JPH09512431A

JPH09512431A - 寄生住血鞭毛虫類を処理するためのワクチン、診断アッセイ及び方法

Info

Publication number: JPH09512431A
Application number: JP7528160A
Authority: JP
Inventors: パウエル，カーティス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1997-12-16
Also published as: US6027934A; WO1995029699A1

Abstract

(57)【要約】トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンス（Trypanosoma brucei rhodesiense）を起源とする固有タンパク質抗原のイムノドミナントフラグメントは、トロパノソーム(Trypanosome)の種、レイシュマニア（Leishmania）の全種、及びその他の寄生住血鞭毛虫類を通じて免疫保護を誘導するのに利用できうる。このフラグメントはワクチンのベースを成し、それは寄生住血鞭毛虫類の感染症の処置に有用である。このフラグメントは一式の診断アッセイの基礎をも成し、それはかかる寄生住血鞭毛虫類の診断に利用できる。かかる診断アッセイを実施するのに必要な試薬を含むキットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】寄生住血鞭毛虫類を処理するためのワクチン、診断アッセイ及び方法発明の背景１．発明の分野本発明は一般的に寄生住血鞭毛虫類感染症、例えば様々なアフリカ産トリパノソーム(trypanosome)により生ずる感染症の宿主を処置するための新規のワクチン及びそれを診断するための新規のアッセイの利用に関する。２．関連技術の説明世界健康機関は年間少なくとも3,700万人がが寄生住血鞭毛虫類感染症にかかり、一部は致死的であると推定している。多かれ少なかれ、家畜タンパク質産生動物も同様に冒されている。今まではワクチンは製造されておらず、その理由は（１）アフリカ産トリパノソームの場合の、寄生虫のその表層コートを変化させる能力、（２）全てのトリパノソーム及びレイシュマニア(Leishmania)における免疫抑制を誘導する能力、並びに（３）感染の一部の箇所において寄生虫が細胞内的に隠れる能力、にある。従来、アフリカ産トリパノソームにおいて、得られうる唯一の免疫は単一株由来の単一の単離体に対するものであった。この免疫は同一の株、又は任意のその他の株もしくはアフリカ産トリパノソーム以外の種から単離した全てのその他の単離体に対しては有効でない。 Olenickら、Infect．Immun.，56：93(1988)は、トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンス(Trypanosoma brucei rhodesiense)の鞭毛ポケットを起源とする約80，74，40及び25kDaのタンパク質の混合物がトリパノソーム・ブルセイ・ローデシエンスの変異体を通じて保護を供することを報告している。しかしながら、この抗原が全てのアフリカ産トリパノソームに共通しているとか、又は実際全ての住血鞭毛虫類に共通しているかどうかはOlenick らからは不明である。これに関連して、Olenickらがトロパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンスの変異体を通じて免疫保護を達成せしめたという単なる事実は、関連の抗原がアフリカ産トリパノソームのうちのその他の種又はその他の住血鞭毛虫類に共通していることを、それのみでは示唆していない。おそらく、類似のタンパク質がアフリカ産トリパノソームの種を通じる免疫保護を供する。Powell，Med.J.Zambia，10：34(1976);Powellら、Med.J.Zambia，1 2：67(1978)；及びPowell，Experientia，34：1450(1978)を参照のこと。Ruizら、Immunol.Lett.，12：１(1986)は、トリパノソーマ・クルジ(Trypanosoma cruz i)に対して免疫保護とするトリパノソーマ・クルジにおける鞭毛抗原を報告しているが、この抗原に対する抗体は哺乳動物の心臓組織に対する抗体を供してしまう（米国特許第 4,298,590号を参照）。寄生虫上のこの鞭毛ポケット部位は、アフリカ産トリパノソームにおいて、レセプター媒介型エンドサイト−シスに関与するとも報告されている。Coppensら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6733(1988 )；Webster，Eur.J.Cell Biol.，49：295(1989)；及びWebsterら、Eur.J.Cell B iol.,49：303(1989)を参照のこと。公開特許出願WO92／22325は、トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンス生物を起源とする固有のタンパク質抗原が、全てのアフリカ産トリパノソーム、トリパノソーマ・クルジ、全種のレイシュマニア、及びその他の寄生住血鞭毛虫類に対する免疫保護を誘導するのに利用できることを教示している。しかしながら、組換手段により抗原の調製を促進するであろう配列及びその他のデーターは開示されていない。組換手段による調製は現状の需要に合わせるのに十分な量で、且つ安価な状況でワクチンを製造するのに必要である。発明の概要本発明の目的は住血鞭毛虫類感染症を処置するのに一般的に有用なワクチンの提供にある。本発明の別の目的は住血鞭毛虫類感染症に対する一般的な免疫保護のための方法の提供にある。本発明の別の目的は住血鞭毛虫類感染症に苦しむ患者のその感染症を診断するための手段の提供にある。更なる目的はかかるワクチン及び比較的安価なかかる方法の提供にある。これら及びその他の目的は本発明によりこの度達成され、ここでトリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンスの鞭毛ポケットに由来する前述の抗原のイムノドミナントフラグメントは住血鞭毛虫類の属を通じて免疫保護を供することが発見された。当該イムノドミナントフラグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列が、見い出され、そして本明細書において報告し、SEQ ID NO：１に示す。従って本発明の一態様は以下の群より選ばれるヌクレオチド配列を有する単離又は合成DNAに関する：（ａ）SEQ ID NO：１；（ｂ）（ａ）に相補性の配列；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の免疫保護フラグメント；（ｄ）ストリンジェンシー条件下で（ａ），（ｂ）又は（ｃ）にハイブリダイズする配列；（ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の縮重変異体。本発明の別の態様は上記のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に関する。本発明の別の態様は、上記のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現を可能とするのに必須な適正な配向において上記のヌクレオチド配列を含む組換クローニングビヒクルに関する。本発明の別の態様は、住血鞭毛虫類により生ずる感染症に対する免疫を誘導するための、それに有効な量の上記のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質及び薬理学的に許容される担体を含んで成るワクチンに関する。本発明の更なる別の態様は寄生住血鞭毛虫類感染症に対する患者の免疫保護を誘導する方法であって、前記患者を上記のワクチンで種痘することを含んで成る方法に関する。本発明の更に別の態様はサンプル中の鞭毛ポケット抗原の検査のための方法であって：（ａ）上記のタンパク質に対する抗体で固体支持体をコーティングする；（ｂ）前記コーティング化支持体を洗浄する；（ｃ）この洗浄したコーティング化支持体をタンパク質含有溶液と接触させる；（ｄ）段階（ｃ）由来の支持体を洗浄する；（ｅ）段階（ｄ）由来の支持体を前記サンプルとインキュベートする；（ｆ）段階（ｅ）由来の支持体を洗浄する；（ｇ）放射能ラベルした又は酵素ラベルした抗体を段階（ｆ）由来の支持体に添加する、ここでこの抗体は上記のタンパク質に対する抗体であろう；（ｈ）段階（ｇ）由来の支持体をインキュベートする；（ｉ）段階（ｈ）由来の支持体を洗浄する；そして（ｊ１）段階（ｉ）の支持体をガンマーカウンターでの測定にかけるか、又は（ｊ２）段階（ｉ）の支持体をELISAにかけ、そしてこのELISAの結果を、コントロールとして利用した正常血清由来のELISA結果と対比させる；ことを含んで成る方法を含む。本発明は更にサンプル中の鞭毛ポケット抗原に対する抗体の検査のための方法であって：（ａ）結合性部位をその上に含む固相支持体に上記のタンパク質を吸着させる；（ｂ）段階（ａ）由来の支持体をその上の結合性部位を飽和にする物質と接触させる；（ｃ）段階（ｂ）由来の支持体を洗浄する；（ｄ）段階（ｃ）由来の支持体をサンプルと接触させて第１結果塊を形成する；（ｅ）段階（ｄ）の結果塊をインキュベートする；（ｆ）段階（ｅ）の結果塊を洗浄する；（ｇ）段階（ｆ）由来の結果塊にヒトIgG又はIgMに対する放射能ラベルした又は酵素ラベルした抗体を加えて第２結果塊を形成する：そして（ｈ１）段階（ｇ）の第２結果塊をガンマーカウンターでの測定にかけるか、又は（ｈ２）段階（ｇ）の第２結果塊をELISAにかけ；次いで（ｉ）コントロールとして利用する正常サンプルを（ａ）から（ｈ１）又は（ｈ２）に至る段階にかけ；そして（Ｊ）段階（ｈ１）又は（ｈ２）と（ｉ）の測定値とを対比させる；ことを含んで成る方法にも関連する。本発明の別の態様は、サンプル中の鞭毛ポケット抗原の検査のための方法であって：（ａ）上記のタンパク質に対する抗体を含む組成物の第１部を前記サンプルとラベル形態の上記のタンパク質との混合物と接触させ、前記第１部をインキュベーション及び洗浄する；（ｂ）前記抗体含有組成物の第２部を、鞭毛ポケット抗原を含まないコントロール中の同量の前記ラベル化タンパク質と接触させ、前記第２部をインキュベーション及び洗浄する；（ｃ）上記の段階（ａ）及び（ｂ）の各組成物に同量のタンパク質含有組成物を添加し、前記双方の組成物をインキュベーションし、前記各組成物を遠心分離し、そしてその中の固形分から液体を分離させる；（ｄ）上記の段階（ｃ）由来の各結果組成物中のラベル化タンパク質の程度を決定する；そして（ｅ）前記第１部を含む結果組成物の活性が前記第２部の結果組成物の活性より低いかを決定するため（この場合、前記サンプルは鞭毛ポケット抗原を含む）、前記各結果組成物中のラベル化タンパク質の相対量を対比する；ことを含んで成る方法に関する。本発明の更なる態様はサンプル中の鞭毛ポケット抗原に対する抗体の検査のための方法であって：（ａ）前記サンプルを非ラベル化形態の上記のタンパク質でコーティングされた固相支持体と接触させ、この接触サンプルをインキュベーションし、そして洗浄する；（ｂ）上記段階（ａ）より得られるインキュベーション・洗浄済みの生成物をラベル化形態の上記タンパク質と接触させ、その結果塊をインキュベーション及び洗浄する；そして（ｃ）上記段階（ｂ）により得られる結果塊中に存在しているラベル化タンパク質の程度を決定する；ことを含んで成る方法。本発明は更に試験サンプル中の鞭毛ポケット抗原を検査するための診断試験キットであって、１又は複数の容器の中に：（ａ）上記のタンパク質に対する一定量の抗体、ここでこの抗体は固相支持体に結合されている；及び（ｂ）前記タンパク質に対するラベル化抗体；を含んで成るキットに関する。本発明は更に鞭毛ポケット抗原に対する抗体の存在を検査するための診断試験キットであって、１又は複数の容器の中に：（ａ）一定量の上記タンパク質、ここでこのタンパク質は固相支持体に結合されている；及び（ｂ１）ヒトIgGもしくはIgMに対するラベル化抗体；又は（ｂ２）ラベル化形態の上記タンパク質；のいづれかを含んで成るキットに関する。略語及び定義以下のアミノ酸は本明細書において以下の３文字又は１文字コードで表示されていることがある：本明細書の中で使用している以下の用語は記載の定義を有するものと解される。本明細書で用いる用語「縮重変異体」とは、一定のヌクレオチド配列の全ての変異体を含むことを意味し、それらは、遺伝子コードの縮重性に基づき、この一定のヌクレオチド配列と同一のアミノ酸配列をコードする。本明細書で用いている用語「患者」とは、ヒト及び一定の動物、特にその他の霊長類、ラクダ、イヌ、ロバ、ラクダ、及び家畜タンパク質産生哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタを意味する。本明細書で用いている用語「適正な配向」とは、発現したときに所望のタンパク質を生成するリーディングフレームをもたらしめるような組換クローニングビヒクル中の配向を意味する。本明細書で用いている用語「ストリンジェンシー条件」とは、採用する特定のハイブリダイゼーションプロトコールとの関係で、特異性を保障するのに十分なストリンジェンシーでありながら、許容される率において安定なハイブリドの形成を可能とするのに十分に柔軟性である当業者に公知の条件を意味する。発明の詳細な説明イムノドミナントフラグメントは以下の実施例に記載の通りに本来調製される。イムノドミナントフラグメントは住血鞭毛虫類の属を通じて免疫保護を供することが見い出された。例えば、このイムノドミナントフラグメントはアフリカ産トリパノソーマ属、例えばトリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンス、トリパノソーマ・ビバックス(T.vivax)、トリパノソーマ・コンゴレンス(T.congolense )、トリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス（T.brucei gambiense）、トリパノソーマ・エバンシ(T.evansi)又はトリパノソーム・ブルセイ・ブルセイ(T.bru cei brucei)を通じて免疫保護を供する。このイムノドミナントフラグメントはまた、トリパノソーマ・クルジ（アメリカ産のトリパノソーマの亜属）及びレイシュマニアの種（別の属）、例えばレイシュマニア・メキシカーナ（L.mexicana ）、レイシュマニア・ブラジリア(L.brasilia)、レイシュマニア・メジャー(L.m ajor)、レイシュマニア・アマゾネシス(L.amazonesis)、レイシュマニア・ドノバニ(L.donovani)、レイシュマニア・インファントゥム(L.infantum)及びレイシュマニア・チャガシ(L.chagasi)、東半球レイシュマニア全て及び西半球レイシュマニア全てに対する免疫保護を供する。本明細書記載のイムノドミナントフラグメントをワクチンの中に組み入れることができ、これによりこのワクチンは感受性宿主、例えばヒト及び一定の動物、特に非ヒト哺乳動物、特にその他の霊長類、ラクダ、イヌ、ロバ、ラクダ及び家畜タンパク質産生哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタにおける住血鞭毛虫類により生ずる感染症に対する免疫保護を誘導するのに有用となる。この目的のため、このイムノドミナントフラグメントは任意の慣用の薬理学的に許容される担体と一緒に存在していてよい。このワクチンは免疫反応を刺激し、それ故ワクチンの効果を強める補助剤を含んで成ってもよい。本発明において利用するための慣用の補助剤はみょうばんである。好都合には、このワクチンは約100μｇ〜約750μｇ／mlの範囲、好ましくは約 500μｇ／mlの最終濃度のイムノドミナントフラグメントを含むように処方する。処方後、このワクチン無菌容器の中に入れ、それをシールし、そして低温で保存してよい。住血鞭毛虫類により生ずる感染症に対するヒト及び動物の免疫を誘導するため、上記の通りに処方した有効な量のワクチンを皮下、皮内又は筋肉内注射により投与する。好適なルートは特定のワクチンに依存するであろうが、筋肉内注射が一般に適当であろうと信じられている。有効な量のワクチンとはヒト又は動物宿主において感染症に対する免疫を誘導するのに十分な量である。この有効な量は、ヒト又は動物のサイズに依存して0.1〜1.0mlのワクチン用量づつで３回の投与により通常達成されるものであり、往々にして初期免疫の６ヶ月後又は１年後にブースターが後続する。その後の用量又はブースターは初期免疫の結果としての血液中の抗体のレベルに依存し、そして一定の状況においては不要でありうる。特に好適な態様において、このイムノドミナントフラグメントはSEQ ID NO:１のヌクレオチド配列を有するDNAによりコードされ、それ故このイムノドミナントフラグメントはSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する。Ｂ細胞エピトープは５〜８個のアミノ酸残基を一般に含んで成るため、免疫保護性であるSEQ ID NO:１のフラグメントも考慮され、そして以上のフラグメントより成る群から選ばれるものでありうる：（番号はSEQ ID NO:１に記載のアミノ酸配列番号に対応する）：16-20，17-21，18-22，19-23，20-24，21-25，22-26 ，23-27，24-28，25-29，26-30，27-31，28-32，29-33，30-34，31-35，32-36， 33-37，34-38，35-39，36-40，37-41，38-42，39-43，40-44，41-45，42-46，43 -47，15-20，16-21，17-22，18-23，19-24，20-25，21-26，22-27，23-28，24-2 9，25-30，26-31，27-32，28-33，29-34，30-35，31-36，32-37，33-38，34-39 ，35-40，36-41，37-42，38-43，39-44，40-45，41-46，42-47，14-20，15-21， 16-22，17-23，18-24，19-25，20-26，21-27，22-28，23-29，24-30，25-31，26 -32，27-33，28-34，29-35，30-36，31-37，32-38，33-39，34-40，35-41，36-4 2，37-43，38-44，39-45，40-46，41-47，13-20，14-21，15-22，16-23，17-24 ，18-25，19-26，20-27，21-28，22-29，23-30，24-31，25-32，26-33，27-34， 28-35，29-36，30-37，31-38，32-39，33-40，34-41，35-42，36-43，37-44，38 -45，39-46，40-47，12-20，13-21，14-22，15-23，16-24，17-25，18-26，19-2 7，20-28，21-29，22-30，23-31，24-32，25-33，26-34，27-35，28-36，29-37 ，30-38，31-39，32-40，33-41，34-42，35-43，36-44，37-45，38-46及び39-47 、並びに上記のフラグメントを含むSEQ ID NO:１内のより長い配列。多量の免疫優性断片を調製するために、その免疫優性断片のアミノ酸配列をコーディングするDNAを、慢性技術に従って好適な組換えクローニング・ベクター内に取り込み、そしてその中で発現させることができる。詳細については、例えば、Sambrook et al.，Molecular cloning：A Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照のこと。好ましい態様においては、この組換えクローニングベクターは、配列番号：１のアミノ酸配列をコーディングするDNAを含む。本発明は、住血鞭毛虫類(hemoflagellate protozoa)の鞭毛凹み(flagellar po cket)抗原と住血鞭毛虫類の鞭毛凹み抗体の直接検出のための診断テストにも向けられる。ヒト又は動物の血清中のこのような抗原及び／又は抗体を検出するために、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を使用することができる。RIA及びELISAに関する詳細は、よく知られており、そして本明細書中に繰り返さない。さらに、蛍光技術を、RIA又はELISAのいずれかの代わりに使用することもできる。再び、このような蛍光技術も当業者によく知られており、そして本明細書中に繰り返さない。固体支持体が使用される場合には、固体支持体は、いすれかの慣用の固体支持体、例えば、ポリスチレン・ビーズ又はマイクロタイター・プレートの壁であることができる。洗浄は、必要に場合、いずれかの慣用の溶液、例えば、トリス・バッファー生理食塩水による。タンパク質含有溶液が必要であるとき、それは、いずれかの慣用溶液であることもできるが、好ましくは、ウシ血清アルブミン(BSA)又はゼラチンである。計数がガンマ・カウンターにより行われる場合、その試料が対照のカウントよりも少なくとも2.1倍高いカウントをもつ場合に、その試料を陽性と考える。上記反応成分の中の１の標識付けは、リポーター基の使用により、例えば、放射性原子又は基、例えば、Ｉ¹²⁵の取り込みにより、あるいは、酵素、例えば、西洋のクサビ・ペルオキシダーゼ、又は染料、例えば、発色団部分又は蛍光基に上記成分をカップリングさせることにより、行われることができる。関連成分は、好ましくは、酵素へのカップリングにより標識付けされる。なぜなら、この見積りが、例えば、そのために特殊な装置が必要である放射能の見積りよりもかなり低いからである。使用される酵素は、好ましくは、比色計により、分光光度計により、又は蛍光計により測定されることができるものである。本発明における使用のための酵素の非限定的な例は、酸化還元酵素、例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベーターグルクロニダーゼ、ベータ−Ｄグルコシダーゼ、ベーターＤ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ガラクトース・オキシダーゼその他から成る群からの酵素を含む。酵素と成分のカップリングは、公知の方法において、例えば、ペプチド化学から知られた方法によるアミド結合の形成により、行われることができる。放射性同位元素による標識付けも、公知の方法において行われることができる。標識付けに有用なアイソトープは、主にＩ¹²⁵，Ｉ¹³¹，Ｃ¹⁴及びＨ³である。上記手順の実施において使用されるインキュベーション段階は、公知のやり方で、例えば、約１〜約48時間の間約20℃〜約50℃の間の温度においてインキュベートすることにより、行われることができる。上記のような洗浄は、典型的には、等張性生理食塩水溶液を使用して、６−８のpHで、好ましくは、約8.0のpHで、水溶液、例えば、緩衝液化されたものを使用して、行われる。上記のように、本発明は、抗原と抗体を検出するための上記の方法を実施するための診断テスト・キットにも関する。上記テスト・キットにおいて使用される放射標識付けされた抗体は、溶液形態で包装されることができる。その上、上記のテスト・キットにおいては、酵素又は蛍光標識付けされた抗体は、記載された放射標識された抗体について置換されることができる。本発明をこれから、以下の非限定的な実施例を参照しながらさらに詳細に説明する；実施例１トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンス（Trypanosoma brucei rhodesien se）血流形態を、ラットが十分に寄生される（10⁸−10⁹／ml）まで、成長させる。次にこれらのラットを殺し、そしてその血清を、ヘパリン被覆管又はクエン酸塩被覆管内のPSG(リン酸塩緩衝液化生理食塩水＋15.0グラムのグルコース／リッター)中に採取する。次にこの血液を、DE−52カラム（DEAE−52）上に入れ、そして上記寄生虫を集め、そして15分間5000rpmにおいて回転沈降させる。これらの寄生虫を、３回冷凍−解凍し、そしてホモジェナイズし、そして次に15分間1, 500rpmにおいて遠心分離する。この沈澱物を、再ホモジェナイズし、そしてPBS( リン酸塩緩衝液化生理食塩水)バッファー中で３回再遠心分離する。これらのホモジェネートを、プールし、そして5,400rpmにおいて20分間遠心分離する。次にこの沈澱物を、レノグラフィン−60（renografin−60）と混合し、そして遠心分離管の底に入れ、そのの後、20−40％レノグラフィン −0.25Ｍスクロース勾配とし、そしてスウィング・バスケット・ローター内で18 ,000rpmにおいて２時間遠心分離する。第２バンドを、単離し、そしてSepharose ４Ｂのカラム上に入れ、クロロホルムで溶出させる。これを、卵アルブミンと（１：１）、そして次にミョウバン（alum）と(１：1 .5)混合し、そして２週間毎に３回、ラット／マウスの足裏に注射する。抗体を、その眼の後から採取し、そして12,000rpmにおいて15分間遠心分離する。実施例２トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンスのラムダ・ザップII（lambda zap II）（Stratagene，La Jolla，CA）cDNA発現ライブラリーを、寒天プレート上のブルー・スクリプト大腸菌（Blue script E.coli）(Stratagene，La Jolla，CA) 上で発現させた。得られたプラークを、上記からの抗体（トリパノソーマ・ブルセイ・ローデシエンスの鞭毛凹み由来の免疫保護的抗原に対する抗体）により処理した。これらの陽性プラークを単離し、そしてヘルパー・ファージＡ408(Stra tagene，La Jolla，CA)を用いてファージミド内に形質転換した。これらのファージミドを、Bluescript E.coli内に形質転換し、そしてイソプロピル−Ｂ−Ｄ −チオガラクトピラノシド（IPTG-1.0mg／ml）により誘導した。これらの発現生成物を、リゾチームにより溶解し、そしてペレット化した。免疫保護的活性をもつペレットを、PBS中に再懸濁させた。実施例３ 60匹のウシ（ゼブ(zebu)）を使用した。これらのウシを、各々20匹のウシの３群に分割した。この第１群を、WO92／22325中に記載された抗原を用いて（ａ）、その第２群を、本発明の免疫優性断片を用いて（ｂ）、接種し、そしてその第３群を、未処理とした（Ｃ）。次にこれらのウシを、Lambwe valley，kenya由来のツェツェ・バエ(tsetse flies)から得られたトリパノソーム（T.vivax 及びT.congolense）を用いて接種した。群（ａ）は、４／20感染をもち、群（ｂ）は、３／20感染をもち、そして群（ｃ）は、13／20感染をもっていた。（ａ）と（ｂ）からの感染は、かなり初期の処置により引き起こされた。なぜなら、これらの感染が、消失しているように見えたからである。これらの動物を、２つの区画内で使用した。第１の区画を、３週間接種し、そして（ａ）４／10、及び（ｂ）３／10及び（ｃ）７／10感染をもっていた。第２の区画を４週間接種し、そして（ａ）０／10及び（ｂ）０／ 10及び（ｃ）６／10及び感染をもっていた。実施例４ 36C57BL／６マウスを、実験１のために、実験２のために40のマウスを、そして実験３のために76のマウスを使用した。これらのマウスを30匹（実験１について５、実験２について10、そして実験３について15又は“５−10−15”），42（ 11−10−21），40（10−10−20）及び40（10−10−20）の４群に分割した。第１群を未処理とし、そして対照に供し、第２群を、非クローン・ベクター・タンパク質(クローン化された免疫優性断片と同じ方法で溶解されたBluescript E.coil )により処理し、第３群をWO92／22325中に記載された抗原により処理し、そして第４群を、クローン化された免疫優性断片により処理した。これらの結果を、以下に作表する：実験１実験２実験３総合すると、実験３と４からのデータは、WO92／22325由来の抗原が、免疫保護的であったことを立証している（ウシにおける感染度は、13／20から４／20に減少され、そしてマウスにおける感染度は、68／72から20／40に減少された。）。驚くべきことに、本発明に係る免疫優性断片(immunodominant fragment)は、W O92／22325由来の抗原よりもさらに良好な保護を与えた（ウシにおける感染度は、さらに３／20に減少され、そしてマウスにおける感染度は、半減され、すなわち、10／20まで減少された。）。本明細書及び請求の範囲は、説明のためのものであり、限定的なものではないこと、そしてさまざまな修正及び変更が、本発明の本質及び範囲から逸脱せずに行われ得ることが、理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/569 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の：（ａ）SEQ ID NO:１；（ｂ）（ａ）に相補的な配列；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の免疫保護的断片；（ｄ）ストリンジェンシー条件下、（ａ），（ｂ）又は（ｃ）にハイブリダイズする配列；及び（ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の縮重変異体、から成る群から選ばれた配列をもつ単離又は合成DNA。２．SEQ ID NO:１の配列をもつ、請求項１に記載の単離又は合成DNA。３．請求項１に記載の単離又は合成DNAによりコードされたタンパク質。４．SEQ ID NO:１によりコードされた、請求項３に記載のタンパク質。５．請求項１に記載の単離又は合成DNAを含む組換えクローニング・ベクター。６．SEQ ID NO:１を含む、請求項５に記載の組換えクローニング・ベクター。７．住血鞭毛虫類(hemoflagellate protozoa)により引き起こされる感染に対する免疫を誘導するためのワクチンであって、そのために有効な量の請求項３に記載のタンパク質及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチン。８．タンパク質がSEQ ID NO:１によりコードされる、請求項７に記載のワクチン。９．医薬として許容される担体がミョウバン（alum）である、請求項７に記載のワクチン。 10．寄生性住血鞭毛虫類感染に対する、患者における免疫保護を誘導する方法であって、請求項７に記載のワクチンをその患者に種痘することを特徴とする方法。 11．誘導された免疫保護がアフリカ・トリパノソーム(Africa trypanosomes) に対するものである、請求項10に記載の方法。 12．アフリカ・トリパノソームが、トリパノソーマ・ビバックス(Trypanosoma vivax) 、トリパノソーマ・コンゴレンス（Trypanosoma congolense）、トリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス（Trypanosoma brucei gambiense）、トリパノソーマ・エバンシイ（Trypanosoma evansi）又はトリパノソーマ・ブルセイ・ブルセイ(Trypanosoma brucei brucei)である、請求項11に記載の方法。 13．誘導された免疫保護が、アメリカン・トリパノソーム(American trypanos omes)に対するものである。請求項10に記載の方法。 14．アメリカン・トリパノソームが、トリパノソーマ・クルジイ(Trypanosoma cruzi) である、請求項13に記載の方法。 15．誘導された免疫保護が、レイシュマニア（Leishmania）の種に対するものである、請求項10に記載の方法。 16．レイシュマニアの種が、レイシュマニア・メキシカーナ(Leishmania mexi cana) である、請求項15に記載の方法。 17．サンプル中の鞭毛ポケット抗原の検出方法であって：（ａ）請求項３に記載のタンパク質に対する抗体により団体支持体をコーティングし；（ｂ）上記コーティング支持体を洗浄し；（ｃ）タンパク質・含有溶液と、上記洗浄コーティング支持体とを接触させ；（ｄ）段階（ｃ）からの支持体を洗浄し；（ｅ）上記サンプルと共に、段階（ｄ）からの支持体をインキュベートし；（ｆ）段階（ｅ）からの支持体を洗浄し；（ｇ）放射標識された又は酵素標識された抗体であって請求項３に記載されたタンパク質に対する抗体であるものを、段階（ｆ）からの支持体に、添加し；（ｈ）段階（ｇ）からの支持体をインキュベートし；（ｉ）段階（ｈ）からの支持体を洗浄し；そして（ｊ１）段階（ｉ）からの支持体をガンマ・カウンター内で計数に供するか；又は（ｊ２）段階（ｉ）の支持体をELISAに供し、そして対照として使用した正常血清からのELISAの結果と、上記ELISAの結果を比較するかのいずれかを行う、ことを特徴とする方法。 18．サンプル中の鞭毛ポケット抗原の検出方法であって：（ａ）請求項３に記載のタンパク質を、その上に結合性部位を含む団体支持体上に吸着させ；（ｂ）その上の結合性部位を飽和させるために、ある材料と、段階（ａ）からの支持体を接触させ；（ｃ）段階（ｂ）からの支持体を洗浄し；（ｄ）あるサンプルと、段階（ｃ）からの支持体とを接触させて、第１の得られたマスを作り；（ｅ）階段（ｄ）からの得られたマスをインキュベートし；（ｆ）段階（ｅ）からの得られたマスを洗浄し；（ｇ）ヒトIgG又はIgMに対する放射標識された又は酵素標識された抗体を段階（ｆ）からの得られたマスに添加して、第２の得られたマスを作り；そして（ｈ１）段階（ｇ）からの第２の得られたマスをガンマ・カウンター内で計数に供するか；又は（ｈ２）段階（ｇ）の第２の得られたマスをELISAに供するかのいずれかを行い；そして（ｉ）対照として使用した正常サンプルを段階（ａ）から段階（ｈ１）又は（ｈ２）のいずれかまでに供し；そして（ｊ）段階（ｈ１）又は（ｈ２）のいずれかと、段階（ｉ）のカウント数を比較する、ことを特徴とする方法。 19．サンプル中の鞭毛ポケット抗原の検出方法であって：（ａ）請求項３に記載のタンパク質に対する抗体を含む組成物の第１部分と、そのサンプルと請求項３に記載の標識されたタンパク質との混合物とを、接触させ、インキュベートし、そしてその第１部分を洗浄し；（ｂ）抗体を含む上記組成物の第２部分と、鞭毛凹み抗原を含まない対照中の上記標識されたタンパク質の同量とを、接触させ、インキュベートし、そしてその第２部分を洗浄し；（ｃ）上記段階（ａ）と段階（ｂ）の組成物の各々に、同量のタンパク質含有組成物を添加し、それらの組成物の両方をインキュベートし、それらの組成物の各々を遠心分離し、そしてその中の団体から液体を分離し；（ｄ）上記段階（ｃ）から得られた組成物の各々の中の標識されたタンパク質の程度を測定し；そして（ｅ）段階（ｃ）から得られた組成物の多々の中の標識されたタンパク質の相対量を比較して、上記第１部分を含む得られた組成物の活性が、上記第２部分の得られた組成物についての活性よりも低いかどうか、この場合、そのサンプルは鞭毛ポケット抗原を含む、を決定する、ことを特徴とする方法。 20．サンプル中の鞭毛ポケット抗原に対する抗体の検出方法であって：（ａ）そのサンプルと、非標識の請求項３に記載のタンパク質によりコートされた固体支持体とを接触させ、インキュベートし、そしてその接触サンプルを洗浄し；（ｂ）上記段階（ａ）から得られたインキュベートされた洗浄生成物と、標識された請求項３に記載のタンパク質とを接触させ、インキュベートし、そしてその得られたマスを洗浄し；そして（ｃ）上記段階（ｂ）により得られたマス中に存在する標識されたタンパク質の程度を決定する、ことを特徴とする方法。 21．テスト・サンプル中の鞭毛ポケット抗原の検出のための診断テスト・キットであって、１以上の容器内に：（ａ）所定量の、請求項３に記載のタンパク質に対する抗体であって固体支持体に結合されたもの；及び（ｂ）上記タンパク質に対する標識された抗体、を含んで成るキット。 22．鞭毛凹み抗原に対する抗体の存在の検出のための診断テスト・キットであって、１以上の容器内に：（ａ）所定量の、請求項３に記載のタンパク質であって、団体支持体に結合されたもの；及び（ｂ１）ヒトIgG又はIgMに対する標識された抗体；又は（ｂ２）請求項３に記載の標識されたタンパク質、のいずれか、を含んで成るキット。