JPH09512338A

JPH09512338A - ヒト精子診断薬

Info

Publication number: JPH09512338A
Application number: JP7527612A
Authority: JP
Inventors: シー．ハール，ジョン; エム．ライト，リチャード
Original assignee: University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: UVA Licensing and Ventures Group
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1994-10-21
Publication date: 1997-12-09
Also published as: WO1995029188A1; CA2188397A1; US5605803A; EP0757696A1; EP0757696A4; AU1127295A; AU693493B2

Abstract

(57)【要約】ヒト男性個体における精子産生を検出するためのキットおよび方法であって、精子組織特異タンパク抗原に対する、ＳＰ−１０などの一以上の抗体が提供され、この抗体は、精子を含有すると思われる試料と混合されて、抗原と抗体とを結合させる。結合は、直接的あるいは間接的に決定されるが、これは試料中の精子の存在の指標となる。結合の頻度はまた、結合の発生を決定するのに用いる手段を所定の濃度以上での精子産生を示すように較正することによって決定することもできる。キットと方法の種々の応用例が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト精子診断薬本願は、１９９２年３月２７日出願の米国特許願第０７／８５８，７９８号の一部継続出願である。米国特許願第０７／８５８，７９８号は、１９９０年２月１６日出願の米国特許願第０７／４８１，４９１号の一部継続出願であり、また米国特許願第０７／４８１，４９１号は、１９８９年３月３日出願の米国特許願第０７／３１８，５５１号の一部継続出願である。技術分野本発明は、生物学的試料中のヒト精子の存在および／またはレベルを知るための診断薬に関する。具体的には、ヒト精子頭部に関連する精子組織特異性抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、射出精液または精子を含有する生物学的試料中におけるヒト精子の存在、不存在、および／またはレベルを決定する診断薬に関する。本発明は、医療的監督指示なしに家庭で行える方法とこれに用いる診断キットを提供する。背景技術ＳＰ−１０は、精子形成の過程を通して存在する先体構成成分として同定される精子特異性抗原である。ＳＰ−１０は、ヒト染色体１１とバンドｑ２３−２４の交叉部に局在する。本発明者らの行った研究の結果、この抗原は組織特異的な性質を有することが判明した。この抗原の高い特異性は、本発明の開発後に刊行された文献であるフリーマン［Freemerman］ら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ５０，６１５〜６２１（１９９４年）を始めとして、本発明の発明者らによって発表された各種文献に発表されている。例えは、カース［ Kurth］ら、ＴｈｅＡｎａｔｏｍｉｃａｌＲｅｃｏｒd，２３６，６１９〜６２５（１９９３年）を参照。この抗原についてのアミノ酸配列は、ライト［Wrig ht］ら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，４２：６９３〜２０１（１９９０年）および、本願発明者によって出願され現在審査に係属中の米国特許出願第０７／４８１，４９１号に記載されている。この米国特許出願の全開示を本明細書の一部として引用する。前記組織特異性抗原に特異的なモノクローナル抗体は従前開発されており、ＭＨＳ−１０と称されている。このモノクローナル抗体は、メリーランド州、ロックヴィル、パークローン・ドライブ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて受託番号第ＡＴＣＣＨＢ１００３９を付与されたハイブリドーマ細胞株によって発現する。このモノクローナル抗体については、前記米国出願第０７／４８１，４９１号において詳しく述べられている。生殖能、妊娠、およびこれらに関連した問題や症状に関する従前の科学的研究および商業的開発は、女性の生殖周期に向けられていた。最近まで、妊娠や排卵の把握には、免許を受けた医師のいる施設に行って調べてもらう必要があった。医師のもとへ行くことは、費用が嵩むとともにプライバシーの問題もあるため、 “家庭用試験キット”は信じがたいほどの成功をおさめてきた。この家庭用試験キットとは、妊娠に関するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の存在、排卵に関する黄体形成ホルモン（ＬＨ）の存在に感度を有するキットであって、その取り扱いは単純かつ簡単である。同時に、家族計画の問題やカップルの不妊の取り上げ方の面からも、男性生殖能力、これに関連する問題、及び医学的対処手続がより一層注目されつつある。現在、あるカップルが妊娠の成立に困難を有している場合に通常なされることは、男子パートナーの精子の生存能力と精子数を調べることである。これには、免許を受けた施設への高コストの再訪が必要であると共に、顕微鏡下での検査のために射精サンプルを採取（一回ではなく、数回のサンプル採取が必要であることが多い）しなければならず、かつその採取は、現代の社会文化からは屈辱的であるか、そうでなくとも少なくとも当惑させるものである。これに関し、上記試験を行うにあたってプライバシーがないことが特に問題である。避妊の方法については、自由意思で行うパイプカットが一般化してきつつあるが、これは一般に“外来診療”が可能であるという性格と、信頼性、および比較的リスクが低いこと等の理由による。パイプカットの効果をモニターして結果を確認すること、および生殖路に精子が存在しないことを調べるための第一の方法は、男性学科研究室において精子試料を繰り返し顕微鏡検査することであるが、これもまた比較的高コストであるとともにプライバシーの問題がある。しかも、他の避妊方法の継続を取り止める前に、一定の期間射出精液が無精子であることを確認する必要がある。医療技術の進歩によって精管吻合術（即ち一旦切断した精管の両端を外科的に再結合してパイプカットの逆を行う再建術）の信頼性が向上しつつある。ここでもまた、このような外科手術が成功したかどうかについては、術後長期間にわたり顕微鏡でモニターして精子レベルが正常に戻ったかどうかや孕性について確認しなければならない。これは前記の場合と同様、費用が嵩むとともにプライバシーを欠くため恥ずかしい思いをしたり屈辱的に感じたりする。妊娠や排卵を知るための家庭用尿試験キットが成功を収めていることを男子の生殖能についての止まることなく増大しつつある重要性と考え合わせ、さらにまた、精子の存在あるいは不存在を調べるのに現在の方法によった場合の高コストを考えてみると、女性の生殖能について利用可能なものに類似した男性のための家庭用試験キットであって生物学的試料中の精子の存在を決定するための簡単、迅速、かつ低コストのキットの必要性が疑いなく存在すると思われる。しかしながら、今日までこのようなニーズは叶えられていない。発明の開示上記の目的およびこれに付随する目的は、以下の明細書の記載によって明らかとなるものである。即ち本発明の目的は、ＳＰ−１０抗原とこれに特異的なモノクローナル抗体（群）との間の反応の存否および／または量を試験し、当該反応を簡単に認知できる仕方で決定するアッセイを提供するものであって、これにより、射出精液やその他の生物学的試料中におけるヒト精子の存在を迅速にかつ簡単に知ることが可能となる。本発明によれば、当該アッセイないし試験をプライバシー保護下において行うことができ、訓練された医療実務家の介在を不要とし、かつ比較的低コストで実施できる。本発明は、本発明方法を用いて得られた結果に基づいて、本人が更なる行動をとれるようにあるいは医療専門家のアドバイスを求めることができるように、予備的示唆(indication)を提供するものである。射出精液や、交接後の膣洗浄液から得た試料の場合などの射出精液の残余を含有する生物学的試料を、ＳＰ−１０抗原またはその他の精子特異性抗原に特異的な一以上のモノクローナル抗体を含む調製物に添加する。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。被験試料中における精子の存在は、精子のＳＰ−１０抗原と抗体との間に結合をもたらす。結合反応は、種々の方法で直接的あるいは間接的に検出される。最も良く知られたアッセイとしては比色法が挙げられるが、これは抗体をレポーター分子で標識して特定の色によってこのレポーター分子を検出するものである。この結合反応は、色または色の変化の何れかをもたらすものである。あるいは色を第二の剤（通常は酵素）で発色させることもできる。レポーター分子の“発色”、即ち適切な色の発色は、結合した抗体が存在する場合にのみ起こるので、抗原が組織特異性を有する場合、陽性反応は精子の存在を示す。予測された色が発色しなかった場合、あるいは異なる色が発色した場合は、“陰性”の結果を示すものである。即ち、抗原がないこと、よって試料中に精子がないことを示す。このタイプの最も簡単に行えるアッセイの一つに固相免疫法がある。これは、第一抗体を膜やビーズ等の表面に結合し、次いでこの膜やビーズ等を、精子が存在するあるいは存在しないことが疑われる試料に暴露するものである。試料に存在する精子は、一次抗体と呼ばれるモノクローナル抗体と結合する。未結合物質は試料から洗い流され、即ち除去され、次いでこれに第二抗体が添加されると、この第二抗体も精子に結合する。この第二抗体は標識、即ち酵素または酵素基質を有するものである。第二抗体は第一抗体と同じエピトープに結合する必要はない。結合させた後、試料を再び洗浄し、酵素または基質の相手を添加する（第二抗体が酵素に結合する場合には、基質を添加し、基質が第二抗体に結合する場合には酵素を添加する）。酵素は基質の一部を開裂し、これによって基質は色変化を起こしたり、化学発光したり、蛍光を発したり、その他容易に検出可能な現象を生起する。アッセイの各種要素、即ち結合第一抗体、標識第二抗体、及び基質は単一のキット内に含めて家庭用に供することができる。精子の存在の直接的あるいは間接的証拠いずれについても、生殖能力の有無を示唆する証拠として利用することができる。本発明によって提供される精巣および精子特異性マーカータンパクは、広範な応用に適する。よって、パイプカット後に精子が引き続き通過することを心配する男性や、精管吻合術後の射出精液中に精子が存在する事を確認したい男性は、家庭で簡単に精子の存在を調べることができる。同様に、女性は、交接後に膣洗浄液中の精子の存在を調べることによって、パートナーが射出した精液中に精子が存在するか否かを知ることができる。これは、例えば、女性にとっては、自分のパートナーがパイプカットしたと言ったことを女性独自に確認することを可能とするものであるとともに、その後妊娠を希望するに至った場合にはパートナーに生殖能力があるかどうかを確かめる機会を与えるものである。上記タイプのアッセイにおける第一抗体として使用可能な３つのモノクローナル抗体を開発し、ブダペスト条約の規定に従って寄託した。ＭＨＳ−１０に加えて、２つのモノクローナル抗体即ち３Ｃ１２と６Ｃ１２を開発した。これらはハイブリドーマ細胞株の３Ｃ１２−Ｄ１Ｃ６およびＣ１２−Ａ１ＡＳによって発現する。これらのハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにそれぞれＡＴＣＣ番号ＨＢ１１５４１およびＨＢ１１５４２としてブダペスト条約の規定に従って寄託済である。追加のモノクローナル抗体も、米国特許出願番号第０７／４８１，４９１号に開示されているように同様に作成可能である。また、ポリクローナル抗体も同様に作成できる。発明を実施するための最良の態様本発明による診断薬およびアッセイの基本的特徴は、精子特異的な抗原、即ち精子細胞と精子、および精子単独の上に認められる若しくはこれに関連して認められる抗原と、これに特異的な（モノクローナル）抗体との間の結合反応に存する。米国特許出願０７／４８１，４９１号は、このタイプの“抗原”、即ち精子に特異的なタンパク、に対する抗体を作成する方法を開示する。一般に、ウサギ、ラット、マウス等の宿主動物を、希望の抗原を含有する精子調製物で免疫し、次いで宿主の脾臓から得たＢリンパ球等の抗体産生細胞を腫瘍細胞と融合してハイブリドーマを生成させる。腫瘍細胞の例としては、ラットの骨髄細胞やマウスの形質細胞腫細胞が挙げられる。次いで、宿主の免役に用いた抗原調製物を用いて前記ハイブリドーマをスクリーニングし、抗体を発現するものを選択する。ＭＨＳ−１０、３Ｃ１２、及び６Ｃ１２はこのようにして得たものである。モノクローナル抗体ＭＨＳ−１０、３Ｃ１２、または６Ｃ１２を用いるモノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーによってヒト精子由来の天然のＳＰ−１０抗原を精製し、次いでＨｅｒｒらがＢｉｏｌ．ｏｆＲｅｐｒｏｄ．４７：１１〜２０（１９９２）に記載したプロトコールに従って、逆相ＨＰＬＣでさらに精製を行うことによって、ＳＰ−１０に対するその他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体も作成できる。次に、抗原に対する抗体が血清に検出されるまで天然のＳＰ−１０を宿主に注入する。付加的なモノクローナル抗体は、宿主の脾臓細胞を腫瘍細胞に融合してハイブリドーマを生成することによって創製することができる。あるいは、他のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、同時係属中の代理人事件番号４９４−１２２−２７で特定される米国特許出願中に記載されている適切な真核性または原核性発現ベクターで産生されたリコンビナントＳＰ −１０抗原に対して作成することもできる。今日まで、ＳＰ−１０タンパクは、実験室において、ＰＷＲ５９０、ｐＧＥＸ並びにｐＭＡＬ、およびｐＥＴにおいて発現されている［Ｒｅｄｄｉら、１９９４年」。ウサギとサルのポリクローナル抗体が、リコンビナントＳＰ−１０に対しＰＷＲ５９０において作られている。ヒヒのポリクローナル抗体は、ｐＭＡ１、ｐＧＥＸおよびｐＥＴにおいて産生されたリコンビナントＳＰ−１０に対して作られている。本発明者らが最近寄託したマウスモノクローナル抗体３Ｃ１２と６Ｃ１２は、ｐＧＥＸにおいて産生されたリコンビナントＳＰ−１０に対して作られたものである。このように、完全長あるいは部分長のリコンビナントＳＰ−１０で動物を免疫することにより、その他の付加的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作成することができる。これらのベクターにおいて発現され次いで接種されたＳＰ−１０リコンビナントインサートの長さによって、完全長あるいは部分長のＳＰ−１０ポリペプチドについての各種決定基に対して抗体を生成することができる。一旦特異モノクローナル抗体が作られると、その突然変異体や変異細胞も従来の技法によって得ることができる。本明細書に記載した前記３つの寄託済抗体は、ＳＰ−１０抗原の異なるエピトープに結合性を示すらしいことに注目される。従って、その他の無数のモノクローナル抗体も同様にして作成できる。同様に、米国特許出願第０７／４８１，４９１号に開示されているように、結合を達成するためにはＳＰ−１０抗原全体の存在は必要ではない。ＳＰ−１０の断片が存在するならば、抗体はそのような断片と結合するであろう。上記の参照出願においては、広範な種類の免疫原性断片が開示されている。本発明に係る使用においては、ＳＰ−１０以外の精子特異性抗原もまた利用できる。抗原の例としては、ヒトＳ７１タンパク、ヒトＰＨ３０タンパク、およびミトコンドリア莢膜セレノタンパク（ラット）が挙げられる。これらのタンパク（あるいはそのエピトープ決定基断片）に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体もまた同様にして作成できる。本発明における基本的必須要素は、精子特異性タンパクまたはタンパク断片に対する少なくとも１つの抗体である。モノクローナル抗体であるＭＨＳ−１０、３Ｃ１２、および６Ｃ１２と、抗原であるＳＰ−１０との組合せは可能な組合せの一例である。本発明においては、抗原抗体反応を生起させるような条件（水性試料、環境温度、および通常の雰囲気）下でモノクローナル抗体を試料と接触させる。十分な反応時間経過後、調製物に第二抗体を添加するが、これもまた問題の抗原に結合するであろう。第二抗体は、酵素や酵素基質等の標識ないしレポーター分子を有し、第一抗体によって結合された抗原に対して同様に結合できる。未結合の物質の除去は、通常、試料を流し去ることによって行う（第一抗体は固相表面に結合でき、この場合アッセイはより単純にかつより“ユーザー・フレンドリー”にできる）。好ましくは、酵素を第二抗体に結合させる。未結合の第二抗体を流し去り、あるいは洗い去り、次いで酵素基質を添加する。この基質は、酵素の存在下で色、化学発光、蛍光に変化を起こしたりあるいは他の何らかの容易に検出可能な変化を受ける。ＳＰ−１０やモノクローナル抗体のＭＨＳ−１０、３Ｃ１２、および６Ｃ１２の使用を除けば、上記のタイプのフォーマットおよびこれを用いたアッセイは良く知られており、それ自体は本発明の特徴ではない。代表的な酵素イムノソルバベントアッセイ（ＥＩＡ）については、米国特許第５，１４９，６２２号に開示されている。この米国特許はアッセイを行う表面を改良したものであり、ここに本明細書の一部としてその開示を引用する。その他の固相および液相のアッセイ方法は、発明的技能の行使なしに行うことができるであろう。家庭用のキットの一態様には、捕捉アッセイ様式(capture assay format)が挙げられ、これにおいては、モノクローナル抗体ＭＨＳ−１０は固相に結合し、ＳＰ−１０抗原を捕捉するために用いられる。ＳＰ−１０抗原の認識には、第二モノクローナルまたはポリクローナル免疫反応試薬（Ｓｈｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２９：２３１〜２４０（１９９３年））をレポーター酵素や第三の免疫反応試薬と組み合わせたものをサンドイッチ法において用いる。別のアッセイ様式としては、ウィック（ディップ・スティック）と、抗体を被覆した着色ビーズとを用いるものが利用可能である。射出精液の一滴（ＳＰ−１０が放出含有されている）を、抗体含有着色ビーズの試料に適用すると、ＳＰ− １０が結合したビーズは、ＳＰ−１０に対する第二抗体によって捕獲されるまでウィックを通って移動する。さらに別のアッセイ様式としては、抗体を被覆した着色磁性ビーズの利用が挙げられる。このアッセイにおいては、磁性ビーズは、ＳＰ−１０に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体で被覆される。精液やSＰ−１０と混合されたビーズは、抗体によって捕獲される。磁性ビーズを回収するには磁性ディップ・スティックを用いることができる。着色磁性ビーズは、その後マグネットから解放され、ウィック中を移動して、ビーズを捕捉する第二抗体のゾーンに至り、着色された線を表出する。また別のアッセイ様式においては、アッセイ用ウィックは二種のモノクローナル抗体で被覆される。一つは精子表面に対するモノクローナル抗体、他の一つはＳＰ−１０に対するモノクローナル抗体である。二種の抗体は互いに非常に近接してウィック上にスプレーされる。二種のモノクローナル抗体の内の一種のものは精子を捕捉する。捕捉された精子の先体は溶解処理される。第二抗体は、ＳＰ −１０が溶解処理されたあとの遊離ＳＰ−１０を捕捉する。次いでウィックを短時間洗浄する。酵素コンジュゲートを有する第二抗ＳＰ−１０モノ−あるいはポリ−クローナル抗体を用いて着色反応生成物を得ることができる。また別のアッセイ様式においては、微小スパイクを有する特別のガラスビーズが用いられる。シラン処理によって形成した微小スパイクを抗−ＳＰ−１０抗体と組み合わせる。ビーズを精子と混合してその先体を破壊するとともに、ＳＰ− １０抗原を捕獲する。ガラスビーズを再び洗浄し、ＳＰ−１０に対する第二抗体を用いて線あるいはスポットを検出する。この度確められたＳＰ−１０の組織特異性、および本発明において用いるモノクローナル抗体群の抗原特異性は、感度と信頼性が特に重要な各種アッセイに有用である。このような（アッセイ）用途のそれぞれのための調製品とアッセイ方法の双方ともが本発明の特徴を構成する。法医学への応用性的攻撃とこれに関連した証拠に関する法律および手続は、この数年で大きく変化している。レイプや性的攻撃を告発する場合における証拠の基本的要素の一つは、被害者とされる人物中に存在するあるいは付着している精子の存在を確かめることである。伝統的な“クリスマスツリー染色”法がこれまで精子の存在を決定するためのアッセイにおいて用いられてきているが、精子数が比較的少量しか存在しない様々な場合（例えば小児性愛の場合等の肛門拭き取り綿棒）においては適用が困難である。このように極めて少量の試料においてでさえも、性的攻撃の予備的な証拠が比較的直接的にかつ高い信頼性で提供できる。このような応用においては法医学的規制下での証拠の確立が必要なので、染色手続等の間接的検出方法を、比色法、化学発光法、蛍光法等の上述したアッセイをもって代えることができる。生殖細胞系列モニタリングＳＰ−１０“抗原”ないしタンパクは、睾丸中の丸い精子細胞に出現し、精子分化の全段階を通して存在する。よって、このタンパクに対するモノクローナル抗体を用いれば、成熟精子のみならず精子形成系列の細胞をも射出精液や生検組織中において同定することができる。男性不妊症の研究が進むにつれ、精子形成系列中の一以上の段階において未成熟細胞数の異常値が男性不妊症と相関していることが明らかになってきている。本発明の“抗原”抗体結合反応は、精子細胞のみならず未成熟精子形成細胞もモニターする方法を提供し、異常数の未成熟精子細胞が産生されることを原因とする現有初発不妊症について付加的な情報を提供するものである。家庭試験キット医療関係者や科学者の介在なしに、あるいは別のいい方をすれはプライバシーを保って、試験を家庭で行いたい場合が種々ある。これが実際特に切望されているということは、妊娠検査のための家庭用尿比色試験が非常な成功を収めていることからもわかる。この家庭用妊娠試験は、ＨＣＧの存在あるいは不存在を比色法で迅速かつ好便に試験するもので、自分が妊娠しているのかどうかを調べたい女性自身がこれを行うものである。また以下に詳述するように、個人の射出精液が実際に精子を含有しているかどうか、また含有しているとすればその精子は現実に妊娠を起こさせるに足る以上の精子レベルであるかどうか、を決定することができることが望ましい種々の状況がある。このようなアッセイにおいては、前述のアッセイと同様、ＳＰ−１０などの精子組織特異抗原ないしタンパクに特異的な一以上のモノクローナル抗体を用いて精子の存在あるいは不存在を決定できる。精子が特定の濃度あるいはレベルで存在するかどうかを評価する必要がある場合には、試験を、ある一定のラインより下では反応が明確に検出されない若しくは観察されないように標準に対して較正することはごく容易である。あるいは、その場合の閾値が陽性である場合には、信号を強化し又は色変化をもたらすようにすることもできる。本試験の基本を繰り返して述べれば、ヒト精子を含有することが疑われる試料を精子に特異的なタンパクに対するモノクローナル抗体に接触させることにある。以下、本発明によって満たされる各種需要について記載するが、本発明が応用可能な用途は記載したものに限定されない。成人不妊カップル妊娠を成立させることに困難を経験しているカップルにとっては、不妊症の専門家等の職業的サービスを求めるに先立ち、子供を懐妊できないことが少なくとも部分的に男性パートナー側の生殖不能若しくは生殖能の弱さにあるのかどうかを確かめたいことが多い。そのような場合、２試験キットが提供される。この２試験キットにおいては、“第一”の試験によって、精子濃度が適正な“正常”レベル即ち約１０８以上である場合に陽性反応若しくはあるいは陽性信号を与えるように設定する。感度は様々な方法、例えばレポーター分子の性質をコントロール等の方法でコントロールできる。レポーター分子の感度が低ければ低いほど、高濃度の抗原、即ち結合リガンド対が“陽性”値をもたらすために必要である。もしこの試験が陽性ならば、男性パートナーの精子数は正常であるという結論が得られる。このような陽性の結果は、医療従事者の注意を女性パートナー側に向けるべきことを示唆するであろう。もし“低感度”アッセイ試験が陰性であるなら、ずっと低濃度の１０⁵〜１０⁶ の精子数でも検出できるように設定した第二の試験を実施する。もしこの試験が陽性でも低精子数を示唆したり、低感度アッセイで精子の不存在が示唆された後で行って完全陰性となった場合には、キットの添付物においてカウセリングを示唆することができる。パイプカットの男性パイプカットを受ける男性は、他の避妊方法を止めたり中断するに先立って、一定の期間精子が通過する生殖路を浄化する必要がある。モノクローナル抗体と精子特異性タンパクとの反応によって精子の存在を決定する試験キットは、この期間の射出精液の試験にかかる高額な費用を不要とするものである。本態様においては、複数のアッセイを含む単一キット製品あるいは複数の同様なアッセイキット群を、推奨される期間にわたって用いることによって、男性当人が生殖路から精子が除かれていく状態をモニターする事を可能にする。精子が存在しなくなるであろう妥当な期間を越えても試験結果が陽性であるならば、医師の診察を受けることが推奨される。パイプカット後には輸精管の切断部が自然に再疎通することがあって、生殖能を取り戻すことがあるため、パイプカットを受けた患者が定期的に精子の再出現を家庭用試験キットでモニターすれば、再疎通が起こったことや孕性が戻った可能性について知ることができる。再疎通はパイプカット術における患者の不満足の原因となり、またまさに医師の信頼性を左右するため、このような家庭用キットは患者の側からもまた医師の側からも有用である。精管吻合術を受けた男性パイプカットを受けた男性は精管吻合と呼ばれる外科的手続によって、切断した輸精管の両端を再建することができる。時にはこの手続には問題があり、またどの場合でも手術が完全に成功したかどうかの判定には、精子レベルが正常値に戻ったかどうかについてのモニターが必要である。この試験を行うために設計されたキットは正常精子レベルに対して較正設定することができる。即ち、陽性の結果は手術の成功の追認であり、これによって医師によるモニタリングという比較的高額の費用と不便さを避けることができる。女性による精子レベルの確認多くの女性にとって、自分のパートナーである男性に受精能があるかどうかは特にパイプカットを行った場合には、現在自らは独立して知ることができない問題の一つである。本発明は、女性が自分のパートナーである男性がパイプカットしたという主張を確認する、あるいは妊娠を考えている場合には将来のパートナーに精子があるかどうかを調べる機会を提供する。この場合、女性は交接後に膣洗浄液を個人的に試料として得ることができる。採取した試料は、射出精液の場合と同様にしてモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体試験キットに導入する。試験キットは、膣洗浄液のような試料では当然の事ながら低濃度に較正したものであって、これを用いることにより、パイプカット済であるというパートナーの主張の真謬性や、あるいはパートナーが受精能を有するかどうかについて女性は即座に知ることができる。本試験の迅速性および交接後直ぐの実施可能性によって、対処が必要な場合には直ぐにこれを行うことができる。精子産生の判定パイプカットやその他の外的影響とは別に、様々な理由から、男性自身が精子が産生されているか否かを確認したいことがある。男子大学生等、思春期の男子や思春期を過ぎた男子がロマンティックな出会いを経験するようになり、自分が精子を生成しているかどうかを知りたいと欲する場合には、精子組織特異性抗原が正常値において存在する場合に陽性応答を呈するように較正された本発明アッセイを利用することができる。生涯のもう一方の側では、再婚した老男性や自分が子供の父親となる能力が有るかどうかを知りたい老男性の場合には、またある場合は別の理由からでも、感度を正常値、正常値未満、あるいは正常値より高く較正設定した本発明アッセイを用いることによって、大きな出費なく種々の情報を迅速に解釈することが出来る。外傷や化学薬品の影響様々な状況において、睾丸の外傷および／または化学薬品の使用によって精子の産生が影響を受けることがある。よって、睾丸の外傷、おたふくかぜ睾丸炎、並びに睾丸および精子索の捻転など、関連する症状の後には、正常値未満あるいは正常値に較正設定した本発明アッセイを用いることによって、機能障害の有無を検出することができるであろう。また、回復の進捗や障害の憎悪もモニターできるであろう。集中トレーニング中の運動競技者および／または同化ステロイドを使用している運動競技者にも、同様の状況がある。このいずれの場合にも、精子産生が減少したり、精子を生成しない場合がある。トレーニングおよび／または同化ステロイドの使用が精子レベルを低下させているかどうかについて知るには、運動プランを実行するに先立ち、個人ベースで第一アッセイないし試験を実施した後、その運動プランを通して定期的に同一レベルに較正した同じ試験を実施する。運動プログラムを実施する前には陽性であった反応が運動プログラム実施の過程を通じて陰性反応に変化した場合には、精子産生能が危険な状態に曝されていることが示唆される。環境とりわけ労働環境は、往々にして精子産生への脅威を与えることがあるが、このような脅威は、（現在）入手可能なアッセイではモニターする事が難しく、かつ話し合ったり検討したりすることも困難である。よって日常ハイリスクの環境に曝されている労働者達（例えば放射線を取り扱う者、高圧酸素に暴露されるパイロットその他の職業の従事者、麻酔科医や麻酔士、有毒物質に暴露される労働者等）は、数カ月毎などのように定期的にキットを与えられて、家庭で精子産生が継続しているかどうかを自身でテストすることができる。この低コストの選択肢は、本人のプライバシーと守秘性を提供するので、上記産業において新たなレベルの福利厚生を確立するものである。同様に、軍の人員が試験や野戦の場合において放射線や有毒物質に被曝した時には、精子産生に及ぼす影響を迅速かつ低廉に調べることができる。生殖路の感染、閉塞、および手術男性の生殖路は、様々な感染症や外科的状況を引き起こしやすく、これによって精子産生が影響を受ける。よって、淋病やクラミジア感染などのウイルス性あるいは細菌性の感染は、精子産生の継続レベルに心配を起こさせる場合がある。感染の治療中あるいは治療後には、精子特異抗原に特異的なモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いた迅速且つ容易なアッセイによって機能が正常に継続していることを再確認できる。同様に、男性の生殖路は、種々の閉塞も起こしやすい。これは感染や、腫瘍、先天的閉塞その他の原因によって引き起こされる。外科現場において用いるための迅速な精子特異抗原アッセイは、閉塞の治療や修復のために医師が選択した部位が閉塞の上あるいは下でないかどうかを判定するために役立つ。この選択部位から吸引された体液をアッセイに付せば、非常に高感度でＳＰ−１０やその他の精子組織特異抗原の存在を知ることができる。陽性反応は明らかにその選択部位が閉塞部と睾丸との間に存在することを示す。上記のような外科手術中における使用の他に、閉塞の修復の後には、正常精子レベルに較正した本発明アッセイを用いて正常な精子産生を確認することができる。男性避妊のモニタリング多くの男性用全身的避妊薬や避妊ワクチンが現在検討されている。ワクチンの候補としては、ＦＳＨが挙げられる。このＦＳＨを接種すれば、ＦＳＨ抗体が産生され、その結果ＦＳＨレベルが下がる一方、射出精液中の精子数が大幅に減少する。別のワクチン剤である現在開発中のＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモン）は、内分泌腺の制御によってテストステロンを減少させ、精子産生を劇的に低下させる。これらのワクチンの効果のモニターにあたっては、本発明のアッセイを用いれば精子数を簡単に知ることができる。テストステロンのインプラントもまた男性用避妊薬として現在試験中であるが、これもＦＳＨをＬＨと同様に減少させるものであって、精子生成もまた低下させる。本発明のアッセイは、インプラントの効果および、当該イプラントの消尽や撤去の場合には、正常精子レベルへの復帰の双方をモニターするために用いることができる。上述の例は限定的なものではなく、種々の材料、方法、その他の応用が容易に想到できる。より複雑な操作、洗練された装置および教育を要するアッセイも可能であり、そのようなものの例としてはラジオイムノアッセイ、表面のプラスマ共鳴をシフトさせる発光スペクトルを利用する蛍光分光アッセイ、およびバイオセンサー等が挙げられる。これらのアッセイは、高度な信頼性を提供するとともに、各種応答レベルを区別することができる。そのようなアッセイおよびアッセイを行うためのキットはすべて同じ基本要素群、即ち精子組織特異抗原ないしタンパク、これに選択的な第一モノクローナル抗体、この両者の間の結合を検出する手段であると共に精子の存在を容易に検出・感知できる手段、により特徴づけられる。その他の点については、請求の範囲の記載を除き、本発明はなんら限定されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ライト，リチャードエム. アメリカ合衆国 22963 バージニア州, パルミラ，ボックス 87−１，ルート２

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト男性個体の精子産生能を、当該個体の射出精液中で精子が所定濃度を有するか否かを決定する方法であって、前記個体の射出精液試料と精子組織特異性タンパク抗原に特異的な第一抗体を含有する調製物とを、当該抗体が当該試料中に存在する前記抗原のいずれかと結合する条件において結合させ、前記結合した試料を検査して結合の頻度を決定する方法であり、前記所定の濃度に対応する頻度またはそれ以上の頻度での前記結合の出現が、前記濃度で精子産生がなされていることの指標であり、前記所定の濃度より低い濃度に対応する値での前記結合の出現が、前記濃度での精子産生がないことの指標であることを特徴とする方法。２．前記抗体がモノクローナル抗体を含有するものである請求項１に記載の方法。３．前記抗体がポリクローナル抗体を含有するものである請求項１に記載の方法。４．前記結合の頻度を決定するステップが、容易に検出可能な信号を検出することによって達成されるものである請求項１に記載の方法。５．前記信号が、比色法、蛍光法、化学発光法あるいは本質的にバイオセンサーである請求項４に記載の方法。６．前記抗原がＳＰ−１０である請求項１に記載の方法。７．前記抗体が、ＡＴＣＣ番号でＨＢ１００３９、ＨＢ１１５４１、ＨＢ１１５４２、およびそれらの混合物から成る群から選択される寄託ハイブリドーマ細胞株によって発現されるものである請求項６に記載の方法。８．前記方法がさらに、前記抗体に未結合の前記試料を実質的に全て除去することと、前記第一抗体とこれに結合したいずれかの物質に対して当該抗原と結合してレポーター物質と複合体を形成する第二抗体を添加することと、前記第二抗体を前記抗原に結合させることと、未結合の第二抗体を全て除去することと、前記レポーター物質の存在を検出することを包含するものである請求項１に記載の方法。９．前記レポーター物質が（Ａ）酵素または（Ｂ）酵素基質であって、前記レポーター分子の存在が、前記レポーター分子でない方のＢまたはＡの添加によって決定されるとともに、ＡとＢとの間の反応を検出するものである請求項８に記載の方法。１０．ＡとＢとの間の反応が、発色、色の変化、蛍光、蛍光の変化、あるいは可視光線やレーザー光の放射を引き起こすものである請求項９に記載の方法。１１．生物学的試料中に精子が存在するかどうかを決定する方法であって、当該試料と精子組織特異性タンパク抗原に特異的な第一抗体を含有する調製物とを、当該抗体が当該試料中に存在する前記抗原のいずれかと結合する条件において結合させ、前記結合した試料を検査して結合の存在を決定する方法であり、前記結合の存在が、前記試料中に精子が存在することの確認であることを特徴とする方法。１２．前記抗体がモノクローナル抗体を含有するものである請求項１１に記載の方法。１３．前記抗体がポリクローナル抗体を含有するものである請求項１１に記載の方法。１４．前記試料が生体から得られるものである請求項１１に記載の方法。１５．前記試料がヒト女性から得られるものである請求項１４に記載の方法。１６．生物学的試料中の精子の存在を検出するためのキットであって、前記試料を付着させるための表面と、精子組織特異タンパク抗原に対して特異的な抗体と、前記モノクローナル抗体の前記試料中に存在する抗原に対する結合を示す手段とを有することを特徴とするキット。１７．前記抗体が前記表面に結合されるものである請求項１６に記載のキット。１８．結合を示す手段が、前記精子組織特異抗体が前記抗体に結合した時には前記精子組織特異抗体に結合する第二抗体を含有し、前記第二抗体がレポーター物質によって補完されるものである、請求項１６に記載のキット。１９．前記抗体がモノクローナル抗体を含有するものである請求項１６に記載の方法。２０．前記抗体がポリクローナル抗体を含有するものである請求項１６に記載の方法。２１．前記レポーター物質が、酵素または酵素の基質である請求項１８に記載のキット。２２．前記キットが、さらに前記レポーター物質と反応して視覚的に検出可能な信号を生成する物質を含有する請求項２１に記載のキット。２３．前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号でＨＢ１００３９、ＨＢ１１５４１、ＨＢ１１５４２、およびそれらの混合物のハイブリドーマ細胞株によって発現されるモノクローナル抗体から成る群から選択されるものである請求項６に記載の方法。