JPH09512462A

JPH09512462A - Ｉｎｖｉｔｒｏで合成された細胞外基質を利用した改善された血液接触表面

Info

Publication number: JPH09512462A
Application number: JP7528416A
Authority: JP
Inventors: シー．ブルックマン，ウィリアム; シー．ベゴバック，ポール
Original assignee: ダブリュ．エル．ゴアアンドアソシエイツインコーポレイティド
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1997-12-16
Also published as: US5908449A; US5716394A; AU2369295A; WO1995029712A1; CA2186372A1; EP0757563A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞外内皮下基質の保存層の付加を通じて実質的に抗血栓性とされた血管補てつ材の如きの改善された血液接触装置に関する。この装置の血液界面を担うこの保存内皮下基質層は天然血管表面の内皮の下の内皮下基質層に類似している。この装置は非分解性合成ベース材料、好ましくは多孔質延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンより成り、その上に内皮下基質の生体層がin situで増殖されている。この生体層は生きた細胞に細胞外基質成分を合成及び蓄積させるinvitro組織培養法を利用して作られる。その後、細胞を殺し及び／又は除去し、そして移植前にその内皮下基質層を保存する。本発明の重要な観点は、受容側の免疫応答を最小限にするよう、最終形態において生きた細胞が存在していないことにある。本発明は６mm又はそれ以下の直径を必要とする動脈バイパスにとって極めて有用な血管補てつ材をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】 IN VITROで合成された細胞外基質を利用した改善された血液接触表面発明の背景１．発明の分野本発明は人工血管及びその他の移植可能な器具の如くの装置において利用するための改善された血液接触表面、及びin vitroでこの改善された血液接触表面を合成するための方法に関する。２．関連技術の説明末梢動脈の閉塞性アテローム症の治療における一般的な外科的手技は、その患者から取り出した生きている静脈の切片を動脈の閉塞領域の近傍にバイパスとして移植することにある。しかしながら、末梢動脈バイパスを必要とする患者全体の約１／４が静脈瘤様腫脹、多分枝形成又は直径の不適合が原因で適当でない伏在静脈を有する。従って、これらの患者はバイパスを行うことのできる代替材料を必要とする。更に、移植した静脈自体往々にしてアテローム症の進行に対して感受性である。このアテローム症の進行は動脈のそれに似ているが、ただし静脈は加速された速度で冒され、しばしば静脈移植不良を起こし、そして更なるバイパスを必要とする。このような理由のため、小口径用途において自家伏在静脈に少なくとも匹敵するように機能するであろう血管代替品のニーズがある。同一の個体におけるある箇所から別の箇所への自家生体組織の移植に加え、この用途においてはその他の生体材料が利用されている。これらには、処理されたドナー同種異系又は異系組織成分、例えば処理済みのヒト臍静脈、冷凍保存した同種異系静脈、又は処理済みの異系動脈が含まれる。ある患者から別の患者への生体血管移植が採用されているにもかかわらず、外来血管は一般に移植後に死んでしまう。生体由来の組織に加え、合成材料も血管を代用するのに一般に利用されている。合成血管移植片は大動脈又は腸骨動脈の如きの大型血管に代わるものとして19 50年代から効果的に利用されている。移植のために利用されている主たる合成品にはポリエチレンテレフタレート及び延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン(ePT FE)が含まれるが、その他の材料、例えばポリプロピレン、ポリウレタン及びポリジメチルシロキサンも利用されている。これらのポリマーの多孔質及び非孔質構築体の双方が利用されている。生体材料及び合成材料の双方がいくつかの用途、例えば大腿動脈から膝の上の膝窩動脈に至るバイパスにおいては良好な成功を収めているが、合成及び生体材料の双方とも、冠状又は膝下動脈の如きの小口径バイパスのために用いられる場合、自系伏在静脈よりはるかに頻繁なる血栓形成を示す。この性能の差異はこれら一層需要のある用途におけるかかる血管代用品の有用性を制約してしまう。天然血液接触表面、例えば血管内に見られるものは、その表面伝いに血液が正常に流れる限り血栓症を予防する固有のメカニズムを有する。哺乳動物の動脈の場合、直接血液接触表面は抗血栓性である内皮細胞層を構成している。内皮細胞層のすぐ外側には、内膜の残り、即ち、基底膜及びその下に広がる糖タンパク質担持細胞外基質より成る内皮下基質層、並びに内部弾性板がある。この内膜層のまわりには平滑筋細胞及びエラスチンを含む多層中膜構造体があり、そしてそのまわりには、線維芽細胞及び接続組織を含んで成る最外層の外膜がある。以下により詳しく説明する通り、血管系が負傷したとき、内皮下層及び中膜は止血を維持するための性質として血栓形成性であることが一般に認められている。例えば、J.A.Madri ら、「The Collagenous Cpmponents of the Subendothelium」Lab.Invest． 43 ：303-15（1980）；及びT．Matsudaら「A Hybrid Artificial Vascular Graft B ased Upon an Organ Reconstruction Model：Significance and Design Criteri a of an Artificial Basement Membrane」ASAIO Transactions 34：640-43（198 8）を参照のこと。天然血管が開存性を維持する詳細なメカニズムの知識は非常に限られている。正常な血管構造の効果的な機能に関連する主たる学説は、血液界面を担う健康で無傷な血管内皮の必要性を基礎とする。内皮層が除去されると、血管の血栓形成が頻繁に起こる。部分的にこの学説の裏付けとなるのは、内皮がそれと直接接触する血液に対し、独特の凝血阻害効果を有するということを示す数多くの実験である。内皮細胞は、ヘパラン硫酸(heparan sulfate)／アンチトロンビンIII、デルマタン硫酸（dermatan sulfate)／ヘパリン補因子II、トロンボモジュリン／プロテインＣ／プロテインＳ、プロスタサイクリン及び組織型プラスミノーゲンアクチベーターを含む凝血又はフィブリン分解機能をもついく種かの物質を合成又は結合せしめることが示されている。従って、このような実験観察、及び血管系における内皮の血液接触箇所に基づき、全てではないにしても、内皮は血管の抗血栓挙動の主たる要因であることが広く認識されている。例えば、R.G.Petty ら「Endothelium-the Axis of Vascular Health and Disease」，J.Royal Coll. Phys．London 23：92-102（1989）及びR.E.Seharfら「Thrombosis and Atheros clerosis：Regulatory Role of Interactions Among Blood Components and End othelium」Blut 51：31-44（1987）を参照のこと。この概念を裏付けするものとして、内皮下構造体及びその下に広がる構造体が、特に血小板接着及び脱顆粒との関連で血栓形成性であることを示唆している、内皮化されていない血管に対する血液の反応性を調べている数多くの実験が報告されている。これらの所見はin vivo及びin vitro血栓アッセイの双方に由来する。直接内皮下基質層に加えて、より深部の中膜層の中の平滑筋細胞も同様に血栓形成性であると一般に考えられている。例えばS.M.Schwartzら、「The Aortic I ntima：II．Repair of the Aortic Lining After Mechanical Denudation」Am.J .Pathol ．81：15-42（1975)； J.J.Zwaginaら、「Thrombogenicity of Vascu1ar Cells：Comparison between Endothelial Cells Isolated from Different Sou rces and Smooth Muscle Cells and Fibroblastsj Arteriosclerosis 10：437-4 8（1990）を参照のこと。この結論の証拠は、血管平滑筋細胞を含む内皮下細胞の培養物への血漿の添加が迅速な大量凝固を引き起こすことを示す研究から来ている。他方、凝血はその実験を内皮細胞培養物で反復したときは阻害され、これも内皮細胞の抗血栓性の性質を強調している。例えばP.Colburn and V.Buonassi si「Anti-clotting Activity of Endothelial Cell Cultures and Heparan Sulf ate Proteoglycans」Biochem.Biophys.Res.Comm． 104：220-27（1982）；及びI .Vlodavskyら「Platelet Interaction with the Extracellular Matrix Produce d by Cultured Endothelial Cells：A Model to Study the Thrombogenicity of Isolated Subendothelial Basal Lamina」Thromb.Res． 28：179-91（1982）を参照のこと。天然血管機能のこのような観察の広く容認されている解釈は、血管構造の内皮細胞層が抗血栓挙動を担うこと、並びに内皮の下にある内皮下層及び平滑筋細胞が血管崩壊の事態において止血をもたらすよう血栓形成性であることである。合成表面、特に血管移植片に内皮の抗血栓機能を与える試みにおいて、生体部材を利用するほとんどの従来技術の文献は、内皮細胞層を支持するであろう表面を提供することに向けられている事は驚くにはあたらない。例えば、Bellに付与された米国特許第 4,539,716号及び4,546,500号は細胞を添加したコラーゲンゲルを用いて生きた管状補てつ材を構築する方法を開示している。これらの細胞は収縮因子を担い、そして線維芽細胞、平滑筋細胞又は血小板とすると記載されている。動脈の代替品に関し、これらの特許には最内層としての内皮、中間層としての平滑筋細胞、そしてコラーゲン及び線維芽細胞の第３層キャストの利用が記載されている。使用している内皮細胞は特定されていない起源のものである。更に、Turinaらに付与された米国特許第 4,804,381号及び第 4,804,382号には、微孔質又は半透過性の膜より成り、内腔側が血液界面を担う生きた内皮細胞の連続層により覆われ、そして内腔上の生きた細胞の生存率を高め且つ弾性を与えるように外側に平滑筋細胞の層がコーティングされている合成動脈血管が記載されている。いくつかのその他の米国特許、例えばCarabasiらの第 4,883,755号、Smithの第 4,960,423号及びMullerらの第 5,037,378号にも、抗血栓性を供するよう血管界面の生きた内皮細胞被覆を成し遂げる手段が記載されている。これらの手法には内皮細胞の播敷(sodding)、エラスチン誘導ペプチドの利用、及び移植表面に内皮細胞を施用(apply)する簡単な物理手段のそれぞれが含まれる。上記のBellのそれに類似の構造がH.Miwaら「Development of a Hierarchicall y Structured Hybrid Vascular Graft Biomimicking Natural Arteries」ASAIO Journal 39：M273-77（1993）により教示されている。この場合、適用されたＩ型コラーゲン及びデルマタン硫酸グリコサミノグリカンの人工基質中の平滑筋細胞を、DACRON（登録商標）「移植片」の上に積層している。次いで内皮細胞層を血液接触表面を担うようにこの人工基質の上で増殖させている。「血管移植片」の内皮化（endothelialization)へのその他のアプローチは X. Yueら「Smooth Muscle Cell Seeding in Biodegradable Grafts in Rats：A New Method to Enhance the Process of Arterial Wall Regeneration」Surgery 1 03：206-12（1988）により開示されている。これらの著者は、生きたラットの腹大動脈の代替品として利用するための、移植の前に非自系ラット平滑筋細胞を播種しておいた、pre-clottingした多孔質生分解性ポリウレタン「血管移植片」を採用している。この研究は、構造を強化する「ネオメディア（neomedia）」を作製することを試みている。その強化がなければ、その構造は生物分解性移植材料の再収着後に機械的に不十分なものとなるであろう。平滑筋細胞層は、ホストの天然内皮細胞がその上で自発的に再生して「移植」表面を覆うこととなる表面を担う。別の研究において、例えば A.Schneiderらは ePTFE血管移植片上に細胞外基質を生成するために角膜内皮細胞を利用している(A.Schneiderら「An Improved Me thod of Endothelial Seeding on Small Caliber Prosthetic Vascular Grafts Coated with Natural Extracellular Matrix」Clin.Mat． 13：51-55(1993))。細胞外基質の生成後、これらのオリジナル細胞をトリトン X-100及びNH₄OHを用いて除去し、そしてこの管に再びウシの大動脈内皮を播種している。しかしながら、この手法は、ePTFE「移植片」を覆う細胞外基質の上で内皮を有効に増殖させることができることを示したものの、移植研究はなされていない。上記の従来技術文献の全てにおいて、その努力は抗血栓機能を供する生きた内皮細胞層形成を達成せしめることに向けられている。上記の努力にもかかわらず、かなりの欠陥がまだ存在している。例えば、小直径用途又は繊細な領域において用いられている「移植片」においては、ささいな血栓の発生でさえも非常に重大な問題となる。上記の内皮細胞被覆化「移植片」のin vivo性能は非常に多彩であるが、現存の移植片に勝る開存性改善の明瞭な実証はないことにも注目すべきである。従って、本発明の主たる目的は、現存の人工表面及び構造体よりも血栓形成しにくい改善された血液接触表面を提供することにある。本発明の別の目的は、容易に製造及び利用できる人工血液接触表面を提供することにある。本発明の更なる目的は、血液と天然血管構造体との相互作用を支配する今もって未解明のメカニズムを特定すること、改善された血液接触構造体を製造すること、並びにその製造及び使用方法を提供することにある。本発明のこのような目的及びその他の目的は以下の説明を参照することで明らかとなるであろう。発明の概要本発明の人工血管及びその他の移植可能な血液接触装置を含む様々な器具において使用するのに好適な改善された血液接触表面に関する。本発明は合成表面上で選定細胞によりin situで合成された細胞外基質を採用する。驚くべきことに、この細胞外基質の抗血栓特性は天然血管及び臓器に匹敵する。この基質は好ましくは、血管組織由来の細胞を用いて細胞培養により製造する。本法の第１段階においては、同種異系、自系又は異系起源から得た平滑筋細胞 (SMC)を有糸分裂条件下で、まず培養皿の中で増殖させ、次いで補てつ材の意図されている血液接触表面の上で、合成ベース材料の表面の集密被覆がほぼ達成されるまで増殖させる。第２段階において、この平滑筋細胞層の表面に血管表面に由来する内皮細胞を植え付ける。この２タイプの細胞を、細胞外基質が層間にできるまで増殖条件下で補てつ材の表面の上で同時培養増殖させる。この基質は正常な動脈血管において見い出せる内皮下基質の類似体である。第３段階において、この内皮細胞を除去してSMCの上に広がる内皮下基質を露出させる。これは重要な本発明の特徴であり、なぜなら従来技術はこの手法を教示していないからである。前述の背景の章において記載の通り、従来技術は内皮細胞が適当な血液接触表面であると教示している。即ち、本発明の重要な要素は生きた細胞、特に内皮細胞の存在しない直接血液接触表面にある。更に重要な要素は、所望のサイズ及び形状の抗血栓性、非免疫原性血管表面をもたらす内皮下基質類似体のin vitro製造にある。最終段階において、この内皮下基質は必要ならば適当な固定試薬及び滅菌試薬を用いて保存及び滅菌してよい。人工血管は本発明の需要の高い血液界面用途のほんの一例にすぎないことが理解されるであろう。その他の可能な用途には、心臓弁、人工心臓、その他の人工臓器、例えば移植片可能な人工腎臓及びその他の直接血液接触器具が含まれる。本発明は、合成ベース材料、この合成ベース材料に付着した平滑筋細胞の層、及びこの平滑筋細胞層に付着した内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質を含んで成る層を含んで成る血液接触表面に関連し、ここでこの内皮下基質が直接血液接触表面を担っている。図面の説明本発明の実施は、添付図面との関連に考慮しながら以下の説明により明らかとなるであろう。図１は哺乳動物の動脈（10）の透視断面図である。図２は哺乳動物の動脈（10）の縦軸伝いの断面図である。図３は合成ベース材料（24）に適用した平滑筋細胞層（20）の断面図である。図４は合成ベース材料（24）上に載っている平滑筋細胞層（20）に直接適用された内皮細胞層（12）の断面図である。図５は内皮細胞（12）と平滑筋細胞（20）との間に内皮下基質（14）を作り上げた後の図４に示す構造の断面図である。図６は、図５の構造体から内皮細胞層（12）を除去した、本発明の一態様の断面図である。図７は図６に示す本発明の管状態様（26）の図である。図８は、図６に示す構造体を平らなシート状の合成ベース材料（24）の上で成長させた、本発明の一態様の図である。図９は本発明の内皮下基質（14）を採用する心臓弁器具（30）の図である。発明の詳細な説明本発明は人工血管及びその他の血液接触器具において利用するものの如きの改善された血液接触表面に関する。まず最初に、図１及び２は典型的な哺乳動物動脈（10）の構造を示す。動脈（ 10）の構造体は、内皮細胞の最内層を有する内膜（12）、基底膜及びその他の細胞外基質成分より成る内皮下基質層（14）、並びに内部弾性板層（16）より成る。内膜の外側には平滑筋細膜（SMC）（20）より成る内膜層（18）があり、そして最後に線維状結合組織又は外膜層（22）がある。上述の「発明の背景」の章において説明した通り、血液が正常に流れる限り、内皮細胞層（12）は血液接触表面を担い、従って抗血栓性でなくてはならない。一方、血管が損傷したときは、血管からの血液漏出を防ぐために血栓が形成されることは重要である。これに関連して、内皮細胞層の下の構造体は、その内皮細胞層のどこかが傷ついたときに凝血を促進させるよう血栓形成性であることで一般に受け入れられている。血管開存性に関する従来技術における従来の実体的な証拠と異なり、血管の抗血栓挙動に寄与する生きた内皮とは独立したメカニズムがあることが発見された。驚くべきことに、このメカニズムの場所は天然血管の直接血液接触表面ではなく、内皮層の内側にある。この抗血栓メカニズムは、従来技術においては血栓形成性であると報告されてきた内皮下細胞外基質に依存する。本発明は、合成材料に実質的に非血栓性の血液界面を供するためにin vitroにおいて生きた血管細胞により合成した内皮下基質の類似体を利用する。この内皮下基質は好ましくは一定時間合成ベース材料上で基質細胞層をまず培養することにより作られる。この基質細胞層は平滑筋細胞(SMC)より成ることが好ましく、そして最も好ましくは血管平滑筋細胞（VSMC）より成る。基質細胞層ができたら、通常の血管細胞関係を再構成するため、好ましくは血管起源の内皮細胞（EC）を植え付ける。SMC及びECの双方がin situで内皮下層を合成するのに十分な培養時間を経た後、合成ベース材料のSMCに覆いかぶさった内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質層が残るようにしてECを特異的に除去する。この処理の目的は、内皮細胞を除去し、しかもその下に広がる細胞外基質の抗血栓特性を保存することにある。培養表面から細胞を除去するために一般的に用いられている数多くの方法が注目の層を崩壊せしめることが認識されるであろう。内皮下基質層を改変する処理には、酵素、例えばトリプシンもしくはディスパーゼへの曝露、又は界面活性剤、例えばトリトンX-100もしくはドデシル硫酸ナトリウムへの曝露が含まれる。次いで複合「移植片」は、免疫原性を最小限とし、且つ「移植片」の直接血液接触表面を担うであろう内皮下基質層を保存させるよう、好ましくはグルタルアルデヒドを用いる固定段階により安定化させることができる。本明細書における「保存内皮下基質層」なる語は、基質を化学的に安定化させ、それ故内皮下基質層を直接血液接触表面として保存させるように固定溶液、例えばグルタルアルデヒドにより処理された内皮下基質層を意味する。以下の実施例は「血管移植」補てつ材に特定されているが、人工血管は本発明の需要の高い血液界面用途のほんの一例にすぎないことが理解されるであろう。本発明を適用できるその他の用途には、とりわけ心臓弁、人工心臓及び人工臓器、例えば移植可能な人工腎臓が含まれる。以下により詳しく説明する通り、直接血液接触表面としての内皮下基質の利用は、実質的に抗血栓性である血液接触表面を作るうえでの従来技術の数多くの欠点を解消することが示された。第１に、天然内皮下基質層の利用は、現状有用な補てつ「移植片」よりも血栓形成及びその他の問題の生ずる傾向が低い。このことは、かかる「移植片」を小口径移植片及び血栓不良を特に起こしがちなその他の用途において利用できるようにする。第２に、人工「移植片」の製造において、実質的に抗血栓性な表面としての天然内皮下基質層の提供は、内皮化表面を有する補てつ材の提供の必要性をなくさせる。in vitro内皮下基質の調製及び利用本発明において利用するための内皮下基質の起源はin vitro組織培養法に基づく。抗血栓能を供する正確な構成要素はいまだ完全に理解されていないが、基質を大量スケールベースで生産する望みをもたせる技術が開発されている。内皮下基質の自然発生は内皮細胞（12）と平滑筋細胞（20）との相互作用の結果のようである。事実、特に有効な血液接触表面は、平滑筋細胞層と内皮細胞層とを組織培養物の中で同時培養し、この同時培養層の間に内皮下基質層を形成させることにより生体外で作製できうることがわかった。これに関する一の方法の段階を図３〜６に例示する。本法における第１段階は、平滑筋細胞層を支持する合成ベース材料の調製を包括する。この好適なベース材料は合成多孔質延伸膨張ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)「移植」材料、例えばW.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ より名称GORE-TEX（登録商標）「血管移植片」で商業的に入手できるものより成る。以下の説明の中で用いている内径４mmの「血管移植片」はこの供給元から得られる商業的に入手可能な製品である。以下の説明の中で用いている内径2.5mm のePTFEチューブは、引用することで本明細書に組入れるGoreの米国特許第 3,95 3,566号の中に教示されているCD123PTFE樹脂ファインパウダー（ICI Americas）より構築されたものである。これらのチューブを伸長により延伸して28μｍの平均フィブリル長にする。本用途にとっては約60μｍ未満のフィブリル長が好ましい。最終チューブは約2.5mmの内径及び約0.33mmの壁厚を有する。上記の通りに製造した多孔質延伸膨張PTFEチューブのフィブリルの長さは、延伸方向においてフィブリルにより接続された接続点間の10回の測定値の平均として本明細書において定義する。10回の測定は以下のようにして行った。第１に、サンプル表面の代表的な部分の顕微鏡写真を、写真の縦方向においてフィブリルが連続して少なくとも５本示されるのに適当な倍率で作製する。顕微鏡写真の縦方向を横断する２本の平行線を引いてその写真を３等分の領域に分割し、フィブリルの延伸方向及び配向方向に対して平行な方向で線分を引く。左側から右側にかけて測定して、写真の上部の線分に沿って、写真の左端付近の線分と交差する最初の接続点から始め、線分と交差する連続している接続点へと続けてフィブリル長の５回の測定を行った。別の線分に沿って更に５回の測定を、写真の右手側の線分を交差する最初の接続点から始め、右側から左側に向って行った。この方法により得た10回の測定値を平均して、この材料のフィブリル長を得た。その他の合成ベース材料には限定することなく以下のものが含まれる：多孔質 PTFE、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリウレタン及びポリジメチルシロキサン。本発明に適当な合成ベース材料は以下のようにして更に調製した。市販の直径４mmのGORE-TEX（登録商標）「血管移植片」（W.L.Gore & Associates，Inc.，F lagstaff，AZ）及び測定内径2.5mmのePTFEチューブを長さ７cmに切り、そしてこの「移植片」の近位及び遠位末端の双方をシリンジ継手（フィッティング）に縛りつけた。次いで各「移植片」をステンレススチール製ワイヤーホルダーに取り付け、そして移植片の遠位末端にあるコネクターの中にプラグを差し込んだ。スチーム滅菌の後、この「移植片」は、通常は疎水性であるePTFEを100％のエタノールで濡らすことによって細胞播種の用意を整えておいた。「移植片」の間隙の中のエタノールを、近位コネクターに取り付けたシリンジを用いて約80〜100 ml のハンク平衡塩溶液（HBSS）（Gibco BRL，Grand Island，NY）と置換した。濡れた「移植片」を、平滑筋細胞による細胞播種のために用いるまでHBSSの中で保存した。ベース材料チューブの用意ができたら、SMC（20）を合成ベース材料（24）の内腔面に施用(apply)し、図３に示す構造集成体を作る。好適な方法は、ベース材料の内腔面の上にSMCを付与するように「移植片」の壁にSMCGMを押し通す陽圧の利用である。SMCをベース材料に施用(apply)するためのその他の適当な手段には、限定することなく、ベース材料チューブ内腔をSMC懸濁物で充填し、次いでその表面にSMCが均一に沈降するように一連の「移植片」回転を行うこと；SMCを支持体上に吸引する陰圧の利用；及び化学走性試薬の利用；が含まれる。例えば、いくつかの実験において、VSMCを入手し、そして以下のようにして合成ベース材料に施用(apply)した。血管SMCはグレイハウンド犬より得た頚動脈又は大腿動脈の３〜４cmの切片を低温無菌メディウム199及び50μｇ／mlのゲンタマイシン(Gibco BRL)を含むチューブの中に入れることにより単離した。層流フードの中で、動脈を縦切りにし、そしてその内腔面を無菌紙タオルでまずこすり、次いで10号のメスでかきとることにより内皮細胞を除去した。動脈中膜の薄いストリップをピンセットではがし、そして無菌ペトリ皿中のHBSSのたまりの中にプールした。次いでこのストリップを1.5mlの平滑筋細胞増殖培地(SMCGM；43％のダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）；43％のメディウム199；13％の胎児牛血清；２mMのグルタミン；15単位／mlのヘパリン；23μｇ／mlのゲンタマイシン；及び12.5μｇ／mlの内皮細胞成長補助剤(Collaborative Biomedical Products ，Bedford，MA))を含む25cm²の組織培養フラスコの中に入れた。このフラスコの中の培養培地を、組織片からの細胞の有意な成長が観察されたとき交換した。次いでT-25フラスコ中の細胞の数に応じて、細胞に週２回３〜５mlの栄養供給を与えた。細胞は一般に集密度約60〜90％のときに継代し、そして通常約１：４に分割する。平滑筋細胞のタイプは形態学基準、アルファー平滑筋細胞アクチンの陽性染色、及び内皮細胞（EC）夾雑を示唆するであろうアセチル化低密度リポタンパク質の取込みの欠如により確認した。「移植片」−播種目的のため、半集密VSMC培養物（約３〜15回継代）をカルシウム・マグネシウム無含有HBSS（CMF-HBSS）で軽くすすぎ、そしてCMF-HBSSの中で約３〜約５分洗った。フラスコから細胞をはがすのにトリプシン−エチレンジアミン四酢酸（トリプシン−EDTA）を用いて細胞を、回収し、次いでトリプシンをSMCGMにより中和した。細胞を約300×ｇで約５分の遠心分離によりペレット化し、そしてそのペレットをヘマサイトメーターを用いる細胞計数のためにSMCGM の中に再懸濁させた。遠心分離の後、この細胞ペレットをSMCGMの中で６〜８ml 当り約2.5〜6.0×10⁶細胞の最終濃度で再懸濁し、そして「移植片」への播種の準備のためにシリンジの中に移し入れた。2.5mmの内径を有する「移植片」は、７cm「移植片」あたり、約2.5〜3.5×10⁶細胞を含む約６mlのSMCGMによって播種し、内径40mmの「移植片」は７cmの「移植片」あたり約４.0〜6.0×10⁶細胞を含む約８mlのSMCGMによって播種した。「移植片」の平滑筋細胞播種は、SMC−含有シリンジを濡れた「移植片」の近位コネクターに取り付け、次いで細胞懸濁物を「移植片」内に静かに注入し、培養液をベース材料「移植片」の壁を通過させることにより行った。次いで近位側の継手は密栓し、そしてその平滑筋細胞を播種した「移植片」をSMCGMで満たされた16mmの培養試験管の中に、その移植片が試験管の中でころがることを防ぐようにくさび留めして入れた。この培養試験管を固くキャップ締めし、そして約37 ℃のインキュベーター内の約10〜50回転／時間で回転するローラー装置上に置いた。この培養試験管中の培地を週２回以上交換し、そして更なる処理又は内皮細胞の添加まで最低約10日間培養した。合成ベース材料（24）に接着した平滑筋細胞20の支持体に付着した内皮細胞の層（12）を図４に示す。この構造体は様々な方法で作ることができ、好適な方法は、内皮細胞の単独細胞懸濁物を作り、移植片の内腔をこの懸濁物で充填し、そして内皮細胞をSMC表面上に付着、増殖及び伸展させて実質的に集密な内皮細胞層を形成させることである。他方、内皮細胞の小さなパッチをドナー血管から直接獲得し、そしてそのパッチを移植片の内腔に播種して付着及び繁殖させ、SMC 層を覆うようにさせることができうる。内皮細胞（EC）を単離するための一の方法は、犬から得た動脈又は静脈血管からECを遊離させる酵素的手法の利用によった。層流フードの中で血管の内腔にカニューレ挿入を施し、HBSSですすぎ、そしてCMF-HBSS中の内皮細胞回収用酵素溶液（例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン等）で37℃で約15分充填させた。内皮細胞を滅菌遠沈管の中にフラッシングし、そしてECを300×ｇで５分かけてペレット化した。次いで細胞をT-25組織培養フラスコ上にまき、そしてほぼ集密となるまで37℃で増殖させ、次いで継代培養した。内皮細胞のタイプは形態学的基準、第VIII因子についての陽性染色、及びアセチル化低密度リポタンパク質の取込みにより確認した。「移植片」一播種目的のため、半集密内皮細胞（約２〜10回継代培養）をCMF- HBSSで軽くすすぎ、そしてCMF-HBSSの中で約５分洗った。細胞を、フラスコから細胞を遊離するトリプシン−EDTAを用いることにより回収し、次いで完全内皮細胞増殖培地（ECGM；80％のメディウム199、16％の胎児牛血清、２mMのグルタミン、15単位／ mlのヘパリン、25μｇ／mlのゲンタマイシン、12.5μｇ／mlの内皮細胞増殖補助剤(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)）によりトリプシン中和にかけた。細胞を300×ｇで約５分かけてペレット化し、そしてそのペレットを1 .1〜1.3×10⁶細胞／mlの最終濃度でECGMの中に再懸濁した。この細胞懸濁物をシリンジの中に移し入れた。予め播種を施したSMC−「移植片」（上記に詳細）を、両端の密栓を外し、そして「移植片」の内腔をHBSSで軽くすすぐことにより、内皮細胞播種のために用意した。次いで内皮細胞懸濁物を含むシリンジをSMC−「移植片」の近位コネクターに付け、そして「移植片」の内腔を液体がその「移植片」の壁を通過することなく細胞懸濁物で充填させた。シリンジ継手に密栓し、そして「移植片」をEC GMで充填した16mmの培養試験管に入れた。「移植片」を試験管の中にくさび留めし、それらが培養試験管と独立して回転できないようにさせた。図４に示す合成ベース材料（24）上の内皮細胞（12）及び平滑筋細胞（20）の複合構造体ができたら、それを培養する。以下の培養条件が有効であることが実証された。培養試験管を約10〜50回転／時間で回転するローラー装置において約 37℃でインキュベートした。培養試験管中の培地は、ECを成長させるために約７日間当りECGMで週２回以上交換し、次いで培養期間（最低約１０日間の全培養期間）の残りの間SMCGMに切換えた。培養後、内皮細胞（12）と平滑筋細胞（20）との間に内皮下基質の層（14）が図５に示すような態様で形成されるであろう。一般に内皮下基質層は厚さが約１ μｍ未満である。適当な内皮下基質層（14）が構成されたら、内皮細胞（12）層を、例えば以下の方法のいづれかを通じて除去する。好ましくは、内皮細胞は「移植片」をHBSSで約３回すすぎ、内皮化表面を剥離溶液、例えば約0.025Ｍの濃度の水酸化アンモニウム(NH₄OH)溶液の中で約４〜4.5分すすぎ、次いでHBSSの中で約３回再びすすぐことにより除去する。その他の適当な処理には約0.01〜約0.5 Ｍの濃度のNH₄OH曲による約30秒〜約60分の処理が含まれる。内皮細胞を除去するその他の考えられる有効な方法には風乾、又はその他の剥離溶液、例えばクロロホルム、メタノール、水酸化ナトリウムもしくは塩化ナトリウムの単独又は組合せ溶液による処理が含まれる。当業者に公知のその他の処理も適当でありうる。細胞層が除去できると、その表面は図６に示す構造を帯びる。図７は本発明の一の態様の状「移植片」形態26の構造を示す。以上のようにして処理した代表的なサンプルの走査電子顕微鏡観察は、元の内皮のほぼ完全な消失及び内皮下基質層の維持を確証せしめた。本発明の目的にとっては、内皮下基質層からの約80％以上の量の元の内皮の除去が、内皮下基質層を実質的にドナー内皮細胞のない層にするものと考えられると解される。内皮細胞の除去後に露出した内皮下基質類似体は数多くの細胞外基質成分を含む。免疫化学アッセイを利用し、この基質は硫酸コンドロイチンプロテオグリカン類(chordroitin sulfate proteoglycans)、コラーゲンＩ、コラーゲンIII、コラーゲンIV、エラスチン及びフィブロネクチンを含むことがわかり、それらは全て露出した血液接触表面の上及び「移植片」壁の内部の中の双方に存在する。更に、ラミニンが内皮下基質血液接触表面の豊富な成分であり、そして「移植片」の壁の中には少ない割合で存在している。 EC除去の後、この「移植片」を固定試薬で処理し、内皮下基質層を保存させ、免疫原性を低め、そして「移植片」を滅菌してよい。この固定は「移植片」を固定溶液、例えば適当な緩衝液中の約0.1〜2.5％の濃度のグルタルアルデヒドの中で利用するグルタルアルデヒドの濃度に依存して約１〜72時間入れておくことにより成し遂げられる。適当な緩衝液にはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸(HEPES)、酢酸塩、２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(MES)、３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸（MOPS）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、リン酸塩等が含まれうる。その他の固定試薬、例えばホルムアルデヒド、ジアルデヒドデンプン類、エタノール及びポリエポキシ化合物も適当でありうる。他方、内皮下基質は固定することなく用いてよい。好適な態様において、「移植片」の内皮下基質層は20mMのHEPES緩衝液中の約0 .5％以上のグルタルアルデヒドの中で最低約２時間かけて固定する。固定した「移植片」を滅菌食塩水で３回すすぎ、そして新鮮な滅菌食塩水の中で最低約24時間洗い、次いで約４℃で保存する。その他の固定試薬、例えばホルムアルデヒドを滅菌を確実にするためにグルタルアルデヒドに加えて用いてよい。この段階で、内皮下基質14の利用に関するいくつかのオプションがある。内皮下基質（14）の抗血栓性により、管状「移植」構造体を実質的に図７に示す通りに移植することが可能である。他方、内皮下基質層を除去し、そしてin vivoの負傷血管に直接適用してよい。更に、同種異系細胞の場合、移植片は細胞が生存状態のまま移植してよい。また、様々なその他の方法を通じて内皮下基質層を作ることが可能である。例えば、一の適当な方法は、ECとSMCとを１：10〜１：１の比(EC：SMC)で組合せ、そして両タイプの細胞を同時に合成ベース材料上に播種する複合培養物播種を包括する。培養物に入れた場合、ECは内腔表面の上で集密な単層を形成し、正常なECとSMCとの関係を再構成するようになるであろう。長い同時培養を経て、細胞層の間に内皮下基質が生成する。次いでこの内皮下基質層を上記に概略した通りに曝露し、そして処理してよい。本発明の内皮下基質層の製造における基質細胞層としてVSMCが好適であるが、類似の機能を供するためにその他のタイプの細胞を使用することが可能であることが理解される。このその他の潜在的なタイプの細胞は線維芽細胞やその他の場合と同じく、消化系又は尿管に由来する平滑筋細胞である。その他の生きていないベース材料の利用を通じて本発明に利用するのに適当な内皮下基質層を作ることも可能である。その材料に対しては、内皮下基質層は付加した内皮細胞層により形成されうる。更に、血管内皮細胞が好適な態様であるが、VSMC，SMC、線維芽細胞又はその他の類似のタイプの細胞と一緒に内皮下基質層を作ることも可能でありうる。このようなタイプの細胞には、例えば微小血管内皮細胞、角膜内皮、糸球体内皮及び中皮細胞がとりわけ含まれうる。本発明は特定の血液界面用途に依存して様々な物理形態において製造できうる。図８の構造体において示す通り、合成ベース材料（24）の上のSMC層（20）の上に内皮下基質14を平らなシート状（28）で作り上げることが可能である。図９に示す本発明のその他の用途は心臓弁（30）の表面上の内皮下基質層（14）の利用を含む。本発明の範囲を限定することなく、以下の実施例は本発明をいかにして作り及び利用するかを例示している。実施例例１以下は移植研究において同一の直径のePTFE「移植片」（コントロール「移植片」）と比較した本発明の「移植片」（発明「移植片」）の例である。発明「移植片」を上記の詳細な説明に記載の通りにして製造した。簡単には、内皮細胞（EC）を血管平滑筋細胞で被覆した(VSMC被覆した)2.5mmのePTFEチューブ上に藩種し、そして同時に最低10日間培養した。発明「移植片」を次に0.25 ＭのNH₄OHで30秒処理して内皮細胞を除去し、そしてHBSSによるフラッシングによりすすいだ。すすぎ後、発明「移植片」を0.2Ｍのソレンソンリン酸緩衝液（p H 7.0）の中の2.5％のグルタルアルデヒドで２時間固定した。固定後、この「移植片」を滅菌標準食塩水を２回交換してすすぎ、そして移植のために必要となるまで滅菌標準食塩水の中で４℃で保存した。発明及びコントロール「移植片」を、直径2.5mmの30μｍのePTFEチューブより成るコントロール「移植片」を用いて試験対としてグレイハンウド犬の上腕動脈に移植した。片方の上腕動脈には発明「移植片」を受容させ、そして反対側の上腕移植片には30μｍのｅPTFEコントロール移植片を受容させた。長さ2.5cmの移植片を標準の端−端匆合外科手技を用いて移植した。抗凝血剤又は抗血小板剤は全く投与しなかった。各犬をドップラー超音波二重スキャナーを用い、術後の最初の２週間は毎日、その後は毎週追跡した。不明瞭な超音波結果の事態においては開存状態を決定するために血管造影法も採用した。１ヶ月目に、発明「移植片」は６例のうち３例（３／６）において開存性であり、そしてePTFE移植片は６例のうち０例（０／６）において開存性であることが見い出された。まとめると、発明「移植片」は同一の直径のコントロールePTFE「移植片」と比べて改善された開存性能を示した。例２本例は上記の例１に記載とは別の本発明の「移植片」を組立てる方法の例である。血管SMC及びECの個々の培養物を「移植片」の製造のため、増殖培地の除去、CMF-HBSSによる細胞のすすぎ及びCMF-HBSS中での細胞の約３〜５分間の洗浄により回収した。次いでCMF-HBSSを取り除き、そして1.5〜3.0mlのトリプシン−EDTA（フラスコのサイズに依存して）を加えてフラスコから細胞を遊離させた。完全SMCGMをトリプシンの失活のために個々のフラスコに加え、そして細胞を分離し、そして300×ｇで５分の遠心分離によりペレットにした。上澄液を捨て、細胞をSMCGMの中に再懸濁し、細胞計数を行い、そして細胞の２回目のペレット化を行った。最終的な個々のSMC及びEC細胞ペレットをSMCGMの中に約１×10⁶細胞／mlの濃度で再懸濁した。これらのタイプの細胞を１：９，１：４及び１：２のEC：SMC比で混合した。内径2.5mm及びフィブリル長30μｍの多孔質ePTFEチューブより成る合成ベース材料を７cmに切り、そしてシリンジコネクター継手に付けた。チューブの遠位末端上にポリプロピレン製密栓を差し込んだ。PTFEを100％のエタノールで濡らした。次いでこのアルコールを、チューブを加圧にかけ、HBSSを多孔質チューブ壁から押し出すことによりHBSS溶液と置換した。この濡れたチューブを血管細胞を植え付けるまでHBSSの中で保存した。発明移植片に平滑筋細胞及び内皮細胞を、陽圧を用い、2.5〜3.5×10⁶細胞の混合物SMC-EC懸濁物をシリンジの中の全容量約６mlのSMCGMの中に入れることにより、播種した。直径2.5mmの発明「移植片」は７cmの「移植片」あたり2.5〜3. 5×10⁶細胞／で播種を施した。細胞懸濁物を含むシリンジを「移植片」上の近位シリンジコネクターに取り付け、そして細胞混合物を陽圧を用い、その培養液を「移植片」の壁を通過させて「移植片」の内腔表面の上に細胞を載せるように静かに注入した。細胞を「移植片」の中に入れた後、第２のポリプロピレン製密栓を開放したコネクターに取り付け、「移植片」の内腔空間中の細胞を封入した。発明の播種「移植片」をSMCGMで充填した16mmの培養試験管に入れた。この「移植片」を培養試験管にくさび留めし、キャップ締めし、そして37℃のインキュベーター内の約10回転／時間で回転するローラー装置に載せた。播種の「移植片」を７〜10日間培養し、新鮮な培地供給を２〜４日毎に施した。この培養期間の間、内皮細胞はSMCから分離し、SMCの上に集密EC単層を形成した。走査電子顕微鏡分析及びアセチル化低密度リポタンパク質染色を、「移植片」の内腔面上のEC の存在を確認するために用いた。発明「移植片」をHBSSで３回すすぎ、そして内腔を0.025又は0.25ＭのNH₄OHでそれぞれ4.5及び3.5分処理してECを除去した。「移植片」をHBSSですすぎ、0.25 ％のグルタルアルデヒドで23℃で24時間固定し、次いで滅菌標準食塩水の中でよく洗った。これは上記の例１において作られたものと類似の内皮下基質層の生成をもたらした。例３以下は線維芽細胞の支持層を用いて本発明をいかにして実施するかの例である。30μｍのePTFEベースチューブを100％のエタノールで濡らし、そしてHBSSをフラッシングしてエタノールを移植片の間隙から置換した。次に犬の包皮線維芽細胞を集め、そして陽圧を用いて細胞を「移植片」の壁の内腔に押し付けるようにして「移植片」の表面に施用(apply)した。次いでその「移植片」を培養物の中に約10〜14日間入れておいた。この後、内皮細胞を線維芽基質表面の上に、その「移植片」の内腔をECGM中約1.1〜1.3×10⁶細胞／１ml濃度の内皮細胞懸濁物で充填することにより、播種した。この「移植片」を培養試験管の中にくさび留めし、そして37℃のインキュベーターの中のローラー装置上に10日以上載せ、内皮細胞が単層を成し、そして確実に付着するようにさせた。内皮細胞被覆はアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みの観察により確認した。内皮下基質層を供するための内皮細胞−線維芽細胞同時培養の終了の後、内皮細胞を剥離溶液による処理により選択的に除去した。内皮細胞を除去した後、この「移植片」をグルタルアルデヒドの中で固定して、内皮下細胞基質を保存、滅菌及び安定化させた。固定後、この移植片を滅菌食塩水溶液でよく洗い、そして使用するまでその中で保存した。本発明の特定の態様を本明細書の中で例示及び説明したきたが、本発明はかかる例示及び説明に限定されるべきものではない。変更及び改良は請求の範囲における本発明の一部に組込まれ、且つ具体化されうることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベゴバック，ポールシー. アメリカ合衆国，アリゾナ 86004，フラッグスタッフ，イーストレインジレーン 3901

Claims

【特許請求の範囲】１．血液接触表面であって：合成ベース材料；この合成ベース材料に付着した第１細胞層；及びこの第１細胞層に付着した第２層；を含んで成り、ここでこの第２層が内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質を含んで成る、この内皮下基質層が直接血液接触表面を担う、前記血液接触表面。２．前記第１層が線維芽細胞を含んで成る、請求項１記載の血液接触表面。３．前記第１層が平滑筋細胞を含んで成る、請求項１記載の血液接触表面。４．前記平滑筋細胞が血管平滑筋細胞である、請求項３記載の血液接触表面。５．前記第２層が保存されている、請求項１記載の血液接触表面。６．前記表面が以下の工程：ａ）前記合成ベース材料上で平滑筋細胞の第１層を培養する；ｂ）前記平滑筋細胞の第１層の上で内皮細胞層を培養する、ここでこの平滑筋細胞と内皮細胞との相互作用は内皮下基質層を形成する；ｃ）前記内皮下基質層から内皮細胞層を剥離し、内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質層を含んで成る第２層を生成する；そしてｄ）前記第２層を直接血液接触表面として利用する；を通じて形成されるものである、請求項１記載の血液接触表面。７．前記の段階ｃ）とｄ）との間に、ｃ．１）前記平滑筋細胞から前記第２層を除去する；そしてｃ．２）直接血液接触表面として利用するため、前記第２層を別の合成ベース材料又は受容側の血管組織に施用(apply)する；ことを更に含んで成る、請求項６記載の方法。８．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、フッ化エチレンプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びシロキサンより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項６記載の方法。９．前記内皮細胞層を剥離溶液により処理することによって前記内皮下基質層から前記内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項６記載の方法。 10．前記剥離溶液が水酸化アンモニウム、クロロホルム、メタノール及び塩化ナトリウムより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項９記載の方法。 11．前記表面が以下の工程：ａ）前記合成ベース材料上で平滑筋細胞の第１層を培養する；ｂ）前記平滑筋細胞の第１層の上で内皮細胞層を培養する、ここでこの平滑筋細胞と内皮細胞との相互作用は内皮下基質層を形成する；ｃ）前記内皮下基質層から内皮細胞層を剥離し、内皮細胞を実質的に含まない内皮下基質層を含んで成る第２層を生成する；ｄ）前記第２層を保存する；そしてｅ）前記保存第２層を直接血液接触表面として利用する；を通じて形成されるものである、請求項１記載の血液接触表面。 12．前記の段階ｃ）とｄ）との間に、ｃ．１）前記平滑筋細胞から前記第２層を除去する；そしてｃ．２）直接血液接触表面として利用するため、前記第２層を別の合成ベース材料又は受容側の血管組織に施用(apply)する；ことを更に含んで成る、請求項11記載の方法。 13．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、フッ化エチレンプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びシロキサンより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項11記載の方法。 14．前記内皮細胞層を剥離溶液により処理することによって前記内皮下基質層から前記内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項11記載の方法。 15．前記剥離溶液が水酸化アンモニウム、クロロホルム、メタノール及び塩化ナトリウムより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項14記載の方法。 16．前記合成ベース材料が、前記第１層を付着せしめるポリマー材料を含んで成る、請求項１記載の血液接触表面。 17．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、フッ化エチレンプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びシロキサンより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項16記載の血液接触表面。 18．前記合成ベース材料が延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンを含んで成る、請求項16記載の血液接触表面。 19．前記延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンが約60μｍ未満の平均フィブリル長をもつ微細構造をとっている、請求項18記載の血液接触表面。 20．前記合成ベース材料が外側と内側とを有するチューブを含んで成り；ここで前記第１層はこのチューブの内側に付着しており；そして前記第２層はこの第１層に付着され、カバーを形成している、請求項１記載の血液接触表面。 21．前記チューブが移植可能な器具として働くように内皮下基質層を有する、請求項20記載の血液接触表面。 22．前記合成ベース材料が、前記第１層を付着せしめるポリマー材料を含んで成る、請求項５記載の血液接触表面。 23．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、フッ化エチレンプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びシロキサンより成る群のうちの少なくとも一種より選ばれる、請求項22記載の血液接触表面。 24．前記合成ベース材料が延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンを含んで成る、請求項22記載の血液接触表面。 25．前記延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンが約60μｍ未満の平均フィブリル長をもつ微細構造をとっている、請求項24記載の血液接触表面。 26．前記合成ベース材料が外側と内側とを有するチューブを含んで成り；ここで前記第１層はこのチューブの内側に付着しており；そして前記第２層はこの第１層に付着され、カバーを形成している、請求項５記載の血液接触表面。 27．前記チューブが移植可能な器具として働くように内皮下基質層を有する、請求項５記載の血液接触表面。 28．前記第２層がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類(chondroitin sulfa te proteoglycans)、コラーゲンＩ、コラーゲンIII、コラーゲンIV、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンより成る群における少なくとも一種のタンパク質を含んで成る、請求項１記載の血液接触表面。 29．前記保存第２層がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類、コラーゲンＩ、コラーゲンIII、コラーゲンIV、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンより成る群における少なくとも一種のタンパク質を含んで成る、請求項１記載の血液接触表面。 30．直接血液接触表面を製造するための方法であって：ａ）平滑筋細胞層を用意する；ｂ）前記平滑筋細胞層の上で内皮細胞層を培養する；ｃ）前記平滑筋細胞と内皮細胞との間に内皮下基質層を形成させる；ｄ）前記内皮細胞層を剥離して内皮下基質層を露出させる；そしてｅ）直接血液接触表面としてこの内皮下基質を利用する；ことを含んで成る方法。 31．前記の段階ｄ）とｅ）との間に：ｄ．１）前記内皮下基質層を管状器具に成形し、前記内皮下基質層が血液の流れる器具の内管を構成するようにさせることを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 32．剥離溶液による処理によって前記内皮細胞層を剥離することを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 33．前記剥離溶液が約0.01Ｍ〜約0.5Ｍに範囲する濃度の水酸化アンモニウム水性剥離溶液を含んで成る、請求項32記載の方法。 34．前記内皮細胞層の凍結−融解処理により前記内皮細胞層を剥離する、請求項30記載の方法。 35．前記内皮細胞層の風乾処理により前記内皮細胞層を剥離する、請求項30記載の方法。 36．前記の段階ｄ）とｅ）との間に：ｄ．２）前記平滑筋細胞層から前記内皮下基質層を除去する；ｄ．３）この内皮下基質層を器具の上に施用(apply)し、その上で直接血液接触表面として働くようにさせる；ことを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 37．前記の段階ｄ）とｅ）との間に：ｄ．４）前記の露出した内皮下基質層を保存する；そしてｄ．５）この保存内皮下基質層を直接血液接触表面として利用する；ことを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 38．前記の段階ｄ）とｅ）との間に：ｄ．６）前記内皮下基質層を固定溶液により処理して前記内皮下基質層を保存させることを更に含んで成る、請求項30記載の方法。 39．前記固定溶液がエタノールである、請求項38記載の方法。 40．前記固定溶液がグルタルアルデヒドである、請求項38記載の方法。 41．前記露出内皮下基質層を保存する前に、前記平滑筋細胞層から前記内皮下基質層を除去する；そしてこの内皮下基質層を器具に施用(apply)して、その上で直接血液接触表面として働くようにさせる；ことを更に含んで成る、請求項37記載の方法。 42．少なくとも一面の血液接触表面を有する移植可能な材料を作るための方法であって：ａ）血管から血管平滑筋細胞を用意する；ｂ）この血管平滑筋細胞を合成ベース材料の表面の上に載せ、血管平滑筋細胞のコーティングを形成する；ｃ）内皮細胞をこの血管平滑筋細胞のコーティングに適用してこの血管平滑筋細胞上に内皮細胞層を形成する；ｄ）この内皮細胞層と血管平滑筋細胞コーティングとの間に内皮下基質層を培養させる；ｅ）前記内皮細胞層を除去して前記内皮下基質層を露出させ、この内皮下基質層が直接血液接触表面として利用されるのに適当なものである；ことを含んで成る方法。 43．血管平滑筋細胞のコーティング及びそれに適用された内皮下基質層を有する合成ベース材料を、その内皮下基質層が直接血液接触表面として配置されるように移植することを更に含んで成る、請求項42記載の方法。 44．前記内皮下基質層を除去し、そしてその内皮下基質層を別の合成ベース材料の表面に施用(apply)することを更に含んで成る、請求項42記載の方法。 45．管状形態、シート形態、球状形態及び中空容器形態より成る群から選ばれる形態の合成ベース材料を用意することを更に含んで成る、請求項42記載の方法。 46．多孔質ポリテトラフルオロエチレンの形態の合成ベース材料を用意することを更に含んで成る、請求項45記載の方法。 47．前記血管平滑筋細胞を多孔質ポリテトラフルオロエチレンのチューブの表面の上で培養することを更に含んで成る、請求項42記載の方法。 48．前記血管平滑筋細胞を多孔質ポリテトラフルオロエチレンのシートの表面の上で培養することを更に含んで成る、請求項42記載の方法。 49．内皮下基質層を保存することを更に含んで成り、ここでこの保存内皮下基質層は直接血液接触表面として使用するのに適当なものである、請求項42記載の方法。 50．前記平滑筋細胞のコーティング及びそれに適用された内皮下基質層を有する合成ベース材料を、その内皮下基質層が直接血液接触表面として配置されるように移植することを更に含んで成る、請求項49記載の方法。 51．前記内皮下基質層を除去し、そしてその内皮下基質層を別の合成ベース材料の表面に適用することを更に含んで成る、請求項49記載の方法。 52．直接血液接触表面であって：コンドロイチン硫酸プロテオグリカン類、コラーゲンＩ、コラーゲンIII、コラーゲンIV、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンより成る群における少なくとも一種のタンパク質を含む内皮下基質層；並びにこの内皮下基質層の付着した合成ベース材料；を含んで成り、ここでこの内皮下基質が直接血液接触表面を担っている、前記直接血液接触表面。 53．前記合成ベース材料がポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、フッ化エチレンプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びシロキサンより成る群のうちの少なくとも一種から選ばれる、請求項52記載の血液接触表面。 54．前記合成ベース材料が延伸膨張ポリテトラフルオロエチレンを含んで成る、請求項52記載の血液接触表面。 55．前記合成ベース材料が管状構造を構成しており、そしてここで前記内皮下基質層は血液導管にとっての直接血液接触表面を担う前記管状構造の内面を占めている、請求項52記載の血液接触表面。 56．前記合成ベース材料が心臓弁の少なくとも一部を構成しており、そしてここで前記内皮下基質層はこの心臓弁にとっての直接血液接触表面を占めている、請求項52記載の血液接触表面。 57．前記合成ベース材料が柔軟シートを構成しており、そしてここで前記内皮下基質層はこのシートにとっての直接血液接触表面を担うこのシート上の表面を占めている、請求項52記載の血液接触表面。