽細胞の侵入限界が約５〜約８μｍであり、そしてまっすぐで均質な気孔を通る白血球侵入の侵入限界が約３〜約５μｍであるBoydenチャンバーマイグレーションアッセイ（chamber migration assays）に基づく。（A.Albiniら、「Fibrob last Chemotaxis」Collagen Rel.Res．，5：283-296，（1985）；W.Morzyckiら、「Tumour Necrosis Factor-alpha but not Interleukin-1 Induces Polymorph onuclear Leucocyte Migration through Fibroblast Layers by a Fibroblast-D ependent Mechanism」Immunology，74：107-113(1991)）。より厚く、よりくねりがある、又は層状の構造の場合、個々の気孔は多少大きくてもよく、なお層の細胞通過の有効なバリヤーを担いつづけることができる。 ePTFE又は類似のフィブリル化さやに関して、このさやの気孔サイズはさや材料のフィブリルの長さに直接関連する。フィブリルの長さは、さやを介する細胞接近を抑え、しかも高分子の透過性を維持する気孔を形成するように選定すべきである。細胞内成長に抵抗するさやの能力を規定するうえで、無細胞アッセイ法が開発されている。３μｍがまっすぐな気孔の細胞透過性の下限界を示すという公開の値を基礎として、所定のさやが直径３μｍの粒子を排除するかどうかを機械的に決定するのにこの直径の微小球を使用できる。その結果、３ μｍの微小球を排除する任意のさや材料は、さやを横断する細胞移動を効果的に阻止するであろう。細胞排除特性に加え、このさや材料は高分子のバルクフローに対して透過性である。「高分子」なる語は、限定することなく、例えば約 2,000,000MWを含めこれに至るまでの分子量を有する分子を含むものと解される。さやのために適当な材料には、限定されることなく、とりわけポリテトラフルオロエチン（PTFE）、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、フッ化エチレンプロピレンコポリマー(FEP)及びそれらの組合せが含まれる。本発明の好適な態様において、このさやは微多孔質であり、ePTFEより成り、高分子のバルクフローに対して透過性であり、ホストの細胞内成長に対しては不透過性であり、そして囲むことを意図する組織がないときでさえも血管代用品として機械的に働くのに十分な強度のものである。本さやは、マンドレルを多層のePTFEフィルム、例えば双方共Goreに付与された米国特許第 3,953,566号及び同第4,187,390号（それぞれは引用することで本明細書に組入れる）に記載のもので包み、そしてこのフィルム及びマンドレルを約380℃のオーブンの中で約10〜約20分加熱することによりフィルム同志を接着させ合うことにより構築される。このフィルムチューブをマンドレルから外し、そして調製しておいた組織移植片をポリマーチューブの管腔の中に設置する。その他の材料又は材料の組合せは、選定の材料の物理特性に適する温度を利用して同様に組織チューブに適用してよい。図４に複合構造体を示し、それではさや（28）は、管状血管移植片（30）を形成する受容体内皮細胞（24）の層で覆われた動脈壁（26）の外面に適用されている。さや材料を製造するその他の方法は、処理した動脈をマンドレルの上に置き、そしてその移植片を多層の ePTFE及び FEP複合フィルムで包み、そしてそのフィルム層を瞬時に約 325℃から約 350℃に加熱して血管の外面上のフィルムラップ同志を融着させることを含む。FEPをコートした延伸膨張 ePTFEフィルムは次の処理を含む工程により作る：ａ）通常は膜又はフィルム状の多孔質PTFE支持体を、好ましくは FEP又はその他の熱可塑性ポリマーのフィルムである別の層と接触させ；ｂ）処理（ａ）において得られた組成物を前記熱可塑性ポリマーの融点より高い温度に加熱し；ｃ）前記熱可塑性ポリマーの融点より高い温度に維持しながら処理（ｂ）の加熱組成物を延伸し；そしてｄ）処理（ｃ）の生成物を冷却する。その他のさや構築法は、Goreの米国特許第 3,593,566号に従い一軸延伸により構築した管状のPTFEの製作である。処理した血管をこのようにして構築した ePT FEチューブの中に挿入する。さやのその他の形態と同様、この管状形態は高分子の通過に対して透過性であるが、しかし細胞は通過させないものでなくてはならない。さやの構築は、引用することで本明細書に組入れる1994年4月29日提出のBruch manらの米国特許出願、題名「Cell Excluding Sheath For Vascular Grafts」US SN 08／235,071号に記載されている。さやの透過特性は、既知サイズのマーカー、例えばデキストラン及びポリスチレン微小球により試験することによって評価できる。例えば、フルオレセイン（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）によりラベルした約2,000,000MWの平均分子量を有するデキストランをさやの高分子通過能力を試験するために用いてよい。さやの細胞不透過性は例えば懸濁物中で固形分約 2 .5％の濃度を有する約３μｍの直径のポリスチレン微小球（Polysciences，Inc. ，Warrington，PA）を用いて試験してよい。さやを着色マーカーにより透過性について試験するとき、そのマーカーは明瞭な可視色を供するのに十分な濃度で水溶液又は懸濁物として懸濁する。このマーカー溶液の化合物の好適な濃度は約 0.2mgのデキストラン／mlの溶液及び約0.02 mlの微小球／mlの懸濁物であり、後者は約 4.5×10⁷のビーズ／mlの懸濁物になる。さやの透過性の評価は約23℃で行う。必要ならば、さやは、それを水に対して透過性とすることによって透過試験の準備を整えておく。例えば、ePTFEより構築したさやを 100％のエチルアルコールにより濡らし、次いで試験前にアルコールを除去するために水でフラッシングする。高分子に対するさやの透過性を試験するため、デキストラン試験溶液をさやの管腔に注入し、そして注射器を利用して約 20.7kPaに加圧する。注射器の内容物をさやに押し込み、そしてさやの壁をしみ出る液体を集め、そして有色デキストランの形跡について白色の背景に対して目視検査する。さやの細胞透過性を試験するための準備において、例えば懸濁物中の微小球の数を適当な計数装置、例えばヘマサイトメーターを用いることにより決定する。次いでさやの透過性を、そのさや材料に微小球含有懸濁物を注射器を用いて約 20.7kPaにて押し込むことにより試験する。注射器に水を再充填し、そしてこの水も約 20.7kPaにてさやに押し込む。さやの壁をしみ出る液体を集め、そして約 300×ｇの遠心分離に約10分かける。上澄液をデカンテーションして捨て、そして微小球のペレットを既知容量の水に再懸濁する。再懸濁したペレットの中の微小球の数を計測し、そしてオリジナルの懸濁物と比較する。さやを通過する微小球の数は、さやの管腔に導入した数のパーセンテージとして表わす。本用途にとって適当なさやは、約 20.7kPa以下の圧力において 2,000,000MWのデキストランを通過させ、その結果さやをしみ出る溶液が白色の背景に対して観察されたときに目に見えるほど着色されているものとなるようにするものである。更に、このさやは約 20.7kPaの圧力において約５％より多くの３μｍの微小球を通過させないようなものであろう。誘導型天然内皮下基質の調製及び利用前述した通り、本発明の重要な要素は、その上で内皮細胞を植え付ける又は増殖させる支持体としての血管内皮下基質層の利用である。本発明は、保存内皮下基質層をもとの位置のままドナー血管上に残し、その基質の表面に内皮細胞を播種し、そしてそのドナー血管をそのまま移植することによって好適に実施される。別の態様は、ドナーの心臓血管組織の表面から内皮下基質層を除去しておき、そして合成構成物に内皮下基質層を再付着させ、次いで内皮細胞を内皮下基質に適用させることである。合成構成物に内皮下基質層を適用する工程における第１の処理はドナーの組織からの内皮の除去である。そこでは内皮下基質層を例えばメスの刃を用いてドナーの組織から機械的に除去する。内部弾性板の上層の細胞外基質層のみを除去する。無傷の内部弾性板はドナーの組織に付着したままにしておく。合成構成物への内皮下基質層の付着のためのいくつかの方法が可能である。合成構成物への内皮下基質層の一つの好適な付着方法は、合成構成物の上に得られた内皮下層を機械的に捕捉させることである。例えば、ウシの大動脈の管腔表面に由来する内皮下層をHBSSの中に懸濁する。ePTFE血管移植片を注射器継手（フィッティング）の上に取り付けた後に 10 0％のエタノールで濡らし、そして内皮下基質懸濁物を含む溶液を注射器圧を利用して微多孔質移植片の隙間に押し通す。その溶液がその移植片に挿し入れられると、内皮下基質の断片は移植片の隙間の中及びその表面上に捕捉されて残る。適用した内皮下基質は受容体の内皮細胞の適用のための支持体を担う。生体外内皮下基質の調製及び利用本発明において利用するための内皮下基質の別の重要な供給元はかかる基質を生体外で作り上げることにある。本発明のこの態様において利用するための内皮下基質の供給元は生体外組織培養法に基づく。非血栓形成性を供する正確な構成要素はいまだ完全には理解されていないが、以下の技術が基質を作るのに適当でありうる。本発明は、合成材料上に受容体のECs を播種するための支持体を提供するために、生体外で生きた血管細胞により合成した内皮下基質の類似体を利用する。この方法の一態様の段階を図５から７に示す。生体外での内皮下基質の生成は内皮細胞と平滑筋細胞との相互作用の自然の結果のようである。内皮下基質は好ましくはまず生物学的支持体細胞層を合成ベース材料の上で一定時間培養することにより作る。この支持体細胞層は平滑筋細胞(SMCs)より成ることが好ましく、そして最も好ましくは血管平滑筋細胞(VSMCs)より成る。支持体細胞層ができたら、それに好ましくは血管が供給元の内皮細胞(ECs)を植え付け、図５に示す通常の血管細胞関係を再構築させる。この構造は、ECs(12)の播種された合成ベース材料（32）の上で増殖したSMCs(20)より成る。図６に示すようにSMCs及びECs の双方がその場で内皮下基質（14 ）を合成するのに十分な培養時間を経た後、図７に示すように合成ベース材料（ 32）より成る合成構成物の上のSMCs(20)の上に積層された無傷の内皮下基質層（ 14）が残るようにECsを特別に除去する。次にこの複合移植片をグルタルアルデヒド固定により安定化させ、免疫原性を最小限とし、且つ内皮下基質層を保存することができる。本法における第１段階は、SMC支持層を支持し、且つ機械的保全性を供する合成ベース材料の調製を包括する。この好適なベース材料は合成多孔質延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)移植材料、例えばW.L.Gore & Associates，In c.，Flagstaff，AZより名称GORE-TEX（登録商標）血管移植片で商業的に入手できるものより成る。以下の説明の中で用いている内径４mmの血管移植片はこの供給元から得られる商業的に入手できる製品である。以下の説明の中で用いている内径2.5mmの ePTFEチューブは、引用することで本明細書に組入れるGoreの米国特許第 3,953,566号の中に教示されている CD123ファインパウダーPTFE樹脂（IC I Americas）より構築されたものである。これらのチューブを伸長により延伸膨張して約28μｍの平均フィブリル長にする。本用途にとっては約60μｍ未満のフィブリル長が好ましい。最終チューブは約 2.5mmの内径及び約0.33mmの壁厚を有した。その他の合成ベース材料には限定することなく以下のものが含まれる。即ち例えばPTFE、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリウレタン及びポリジメチルシロキサンである。上記の通りに製造した多孔質延伸膨張PTFEチューブのフィブリルの長さは、延伸方向においてフィブリルにより接続された結節間の10回の測定値の平均として本明細書において定義する。10回の測定は以下のようにして行なわれる。第１に、サンプル表面の代表的な部分の顕微鏡写真を、写真の縦方向においてフィブリルが連続して少なくとも５本示されるのに適当な倍率で作製する。顕微鏡写真の縦方向を横断する２本の平行線を引いてその写真を３等分の領域に分割し、フィブリルの延伸方向及び配向方向に対して平行な方向で線分を引く。左側から右側にかけて測定して、写真の上部の線分に沿って、写真の左端付近の線分と交差する最初の結節から始め、線分と交差する引き続く結節へと続けてフィブリル長の５回の測定を行う。別の線分に沿って更に５回の測定を、写真の右手側の線分と交差する最初の結節から始め、右側から左側に向って行う。この方法により得た10回の測定値を平均して、この材料のフィブリル長を得る。本発明に適当な合成ベース材料は以下のようにして更に調製した。市販の直径４mmのGORE-TEX（登録商標）血管移植片及び測定内径 2.5mmの ePTFEチューブを長さ約７cmに切り、そしてこの移植片の近位及び遠位末端の双方に注射器継手（フィッティング）を縛りつけた。次いで各移植片をステンレススチール製ワイヤーホルダーに取り付け、そして移植片の遠位末端にあるコネクターの中にプラグを差し込んだ。スチーム滅菌の後、この移植片は、通常は疎水性である ePTFEを 100％のエタノールで濡らすことによって細胞播種の用意を整えておいた。移植片の間隙の中のエタノールを、近位コネクターに取り付けた注射器を用いて約80 〜100ml のハンクスの平衡塩溶液(HBSS)(Gibco BRL，Grand Island，NY)と交換した。濡れた移植片を、細胞播種のために用いるまでHBSSの中で保存した。合成ベース材料チューブの用意ができたら、SMCsをこの支持構造体の管腔面に適用する。好適な方法は、移植片の壁に培地を押し入れる正圧を利用し、ベース材料の管腔面の上にSMCsを付着させることである。SMCsをベース材料に適用するためのその他の適当な手段には、限定することなく、例えばベース材料管状管腔をSMC懸濁物で充填し、次いでその表面にSMCsが均質に沈降するように一連の移植片回転を行うこと；SMCs をベース材料上に引く負圧の利用；及び化学走化性試薬の利用；が含まれる。一つの実験において、例えば、VSMCs を入手し、そして以下のようにして合成ベース材料に適用した。血管SMCsはグレイハウンド犬より得た頸動脈又は大腿動脈の約３〜４cmの切片を低温無菌メディウム 199及び50μｇ／mlのゲンタマイシン(Gibco BRL)を含むチューブの中に入れることにより単離した。層流フードの中で、動脈を縦切りにし、そしてその管腔面を無菌紙タオルでまずこすり、次いで10号のメスの刃でひっかくことにより内皮細胞を除去した。動脈中膜の薄いストリップをピンセットではがし、そして無菌ペトリ皿中のHBSSのたまりの中にプールした。次いでこのストリップを 1.5mlの平滑筋細胞増殖培地(SMCGM)(43％のダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）；43％のメディウム199；13％の胎児牛血清；２mMのグルタミン；15ユニット／mlのヘパリン；23μｇ／mlのゲンタマイシン；及び12.5μｇ／mlの内皮細胞成長補助剤(Collaborative Biomedical Produc ts，Bedford，MA))を含む 25cm²の組織培養フラスコの中に入れた。このフラスコの中の培養培地を、組織片からの細胞の有意な盛り上がりが観察されたとき交換した。次いでＴ−25フラスコ中の細胞の数に依存して、毎週二回細胞に約３〜５mlの SMCGMを与えた。細胞は一般に集密度約60〜90％のときに継代し、そして通常約１：４に分割する。平滑筋細胞のタイプは形態学基準、アルファー平滑筋細胞アクチンの陽性染色、及びEC夾雑を示唆するであろうアセチル化低密度リポタンパク質の取込みの欠如により確認した。移植片−播種目的のため、半集密VSMC培養物（例えば、約３〜15 回継代）をカルシウム・マグネシウム無含有HBSS（CMF-HBSS）で簡単にすすぎ、そしてCMF-HBSSの中で約５分洗った。フラスコから細胞をはがすのにトリプシン −エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて細胞を回収し、次いでトリプシンを SMCGMにより中和した。細胞を約 300×ｇで約５分の遠心分離によりペレット化し、そしてそのペレットを細胞計数のためにSMCGMの中に再懸濁させた。遠心分離の後、この細胞ペレットを SMCGMの中で６〜８ml当り約 2.5〜 6.0×10⁶細胞の最終濃度で再懸濁し、そして移植片播種の準備のために注射器の中に移し入れた。約 2.5mmの内径を有する移植片には約６mlの SMCGM中で約 2.5〜 3.5×10⁶ 細胞／７cmの移植片を播種し、そして内径 4.0mmの移植片には約８mlの SMCGM中で約 4.0〜 6.0×10⁶細胞／７cmの移植片を播種した。細胞数はヘマサイトメーターを用いて計数した。移植片への細胞播種は、SMC−含有注射器を濡れた移植片の近位コネクターに取り付け、次いで細胞懸濁物を移植片の中に、そして培地をベース材料移植片の壁を通すように静かに押し込むことにより行った。次いで近位側の継手にプラグを差し込み、そしてその細胞播種を施した移植片を SMCGMで満たされた16mmの培養チューブの中に、その移植片がチューブの中でころがることを防ぐようにそれを培養チューブの中にくさび留めして入れた。この培養チューブを固くキャップ締めし、そして約10〜50回転／時間で回転するローラー装置上の約37℃のインキュベーターの中に置いた。この培養チューブ中の培地を週２回以上交換し、そして更なる処理又は内皮細胞の添加まで最低約10日間培養した。合成ベース材料（32）に付着した平滑筋細胞（20）の支持体に付着した内皮細胞の層（12）を図５に示す。この構造体は様々な方法で作ることができ、好適な方法は、内皮細胞の単独細胞懸濁物を作り、移植片の管腔をこの懸濁物で充填し、そして内皮細胞を SMC表面上に付着及び伸展させることにより作り上げられうる。他方、内皮細胞の小さなパッチをドナー血管から直接獲得し、そしてそのパッチを移植片の管腔に植え付けて付着及び繁殖させ、SMC支持体層を覆うようにさせることができうる。内皮細胞(ECs)を単離するのに有効であると示されている一つの方法は、犬から得た動脈又は静脈血管からECs を遊離させる酵素的な方法の利用によった。例えば層流フードの中で血管の管腔にカニューレ挿入を施し、HBSSですすぎ、そしてCMF-HBSS中の内皮細胞獲得用酵素溶液で約37℃で約15分充填させた。適当な酵素には、限定することなく、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びトリプシンが含まれる。内皮細胞を無菌遠心分離管の中にフラッシングし、そしてECs を 300×ｇで約５分かけてペレット化した。次いで細胞をＴ−25組織培養フラスコ上にまき、そしてほぼ集密となるまで約37℃で増殖させ、次いで継代培養した。内皮細胞のタイプは形態学的基準、第VIII因子の陽性染色、及びアセチル化低密度リポタンパク質の取込みにより確認した。移植片−細胞播種の目的のため、半集密内皮細胞（例えば約２〜10回継代培養）をCMF-HBSSで簡単にすすぎ、そしてCMF-HBSSの中で約５分洗った。細胞を、フラスコから細胞を遊離するトリプシン−EDTAを用いることにより集め、次いで完全内皮細胞増殖培地(ECGM)(80％のメディウム 199、16％の胎児牛血清、２mMのグルタミン、15単位／mlのヘパリン、25μｇ／mlのゲンタマイシン、12.5μｇ／ mlの内皮細胞増殖補助剤(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)) によりトリプシン中和にかけた。細胞を例えば 300×ｇで約５分かけてペレット化し、そしてそのペレットを約 1.1〜 1.3×10⁶細胞／mlの最終濃度でECGMの中に再懸濁した。この細胞懸濁物を細胞播種のための注射器の中に移し入れた。予め細胞播種を施した上記の SMC−移植片を、両端のプラグを外し、そして移植片の管腔をHBSSで簡単にすすぐことにより内皮細胞播種のために用意した。次いで内皮細胞懸濁物を含む注射器をSMC−移植片の近位コネクターに付け、そして移植片の管腔をその移植片の壁を通じて液体を押し込むことなく細胞懸濁物で充填させた。注射器継手にプラグを差し込み、そして移植片をECGMで充填した16 mmの培養チューブに入れた。移植片をチューブの中にくさび留めし、それらがインキュベーション中に培養チューブと独立して回転できないようにさせた。合成ベース材料（32）上の内皮細胞（12）及び平滑筋細胞（20）の複合構造体ができたら、それは図５に示す構造を帯びるようになる。この複合構造体を以下の有効であることが実証された条件下に置いた。培養チューブを約10〜50回転／時間で回転するローラー装置において約37℃でインキュベートした。培養チューブ中の培地は、ECs をつくりあげるために最初の１週間はECGMで週２回以上交換し、次いで培養期間（最低約１０日間の全培養期間）の残りの間 SMCGMに換えておいた。培養後、内皮細胞（12）と平滑筋細胞（20）との間に内皮下基質の層（14）が図６に示すような態様で形成されるであろう。一般に内皮下基質は厚みが約１μ ｍ未満である。適当な内皮下基層ができたら、内皮細胞層を以下の方法のいづれかによって除去する。好ましくは、内皮細胞は移植片をHBSSで約３回すすぎ、約 0.025Ｍの濃度の水酸化アンモニウム溶液の中で約４〜4.5 分処理して内皮細胞を除去することによって剥離し、次いでHBSSの中で約３回再びすすぐ。その他の適当な処理には例えば0.01〜0.5 Ｍの濃度の NH₄OHによる約30秒〜約60分の処理が含まれる。内皮細胞を除去するその他の考えられる有効な方法には風乾、又はその他の剥離溶液、例えばクロロホルム、メタノール、水酸化アンモニウムもしくは塩化ナトリウムの単独又は組合せ溶液による処理が含まれる。同様に、クロロホルム／メタノール処理をグルタルアルデヒド固定化細胞材料の潜在的なカルシウム沈着を抑えるために採用してよい。当業者に公知のその他の処理も適当でありうる。内皮細胞層が除去できると、その構造は図７に示す構造を帯びる。以上のようにして処理した代表的なサンプルの走査電子顕微鏡観察は、内皮細胞のほぼ完全な消失及び内皮下基質層の維持を確証せしめた。本発明の目的にとっては、内皮下基質層からの約80％より多くの量の内皮細胞の除去が、内皮下基質層を実質的にドナー内皮細胞のない層にするものと考えられると解される。内皮細胞の除去後に露出した内皮下基質類似体は数多くの細胞外基質成分を含む。免疫細胞化学アッセイを利用し、この基質は硫酸コンドロイチンプロテオグリカン類、コラーゲンＩ、コラーゲンIII、コラーゲンIV、エラスチン及びフィブロネクチンを含むことがわかり、それらは全て露出した血液接触表面の上及び移植片壁の内部の中の双方に存在する。更に、ラミニンが内腔の内皮下基質血液接触表面の豊富な成分であり、そして移植片の壁の中により少ない程度で存在している。 EC除去の後、この移植片を固定剤で任意的に処理する。この工程の目的は内皮下基質層を保存させ、免疫原性を低め、そして移植片を滅菌することにある。この固定は移植片を固定溶液、例えば適当な緩衝液中の 0.1〜2.5 ％の濃度のグルタルアルデヒドの中へ、利用するグルタルアルデヒドの濃度に依存して約１〜72 時間入れておくことにより成し遂げられる。適当な緩衝剤には、限定することなく、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸(HEPES)、酢酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(MES)、３− 〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸（MOPS）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、リン酸塩等が含まれうる。好適な態様において、移植片は20mMの HEPES緩衝液中の約 0.5％より濃いグルタルアルデヒドの中で最低約２時間かけて固定する。固定した移植片を無菌標準食塩水で３回以上すすぎ、そして新鮮な無菌標準食塩水の中で最低約24時間洗い、次いで新鮮な無菌標準食塩水の中で約４℃で保存する。その他の適当な固定剤、例えばホルムアルデヒドを無菌を確実にするためにグルタルアルデヒドに加えて用いてよい。この段階で、残留アルデヒドの反応部位はアミノ基含有溶液でブロッキングする。この手順のための適当な試薬には、限定することなく、例えば 0.1Ｍのグリシン、メディウム 199、ダルベッコの改良イーグル培地及びその他の生理学的培養培地が含まれる。この移植片をこれらの溶液のいづれかの中で最低約12時間約 37℃でインキュベートする。ブロッキング工程が完了したら、この移植片をECGM に入れ、そして血管切片を内皮細胞培養培地に対して平衡とさせるまで数時間インキュベートする。内皮細胞の単独細胞懸濁物を血管の管腔に入れ、血管の両端にプラグを差し込み、そしてその移植片を回転培養器の中に置き、内皮細胞が図８に示すように表面の上で集密の単層を形成するようにさせる。図８に示す構造を帯びた構造体が、生体外内皮下基質（14）上に載った受容体の内皮細胞（24）によりでき上がる。内皮細胞は動脈又は静脈供給元であってよく、そしてこれらの細胞は免疫応答を阻止するために受容体に由来していることが好ましい。また、様々なその他の方法によって内皮下基質層を作ることが可能である。例えば、一つの適当な方法は、ECs とSMCsとを約１：10 〜１：１の比(EC：SMC)で組合せ、そして両タイプの細胞を同時に合成ベース材料上に植え付ける複合培養物播種の使用を包括する。培養物に入れたら、ECs は管腔表面の上で集密な単層を形成し、それにより正常なECと SMCとの関係を再構築するようになるであろう。長い同時培養を経て、細胞層の間に内皮下基質が生成する。次いでこの内皮下基質層を上記に概略した通りに曝露し、そして適宜に処理してよい。本発明の内皮下基質層の製造における支持体細胞層としてVSMCsが好適であるが、類似の機能を供するためにその他のタイプの細胞を使用することが可能であることが理解される。このその他の潜在的なタイプの細胞の中には、とりわけ、例えば消化系又は尿管に由来する平滑筋細胞及び線維芽細胞がある。更に、血管内皮細胞が好適な態様であるが、VSMCs，SMCs、線維芽細胞又はその他の類似のタイプの細胞と一緒に内皮下基質層を作るその他のタイプの細胞を利用することも可能でありうる。このようなタイプの細胞には、限定することなく、例えば微小血管内皮細胞、角膜内皮、糸球体内皮及び中皮細胞がとりわけ含まれうる。本発明は血管及び類似の器具に特に適用できるが、実質的に非血栓形成性である血液接触表面を提供しなくてはならない数多くの領域に適用できうる。本発明に従って作ることのできうるその他の器具の例には、限定することなく、図９に示す柔軟シート、図10に示す心臓弁、人工心臓、人工器官、例えば移植可能な人工腎臓等が含まれる。本発明の範囲を限定するつもりでなく、以下の実施例は本発明をどのようにして実施及び利用するかを例示している。実施例例１（内皮細胞の播種された保存内皮下層）数対のイヌ頸動脈を15％のDMSO含有HBSS溶液の中に集め、そして液体窒素の中で瞬間凍結した。その動脈切片を融解し、管腔にHBSS又は標準食塩水をフラッシングし、そしてその外膜を切開により除去した。次いで両動脈をめくり返し、そして 2.5mmのマンドレルの上に設置した。内皮細胞のない無傷な内皮下層を有する本発明動脈をマンドレルから外し、そしてそのもとの状態にもどした。コントロール動脈は綿棒で動脈の内皮表面をこすることにより内皮下層を除去した。動脈をHBSSの中ですすぎ、そして更なる処理のためにそのもとの状態にもどした。発明及びコントロール動脈の双方を平行して更なる処理にかけた。動脈をそれぞれ、約 2.5mmの直径の固定移植片をもたらすのに十分な直径のGO RE-TEX（登録商標）血管移植片（通常は 3.0mm）でそで通しした。このそで通しした動脈を吸い取って乾かし、そして 100％の医療級エタノールの中に浸した。動脈を 100％のエタノールの中で23℃で２時間、約 27.6kPa圧のもとで加圧固定した。固定後、動脈切片を70％のエタノールの中での一夜のインキュベーションにより滅菌した。滅菌後、その動脈切片を、HBSSに至るまでの段階式エタノール系列の中で再水和させた。次いで動脈切片をメディウム 199の中に約４〜５時間 37℃で入れておき、そして新鮮なメディウム 199の中で一夜インキュベーションした。最後に切片をECGMの中で37℃で４〜５時間インキュベートした。自己由来静脈内皮細胞をトリプシン処理により回収し、そしてECGMの中で 1.1×10⁶細胞／mlで再懸濁した。本発明及びコントロール動脈を細胞懸濁物で充填し、各動脈の末端にプラグを差し込み、そしてその動脈をECGMを含む培養チューブの中で37 ℃でインキュベーションした。細胞播種の翌日、動脈の末端のプラグを外し、そしてその動脈管腔表面上の内皮細胞が集密に達するまで移植片を培養した（一般には７〜10日以上）。内皮細胞の単層ができあがったことはアセチル化低密度リポタンパク質による染色及び走査電子顕微鏡観察により確認した。移植の一日前、移植片を内皮無血清培地（Endothelial Serum Free Medium)(G ibco BRL，Grand Island，NY)の中に入れた。移植の30分前、その移植片を無菌の37℃のHBSSでよくすすぎ、そして移植まで温暖なHBSSの中で保存した。これらの内皮化(endothelialized)発明移植片及びコントロール移植片を成犬グレイハウンドの腕動脈の中に試験対として移植した。この対の移植片のそれぞれを、一匹の犬における移植片の直接対比ができるように一方の腕動脈に移植した。長さ 2.5cm、内径 2.5mmの血管移植片は成犬グレイハウンド受容体の天然腕動脈に合う良好な直径のものであった。移植のために標準の端々吻合（end-to-end）外科技術を利用し、そして抗凝血剤又は抗血小板剤は犬に全く投与しなかった。移植の経過を二重超音波検査を利用して追跡した。術後20日目において、腕移植片を外科的に露出させ、そして移植箇所から距離を置いて動脈を切開することによって開存性を試験した。自己由来内皮細胞を保存内皮下基質の上で増殖させた本発明移植片は広く開存しており、自系内皮細胞を保存内皮下層のない血管上で増殖させたコントロール移植片は閉塞していた。即ち、内皮細胞のための支持体としての保存内皮下層の利用は改善された開存性を供した。例２（内皮細胞を播種した生体外内皮下基質）前述の詳細な説明に記載の通りに製造した血管平滑筋細胞−内皮細胞基質発明移植片を調製し、固定化細胞生成内皮下基質を有する基礎移植片を得た。この発明移植片をメディウム 199の中で最低12時間37℃で入れておいて未反応のアルデヒド基をブロッキングし、次いで内皮細胞増殖培地(Endothelial Cell Growth M edium)(ECGM )の中でインキュベーションした。次いで自己由来静脈内皮細胞をこの移植片の内皮下基質の上に、その移植片の管腔を 1.1〜 1.3×10⁶細胞／１mlのECGMの濃度の内皮細胞懸濁物で充填することにより播種した。次いでこの移植片を培養チューブの中でくさび留めし、そしてローラー装置の上の37℃のインキュベーターの中に10日以上置いて内皮細胞が単層をつくりあげ、そしてしっかりと付着するようにさせた。内皮細胞被覆はアセチル化低密リポタンパク質の取り込み及び走査電子顕微鏡観察により確認した。これらの内皮下基質発明移植片を２匹の成犬グレイハウンドの腕動脈の中に、 30μのコントロール ePTFE移植片を用いて試験対として移植した。各対を一匹の犬の腕動脈の中に移植し、各犬における血管の直接対比ができるようにした。長さ 2.5cm、内径 2.5mmの血管移植片は成犬グレイハウンド受容体の天然腕動脈に合う良好な直径のものであった。標準の端々吻合外科技術を移植のために利用し、そして抗凝血剤又は抗血小板剤は犬に全く投与しなかった。移植の経過を対照血管造影及び二重超音波検査を利用して追跡した。双方の犬において、本発明及びコントロール移植片は共にそれぞれ74及び27日の開存であった。例３（ESs を播種した混合SMC-ES生体外生成内皮下基質）血管 SMC及びECの個々の培養物を移植片の製造のため、増殖培地から取り出し、細胞をCMF-HBSSですすぎ、次いで細胞をCMF-HBSSの中で３〜５分洗浄することによって集めた。次いでCMF-HBSSを除き、そしてフラスコのサイズに依存して 1 .5〜3.0ml のトリプシン−EDTAを加えて細胞をフラスコから遊離させた。完全 S MCGMをトリプシンを失活させるためにフラスコに加え、細胞を粉砕し、そして 3 00×ｇで５分の遠心分離によりペレット化した。上澄液を捨て、細胞を SMCGMの中で再懸濁し、そして細胞計測を行い、次いで細胞の２回目のペレット化を行った。最終的な個々の SMC及びEC細胞ペレットを SMCGM の中に１×10⁶細胞／mlの濃度で再懸濁し、次いで細胞タイプを１：９，１：４及び１：２のEC：SMC 比で混合した。内径 2.5mm、フィブリル長約30μｍの数本の多孔質 ePTFEチューブを７cmに切り、そして注射器コネクター継手（フィッティング）に設置した。ポリプロピレンプラグを各チューブの遠位末端に差し込んだ。ePTFEチューブを 100％のエタノールで濡らし、次いでそのチューブを加圧し、これによりHBSSを多孔質チューブ壁に押し通すことによってアルコールをHBSSで追い出した。次いでこの濡れたチューブを血管細胞による播種までHBSSの中で保存した。各ePTFEチューブの細胞播種は、混合SMC-EC懸濁物の 2.5〜 3.5×10⁶個の細胞を注射器の中の全容量６〜８mlの SMCGMの中に入れることによって実施した。内径 2.5mmの移植片は 2.5〜 3.5×10⁶細胞／移植片により植え付けを施した。各移植片に対し、細胞懸濁物を含む注射器を近位注射器コネクターに取り付け、そしてスラリーを移植片の管腔の中に静かに注入した。各移植片の中に細胞を入れた後、第２のポリプロピレン製プラグを開放コネクターに取り付け、移植片の管腔の中の細胞を封入した。細胞播種を施した移植片をそれぞれSMCGMで充填された16mmの培養チューブの中にくさび留めし、インキュベーションの際の移植片の完全な回転を確実なものとさせた。培養チューブを固くキャップ締めし、そして約10回転／時間で回転するローラー装置にかけ37℃のインキュベーターの中に置いた。細胞播種を施した移植片を７〜10日間培養し、２〜４日毎に新鮮な培地を供給しておいた。この培養期間中、内皮細胞はSMCsから分離し、SMCsの上で集密EC単層が形成された。これは走査電子顕微鏡分析及び移植片の管腔表面上のECs を可視化させるためのアセチル化低密度リポタンパク質による染色の双方によって確認した。次いで移植片をHBSSで３回すすぎ、そして管腔を 0.025Ｍの NH₄OHで 4.5分処理してECs を除去した。この移植片をHBSSですすぎ、0.25％のグルタルアルデヒドで23℃で24時間固定し、次いで無菌標準食塩水でよく洗った。次いでこの移植片をメディウム 199の中で37℃で一夜インキュベーションし、次いで遊離及び未反応のグルタルアルデヒド基をブロッキング及び中和するためにECGMの中で４〜６時間インキュベーションした。各移植片の管腔空間を 1.1× 10⁶細胞／mlの植え付け密度においてESs 懸濁物により充填した。この移植片を培養チューブの中にくさび留めし、そしてローラー装置の上で 10RPM、37℃にて７〜14日間インキュベーションし、内皮細胞単層をつくりあげた。EC被覆の確認は走査電子顕微鏡分析及び内皮細胞の存在を同定するためのアセチル化低密リポタンパク質による染色によって行った。例４（内皮細胞を播種した誘導内皮下層）商業的に入手できる４mmのGORE-TEX（登録商標）血管移植片をドナー雌牛大動脈に由来する内皮下層の付加によって改質させた。血管は屠殺所から入手し、そして使用するまで−20℃で凍結しておいた。縦方向の切開により開いた後、内膜層をペーパータオルで静かにこすり、凍結−融解サイクルの後の残留内皮細胞の除去が確実なものとなるようにした。次いでメスの刃を用い、ドナー血管の内膜の表面を内部弾性板を突き刺さないよう注意を払いながら慎重にかき落した。約５cmの雌牛大動脈からこのようにして得た内皮下基質を一本の４mm×５cmの発明移植片のために用いた。雌牛大動脈からのかき落し物を約50mlのHBSSの中に懸濁し、そしてバーチ(Verti)剪断ミキサーによる約60秒のホモジナイゼーションにかけた。このホモジナイゼーションにかけた内皮下層を約10分間放置して大きめの塊を沈除させ、そしてホモジナイゼーションにかけた残りはデカンターに移した。この懸濁物を注射器の中に入れ、そして本発明移植片を有刺継手（barbed f itting）に設置した。４mmのGORE-TEX（登録商標）血管移植片を 100％のエタノールで濡らし、そしてエタノールをHBSSで追い出した。かき落し物を含む試料の一部を移植片の気孔に押し通し、移植片の表面の上に内皮下細胞外基質が付着するようにさせた。この移植片を70％のエタノールの中で一夜滅菌し、そしてHBSS に至る段階式エタノール系列の中で再水和させた。次いでこの移植片をメディウム 199の中で一夜インキュベートし、そしてその移植片を培養培地に対して平衡になるようECGM中でインキュベートした。内皮細胞を集め、そして移植片の内皮下表面の上に、その移植片の管腔を 1.1〜 1.3×10⁶細胞／１mlのECGMの濃度の内皮細胞懸濁物で充填することにより播種した。次いで移植片の両端をキャップ締めし、培養チューブの中にくさび留めし、そしてローラー装置上の37℃のインキュベーターの中に７〜10日間置いて、内皮細胞が単層をつくりあげ、且つしっかりと付着するようにさせた。内皮細胞被覆はアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みを観察することにより確認した。本発明の特定の態様を本明細書の中で例示及び説明してきたが、本発明はかかる例示及び説明に限定されるべきものではない。変更及び改良は次の請求の範囲における本発明の一部に組込まれ、且つ具体化されうることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベゴバック，ポールシー. アメリカ合衆国，アリゾナ 86004，フラッグスタッフ，イーストレインジレーン 3901

Claims

【特許請求の範囲】１．血液接触表面であって：適用した心臓血管内皮細胞の付加及び増殖を支持する内皮下基質層を含んで成る支持体；前記内皮下基質層に付着した適用心臓血管内皮細胞層；を含んで成り、ここで前記心臓血管内皮細胞が直接血液接触表面を担い、そしてここで前記支持体に付着された細胞がないとき、前記支持体が直接血液接触表面を担う、前記血液接触表面。２．前記内皮下基質層が保存されている、請求項１記載の血液接触表面。３．前記支持体がドナー血管におけるそのもとの位置に位置する、請求項１記載の血液接触表面。４．前記内皮下基質層が、ドナー血管より摘出され、そして合成構成物に適用されたものであり、この内皮下基質層が直接血液接触表面を担っている、請求項３記載の血液接触表面。５．前記内皮下基質層が保存されている、請求項４記載の血液接触表面。６．前記ドナー血管がその縦方向にわたりさやにより包まれており；そしてここで前記さやは、細胞内成長に対して抵抗性であり、しかも高分子に対して透過性である微多孔質ポリマー材料製である、請求項３記載の血液接触表面。７．前記さやがポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン及びフッ化エチレンプロピレンコポリマーの単独又は組合せ物より成る群から選ばれる微多孔質ポリマー材料製である、請求項６記載の血液接触表面。８．前記さやが延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン及びフッ化エチレンプロピレンコポリマーの多重層の組合せ物より成る、請求項６記載の血液接触表面。９．前記内皮下基質層が内皮細胞と平滑筋細胞との生体外組織同時培養により生成されたものである、請求項１記載の血液接触表面。 10．前記内皮細胞が心臓血管組織から得られたものである、請求項９記載の血液接触表面。 11．前記平滑筋細胞が心臓血管組織から得られたものである、請求項９記載の血液接触表面。 12．内皮細胞と平滑筋細胞との生体外組織同時培養により生成された前記内皮下基質層が、合成ベース材料の表面であってその上で内皮下基質層が形成されるようにその上に直接血液接触表面をつくりあげるべき表面に適用されている、請求項９記載の血液接触表面。 13．前記合成ベース材料が管状構造を構成している、請求項12記載の血液接触表面。 14．前記合成ベース材料が心臓弁の少なくとも一部を構成している、請求項12 記載の血液接触表面。 15．前記合成ベース材料が柔軟性シートを構成している、請求項12記載の血液接触表面。 16．前記合成ベース材料が、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン及びフッ化エチレンプロピレンコポリマーの単独又は組合せ物より成る群から選ばれるポリマー材料製である、請求項12記載の血液接触表面。 17．前記合成ベース材料が延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンである、請求項12記載の血液接触表面。 18．前記内皮細胞と平滑筋細胞との生体外組織同時培養を、合成ベース材料の表面であって、その上で直接血液接触表面をつくりあげるべき表面の上で行う、請求項９記載の血液接触表面。 19．前記合成ベース材料が管状構造を構成している、請求項18記載の血液接触表面。 20．前記合成ベース材料が心臓弁の少なくとも一部を構成している、請求項18 記載の血液接触表面。 21．前記合成ベース材料が柔軟性シートを構成している、請求項18記載の血液接触表面。 22．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン及びフッ化エチレンプロピレンコポリマーの単独又は組合せ物より成る群から選ばれるポリマー材料からつくられる、請求項18記載の血液接触表面。 23．前記合成ベース材料が延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンである、請求項18記載の血液接触表面。 24．前記支持体が、硫酸コンドロイチンプロテオグリカン類(chondroitin sul fate proteoglycans)、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、 IV型コラーゲン及びエラスチンより成る群における少なくとも一種のタンパク質を含む、請求項１記載の血液接触表面。 25．前記表面が以下の方法：平滑筋細胞層に付着した内皮下基質層に付着した内皮細胞層を含んで成るドナー血管を用意する；実質的に内皮細胞を含まない内皮下基質支持体を生成するため、このドナー血管の内皮下基質層から内皮細胞を剥離する；心臓血管内皮細胞をこの支持体に適用する；ことにより形成されたものである、請求項１記載の血液接触表面。 26．剥離溶液により処理することによって前記内皮下層から内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項25記載の方法。 27．前記剥離溶液が約0.01Ｍ〜約 0.5Ｍの濃度範囲の水酸化アンモニウム水溶液である、請求項26記載の方法。 28．内皮層の凍結−融解処理により内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項25記載の方法。 29．内皮層の風乾処理により内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項25記載の方法。 30．前記ドナー血管から内皮下基質層を取り外し、そしてその内皮下基質層を合成構成物に適用することを更に含んで成り、前記内皮下基質層が直接血液接触表面を担うものである、請求項25記載の方法。 31．前記内皮下基質層を保存することを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 32．主として脂質成分を抽出する溶液によって前記内皮下基質層及び任意の結合血管組織を飽和せしめることにより、カルシウム沈着率を下げるために前記内皮下基質層及び任意の結合血管組織を処理することを更に含んで成る、請求項25 記載の方法。 33．カルシウム沈着率を下げるために用いる前記溶液がクロロホルムとメタノールとの溶液である、請求項32記載の方法。 34．前記内皮下基質層を保存するため、前記内皮下基質層を固定溶液で処理することを更に含んで成る、請求項31記載の方法。 35．前記固定溶液がエタノール溶液である、請求項34記載の方法。 36．前記固定溶液がグルタルアルデヒド溶液である、請求項34記載の方法。 37．前記表面が以下の方法：平滑筋細胞層の上に広がった内皮細胞層をつくりあげるため、内皮細胞と平滑筋細胞を生体外で同時培養する；この内皮細胞層をこの平滑筋細胞層と共に、この内皮細胞層とこの平滑筋細胞層との間に内皮下基質層が生成されるのに十分な時間にわたりインキュベーションする；内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質支持体を生成するため、この内皮下基質層から内皮細胞層を剥離する；心臓血管内皮細胞層がその上で形成されるようこの支持体に心臓血管内皮細胞を適用する；ことにより形成されたものである、請求項９記載の血液接触表面。 38．剥離溶液により処理することによって前記内皮下層から内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 39．前記剥離溶液が約0.01Ｍ〜約 0.5Ｍの濃度範囲の水酸化アンモニウム水溶液である、請求項38記載の方法。 40．内皮層の凍結−融解処理により内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 41．内皮層の風乾処理により内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 42．内面と外面とを有する管状人工血管補てつ物を用意する；前記平滑筋細胞層から前記内皮下基質層を取り外す；そしてこの内皮下基質層を前記管状人工血管補てつ物の内面に適用して内皮下基質支持体を供する；ことを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 43．前記内皮下基質層を保存するため、前記内皮下基質層を固定溶液で処理することを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 44．前記固定溶液がエタノール溶液である、請求項43記載の方法。 45．前記固定溶液がグルタルアルデヒド溶液である、請求項43記載の方法。 46．前記表面が、平滑筋細胞層の上に広がった内皮細胞層をつくりあげるため、直接血液接触表面を担う人工血管補てつ物の表面上での内皮細胞と平滑筋細胞との生体外同時培養により形成されるものである、請求項37記載の血液接触表面。 47．前記人工血管補てつ物が内面及び外面を有する管状血管補てつ物であり、ここで前記生体外同時培養がこの管状血管補てつ物の内面上で行われる請求項46 記載の血液接触表面。 48．血液接触表面を製造する方法であって：平滑筋細胞層に付着した内皮下基質層に付着した内皮細胞層を含んで成るドナー血管を用意する；支持体を形成するため、内皮細胞が除去され、しかも内皮下基質層がその場に残されるように前記血管を処理する；前記支持体に細胞が付着していない状態で、器具の直接血液接触表面として前記支持体を採用する；血管内皮細胞層を形成するため、前記支持体の上で血管内皮細胞を増殖させる；そして器具の直接血液接触表面として、前記血管内皮細胞層を採用する；ことを含んで成る方法。 49．ドナー血管から獲得した人工血管補てつ物を含んで成る器具として前記支持体を採用することを更に含んで成る、請求項48記載の方法。 50．前記人工血管補てつ物のまわりをその縦方向にわたってさやで包むことを更に含んで成り、ここでこのさやはそれを高分子が透過でき、しかも移植したときにこの人工血管補てつ物のまわりの組織からの細胞の内成長に抵抗するものである、請求項49記載の方法。 51．前記ドナー血管から内皮下基質層を摘出し、そしてその内皮下基質層を合成構成物に適用することを更に含んで成り、前記内皮下基質層が直接血液接触表面を担うものである、請求項48記載の方法。 52．前記内皮下基質層を保存することを更に含んで成る、請求項51記載の方法。 53．主として脂質成分を抽出する溶液によって前記内皮下基質層及び任意の結合血管組織層を処理することによりカルシウム沈着率を下げることを更に含んで成る、請求項48記載の方法。 54．カルシウム沈着率を下げるために用いる前記溶液がクロロホルムとメタノールとの溶液である、請求項53記載の方法。 55．前記内皮下基質層を保存するため、前記内皮下基質層を固定溶液で処理することを更に含んで成る、請求項52記載の方法。 56．前記固定溶液がエタノール溶液である、請求項55記載の方法。 57．前記固定溶液がグルタルアルデヒド溶液である、請求項55記載の方法。 58．血液接触表面を製造する方法であって：平滑筋細胞層の上に広がる内皮細胞層をつくりあげるため、内皮細胞と平滑筋細胞とを生体外で同時培養する；前記平滑筋細胞とドナー内皮細胞との相互作用によりこのドナー内皮細胞層と平滑筋細胞層との間に内皮下基質層が形成されるまでこの同時培養物をインキュベーションする；前記ドナー内皮細胞が除去されて内皮下基質支持体が形成されるよう、この同時培養した内皮細胞層と平滑筋細胞層とを処理する；前記支持体に細胞が付着されていない状態で、器具の直接血液接触表面として前記支持体を採用する；内皮細胞層を形成するため、前記支持体上で血管内皮細胞を増殖させる；そして器具の直接血液接触表面として前記血管内皮細胞層を採用する；ことを含んで成る方法。 59．前記平滑筋細胞層から前記内皮下基質層を取り外し、そして血液接触表面をその上に配置すべき人工血管補てつ物の表面にこの内皮下基質支持体を適用することを更に含んで成る、請求項58記載の方法。 60．前記血液接触表面をその上に配置すべき人工血管補てつ物の表面の上で内皮細胞と平滑筋細胞とを生体外同時培養し、前記平滑筋細胞層の上に広がる内皮細胞層をつくりあげることを更に含んで成る、請求項58記載の方法。 61．前記人工血管補てつ物が内面及び外面を有す管状血管補てつ物であり、ここで前記生体外同時培養がこの管状血管補てつ物の内面の上で行われる、請求項 60記載の血液接触表面。 62．血管内皮細胞である内皮細胞を採用する、請求項58記載の方法。 63．血管平滑筋細胞である平滑筋細胞を採用する、請求項58記載の方法。 64．前記内皮下基質層を保存するために前記内皮下基質層を固定溶液で処理することを更に含んで成る、請求項58記載の方法。 65．前記固定溶液がエタノール溶液である、請求項64記載の方法。 66．前記固定溶液がグルタルアルデヒド溶液である、請求項64記載の方法。 67．人工血管補てつ物であって：固定剤により保存された脱内皮された内皮下基質層を含んで成り、この支持体は血管内皮細胞をその上に付着及び増殖させて血管内皮細胞層を形成すべき下部構造を担い；ここで前記血管内皮細胞層は直接血液接触表面を担い；そしてここで前記保存内皮下基質層に細胞が付着されていないとき、この保存内皮下基質層が直接血液接触表面を担う、前記人工血管補てつ物。 68．前記内皮下基質層がドナー血管から獲得され、且つこのドナー血管においてその場で保存されているものである、請求項67記載の人工血管補てつ物。 69．前記内皮下基質層が、内皮細胞と平滑筋細胞との生体外同時培養により生成され、且つ直接血液接触表面を担うべき人工血管補てつ物の表面に適用されたものである、請求項67記載の人工血管補てつ物。 70．前記内皮下基質層が、直接血液接触表面を担うべき人工血管補てつ物の表面の上で行われた内皮細胞と平滑筋細胞との生体外同時培養により生成されたものである、請求項67記載の人工血管補てつ物。 71．前記脱内皮された内皮下基質層の保存処理の前に、この脱内皮された内皮下基質層及びこの脱内皮された内皮下基質層の外側に付着した任意の血管組織層を処理してカルシウム沈着率を下げている、請求項67記載の人工血管補てつ物。