JPH09512704A

JPH09512704A - シグナル変換経路を調節するための産物および方法

Info

Publication number: JPH09512704A
Application number: JP7524210A
Authority: JP
Inventors: ジヨン・シーキヤンビア，; クリストフアー・エムプレイマン，; マーカス・アールクラーク，
Original assignee: ナシヨナル・ジユーイツシユ・センター・フオー・イミユノロジー・アンド・レスピラトリー・メデイシン
Priority date: 1994-03-17
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1997-12-22
Also published as: AU699662B2; EP0804218A4; EP0804218A1; CA2184631A1; WO1995024915A1; AU2187495A

Abstract

(57)【要約】細胞内のシグナル変換経路を調節するための産物および方法が開示される。本発明のある態様は、チロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびアダプター分子の活性を調節するのに有用な、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフを有するペプチドに関する。本発明の別の態様は、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりチロシンキナーゼによるエフェクターの結合および活性化を遮断しうるペプチドに関与する、細胞内のシグナル変換経路を阻害するための産物および方法に関する。先の化合物およびペプチド組成物の両方共が、一例ではアレルギー応答、自己免疫性疾患、炎症性応答、癌、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、ならびに例えばＥＢＶおよびＢＬＶのようなウイルスにより生じる疾患などの医学的障害の治療に有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】シグナル変換経路を調節するための産物および方法本発明の一部分は、全てｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（米国国立衛生研究所）により与えられたＵＳＰＨＳＧｒａｎｔｓＡＩ２１７６８、ＡＩ２０５１９、ＡＩ２９９０３、およびＤＫ４７１２１による米国政府の援助を得て成された。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。関連出願の相互参照本出願は、１９９４年３月１７日に出願された「ＰｒｏｄｕｃｔａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒＲｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰａｔｈｗａｙｓ」についての米国特許第０８／２１５，１１６号の一部継続出願であり、この特許は引用によりその全てが本明細書に取り込まれる。発明の分野本発明は、チロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびアダプター分子の活性を調節することが可能なペプチドを用いる、細胞内でのシグナル変換経路を調節するための産物および方法に関する。発明の背景全ての多細胞生物では、細胞から細胞へのコミュニケーションは生物体内に含まれる多数のタイプの細胞の増殖、分化、および代謝と同調している。長距離にわたる細胞間のコミュニケーションはシグナル分子として作用する細胞外産物（リガンド）により促進される。シグナル分子はその生物体を通って特異的細胞へと移動して行き、その細胞内ではそのシグナルはそれらのシグナル分子と結合することが可能なレセプターを有する標的細胞にのみ特異的応答を誘導する。レセプターへのシグナル分子の結合はレセプターを保持する細胞内での複雑な細胞内反応を開始させ、その細胞内に存在する分子の改変を開始するか、もしくは遺伝子発現のパターンを変化させることとなり、そのことによりその細胞の生物学的機能の変化がもたらされる。この過程がシグナル変換と称される。細胞内でのシグナル変換ネットワークを調節するための方法を理解および発見することの必要性が長年論じられてきていたにも拘わらず、このようなネットワークが複雑であるがために、疾患に関与するシグナル変換ネットワークを調節するための産物および方法の開発が阻まれてきた。ある蛋白質が標的分子に結合することにより多様な生理学的現象がもたらされることが可能である。蛋白質は標的分子を、例えば：その標的分子のアロステリック変化；その標的分子のリン酸化；もしくは細胞の他の領域へのその標的分子の転移により改変することが可能である。思わぬ発見により得られたことであるが、蛋白質と標的分子との間の結合は例えば、標的分子の活性化の原因であったり、阻害活性の原因であったりする可能性があるため、シグナル変換ネットワークの内のどの特定の段階が特定の生物学的機能を生じる究極的原因となっているのかを予測することが困難となっている。特定の細胞経路がどのように作用し、かつどの分子および／またはそのような分子の機能因子がそのような細胞経路を開始および／または調節する原因となっているのかを解明する必要性自体が残されたままになっている。特に、シグナル変換ネットワークの特異的段階の有効な調節を可能にする産物および方法についての必要性が存在する。シグナル変換ネットワークの特異的段階の調節により細胞内でのシグナル変換の予想可能な制御の実施が可能となり、このことにより細胞のシグナル変換経路に対する異常により生じる様々な疾患の治療が可能となる。発明の要約本発明は一般的にはシグナル変換経路の調節に関し、そしてより具体的には細胞の変換経路の２つの特定の部分に関する。シグナル変換経路内の特定の分子間のこれまで認められてはおらずかつ気づかれていなかった相互作用により、我々は細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および多分化能性幹細胞）の調節を可能にする産物および方法を解明した。その上、本発明により、アレルギー性応答、自己免疫疾患、炎症性応答、癌、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、ならびびにウイルス性疾患（これにはエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）感染（例えば、慢性疲労症候群もしくは感染性単核細胞症）およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染（例えば、Ｂリンパ球の形質転換）が含まれるが、これらには限定されない）を初めとする様々な医学的障害の調節および治療が可能となる。本発明の一つの態様はシグナル変換を調節する方法を含み、その方法は細胞を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというアミノ酸モチーフを有するペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量に接触させることを含む。本発明は更にそのような化合物を含む治療用組成物、ならびにチロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼの活性を測定するための方法と組合わせてそのような化合物を利用するキットに関する。本発明の他の態様はシグナル変換を調節するための方法を含み、その細胞を、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりチロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断することが可能なペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量に接触させることを含む。本発明は更にそのような化合物を含む治療用組成物、ならびにチロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼの活性を測定するための手段をそのような化合物と共に含むキットをも含む。本発明の他の特徴および態様は、以下に提供される図面および詳細な説明の考慮の後には当業者には明白になるであろう。図面の簡単な説明図１は、細胞のシグナル変換経路の概略図である。図２は、レセプター結合の前および後の細胞内反応の概略図である。図３は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフスイッチ突然変異体の図面表示である。図４は、野生型もしくはＩｇ−α／Ｉｇ−βスイッチ突然変異体への蛋白質結合を表す。図５は、ＡＲＨ１ペプチドへの蛋白質結合を表す。図６は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフの点突然変異体の結合活性を表す。図７は、野生型、および３つのチロシンがフェニルアラニンに変化させられたＩｇ−α ＡＲＨ１融合蛋白質への蛋白質結合を表す。図８は、野生型およびＩｇ−αチロシン突然変異化融合蛋白質へのＦｙｎ蛋白質の結合を表す。図９は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフのチロシンリン酸化に対するＦｙｎ結合性を説明する。図１０は、非リン酸化およびリン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドへの蛋白質結合を表す。図１１は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βペプチドのリン酸化に対するＦｙｎの結合性を表す。図１２は、二重にリン酸化されたＩｇ−αおよびＩｇ−βへのＦｙｎ結合を表す。図１３は、リン酸化Ｉｇ−α蛋白質による結合を受けた際のＦｙｎ蛋白質の活性を説明する。図１４は、リン酸化Ｉｇ−αペプチドに結合したＦｙｎ蛋白質の比活性を説明する。図１５は、ＬｙｎおよびＦｙｎ蛋白質による２つの高プロリン領域のリン酸化の刺激化を表す。図１６は、ｐ８５ペプチドへのＦｙｎおよびＬｙｎ蛋白質の結合性を表す。図１７は、ｐ８５ペプチドへのＳＨ３ドメイン融合蛋白質の結合性を表す。図１８は、ＳＨ３ドメイン融合蛋白質によるＰＩ−３Ｋの活性の刺激化を説明する。図１９は、ｐ８５ペプチドによるＰＩ−３Ｋ活性の刺激化を説明する。図２０は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフを用いるＳｈｃ蛋白質の免疫沈降法を説明する。図２１は、様々なリン酸化および非リン酸化ＡＲＨ１モチーフを用いるＳｈｃ蛋白質の免疫沈降法を説明する。図２２は、リン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフならびに非リン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフを用いるＳｈｃ蛋白質の免疫沈降法を説明する。図２３は、様々な二重リン酸化ＩＴＡＭペプチドへの、ＰＩ−３Ｋ、Ｓｙｋ、Ｌｙｎ、およびＳｈｃ蛋白質の確認的(differential)結合を説明する。詳細な説明本発明は、細胞内のシグナル変換経路を調節するための新規の産物および方法に関する。本明細書内に用いられる際には「シグナル変換」は、細胞の外側の環境に基づき、その細胞がその生物学的機能を改変することが可能になる細胞内の化学反応を意味する。本発明は細胞内のシグナル変換経路を調節することが可能な２つの新規の化合物を含む。本発明の最初の新規の化合物は、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、ｓｙｋ−ファミリーのキナーゼ、Ｓｈｃ分子、および／またはＰＩ−３Ｋの活性を調節することが可能なペプチドを含み、そのようなペプチドはＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというアミノ酸モチーフ［このモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であることが可能であり、そしてΨはロイシンもしくはイソロイシンのいずれかであることが可能である］、またはそのミメトープにより表されるアミノ酸配列を含む。本発明の第二の新規の化合物は高プロリンペプチド（高Ｐｒｏペプチド）もしくはそのミメトープであり、これはチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことによりキナーゼのそのキナーゼのエフェクターへの結合を阻害することが可能である。本発明に従うと、本明細書に特定されるようなペプチドを含むいずれかのアミノ酸配列もしくはそのようなペプチドをコードする核酸配列は、そのような配列のミメトープを含む。本発明は特に、細胞内でのシグナル変換の様々な段階を調節することにより多種多様な細胞機能を調節するための新規の化合物を提供し、かつ細胞内でのシグナル変換を調節することが可能なさらなる化合物を同定するための方法を提供するという点で特に有利である。シグナル変換経路は細胞をその環境に適合させることを可能にするために、細胞によって用いられる。シグナル変換経路は細胞の外界から受信されるシグナルを、その細胞の原型質膜を横断させ、細胞の細胞質を通して核内に伝達する。この様式で伝達されるシグナルにより典型的には細胞内での遺伝子発現の変化がもたされる。複数の細胞性因子が細胞内でのシグナル伝達の調節の原因となることがあり得る。このような因子には、イニシエーター分子、トランスデューサー分子、増幅因子分子、初期標的分子、および第二メッセンジャー分子が含まれる。本明細書に用いられる際には「分子」は蛋白質もしくは脂質を意味することが可能である。提案されているシグナル伝達経路の概略図が図１に示される。イニシエーター分子は細胞内でのシグナル変換を開始することが可能である。イニシエーター分子の一例は、細胞表面に膜結合型レセプターを含むトランスデューサー分子に結合することが可能な細胞外リガンドである。本明細書に用いられる際には「リガンド」は、ある分子が第二分子と結合した際に電子を供与する分子を意味する。細胞外リガンドには例えば、ホルモン、成長因子、抗原、他の分化作用因子、および他の細胞タイプ特異的マイトジェンが含まれることが可能である。イニシエーター分子への結合後には、トランスデューサー分子が細胞の原型質膜を横切ってシグナルを細胞内増幅因子分子に伝達する。トランスデューサー分子は、シグナル変換に関与する細胞内蛋白質と相互作用することが可能な細胞質領域を有するいずれかの表面レセプターを含むことができる。トランスデューサー分子はキナーゼドメインを含むか、あるいは細胞内キナーゼと結合することが可能である。トランスデューサー分子の例には、例えばチロシンキナーゼレセプター、アルファーおよびベータアドレナリン作動性神経薬、Ｇ−蛋白質結合型レセプター、ならびに免疫応答に関与する他のレセプターが含まれる。レセプターはサブユニットとして引用される複数の蛋白質を含んでいてもよく、レセプターの内の一つの部類は多重サブユニットレセプターとして称され、その例は多重サブユニット免疫認識レセプター（ＭＩＲＲ）である。ＭＩＲＲは非共有結合的に結合する複数のサブユニットを有するレセプターを含み、かつｓｒｃ −ファミリーチロシンキナーゼとの相互作用を行うことができる。ＭＩＲＲはＢ細胞抗原レセプター、Ｔ細胞抗原レセプター、Ｆｃレセプター、およびＣＤ２２を含むことが可能であるが、それらには限定されない。ＭＩＲＲの一つの例はＢ細胞表面上の抗原レセプターである。Ｂ細胞表面上のＭＩＲＲは、サブユニットＩｇ−αおよびＩｇ−βもしくはＩｇ−γと結合する膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）を含み、それらのサブユニットは抗原による結合を受けた際にはＢ細胞機能を調節することが可能な複合体を形成する。抗原レセプターは、増幅因子分子が遺伝子転写を調節することが可能にする様式で機能的に増幅因子分子と結合することができる。トランスデューサー分子は増幅因子分子と相互作用を行って、細胞表面で受信されるシグナルの、細胞の原型質内への伝達を更に拡張することが可能である。増幅因子分子は典型的には、細胞内の生理学的変化が生じ、それにより遺伝子転写の変化がもたらされる様式で初期標的分子を改変することが可能な酵素である。増幅因子分子は初期標的分子を、例えば：初期標的分子のアロステリック変化；初期標的分子のリン酸化；もしくは初期標的分子の細胞の他の領域への転移により改変することが可能である。初期標的分子は標的分子もしくはエフェクターを含むことが可能であるが、これらには限定されない。本明細書において用いられる際には「標的分子」は、特定の酵素によるリン酸化により改変される分子である。本明細書に用いられる際には「エフェクター」は、特定の酵素によるアロステリック変化により改変される分子である。シグナル変換に関与する増幅因子分子の例には、キナーゼレセプターおよび非レセプターキナーゼ（例えばｓｒｃ−ファミリーのキナーゼもしくはｓｙｋ−ファミリーのキナーゼ）が含まれるが、それらには限定されない。ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化することが可能な酵素である。典型的にはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼは一つもしくは複数の結合性ドメインおよびキナーゼドメインを含む。ｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼの結合性ドメインは標的分子に結合することが可能であり、かつキナーゼドメインはキナーゼに結合する標的分子をリン酸化することが可能である。ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼのメンバーは、Ｎ− 末端の独特な領域およびその後に続く３つの領域を特徴とするが、後記３つの領域はそのファミリーの全メンバーの中で様々な程度の相同性を示す。それら３つの領域はｓｒｃ相同性領域１（ＳＨ１）、ｓｒｃ相同性領域２（ＳＨ２）、およびｓｒｃ相同性領域３（ＳＨ３）として引用される。ＳＨ２およびＳＨ３の両ドメイン共が、シグナル変換複合体の形成にとって重要な蛋白質結合機能を有すると考えられている。Ｎ−末端の独特な領域のアミノ酸配列は各ｓｒｃ −ファミリーチロシンキナーゼ間で変化する。Ｎ−末端の独特な領域は、ｓｒｃ −ファミリーチロシンキナーゼのＮ−末端の内の少なくとも最初の約４０アミノ酸残基であることができる。ｓｙｋ−ファミリーキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化することができる酵素である。典型的にはｓｙｋ−ファミリーキナーゼは一つもしくは複数の結合性ドメインおよび一つのキナーゼドメインを含む。ｓｙｋ−ファミリーキナーゼの結合性ドメインは標的分子に結合することが可能であり、そしてキナーゼドメインはそのキナーゼに結合する標的分子をリン酸化することが可能である。ｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼのメンバーは、蛋白質結合機能のための２つのＳＨ２ドメインおよび一つのチロシンキナーゼドメインを特徴とする。初期標的分子は、第二メッセンジャー分子を改変することによりシグナル変換経路を更に拡張することが可能である。初期標的分子には、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、Ｐ２１^rasＧＡＰａｓｅ−活性化蛋白質、ならびに結合したＰ１９０とＰ６２蛋白質、ホスホリパーゼ（例えば、ＰＬＣγ１およびＰＬＣγ２）、ＭＡＰキナーゼ、Ｓｈｃ、およびＶＡＶが含まれるが、それらには限定されない。初期標的分子は第二メッセンジャー分子を産生することが可能であり、これは、ジアシルグリセロールおよび１，４，５−三リン酸イノシトール（ＩｎｓＰ３）を初めとする（しかし、これらには限定されない）分子を拡張することが可能である。第二メッセンジャー分子は遺伝子転写における変化をもたらすことが可能である生理学的現象を開始することが可能である。例えば、ＩｎＰ３の産生により細胞内カルシウムの放出がもたらされることが可能であり、その後にはそのことによりカルモジュリンキナーゼＩＩの活性化がもたらされることが可能であり、その後にはそのことによりｅｔｓ −１癌原蛋白質として引用されるＤＮＡ結合性蛋白質のセリンリン酸化がもたらされることが可能である。ジアシルグリセロールはシグナル変換蛋白質であるプロテインキナーゼＣを活性化することが可能であり、このことによりＡＰ１ＤＮＡ結合性蛋白質複合体の活性が影響を受ける。シグナル変換経路は、例えばｃ −ｆｏｓ、ｅｇｒ−１、およびｃ−ｍｙｃのような遺伝子の転写の活性化をもたらすことが可能である。本発明に従うと、Ｓｈｃはアダプター分子である。アダプター分子は他の２つの蛋白質が複合体（例えば、３分子複合体）を形成することを可能にする蛋白質を含む。Ｓｈｃ蛋白質はＧｒｂ２およびＳＯＳを含む複合体形成を可能にする。ＳｈｃはＧｒｂ２のＳＨ２ドメインと結合することが可能なＳＨ２ドメインを含む。シグナル変換経路の分子は認識配列を用いて互いに結合することが可能である。本発明に従うと、認識配列により２分子間の特異的結合が可能となる。認識配列は、互いに結合し合う分子の構造に依存して変化することが可能である。ある分子は一つもしくは複数の認識配列を有することが可能であり、そしてそれ自体が一つもしくは複数の異なる分子と結合することが可能である。シグナル変換経路は細胞の生物学的機能を調節することが可能である。そのような機能には、細胞が増殖する、分化する、そして細胞性産物を分泌する能力が含まれるが、それらには限定されない。シグナル変換経路は動物による特別な応答に関与する特異的タイプの細胞の生物学的機能（例えば、免疫応答、炎症性応答、およびアレルギー応答）を調節することが可能である。免疫応答に関与する細胞は例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびプラズマ細胞を含むことが可能である。炎症性応答に関与する細胞は例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球、好中球、およびマクロファージを含むことが可能である。アレルギー応答に関与する細胞は例えば、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージを含むことが可能である。それに加えて、動物によるこのような応答は多分化能幹細胞のシグナル変換経路により調節されることが可能であり、この多分化能幹細胞は既述の応答および動物の他の機能に関与する成熟細胞へと発達することが可能である。細胞の異常な生物学的機能が疾患をもたらすことが可能である。そのような異常性を矯正するためのシグナル変換経路の調節自体が疾患の治療に有効であり得る。それに加えて、様々な医療的方法（例えば、臓器および皮膚の移植術）は特異的なタイプの細胞の生物学的機能の調節を必要とする。そのような細胞内でのシグナル変換機能自体が特別な医療的方法に有用であり得る。蛋白質と標的分子の間の結合により様々な生物学的現象がもたらされ得ることが当業者により知られている。例えば、蛋白質と標的分子との間の結合により標的分子の立体配座の改変がもたらされ、そのことによりその標的分子が第二蛋白質による結合を受けることが可能となるか、あるいは別法ではその標的分子が典型的な結合を生じることが妨げられ、そのことによりそのような分子が関与する系の調節を変化することが可能となる。他の実施例では、蛋白質と標的分子との間の結合によりその標的分子の転移がもたらされて、その標的分子と結合することが可能な他の蛋白質の近傍内にその標的分子が移動してくることが可能となる。更に別の実施例では、蛋白質と標的分子との間の結合により、その標的分子の活性が活性化、刺激化、もしくは阻害される様式でのその標的分子の改変がもたらされることが可能である。その標的分子の活性は例えば、酵素活性もしくは結合性活性を含むことが可能である。蛋白質と標的分子との間の結合は、その蛋白質上およびその標的分子上の特異的認識配列に依存することが可能であり得ることも当業者に知られている。本発明に従うと、認識配列は、ある蛋白質が特異的様式で標的分子に結合することを可能にさせる配列である。単一の蛋白質はその蛋白質の配列内に含まれる様々な認識配列を使用して異なる標的分子に結合することが可能である。それとは対照的に、単一の標的分子は標的分子の配列内に含まれる様々な認識配列を用いて様々な蛋白質による結合を受けることが可能である。蛋白質と標的分子との間の分子相互作用の複雑性により当業者が特別な相互作用を理解および予想することが制限されている。ある態様では本発明の化合物は、チロシンキナーゼの活性、好ましくはチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０の活性を調節することにより細胞内のシグナル変換を調節することができる。他の態様では、本発明の化合物は、アダプター分子、好ましくはＳｈｃの活性を調節することができる。更に他の態様では、本発明の化合物は脂質キナーゼ、好ましくはＰＩ−３Ｋの活性を調節することができる。更に他の態様では、本発明の化合物は、ＧＡＰ、ＣＤ２２、およびＭＡＰＫを初めとする蛋白質の活性を調節することができる。他の態様では、本発明の化合物は、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨというアミノ酸モチーフを有する単離されたペプチド（もしくはそのミメトープ）を含む。本発明に従うと、単離された、もしくは生物学的に純粋なペプチドは、その天然の環境から取り出されたペプチドである。「単離された」および「生物学的に純粋な」はそれ自体、蛋白質が精製されている程度を反映させる必要はない。本発明の単離された化合物は天然の源から取得するか、あるいは組換えＤＮＡ技術もしくは化学的合成を用いて産生することが可能である。本明細書に用いられる際には、単離されたペプチドは全長蛋白質もしくはそのような蛋白質のいずれかの同族体であることが可能であり、そのような同族体ではアミノ酸の欠失（例えば、その蛋白質の切断型）、挿入、反転、置換、および／または誘導化（例えば、アセチル化、グリコシル化、カルボキシメチル化されてミリスチル化、プレニル化、もしくはパルミトイル化されたアミノ酸に連結されている）が生じており、その結果そのペプチドはチロシンキナーゼ、アダプター分子、および／または脂質キナーゼの活性を調節することが可能となる。本発明に従うと「ミメトープ」は、本発明の単離された化合物の能力を模倣することが可能ないずれかの化合物を意味する。ミメトープは分解に対する感受性を減少するように改変させてあるが、依然として調節活性を保持するペプチドであることが可能である。ミメトープの他の例には、蛋白質を基にする化合物、炭水化物を基にする化合物、脂質を基にする化合物、核酸を基にする化合物、天然の有機化合物、合成により得られる有機化合物、抗−イディオタイプ抗体、および／または触媒的抗体、あるいはそれらの断片が含まれるが、それらには限定されない。ミメトープは例えば、本明細書中に記載されるチロシンキナーゼの活性を調節することが可能な化合物についての、天然および合成化合物のライブラリーのスクリーニングにより取得することが可能である。ミメトープは更に、例えば天然および合成化合物のライブラリー、特に化学的もしくは組合わせライブラリー（すなわち、配列もしくはサイズが異なるが、同一の構築ブロックを有する化合物のライブラリー）から取得することが可能である。ミメトープは例えば合理的な薬剤設計により取得することも可能である。合理的薬剤設計方法では、本発明の化合物の３次元構造を例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）もしくはｘ−線結晶回折により分析することが可能である。その後にその３次元構造を用いて例えば、コンピューターモデル化により有望なミメトープの構造を予想することが可能である。その後に予想されたミメトープ構造を例えば、化学合成、組換えＤＮＡ技術によるか、あるいは天然の源（例えば、植物、動物、細菌、および真菌類）からミメトープを単離することにより産生することが可能である。ある態様では、本発明の化合物は、そのペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することが可能な様式でそのペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼによる結合を受けることを可能にするアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドは、そのペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの少なくとも一つの結合部位による結合を受けることを可能にするサイズおよび性質のものである。特に本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域およびＳＨ２ドメインによる結合を受けることが可能である。本発明のＡＲＨ１ペプチドがｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域、ＳＨ２ドメイン、およびＳＨ３ドメインによる結合を受けることが可能であることが好ましい。他の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドが標的分子（例えば、ＭＩＲＲ）へのｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの結合を調節することが可能な様式でそのペプチドがｓｙｋ−ファミリーのキナーゼによる結合を受けることを可能にするアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの少なくとも一つの結合部位との会合による結合をそのペプチドが受けることを可能にさせるサイズおよび性質のものである。特に本発明のＡＲＨ１ペプチドは、ｓｙｋ−ファミリーキナーゼの一つのＳＨ２ドメイン、好ましくはｓｙｋ−ファミリーキナーゼの両方のＳＨ２ドメインによる結合を受けることが可能である。更に他の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドが標的分子（例えば、Ｇｒｂ２もしくはＳＯＳ）へのＳｈｃ分子の結合を調節することが可能な様式でそのペプチドがＳｈｃによる結合を受けることを可能にさせるアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドはＳｈｃ分子の少なくとも一つの結合部位による結合をそのペプチドが受けることを可能にさせるサイズおよび性質のものである。特に、本発明のＡＲＨ１ペプチドはＳｈｃ分子のＳＨ２ドメインによる結合を受けることがある。更に別の態様では、本発明の化合物は、そのペプチドがＳＰ−６キナーゼの活性化を調節することが可能な様式でそのペプチドがＰＩ−３Ｋによる結合を受けることを可能にさせるアミノ酸配列を有する単離されたＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のＡＲＨ１ペプチドはＰＩ−３Ｋ分子の少なくとも一つの結合部位による結合をそのペプチドが受けることを可能にさせるサイズおよび性質のものである。特に本発明のＡＲＨ１ペプチドは、ＰＩ−Ｋ３分子のＳＨ２ドメインによる結合を受けることが可能である。本発明の化合物は、少なくとも４つのアミノ酸残基、好ましくは約１５のアミノ酸残基、より好ましくは約１７のアミノ酸残基を含むＡＲＨ１ペプチドを含むが、そのペプチドは少なくとも約２６のアミノ酸残基であることができる。ある態様では本発明のＡＲＨ１ペプチドは約３ｋＤのサイズを有し、そして約２６のアミノ酸残基を有する。ある態様では、本発明のＡＲＨ１ペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも２つのチロシン残基ならびに少なくとも２つのロイシンおよび／またはイソロイシン残基を有するＡＲＨ１モチーフを含む。本明細書において用いられる際には「モチーフ」は、特別な機能を有する蛋白質内に含まれる一連のアミノ酸残基を意味する。本発明のＡＲＨ１モチーフが、標準的一文字アミノ酸コードを用いるＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフにより表される空間配置を有するチロシン、ロイシン、および／またはイソロイシン残基を含むことが好ましく、そしてそのモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であることができ、「Ψ」はロイシンもしくはイソロイシンのいずれかであることができる。ある態様では、ＡＲＨ１ペプチドはＢ細胞中のｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することが可能な配列を含むことができる。ｓｒｃ−ファミリーキナーゼ特異的ＡＲＨ１ペプチドがＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好ましく、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸配列ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含み、アミノ酸配列ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩであることが更に一層好ましい。他の態様では、ＡＲＨ１ペプチドはｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することが可能な配列を含むことが可能である。ｓｙｋ−ファミリーキナーゼ−選択的ＡＲＨ１ペプチドには、アミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨが含まれ、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ ε、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質のＡＲＩ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨもしくはＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいｓｙｋ−ファミリーキナーゼ一選択的ＡＲＨ１ペプチドは、アミノ酸モチーフＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬもしくはＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬを含み、アミノ酸モチーフＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬもしくはＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬであることが更に一層好ましい。本発明のｓｙｋ−ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドはリン酸化されているかもしくはリン酸化されていないかのいずれかであることが可能である。非チロシンリン酸化ｓｙｋ−ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドが、アミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨを含むＡＲＨ１モチーフを含むことが好ましく、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含むＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。チロシンリン酸化ｓｙｋ −ファミリーキナーゼ−選択的ペプチドが、アミノ酸モチーフｐＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩｐＹＸＸΨ、もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨを含むＡＲＨ１モチーフを含むことが好ましく、ペプチドがリン酸化されているＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、Ｆｃ６ＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸モチーフｐＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴｐＹＸＸΨもしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬｐＹＸＸ Ψが更に一層好ましい。更に別の態様では、ＡＲＨ１ペプチドがＳｈｃアダプター分子に結合することが可能な配列を含むことが可能である。Ｓｈｃ−選択的ＡＲＨ１ペプチドはＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好ましく、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃＥＲＩβ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含み、アミノ酸モチーフＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩであることが一層好ましい。本発明のＳｈｃ−選択的ペプチドはチロシンリン酸化かもしくは非チロシンリン酸化のいずれかであることが可能である。非チロシンリン酸化Ｓｈｃ−選択的ペプチドはＡＲＨ１モチーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨを含むことが好ましく、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてアミノ酸配列ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを含むＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。チロシンリン酸化Ｓｈｃ−選択的ペプチドはｐＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩｐＹＸＸΨ、もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフを含むことが好ましく、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質に実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてペプチドがリン酸化されているアミノ酸モチーフＤＨＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、もしくはＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬを含むＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。更に別の態様では、ＡＲＨ１ペプチドはＰＩ−３Ｋに結合することが可能な配列を含むことが可能である。ＰＩ−３Ｋ−選択的ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨを含むことが好ましく、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドは配列ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬを含む。ある好ましい態様では、本発明のＰＩ−３Ｋ−選択的ペプチドはチロシンがリン酸化されている。本発明のＡＲＨ１ペプチドの特に好ましいミメトープは表１に示されるアミノ酸配列を含むことが可能であるが、それらには限定されない。他の態様では、本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの比活性を刺激化することができる。本明細書で用いられる際には用語「比活性」は、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼが初期標的分子を改変することが可能な速度を意味する。比活性の速度は例えば、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼが初期標的分子をリン酸化する速度により測定することができる。比活性は更に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの自己リン酸化の速度をも意味することが可能である。本発明のＡＲＨ１ペプチドは少なくとも約２倍、そして最高で約７０倍、そして一層好ましくは約３倍〜約６０倍にｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの比活性を刺激化できることが好ましい。比活性の刺激化は、そのペプチドをｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの免疫沈降物と共にインキュベートした際に観察される。ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を刺激化できる本発明のＡＲＨ１ペプチドは少なくとも２つのリン酸化チロシン残基を含む。刺激性ＡＲＨ１ペプチドが、本明細書内に記載される様式で空間的に配置される少なくとも２つのリン酸化チロシン残基を有するＡＲＨ１モチーフを含むことが好ましい。本発明の刺激性ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフｐＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴｐＹＸＸΨ、ｐＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩｐＹＸＸΨ、もしくはｐＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴｐＹＸＸΨ［これらのモチーフ中、ｐＹはリン酸化チロシン残基を意味する］を含むことが好ましく、チロシン残基がリン酸化されているＩｇ−α、Ｉｇ−β、ＦｃεＲＩβ、もしくはＦｃεＲＩγ 蛋白質のＡＲＨ１モチーフに実質的に類似するＡＲＨ１モチーフがより好ましく、そしてｐＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭｐＹＸＸΨ ＡＲＨ１モチーフが更に一層好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１ペプチドは配列ｐＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭｐＹＥＤＩを含み、配列ＮＬｐＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭｐＹＥＤＩであることがより好ましい。論理に拘束されるものでないが、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼは膜結合型レセプターのＡＲＨ１モチーフと非共有結合的に結合することが可能であると考えられる。第一に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域はレセプターのＡＲＨ１モチーフと結合し、そしてリガンドがそのレセプターの細胞外ドメインに結合するまで刺激化されない状態のままになる。リガンドの結合の際にはそのレセプターは立体配座の変化を受け、それによりそのＡＲＨ１モチーフ内に含まれるチロシン残基のリン酸化が開始する（例えば、それらのチロシンは結合したキナーゼによりリン酸化される）。その後に結合化キナーゼのＳＨ２ドメインがリン酸化されたＡＲＨ１モチーフに結合する。この第二結合現象は、結合したキナーゼのキナーゼドメインがそのキナーゼの初期標的を改変するに利用可能になるような様式でＣ−末端リン酸化チロシンの位置を改変することにより結合したキナーゼの活性の抑制解除を行うと考えられる。従って、リン酸化されたＡＲＨ１モチーフは、そのキナーゼの活性を積極的に阻害する因子の除去により結合したキナーゼの抑制解除を行うことが可能である。理論に拘束されるものでないが、図２は、レセプター複合体（Ｉｇ−α）の一部分と細胞内分子との間に生じることが可能な相互作用を表す。特に図２は、リガンドによるレセプターの結合の後に生じることが可能であるチロシンキナーゼ（ｋｉｎ．）の立体配座変化を詳細に説明する。既述のメカニズムによると、ＡＲＨ１モチーフを含むＡＲＨ１ペプチドは酵素ではない。むしろそのペプチドはシグナル変換分子と結合し、そしてそのシグナル変換分子の立体配座の変化を誘導する。ＡＲＨ１モチーフの、リン酸化されていないかもしくは部分的にリン酸化されたチロシン残基はｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＮ−末端の独特な領域の、ＡＲＨ１ペプチドへの結合を阻害できるものと考えられる。本発明の阻害的ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼＡＲＨ１ペプチドは２つのチロシン残基を含むＡＲＨ１モチーフを含むことが可能であり、この場合それらのチロシン残基の内の一つのみがリン酸化されるかもしくは両方のチロシン残基共がリン酸化されていない。ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害的ＡＲＨ１ペプチドのチロシン残基はリン酸化されていないことが好ましい。本発明の好ましいｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害的ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフＦＸＸＬＸＸＸＸＸＸＦＸＸＩ、より好ましくはモチーフＦＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＦＸＸΨ、ＦＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＦＸＸΨ、ＦＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＦＸＸΨ、もしくはＦＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＦＸＸΨ、そして更に一層好ましくはモチーフＦＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＦＸＸΨを含む。本発明の特に好ましいｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの阻害的ＡＲＨ１ペプチドはアミノ酸モチーフＦＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＦＥＤＩを含み、アミノ酸モチーフＤＭＰＤＤＹＥＤＥＮＬＦＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＦＥＤＩであることがより好ましい。本発明に従うと、本発明のシグナル変換調節性化合物は、本発明の一つもしくは複数のＡＲＨ１モチーフを含むアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ｓｙｋ −ファミリーキナーゼの活性を調節することが可能な本発明の化合物は、アミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨと共有結合により結合しているアミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨを含むことができる。別法ではアミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨは、それ自体がＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、もしくはＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨに共有結合により結合しているアミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨに共有結合により結合することができる。本発明の化合物を含む多重ＡＲＨ１モチーフが、アミノ酸配列ＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬと共有結合により結合しているアミノ酸配列ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬを含むことが好ましく、そしてより好ましくはアミノ酸配列ＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬと共有結合により結合しているアミノ酸配列ＤＨＴＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬを含むことがより好ましい。本発明の別の態様は、特定の酵素の活性を調節できるとの認識に関するが、それはそのような酵素の高プロリン領域が標的となって正常な結合パターンを妨害することが可能であり、そのことによりシグナル変換経路における酵素活性を改変することが可能となるということの認識に基づいている。これまでの研究者らにより、酵素ＰＩ−３Ｋは最高で５つの酵素（例えば、血小板由来の成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、ｐｐ６０^v-src、ｐｐ６０^c-src 、インスリンレセプター、ＩＬ−４レセプター、およびＣＳＦ−１レセプター）についての標的分子として作用する可能性があることが示されている（Ｏｔｓｕｅｔａｌ．、ｐｐ．９１−１０４、１９９１、Ｃｅｌｌ．、Ｖｏｌ．６５）。ＰＤＧＦＲは、ＹＸＸＭアミノ酸モチーフ［このモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、そしてＹ残基はリン酸化されている］を有するホスホペプチドを含む認識配列を用いてＰＩ−３ＫのＳＨ２ドメインに結合することが示されている（既述）。このような結合がＰＩ−３Ｋ機能を活性化させることが示されている。従って当業者はＰＩ −３Ｋを活性化させるためのメカニズムは、ＰＩ−３Ｋの結合を介して蛋白質のＹＸＸＭモチーフに至るものであるという考えに至るであろう。それに加え、ｐｐ６０^v-secおよびｐｐ６０^c-secはそれらのＳＨ３ドメインによりＰＩ−３Ｋに結合することが示されている（既述）。このような結合がＰＩ−３Ｋの活性化をもたらすことは示されてはいない。従ってＰＩ−３Ｋへの酵素結合が、様々な認識配列を用いることで生じることが可能であり、そしてＰＩ−３Ｋの限定的活性化がホスホペプチド配列ＹＸＸＭの結合の際に達成され得る。ある態様では本発明の化合物は初期標的分子へのチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインの結合を阻害し、そのことによりその標的分子の活性化を阻害することができる。本発明の適切な標的分子には、チロシンキナーゼによる結合を受けうる高プロリン配列を有する蛋白質が含まれる。本発明の標的分子が、例えばＰＩ− ３Ｋ、ｒａｓ−ＧＡＰ、３ＢＰ１、および３ＢＰ２のようなエフェクター分子を含むことが好ましいが、これらには限定されない。本発明に従うと、本発明の化合物はシグナル変換経路内で増幅因子として作用しうるレセプターおよび／または非レセプターチロシンキナーゼの活性を調節しうる単離された高Ｐｒｏペプチドを含む。本明細書において用いられる際には「高Ｐｒｏペプチド」は更に単離された高ｐｒｏペプチドをも意味する。本発明の高Ｐｒｏペプチドは特に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することによりｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼと結合しうるレセプターに結合するリガンドから生じるシグナル変換経路を調節することができる。本発明の適切なレセプターにはＢ細胞抗原レセプター、Ｔ細胞抗原レセプター、Ｆｃレセプター、ＭＨＣクラスＩＩ、ＩＬ−４レセプター、およびＣＤ４が含まれるが、これらには限定されない。本発明の適切なｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼにはＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｚａｐ７０、およびＳｒｃが含まれるが、これらには限定されない。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、初期標的分子とのキナーゼの結合を妨害することによりチロシンキナーゼを調節することができる。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドが初期標的分子とキナーゼの結合とを妨害する様式でそのペプチドがチロシンキナーゼに結合することを可能にさせるに十分なサイズを含む。本発明の高Ｐｒｏペプチドが少なくとも約５アミノ酸残基、より好ましくは約７アミノ酸残基〜約４０残基、そして更に一層好ましくは約１０アミノ酸残基〜約３０アミノ酸残基を有する。本発明の高Ｐｒｏペプチドは大きければ約８５ｋＤの、そして小さければ約１ｋＤのサイズのものであり得る。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドが初期標的分子とのそのキナーゼの結合を妨害する様式でそのペプチドのチロシンキナーゼへの結合を可能にさせるアミノ酸配列を含む。本発明の高ＰｒｏペプチドがチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン、より好ましくはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン、そして更に一層好ましくはｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼのＳＨ３ドメイン内に含まれる高プロリン配列結合部位に結合することが可能なアミノ酸配列を含む。ある態様では本発明の高Ｐｒｏペプチドのアミノ酸配列は、約２０％のプロリン残基〜約１００％のプロリン残基、より好ましくは約３０％のプロリン残基〜約９０％のプロリン残基、および更に一層好ましくは約４０％のプロリン残基〜約８０％のプロリン残基を有する高プロリンモチーフを含む。これらのプロリン残基は、本発明の高Ｐｒｏペプチドがチロシンキナーゼ上の高プロリン結合部位による結合を受けうるのに適切な様式での空間的配置をとることができる。このような空間的配置は、ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰアミノ酸モチーフもしくはＰＸＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰアミノ酸モチーフ［このモチーフ中、Ｘはいずれかのアミノ酸残基を表す］により表すことができる。プロリン残基はＰにより省記される。好ましい態様では、本発明の高ＰｒｏペプチドはＰＩ−３Ｋの高プロリンドメインを含む。ＰＩ−３Ｋは非触媒的ｐ８５サブユニット（８５ｋＤ）および触媒的ｐ１１０サブユニット（１１０ｋＤ）から成る。ＰＩ−３ＫはＤ−３ヒドロキシルの位置でイノシトール脂質をリン酸化することができる。２つの高プロリンドメインがｐ８５サブユニット内に含まれる。ＰＩ−３Ｋの最初の高プロリンドメインはおおよそ残基８０からおおよそ残基１０４までに広がり、そしてアミノ酸モチーフＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴを含むことが可能である。ＰＩ−３Ｋの第二高プロリンドメインはおおよそ残基２９９からおおよそ残基３１８までに広がり、そしてアミノ酸モチーフＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含むことができる。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴもしくはＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含む少なくとも一つのアミノ酸モチーフを含むことが好ましい。本発明に従うと、Ｋ＝リシン、Ｒ＝アルギニン、Ｖ＝バリン、およびＱ＝グルタミンである。本発明の高Ｐｒｏペプチドもしくはそのミメトープはチロシンキナーゼによる標的分子の活性化を阻害することができ、それはその高Ｐｒｏペプチドが事前にチロシンキナーゼに結合し、そのことにより標的分子の結合が、次いでそのため標的分子の活性化が阻害されるためである。本発明の高Ｐｒｏペプチドは、約７０％、より好ましくは約８０％、そして更に一層好ましくは約９０％、標的分子へのチロシンキナーゼの結合を阻害しうるものであることが好ましい。それに加え本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドがキナーゼに対するペプチドの２００：１の比率で、より好ましくはキナーゼに対するペプチドの１００：１の比率で、そして更に一層好ましくはキナーゼに対する２０：１の比率で存在する場合に、チロシンキナーゼと標的分子との間の結合を実質的に阻害する（９０％と１００％との間）ことができる。好ましい態様では本発明の高Ｐｒｏペプチドは、そのペプチドがＰＩ−３Ｋを含む細胞内に組込まれた際にＰＩ−３Ｋの活性化を阻害することができる。そのようなＰＩ−３Ｋの活性化は少なくとも８０％およびより好ましくは少なくとも９０％阻害されることが好ましい。本発明に従うと、本明細書に詳細が記載される本発明の化合物のミメトープは脂質二重層（例えば、細胞の原型質膜）を横切ることが可能である。脂質二重層を横切ることが可能なミメトープは有機分子、特に炭水化物を基にする分子であることができる。更に本発明に従うと、本発明の化合物はコンカテマーを含むことができ、この際、一つもしくは複数のＡＲＨ１ペプチドあるいは一つもしくは複数の高Ｐｒｏペプチドが互いに結合している。本発明の他の態様は、本明細書に開示される本発明の化合物をコードする単離された核酸分子に関する。本発明に従うと、核酸についての引用事項は核酸分子をも意味する。本発明に従うと、単離された核酸分子は、その天然の環境から予め取り出されている核酸分子である（すなわち、予めヒトによる操作に供されている）。「単離された」自体は、その核酸分子が精製された度合いを反映する必要はない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかのハイブリッドもしくは誘導体を含むことができる。本発明の核酸は、核酸分子の発現を制御する調節領域（例えば、転写もしくは翻訳制御領域）、全長もしくは部分的なコーディング領域、およびそれらの組み合わせ物を含むことができる。本発明の核酸分子のいずれかの部分は、（１）その天然の環境からのその分子の単離；（２）組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ増幅、クローニング）を用いること；もしくは（３）化学的合成法を用いること、により産生することが可能である。本発明の核酸分子は、天然の対立遺伝子変異体（しかし、それらには限定されない）を含む本発明の化合物をコードする天然の核酸分子、ならびに改変化核酸分子（これらの分子においてはヌクレオチドに、そのような改変がシグナル変換を調節しうる本発明の化合物をコードするその核酸分子の能力を実質的に妨害することのない様式で挿入、欠失、置換、および／または逆位を予め生じさせてある）の機能的等価物を含むことができる。好ましい機能的等価物には、緊縮条件下で：Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質に由来するＡＲＨ１ペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分；あるいはＰＩ−３Ｋ蛋白質に由来する高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分にハイブリダイズすることが可能な核酸配列が含まれる。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｓＰｒｅｓｓ、１９８９（これは引用によりその全体が本明細書に取り込まれる）に記載されている。いずれかの特定の核酸分子にどのような特定の改変を行うことが可能であるかを決定する際の手引きとして、当業者は不適切な実験についての必要性を伴うことなく、当業者が本発明の実行可能な態様を認識することを可能にさせる幾つかの因子を考慮すべきである。例えばそれらの因子は本発明のコード化化合物の特別な機能的領域を維持するような様式で実施される核酸分子に対する改変を含み、それらのコード化化合物には：そのモチーフがそのキナーゼもしくはアダプター分子の活性を調節しうる様式でチロシンキナーゼ、アダプター分子、もしくは脂質キナーゼによる結合を受けることが可能なＡＲＨ１モチーフ；あるいはチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインへの結合が可能であり、そのことによりそのキナーゼの活性化もしくは結合能を変化させることが可能である高プロリンモチーフが含まれる。これらの様々な特性の機能的検査（例えば、結合性検査、キナーゼアッセイ、脂質リン酸化アッセイ）により当業者は、その核酸分子に対してはどのような改変が適切であるか、もしくはどのような改変が適切でないかを決定することが可能となる。ある態様では本発明の単離された核酸分子は本発明のＡＲＨ１ペプチドをコードする核酸配列を含み、そのようなペプチドの例が本明細書内に開示される。本発明のＡＲＨ１ペプチド核酸分子は、アミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨを有するＡＲＨ１モチーフをコードする核酸配列もしくはそのミメトープを含むことが可能である。ＡＲＨ１ペプチドをコードする好ましい核酸分子には、ペプチド配列ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸ Ψ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨをコードする核酸配列、あるいはそれらのミメトープが含まれる。ＡＲＨ１ペプチドをコードするより好ましい核酸分子には、ペプチド配列をコードする核酸配列、あるいはそれらのミメトープが含まれる。更に一層好ましい核酸分子は、配列：もしくはを含む。一つのＡＲＨ１ペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分を、異なる構成成分（例えば、制御因子）の少なくとも一部分をコードする他のいずれかの配列に共有結合により（標準的組換え技術を用いて）結合させて本発明のＡＲＨ１ペプチドを産生することができる。これらの配列を、それらの配列がインフレームで転写され、そのことによりｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、ｓｙｋ −ファミリーのキナーゼ、Ｓｈｃ分子、およびＰＩ−３Ｋの活性を調節することが可能な機能的ＡＲＨ１ペプチドを産生する様式で連結させることができる。本発明の別の特徴および態様では単離された核酸分子は、本発明の少なくとも一つの高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸配列を含み、そのようなペプチドの例が本明細書に開示される。本発明の高Ｐｒｏペプチド核酸分子には、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合しうるアミノ酸配列を有する高プロリンモチーフをコードする核酸配列が含まれる。高Ｐｒｏペプチドをコードする好ましい核酸分子には、ペプチド配列ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰをコードする核酸配列が含まれる。高Ｐｒｏペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分を、異なる構成成分（例えば、制御因子）の少なくとも一部分をコードする他のいずれかの配列に共有結合的に（標準的組換えＤＮＡ法を用いて）結合させて、本発明の高Ｐｒｏペプチドを産生することができる。この配列を、その配列がインフレームで転写させ、そのことによりチロシンキナーゼの活性を調節しうる機能的高Ｐｒｏペプチドを産生することを可能にする様式で結合させることができる。他の態様では、本発明の化合物の、その化合物を産生する細胞からの分泌を亢進させうるシグナルもしくはリーダーセグメントをコードする核酸配列が用いられる。リーダーもしくはシグナルセグメントをコードする核酸配列は、核酸分子の５’末端（アミノ末端）に共有結合（塩基対結合）により連結される。そのリーダーもしくはシグナルセグメントは本発明の一部分に天然の状態で連結するセグメントであってもよく、あるいは異種セグメントであってもよい。膜結合型の態様を取得するためには、本発明の化合物を脂質含有性標的分子に連結することが可能な少なくとも一つの貫膜セグメントを含む核酸配列が用いられ、そのようなセグメントには貫膜ドメインの少なくとも一部分および細胞質ドメインの少なくとも一部分が含まれる。貫膜セグメントをコードする核酸配列は、本発明の化合物をコードする核酸分子の３’末端（カルボキシル末端）に共有結合的に（塩基対結合により）結合する。膜結合型であることが可能である本発明の化合物をコードする核酸分子は、貫膜コード化配列がインフレームで転写される様式で細胞外ドメインをコードする核酸配列の３’末端に連結されるセグメントをコードする少なくとも一つの核酸配列を含む。好ましいシグナルもしくはリーダーセグメントは、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ 、もしくはＦｃεＲＩβ蛋白質、あるいはＰＩ−３Ｋ蛋白質と天然の状態で結合するセグメントである。好ましい貫膜セグメントには、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃＥＲＩγ、もしくはＦｃ６ＲＩβ蛋白質、あるいはＰＩ−３Ｋ蛋白質と天然の状態で結合するセグメントが含まれる。本発明の他の態様は、融合セグメントに連結される本発明の化合物を含むドメインを含む融合蛋白質に関する。本発明の化合物の部分としての融合セグメントの組込みは、産生、保存、および／または使用中の化合物の安定性を亢進させることが可能である。それに加えて融合セグメントは本発明の化合物の精製を単純化させるための道具として機能することが可能であり、その例は、親和性クロマトグラフィーを用いて得られる融合蛋白質の精製を可能にすることなどである。適切な融合セグメントは所望される機能（例えば、安定性の増加および／または精製）を有するいずれかのサイズのドメインであることが可能である。一つもしくは複数の融合セグメントを特許請求される化合物のアミノおよび／またはカルボキシル末端に結合させることが可能であり、そして融合セグメントと化合物との間の結合を、その化合物の簡便な回収を可能にさせるために開裂に対して感受性を示すように作製することが可能である。融合蛋白質が、その化合物のカルボキシルおよび／またはアミノ末端のいずれかに連結される融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列で形質転換させた組換え細胞を培養することにより産生されることが好ましい。本発明の融合蛋白質には、因子Ｘもしくはトロンビン、好ましくは因子Ｘによる開裂を受けることが可能であるグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）本発明の化合物をコードする核酸分子が含まれる。ある態様では、本発明のＡＲＨ１融合蛋白質は、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸配列ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨをコードする核酸分子を含む。ＡＲＨ１融合蛋白質がＩｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩβ、Ｆｃε ＲＩγ蛋白質の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むことが好ましく、そしてNLYEGLNLDDCSMYEDI，DHTYEGLNIDQTATYEDI，DRLYEELNHVYSPIYSELもしくはD AVYTGLNTRNQETYETL、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸配列DGLYQGLSTATKDTYDALもしくはNPDYEPIRKGQRDLYSGLを含むことがより好ましい。本発明の特に好ましいＡＲＨ１融合蛋白質は、アミノ酸配列DMPDDYEDENLYEGLNLDDCSMYEDI，DHTYEGLNIDQTATYEDI，DRLYEELNHVYSPIYSEL，DA VYTGLNTRNQETYETL，DGLYQGLSTATKDTYDALもしくはNPDYEPIRKGQRDLYSGLをコードする核酸分子を含む。本発明の別の特徴および態様は、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸配列ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰを含む高Ｐｒｏ融合蛋白質に関する。高Ｐｒｏ融合蛋白質がＰＩ−３Ｋ蛋白質の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むことが好ましく、そしてアミノ酸配列ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴ、もしくは因子Ｘによる開裂を受けうるグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）アミノ酸配列ＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡを含むことがより好ましい。更に他の態様では本発明のＳＨ３融合蛋白質は、因子Ｘによる開裂を受けることが可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインの少なくとも一部分をコードする核酸分子を含む。ＳＨ３融合蛋白質が、因子Ｘによる開裂を受けうるグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合セグメントをコードする核酸分子に連結される（塩基対結合により）Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｔｋ、Ｌｃｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、もしくはＺａｐ７０、より好ましくはＬｙｎを初めとするｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼに由来するＳＨ３ドメインの少なくとも一部分をコードする核酸分子を含むことが好ましい。本発明は更に、宿主細胞内で発現しうるベクターに操作可能に連結される本発明の化合物をコードする核酸分子を含む組換え分子をも含む。本明細書において用いられる際には「操作可能に連結される」は、その配列が細胞内に形質転換された場合に発現しうる様式での発現ベクター内への核酸配列の挿入を意味する。本明細書において用いられる際には「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換しかつ適切な核酸分子の発現をもたらし、好ましくは宿主細胞内で複製することが可能なＲＮＡもしくはＤＮＡベクターである。発現ベクターは原核生物もしくは真核生物のいずれかであることが可能であり、そして典型的にはウイルスもしくはプラスミドである。所望の発現ベクターの構築は当業者に知られる方法により実施することが可能であり、そして発現を真核生物もしくは原核生物の系内で実施することができる。適切な原核生物系は細菌株であり、これにはバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な株もしくはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の様々な種が含まれるが、これらには限定されない。原核生物系では、宿主細胞に適合する種に由来する複製起点および制御配列を含むプラスミドが用いられる。制御配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボゾーム結合性部位、およびシャイン−ルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含むことが可能であるが、これらには限定されない。真核生物宿主細胞に有用な発現系は適切な真核生物性遺伝子に由来するプロモーターを含む。有用な哺乳類プロモーターにはＳＶ４０らの初期および後期プロモーター、あるいは他のウイルス性プロモーター（例えば、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシのパピローマウイルス、もしくは鳥類の肉腫ウイルスに由来するもの）が含まれる。本発明の発現ベクターには本発明の組換え細胞内で機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）いずれかのベクターが含まれ、それらには細菌、イースト、他の真菌類、昆虫、植物、哺乳類の細胞が含まれる。発現系は当業者に知られる方法を用いて本発明の核酸分子に操作的に連結される既述の制御因子の内のいずれかから構築することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔａｌ．、前述、を参照されたい）。本発明の宿主細胞は：本発明の化合物を産生することが天然の状態で可能な細胞；もしくは本発明の化合物をコードする核酸分子で形質転換させた際に本発明の化合物を産生しうる細胞であることができる。本発明の宿主細胞には細菌、真菌類、昆虫、植物、および哺乳類の細胞が含まれるが、これらには限定されない。より好ましい宿主細胞には、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＳＦ９、およびドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）が含まれる。組換え細胞は一つもしくは複数の組換え分子で宿主細胞を形質転換することにより産生することが好ましく、各々の組換え分子は一つもしくは複数の転写制御配列を含む発現ベクターに操作的に連結される本発明の一つもしくは複数の核酸分子を含む。本発明の組換え分子は、形質転換予定の細胞内で核酸分子（一つもしくは複数）の発現を効果的に調節しうるいずれかの転写制御配列の内の少なくとも一つに操作可能に連結される、これまでに記載された核酸分子の内の少なくとも一つを含みうる分子である。組換えＤＮＡ技術の使用により、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピー数を操作することにより形質転換化核酸分子の発現、それらの核酸分子が転写される効率、および得られる転写物が翻訳される効率、ならびに翻訳後修飾の効率が改善され得ることが当業者により認識される。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術には、多コピー数プラスミドへの核酸分子の操作可能に連結、一つもしくは複数の宿主細胞染色体内への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定化配列の添加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換もしくは改変、翻訳制御シグナルの置換もしくは改変、宿主細胞に利用されるコードに対応させるための本発明の核酸分子のへの改変、転写物を不安定化させる配列の削除、ならびに発酵中の組換え酵素産物から増殖する組換え細胞を一次的に分離する制御シグナルの使用が含まれるが、これらには限定されない。本発明の発現化組換えペプチドの活性は、そのようなペプチドをコードする核酸分子を断片化、改変、もしくは誘導化することにより改善することができる。本発明に従うと、本発明の組換え細胞を用いて、そのような細胞をそのような化合物を産生させるのに有効な条件下で培養し、そしてその化合物を回収することにより本発明の化合物を産生することが可能である。本発明の化合物を産生するのに有効な条件には、ペプチド産生を可能にさせる適切な培地、生物反応装置、温度、ｐＨ、および酸素条件が含まれるが、これらには限定されない。適切な培地は、培養した際に本発明の細胞が本発明の化合物を産生することが可能となるいずれかの培地を意味する。有効な培地は典型的には、同化性炭水化物、窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩、無機物、金属、および他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む水性培地である。この培地は複合栄養物を含むことができるか、もしくは特定された最少培地であることができる。この培地は更に、特定の組換え分子の発現についての選択を行う化学性試薬も含むこともできる。このような試薬にはネオマイシン、アンピリシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、およびミコフェノール酸が含まれるが、これらには限定されない。産生用に用いられるベクターおよび宿主系に依存して本発明の得られる化合物は、組換え細胞内に滞在するか；発酵培地中に分泌されるか；２枚の細胞膜間の空間内（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のペリプラズム空間）に分泌されるか；あるいは細胞もしくはウイルスの膜の外側表面上に保持されるかのいずれかとなることができる。成句「化合物の回収」は単にその化合物を含む全発酵培地を回収することを意味し、そして分離もしくは精製の追加的段階を意味する必要はない。本発明の化合物は様々な標準的蛋白質精製技術を用いて精製することが可能であり、そのような技術とは例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気穿孔法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、鑑別可溶化法、および免疫沈降法であるが、これらには限定されない。本発明の化合物は「実質的に純粋な」形態で回収されることが好ましい。本明細書で用いられる場合には「実質的に純粋な」は、治療用化合物としてか、もしくはアッセイ系におけるその化合物の効果的な使用を考慮する純度を意味する。本発明の実質的に純粋な化合物は例えば、そのような細胞に対して実質的な毒性を呈することなく細胞内でチロシンキナーゼ、Ｓｈｃ分子、脂質キナーゼ、ＰＩ−３Ｋ、もしくはチロシンキナーゼエフェクターの活性を調節することができるはずである。本発明のある態様は、有効な様式で動物に投与した際にその動物の細胞内でのシグナル変換を調節しうる治療用組成物である。本発明の治療用組成物は細胞内での異常なシグナル変換により部分的に生じるいずれかの疾患の治療に有用である。このような疾患には、癌、自己免疫疾患、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、アレルギー応答、および炎症性疾患が含まれる。本発明の治療用組成物は更に医療的治療（例えば、臓器および皮膚の移植）中の免疫応答の調節にも有用である。自己免疫疾患は例えば、全身性狼瘡、重症筋無力症、リューマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、および実験的アレルギー性脳髄膜炎を含むことができる。免疫不全性疾患は例えば、ヒトＡＩＤＳ、重症複合性免疫不全症、および低ガンマー−グロブリン血症を含むことができる。免疫増殖性疾患は例えばリンパ腫および白血病を含むことができる。それに加えて本発明の治療用組成物は腫瘍形成を初めとする癌の全形態の治療に有用である。本発明の治療用組成物はウイルス性疾患（例えば、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）を一例とするヘルペスウイルスにより生じるもの）の治療にも有用である。このような疾患には例えば、感染性単球細胞症、慢性疲労症候群、および免疫無防備状態宿主におけるＢ−リンパ球増殖性障害が含まれる。Ｂリンパ球はＥＢＶによる潜伏的な感染を受けることが可能である。Ｂ細胞における潜伏期中にはＥＢＶは宿主の免疫系による攻撃に対する感受性を示さない。ＥＢＶはＢ細胞が休止期（例えば、分泌されるべき抗体の産生を行わない）である場合には潜伏状態をとり続けるが、それはＥＢＶ遺伝子複製が宿主細胞遺伝子複製に関わる蛋白質を必要とし、かつ休止期のＢ細胞転写が最少限となるためである。休止期Ｂ細胞の活性化の際にはＥＢＶが増殖するが、それは宿主細胞遺伝子転写機構が増加するためである。本発明の治療用組成物は、休止期Ｂ細胞内のシグナル変換の活性化を刺激化し、そしてそのことによりそのＥＢＶウイルスの複製およびそのような細胞内での潜伏期からの脱離を生じることによりＥＢＶ−由来の疾患から動物を防御することができる。その後に増加性ＥＢＶは宿主免疫系による攻撃に対する感受性を示す。ＬＭＰ２Ａは潜伏期からの再活性化を調節する膜内在性蛋白質である。ＬＭＰＡ２はそのＡＲＨ１モチーフを介してＬｙｎおよびＳｋｙと相互作用を行い、そのことによりＬｙｎもしくはＳｋｙの酵素活性を刺激化し、それを受けて潜伏期からのＥＢＶの再活性化の増加がもたらされる。従ってＬＭＰ２Ａに由来するＡＲＨ１ペプチドはＥＢＶ由来の疾患から動物を防御するのに有用であり得る。ＥＢＶは更に免抑制剤治療により悪化する可能性のある移植後のリンパ球増殖性障害（ＰＬＰＤ）にも関連している。ＥＢＶ核蛋白質ＥＢＮＡ２の発現の欠失は充実性腫瘍形成の病因に関連している。従って、ＥＢＮＡ２に由来するＡＲＨ１ペプチドはＥＢＶの発現を刺激化し、そしてそのことにより宿主の免疫系による攻撃に対するＥＢＶの感受性を増加させることにより腫瘍形成から動物を防御するのに有用であり得る。本発明の治療用組成物は更に、ウイルス（例えばウシの白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染化細胞の形質転換により生じる腫瘍の治療にも有用である。ＢＬＶ感染化宿主細胞はＢＶＬ蛋白質ｇｐ３０に対する抗体を産生する。ＢＬＶ感染化Ｂリンパ球の表面上でのｇｐ３０の発現の際には、そのような抗体は表面に結合しているｇｐ３０に結合および架橋形成を行い、そのことによりＢリンパ球を活性化することが可能である。Ｂリンパ球の活性化は悪性細胞へのリンパ球の形質転換をもたらすことが可能である。本発明の治療用組成物はｇｐ３０の架橋結合により休止期のＢ細胞の活性化を阻害し、そのことによりＢ細胞の形質転換を阻害しうる。治療用組成物は適切な担体と組み合わせた本発明の化合物を含む。本明細書で用いられる際には「担体」は、インビトロもしくはインビボでの適切な作用部位に本発明の化合物を輸送するための賦形剤として適するいずれかの物質を意味する。担体それ自体が本発明の化合物を含む治療用組成物の添加剤もしくは製剤として作用することが可能である。好ましい担体はチロシンキナーゼと結合しうる形態で本発明の化合物を維持することができる。そのような担体の例には、水、リン酸緩衝化食塩水、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液、デキストローズ溶液、血清含有性溶液、ハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液、および他の生理学的平衡化水溶液を含むが、それらには限定されない。水性担体は例えば、化学的安定性および浸透圧性を亢進させることによりレシピエントの生理学条件に近づけるのに必要な適切な補助物質も含むこともできる。適切な補助物質には例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ならびにリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、および重炭酸塩緩衝液を生じるのに用いられる他の物質が含まれる。補助物質は更に例えば、チメロサール、ｍ−およびｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンゾジルアルコールのような保存料を含むことが可能である。エアロゾル輸送にとって好ましい補助物質にはレシピエントにとって無毒性の界面活性剤物質が含まれ、その例はエステル、あるいは約６〜約２２の炭素原子を含む脂肪酸の部分的エステルである。エステルの例には例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレオステアリン酸、およびオレイン酸が含まれる。本発明の治療用組成物は通常の方法および／または凍結乾燥により滅菌することができる。本発明の担体は更にアジュバントをも含んでいてもよく、それらのアジュバントにはフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）のアジュバント；他の細菌性細胞壁構成成分；アルミニウムを基にする塩；カルシウムを基にする塩；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清蛋白質；ウイルスコート蛋白質；および他の細菌由来の調製物が含まれるがこれらには限定されない。本発明の化合物に有用な担体には、いずれかの人工もしくは天然の脂質含有性標的分子、好ましくは細胞、細胞膜、リポソーム、およびミセルが含まれる。貫膜セグメントが本発明の化合物に結合する場合には、本発明の治療用組成物をリポソームもしくはミセルの形態で投与することが好ましい。本発明のリポソームおよびミセルは細胞の細胞外空間から細胞の細胞内空間へと化合物を輸送することができる。リポソームもしくはミセルと組合わせられる本発明の化合物の濃度には、その化合物の十分量を細胞へ輸送し、その結果そのような細胞内でのシグナル変換が調節されるのに有効な量が含まれる。本発明の治療用組成物は既述の本発明の化合物の内の少なくとも一つを含み、そして更にシグナル変換を調節することが可能な少なくとも一つの追加的治療用組成物をも含むことができる。先に一層詳細に記載されるように、本発明のＡＲＨ１ペプチドはシグナル変換経路における初期現象を調節することが可能である。本発明のＡＲＨ１ペプチドはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼもしくはｓｙｋ −ファミリーのチロシンキナーゼの活性を調節することができ、そのチロシンキナーゼが膜結合化分子の活性を調節する。先にも記載したように、本発明のＡＲＨ１ペプチド（Ｓｈｃ−選択的ペプチドもしくはＰＩ−３Ｋ−選択的ペプチド）あるいは本発明の高Ｐｒｏペプチドは膜結合化レセプターとの相互作用には直接関わることのないシグナル変換経路内の複数の段階を調節することができる。ＡＲＨ１ペプチドもしくは高Ｐｒｏペプチド自体はその経路内の後期にシグナル変換現象を調節する。従って当業者は、本発明の化合物を細胞内のシグナル変換の二重調節を可能にするためにいずれかの組み合わせで用いてもよいことを認識している。例えば、本発明の治療用組成物は、本発明の少なくとも一つのＡＲＨ１ペプチドおよび本発明の少なくとも一つの高Ｐｒｏペプチドを含むことができる。本発明の治療用組成物が細胞内のシグナル変換を刺激しうる少なくとも一つのリン酸化ＡＲＨ１ペプチドおよび細胞内のシグナル変換を阻害しうる高Ｐｒｏペプチド、あるいは細胞内のシグナル変換を阻害しうる少なくとも一つの非リン酸化ＡＲＨ１ペプチドおよび細胞内のシグナル変換を阻害しうる少なくとも一つの高Ｐｒｏペプチドを含むことが好ましい。本発明の治療用組成物をいずれかの動物、好ましくは哺乳類、および更に一層好ましくはヒトに投与することができる。有効な様式での本発明の治療用組成物を投与するための許容されるプロトコールには、個々の投与剤サイズ、投与剤数、投与剤投与の頻度、および投与の様式が含まれる。輸送の方法は、疾患の予防および治療に適合するいずれかの方法を含むことができる。輸送の方法には非経口投与、経口投与、静脈内投与、局所投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）すなわち局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えばエアロゾルによる）、あるいは経皮投与が含まれるが、これらには限定されない。本発明は更に、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの活性化の刺激を阻害しうる化合物を同定するためのキットも含む。そのようなキットには：（１）チロシンキナーゼ；（２）チロシンキナーゼの活性を刺激化しうる本発明の化合物；および（３）チロシンキナーゼの活性を測定するための方法が含まれる。例えばそのキットにｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼによる改変を受けることが可能な初期標的分子およびそのような改変を検出するための手段を添加することにより、阻害的化合物を同定するために本発明のキットを改変することは当業者の技術範囲内に含まれる。チロシンキナーゼの活性を、例えばキナーゼによる初期標的分子の自己リン酸化もしくは改変を測定することにより測定することが可能である。ある態様では本発明のキットは：本発明の（１）ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼおよび（２）刺激性ＡＲＨ１ペプチド；ならびに（３）所望されるリン酸化を施すに十分な量のγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含む。本発明のキットは、ｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、より好ましくはＦｙｎもしくはＬｙｎ、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、および更に一層好ましくはＦｙｎを含んでいてもよいが、それらには限定されない。本発明の適切な刺激性ＡＲＨ１ペプチドは、本明細書に開示されるリン酸化ＡＲＨ１ペプチドを含む。本発明のキットは配列ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩを有するリン酸化ＡＲＨ１ペプチドを含むことが好ましく、配列ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩであることが一層好ましい。ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ内へのγ−³²Ｐ−ＡＴＰの取り込みを検出するためのいずれかの手段がそのキット内に含まれていてもよく、そのような手段は例えばホスホセルロースブロット用の手段である。他の態様では本発明のキットはチロシン残基を有するいずれかのペプチドを更に含むことができる。そのようなペプチドはアミノ酸配列ＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬを含むことが好ましい。他の態様では本発明のキットは、初期標的分子の自己リン酸化もしくはリン酸化を検出するための手段として使用されるべきホスホチロシン残基に特異的な抗体を含むことができる。リン酸化もしくは非リン酸化標的分子は、抗−ホスホチロシン抗体の添加前もしくは後に表面（例えばニトロセルロースもしくはＥＬＩＳＡプレート）に結合することができる。例えば抗体結合が蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析により分析予定である場合には抗体の添加後にも標的分子が未結合のままであることが可能である。本発明のキットは更にその標的分子への抗体の結合を検出するための「顕色用構成成分」を含むことができる。この顕色用構成成分は抗体に結合する化合物を含んでいてもよく、その化合物は検出用標識に連結している。結合性化合物は、第一抗体が標的分子に結合する際にその第一抗体に結合しうる第二抗体；抗体に結合する細菌表面蛋白質（例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧ）；ビオチン−ストレプトアビジンもしくはビオチン−アビジン連結化検出系；抗体と相互作用する細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、あるいはマクロファージ）；抗体に結合する真核生物細胞表面蛋白質（例えば、ＦＣレセプター）；ならびに補体蛋白質、を含むことができるが、これらには限定されない。検出用標識の変異体を用いることができ、それらには放射活性ラベル、酵素性ラベル、および蛍光ラベルが含まれるがそれらには限定されない。標識の検出はアッセイに依存して様々な熟知された技術を用いて達成することができる。酵素アッセイ（例えば、アルカリ性ホスファターゼもしくはセイヨウカラシパーオキシダーゼの使用）では、肉眼的か、あるいは例えばデンシトメーターもしくは分光光度計のような装置により検出することが可能である比色分析用産物を生じさせることがよくある。本発明のキットは更に、免疫沈降法および免疫ブロット分析を実施するための試薬を含むことが可能である。本発明の別の特徴および態様では、キットは：（１）チロシンキナーゼ（２）高プロリン蛋白質；および（３）初期標的分子を含む。本発明のキットはｓｒｃ −ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、もしくはそれらのいずれかの組み合わせ物を含むことが好ましく、より好ましくはＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、もしくはそれらのいずれかの組み合わせ物、および更に一層好ましくはＬｙｎもしくはＦｙｎ、あるいはそれらの組み合わせ物を含むが、それらには限定されない。適切な高プロリン蛋白質はＰＩ−３Ｋおよびｐ８５［８０〜１０４］を含むがそれらには限定されない。初期標的分子はリン酸化を受けることが可能な蛋白質もしくは脂質の分子を含むことが好ましく、より好ましくは脂質分子、そして更に一層好ましくはホスファチジルイノシトール、４−リン酸ホスファチジルイノシトール、４，５−二リン酸ホスファチジルイノシトール、あるいはそれらの組み合わせ物を含む。標的分子のリン酸化を検出するためのいずれかの手段がキット内に含まれていてもよく、その手段の例は薄層クロマトグラフィー分析のための手段などである。このようなキットはチロシンキナーゼ／標的分子結合の活性を競合的に阻害しうる本発明の適切な化合物を発見するのに用いられる。本発明のキットを、各段階を研究用技術により実施することを必要とする自動システムもしくは手動システム内で用いることができる。この検査用キットは更にチロシンキナーゼの酵素活性を維持するのに必要とされる全ての適切な反応緩衝液を含むこともできる。本発明のキットは免疫応答、特にＢ細胞およびＴ細胞におけるものに関与する細胞内のシグナル変換を調節しうる治療用組成物の同定に特に有用である。特に有用な化合物はチロシンキナーゼ、アダプター分子、もしくは脂質キナーゼに結合するおよび／またはそれらを活性化する化合物を含み、かつそれらの化合物は高い特異性を有するためそれらを低用量で投与することが可能となる。本発明の他の態様は、細胞内のシグナル変換を阻害しうる化合物を同定するための方法である。本発明のある態様では、阻害性化合物を；（ａ）チロシンキナーゼを仮想的阻害性化合物と接触させて反応混合物を形成させる段階；（ｂ）その反応混合物を本発明の刺激性ＡＲＨ１ペプチドと接触させる段階；および（ｃ）その仮想的阻害性化合物がチロシンキナーゼの自己リン酸化を阻害する能力を決定する段階、を含む方法により同定することができる。本発明で用いられるチロシンキナーゼはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、もしくはそれらのいずれかの組み合わせ物を含むことが好ましく、より好ましくはＦｙｎ、Ｌｙｎ、もしくはＢｌｋ、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、および更に一層好ましくはＢｔｋもしくはＦｙｎ、あるいはそれらの組み合わせ物を含むが、それらには限定されない。適切な刺激性ＡＲＨ１ペプチドには本明細書に開示されるリン酸化ＡＲＨ１ペプチドが含まれる。他の態様では阻害性化合物は、キナーゼによるリン酸化を受けうる標的分子とチロシンキナーゼとを接触させて反応混合物を形成することにより同定することができる。その後にこの反応混合物を仮想的阻害性化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる。その後に本発明の刺激性ＡＲＨ１ペプチドをそのアッセイ混合物に添加し、そしてその仮想的阻害性化合物がそのチロシンキナーゼによりその標的分子のリン酸化を阻害する能力を測定する。本発明の別の特徴および態様に関しては、阻害性化合物を：（ａ）チロシンキナーゼを仮想的阻害性化合物と接触させて反応混合物を形成させる段階；（ｂ）その反応混合物を高プロリン蛋白質と接触させてアッセイ混合物を形成させる段階；（ｃ）そのアッセイ混合物をそのチロシンキナーゼによる改変を受けることが可能な初期標的配列と接触させる段階；および（ｄ）その仮想的阻害性化合物がそのチロシンキナーゼによる標的分子の改変を阻害する能力を決定する段階、を含む方法により同定することが可能である。適切なチロシンキナーゼにはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼが含まれ、好ましくはキナーゼＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、あるいはそれらのいずれかの組み合わせ物、より好ましくはＦｙｎ、Ｌｙｎ、もしくはＢｔｋ、あるいはそれらのいずれかの混合物、および更に一層好ましくはＢｔｋもしくはＦｙｎが含まれるが、それらには限定されない。本発明の方法において有用な高プロリン蛋白質にはＰＩ−３Ｋが含まれることが好ましいが、これには限定されない。初期標的分子がリン酸化を受けうる蛋白質もしくは脂質の分子を含むことが好ましく、脂質分子を含むことがより好ましく、そしてホスファチジルイノシトール、４−リン酸ホスファチジルイノシトール、４，５−二リン酸ホスファチジルイノシトールあるいはそれらの組み合わせ物を含むことが更に一層好ましい。初期標的分子の改変を検出するための方法には例えば、ホスホセルロースブロットもしくは薄層クロマトグラフィーが含まれ得る。本発明の他の態様には、シグナル変換を調節しうる化合物を同定するための細胞を基にするアッセイを用いる方法が含まれる。ある態様ではシグナル変換を刺激しうる化合物の同定に有用な本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞を、その化合物がその細胞内に侵入することが可能な様式で仮想的刺激性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物と細胞を、その化合物と適切な細胞内分子との会合が可能になるようにインキュベートする段階；（ｃ）細胞を溶解する段階；および（ｄ）その化合物に結合した細胞内分子のリン酸化の段階を決定する段階、を含む。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されない。適切な細胞内分子にはｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、特にＬｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０が含まれるがこれらには限定されない。細胞内分子のリン酸化の状態を決定するための方法にはＥＬＩＳＡアッセイもしくはＦＡＣＳ分析が含まれる。溶解した細胞をＥＬＩＳＡプレートに結合させた細胞内分子に特異的な抗体と接触させることが可能であることが好ましい。そのプレートを洗浄し、そしてその後に先に詳細が記述されている標識を結合させてある抗−ホスホトリプシン抗体と接触させてもよい。ＥＬＩＳＡプレートに結合した抗−ホスホトリプシン抗体の量を測定して、その仮想的刺激性化合物による細胞内分子のリン酸化およびそのことによる刺激化の程度を決定することができる。細胞内分子のリン酸化の状態を決定するための他の方法には、細胞内分子に特異的な抗体を溶解させた細胞と溶液中で接触させることが含まれる。抗−ホスホトリプシン抗体をその溶液に添加し、そしてＦＡＣＳ分析により分析することができる。抗−ホスホトリプシン抗体は蛍光標識を有していてもよいが、あるいは標識を有する第二抗体をその溶液に添加してもよい。他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは、シグナル変換を阻害しうる化合物の同定に有用である。本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物を細胞と共に、その化合物が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ）その細胞表面上の膜結合化レセプターを連結させる段階；（ｄ）その細胞を溶解する段階；および（ｅ）その仮想的阻害性分子へ結合した細胞内蛋白質のリン酸化の状態を決定する段階、を含むことができる。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されない。適切な細胞内分子はＬｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０を含んでいてもよいが、これらには限定されない。細胞内蛋白質のリン酸化の状態は直ぐ上に詳細に記載される方法を用いて決定することができる。更に他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物とその細胞とを、その化合物が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ）細胞表面上の膜結合化レセプターを連結させる段階；および（ｄ）仮想的阻害性分子が細胞内のカルシウム流動化を阻害する能力を決定する段階、を含むことができる。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されない。適切な仮想的調節分子には、本発明のＳｙｋ−選択的、Ｓｈｃ−選択的、もしくはＰＩ−３Ｋ選択的ペプチドのミメトープが含まれる。カルシウム流動性は、Ｊｕｓｔｍｅｎｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：８８１−８８６、１９８６、において一般的に記載される方法を用いて測定することが可能である。更に他の態様では、本発明の細胞を基にするアッセイは：（ａ）細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる段階；（ｂ）その化合物とその細胞とを、その化合物が細胞内分子に結合しうるようにインキュベートする段階；（ｃ）細胞表面上の膜結合化レセプターを連結させる段階；および（ｄ）仮想的阻害性分子が細胞内のリン酸化ホスホイノシチド形成を阻害する能力を決定する段階、を含むことができる。適切な細胞には哺乳類細胞が含まれるが、これには限定されない。リン酸化ホスホイノシチドの形成は、Ｒａｎｓｏｍｅｔａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：７０８−７１５、１９８６）に一般的に記載される方法を用いて測定することができる。好ましい態様では、本発明の細胞を基にするアッセイにおいて用いられる細胞には、その細胞を仮想的阻害性化合物と接触させる以前に透過性処理が施される。本発明のアッセイにおける使用のために細胞に透過性処理を施すための技術は以下の実施例に記載される。以下の実施例は説明の目的で提供され、かつ本発明の範囲を制限することを意図するのではない。実施例実施例１この実施例は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βの結合特異性をＡＲＨ１モチーフの保存化チロシン間に存在する４つのアミノ酸により決定することができることを説明する。多様性配列の領域が交換されている一連のＩｇ−αおよびＩｇ−βスイッチ突然変異体を構築した（図３、太文字により示されている）。Ｉｇ−αおよびＩｇ −βの細胞質側テイルの突然変異誘発もしくは切断は、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β のｃＤＮＡ鋳型を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いて達成された。各突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、１．５ｍＭＭｇ²⁺を含む標準的ＰＣＲ反応混合物中で用い、そして２５〜３０回の周期に付した（９４°、５５°、７２℃、各１分間）。内部ヌクレオチドの交換突然変異誘発もしくは点突然変異誘発は、その突然変異が重複配列の５’もしくは３’配列内に含まれるＤＮＡ断片の産生を必要とした。これらの断片を互いにつなぎあわせ、そしてその後に相補的フランクプライマーで増幅させた。Ｉｇ−α_HTおよびＩｇ−β_QTATスイッチ突然変異体、ならびにＹ１８２ΔＦおよびＹ１９３ΔＦチロシン突然変異体を、製造業者（Ｂｉｏｒａｄ社）により推奨されるキットを用いる部位特異的突然変異誘発により作製した。以下に列挙されるオリゴヌクレオチドを突然変異誘発用に用いた。突然変異もしくは切断を施したｃＤＮＡの最終増幅については、制限部位（下線を施してある）を含むプライマーを用いてクローニングを容易にさせた。切断突然変異体は以下のプライマーを用いて作製した：スイッチ突然変異体は以下のプライマーを用いて作製した：チロシン突然変異体は先に列挙されるＩｇ−α ＡＲＨ１プライマーを以下のプライマーと組み合わせて用いて作製した：点突然変異体は先に列挙されるＩｇ−α ＡＲＨ１プライマーを以下のプライマーと組み合わせて用いて作製した：先に列挙されるＩｇ−αおよびＩｇ−βの突然変異体をコードするＰＣＲ産物を一晩、２５℃下で、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、そして３％のＮｕＳｉｅｖｅアガロース（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社）を通す電気泳動により分離させ、そしてＭＥＲｍａｉｄ（ＢＩＯ１０１）で単離した。Ｉｇ− αおよびＩｇ−βの各突然変異体の融合蛋白質は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化させたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化させたｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内に連結させ、そして得られる組換え分子を細菌ＤＨ５α 内にトランスフォームさせることにより産生させた。アンピリシン（１００μｇ／ｍｌ）上で選択されたトランスフォーム体をＰＣＲを用いてスクリーニングし、そしてプラスミドＤＮＡをｔｉｐ−１００カラム（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。二本鎖ＤＮＡについては、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０（ＵＳＢ社）、ならびにｐＧＥＸ−３Ｘ（５’−ＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧ−３’）に対するプライマーを用いて直接配列決定を行った。適切なＩｇ−αおよびＩｇ−β融合蛋白質を産生するトランスフォーム化細胞を用いて、１リットルの対数期細胞（Ｏ．Ｄ．５９５＝０．３７５）を０．２ｍＭのイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導させることにより融合蛋白質を調製した。培養物を回収し、そして細胞を遠心分離によりペレット化させた。この細胞ペレットを、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、超音波処理により溶解させ、そしてその溶解物を遠心分離により清澄化させた。清澄化させた溶解物を５００μｌのグルタチオン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズの５０：５０スラリーと共に一晩４℃でインキュベートし、そしてその後に１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで完全に洗浄した。ビーズ体積当たりに結合した融合蛋白質の相対量を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）での染色により定量化した。幾つかの融合蛋白質をその後に、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＣａＣｌ₂中の３０μｇの因子Ｘａ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）で一晩４ ℃下で開裂した。この開裂化ペプチドを４ｍｌの総容積中でビーズから洗浄し出し、濃縮し、そして全ての開裂化ペプチドについて同等のペプチドモル数対ビーズ容積比を維持させて臭化シアン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の４００μｌの５０：５０スラリーに直接連結させた（室温で２時間）。残存性反応基は、更に２時間室温で０．２Ｍのグリシン中でそのビーズをインキュベートすることにより遮断した。このビーズを徹底的に洗浄して非結合化ペプチドを除去し、そして０．０２％のアジ化ナトリウムを含む溶解用緩衝液中に保存した。様々なＩｇ−αおよびＩｇ−β突然変異体融合蛋白質がｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼに結合する能力を、結合性アッセイおよびインビトロキナーゼアッセイを用いて検査した。Ｂリンパ腫細胞Ｋ４６、もしくは繊維芽細胞Ｆｙｎ⁺ＮＩＨ−３Ｔ３を遠心分離により回収し［試料当たり、２×１０⁷（Ｋ４６）もしくは１〜３×１０⁶（Ｆｙｎ⁺ＮＩＨ− ３Ｔ３）の細胞］、そして１ｍｌの溶解用緩衝液［０．５％ＮＰ−４０、１５０ｍｌＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＦ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ならびに各２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプシン、およびα−１−アンチトリプシン］中で溶解した。清澄化溶解物を完全な融合蛋白質もしくはペプチドでコートしたビーズ（５〜１０μｌの５０：５０スラリー）と共に４時間２５℃もしくは一晩４℃でインキュベートした。吸着後にはそのビーズを１ｍｌの溶解用緩衝液で３度洗浄し、そして様々な方法により分析した。Ｉｇ−αおよびＩｇ−β突然変異体融合蛋白質がチロシンキナーゼ活性を有する蛋白質に結合する能力、すなわちインビトロキナーゼアッセイを実施した。このインビトロキナーゼアッセイでは吸着物（既述の要領で調製される）を２度、１ｍｌのキナーゼ用緩衝液［１０ｍｌＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、および１ｍＭＰＭＳＦ］中で洗浄し、ペレット化させ、１０μＣｉのγ−³²ＰＡＴＰ、３０００Ｃｉ／ｍｍを含む２０μｌのキナーゼ用緩衝液中に再懸濁させ、そして１０分間３０℃ でインキュベートした。その後にこの試料を溶解用緩衝液中で洗浄し、そして３０μｌの還元的試料用緩衝液中に再懸濁させた。等量の蛋白質を１０％ＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分離し、そして−７０℃で１〜２時間のオートラジオグラフィーによる検出を行った。この結果が図４に示される。各スイッチ突然変異体はその親鎖（Ｉｇ−αもしくはＩｇ−β）およびその突然変異体が含む他の鎖からのアミノ酸により命名される。第一の保存化チロシンへの非保存化アミノ酸残基アミノ末端の交換が生じた場合（Ｉｇ−α：ＨＴ／Ｉｇ−β：ＮＬ）、いずれの鎖の結合性特性にも全く効果は観察されなかった（図４）。ＡＲＨ１チロシンの間の４つの非保存化残基が交換を生じた場合には（Ｉｇ−βのＱＴＡＴに代わるＩｇ−αのＤＣＳＭ）、Ｉｇ−αは野生型Ｉｇ− αに結合する５０〜６０ｋＤ能力範囲の蛋白質のクラスターと結合しなくなる。同様に、Ｉｇ−αの４つのアミノ酸（ＤＣＳＭ）を含むＩｇ−βスィッチ突然変異体が今度は蛋白質のこのクラスターに結合する。Ｉｇ−αおよびＩｇ−βに結合するｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼの特異性を更に調査するために、野生型、Ｉｇ−α（ＱＴＡＴ）もしくはＩｇ−β （ＤＣＳＭ）スイッチ突然変異体のいずれかに相当する合成ペプチドを用いてＦｙｎを過剰発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｆｙｎ⁺ＮＩＨ−３Ｔ３）の溶解物を探索した。Ｆｙｎ免疫ブロット分析を以下の要領で実施した。既述の要領で調製される吸着物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液で溶出させ、そして還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、そしてニトロセルロースに転移させた。転移物を、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）［１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭＮａＣｌ］中の３％無脂肪乾燥乳で４時間、２５℃で遮断させ、そして乳−ＴＢＳ中で１：５００〜１：１０００に希釈したウサギ抗−Ｆｙｎ抗体に２時間、２５℃下でハイブリダイズさせた。インキュベーション後、膜を、ＴＢＳ、もしくは０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴＢＳで交互に数回洗浄し、¹²⁵ −Ｉラベル化プロテインＡと共に２５℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、そして免疫反応性をオートラジオグラフィーにより可視化させた。別法では放射活性を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃ’ｓＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒをＩｍａｇｅＱｕａｎｔｖｅｒｓｉｏｎ３．２２と共に用いて定量化した。免疫ブロットはモノクローナルのα−ホスホチロシン抗体Ａｂ −２（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）を用いても実施した。これらの事例ではＴＢＳ中の３％の低リン酸塩のウシアルブミン（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社）を無脂肪乾燥乳の代わりに利用した。幾つかの免疫ブロットではアルカリ性ホスファターゼ複合化ヤギ抗−ウサギ抗体を用いた。これらのブロットを１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中で、ＶｅｃｔｏｒＩＩキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．社）を用いて発色させた。図５に示されるように、様々なペプチドに結合する免疫反応性Ｆｙｎを検出するための能力は、インビトロキナーゼラベルにより検出可能な５０および５９ｋＤａの蛋白質に結合する各モチーフの能力と平行していた（図４）。小さい方の免疫反応性バンドはＦｙｎの分解産物を表す。Ｉｇ−αのアスパラギン酸、システイン、セリン、およびメチオニンが個別にアラニンに変化している融合蛋白質も作製し（既述の要領で）、そしてそれらの結合性活性を評定した。ＤＣＳＭ点突然変異体のＧＳＴ融合蛋白質を因子Ｘａで開裂し、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に連結させ、そしてそれを用いて実施例１に記載されるＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物を吸着させた。吸着物を以前の要領で画化させ、そして電気泳動的転移物を抗−Ｆｙｎで探索した。図６に示されるようにこれらの単一アミノ酸変化の内のいずれのものも結合性には何の影響も及ぼさなかった。まとめると、これらの結果により、ＦｙｎへのＡＲＨ１モチーフの結合およびＦｙｎの活性化に寄与するのはＡＲＨ１領域の全体的構造であって、個々のアミノ酸ではないことが示される。２つもしくは複数のアミノ酸の変化もしくは欠失に関与する突然変異が機能の破壊には必要であるはずである。それに加え、Ｉｇ −αのＡＲＨ１モチーフはＬｙｎおよびＦｙｎについての結合特異性を決定する４つのアミノ酸からなる配列を含む。実施例２この実施例は、Ｉｇ−αのＡＲＨ１ドメインのチロシンはＦｙｎに対する結合には必須ではないことを示す。既述の要領で、Ｉｇ−αの２つの保存的ＡＲＨ１チロシン（位置１８２および１９３）ならびに第三の非保存的チロシン（位置１７６）を実施例１に記載される方法を用いてフェニルアラニンに突然変異させた。チロシンの位置は以下のとうりである：これらの突然変異体がＦｙｎ蛋白質に結合する能力を、実施例１に記載されるインビトロキナーゼアッセイを用いてアッセイした。吸着物を実施例１に記載される要領で調製し、そしてキナーゼ用緩衝液中で［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰと共にインキュベートし、洗浄し、そして１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。典型的な実験の結果を図７に示す。これら全ての位置のチロシンに代わるフェニルアラニンの置換はＩｇ−αの細胞質ドメインが安定にＦｙｎに結合する能力には影響を及ぼさなかった。野生型蛋白質とＩｇ−αチロシン突然変異化融合蛋白質がＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物から免疫沈降させたＦｙｎに結合する能力の間の比較を行った。野生型Ｉｇ−α ＡＲＨ１融合蛋白質、もしくは３つ全てのチロシンがフェニルアラニンに突然変異させてある融合蛋白質に結合した免疫反応性Ｆｙｎの量には全く差異が見いだされなかった（図８）。これらのデータにより、Ｉｇ−αのＡＲＨ１モチーフへのＦｙｎの根本的結合はこれらのチロシンには非依存的であり、かつそのためそれらのリン酸化に依存する可能性がないことが示される。実施例３この実施例は、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフのチロシンリン酸化がＦｙｎに対するその結合性を特異的に増加させることを示す。リン酸化されたＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフを作製するために、チロシンキナーゼＥｌｋの触媒性ドメインを、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターおよびクロラムフェニコール耐性標識を利用する発現ベクターｐＢＣ内にクローン化した。この構築物を、ｌａｃプロモーターの制御下にＴ７ポリメラーゼをコードするｃＤＮＡを含む細菌株ＢＬ２１／ＤＥ３内にトランスフェクトさせた。その後にＩｇ− α ＡＲＨ１野生型、ならびに融合蛋白質を含むＩｇ−α ＡＲＨ１チロシン突然変異体を、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドでの誘導化によりこれらの細菌内で発現およびリン酸化させた。チロシンキナーゼＥｌｋの触媒性ドメインは、ＴｏｎｙＰａｗｓｏｎ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒｏｎｔｏ）により供与されたｃＤＮＡから、以下のオリゴヌクレオチドプライマー： 5′-AAGAGGATCCGGTGGCCATGGAAGCTGTCCGGGAGTTTGC-3′および5′-AAGAGAATTCGAGT TCTCATGCCATTACCGACGG-3′を用いるＰＣＲ増幅を用いて増幅させた。このＰＣＲ産物を実施例１に記載される要領で精製し、ｐＢＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結させ、そして細菌ＢＬ２１／ＤＥ３内にトランスフォームさせた。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）上で選択され、かつ０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導化させた（既述の要領で）トランスフォーム体を、総細菌溶菌物を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、ニトロセルロースに転移させ、そしてα−ホスホチロシン抗体Ａｂ−２（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）での免疫ブロット（実施例１に記載される要領）を実施することにより細菌蛋白質をリン酸化させるそれらの能力についてのスクリーニングを行った。陽性クローンを選択し、そしてその後に電気穿孔法によりＩｇ−α ＡＲＨ１（切断化野生型）もしくはＩｇ−α ＡＲＨ１チロシン突然変異体をコードするプラスミドで形質転換させた。二重形質転換体をクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）およびアンピリシン（１００μｇ／ｍｌ）上で同時に選択し、そしてその後に誘導化を施してＥｌｋにより２〜５％がインビボでリン酸化されるＧＳＴ−融合蛋白質を発現させた。非リン酸化産物からリン酸化産物を分離させる目的で、この混合化融合蛋白質の約４０ｍｇをα−ホスホチロシン親和性カラム（１４ｍｇ／ｍｌセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）でのＩＧ２、ＲａｙＦｒａｃｋｅｌｔｏｎ博士、ＢｒｏｗｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、から供与された）に通した。その後にこのカラムをリン酸緩衝化食塩水［１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、４．３ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、および１．４ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．４）］で洗浄し、そしてリン酸化融合蛋白質を０．１Ｎ酢酸で溶出させた。リン酸化融合蛋白質溶出物を１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和させ、リン酸緩衝化食塩水に対して透析し、そしてグルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後にビーズ容積当たりに結合したリン酸化融合蛋白質の相対量を実施例１に記載される要領で定量化した。因子ＸａでのＩｇ−α ＡＲＨ１リン酸化融合蛋白質の開裂およびその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ホスホチロシン免疫ブロットにより、ＧＳＴ融合相手ではなくＡＲＨ１テイルがチロシンのリン酸化を受けることが示された。先の要領で発現されたＡＲＨ１野生型融合蛋白質のチロシンリン酸化分画を抗−ホスホチロシン親和性カラムを用いて更に精製し、そしてその後にグルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに結合させた。この分画は総融合蛋白質の僅か約２〜５パーセントのみを占めるに過ぎなかった。その後に等量のリン酸化および非リン酸化融合蛋白質を、それらがＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＮＰ４０溶菌物からのＦｙｎに結合する能力についてのアッセイを行った（実施例１に記載される要領で）。抗−Ｆｙｎ抗体を用いてＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞からＦｙｎを免疫沈降させた。この免疫沈降化Ｆｙｎを非リン酸化もしくはリン酸化ＡＲＨ１Ｉｇ−α融合蛋白質と共にインキュベートした。洗浄した吸着物を１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてニトロセルロースに転移させた。その後にこのブロットをウサギ抗−Ｆｙｎ抗血清および¹²⁵Ｉ−プロテインＡで探索した。図９に示されるように、非リン酸化モチーフと比較すると約１０倍多い免疫反応性Ｆｙｎがリン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフと結合した。Ｆｙｎ結合性の亢進における反応性ホスホチロシンの相対的役割を決定するために、チロシン残基１８２もしくは１９３あるいはその両方が非リン酸化もしくはリン酸化のいずれかを受けているＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフ（残基：１７１〜１９６）に対応するペプチドを合成した（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社モデル４３０Ａを用いて）。ペプチド配列および純度をアミノ酸加水分解分析により確認した（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社Ｐｉｃｏ− Ｔａｇシステム）。合成ホスホペプチドの使用により特異的残基での化学量論的リン酸化が確実に実施された。これらのペプチドはセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに共有結合的に連結し（融合蛋白質由来ペプチドについて先に記載した要領で）、そしてこれをＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物の吸着に用いた。抗−Ｆｙｎ免疫沈降物を陽性対照として分析した（図１０、「抗−Ｆｙｎ」ラベル）。洗浄した吸着物を１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、そしてニトロセルロースに転移させた。その後にそのブロットをＦｙｎに対する抗体および¹²⁵Ｉ−プロテインＡとで逐次的に探索した。洗浄したブロットをオートラジオグラフィーに供した。図１０に示される結果は、Ｉｇ−αのペプチドの全てに対するＦｙｎ結合が免疫ブロットにより検出されたことを示す。単一のリン酸化を受けたペプチドと結合したＦｙｎの量は非リン酸化ペプチドと比較すると２．０倍（Ｙ１８２）および１．６倍（１９３）増加した（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて測定した）。二重のリン酸化を受けたペプチドと結合したＦｙｎの量は２４倍増加した。新規の蛋白質がリン酸化されたＩｇ−αに結合するという可能性を更に詳しく説明するために、Ｋ４６溶解物からの吸着物をインビトロキナーゼ反応およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。吸着物をインビトロリン酸化に供し、そして実施例１に記載される方法に従って１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。図１１に示されるように、リン酸化されたＩｇ−αペプチドと結合するリン酸化が可能な新規の蛋白質の明白な証拠は全く存在しなかった。実施例４この実施例は、両方のチロシンリン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフが亢進化Ｆｙｎ結合性活性を呈することを示す。ＡＲＨ１チロシンの両方がリン酸化を受けているＩｇ−βおよびＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフペプチドを実施例１に記載される要領で合成した。これらのリン酸化ペプチドおよび追加的非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドをセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に連結させ、そしてＦｙｎの結合性の分析に用いた。合成の二重リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフペプチド、ならびに非リン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−βＡＲＨ１モチーフペプチドを用いてＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物を吸着させた。吸着物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画化し、転移させ、そしてウサギ抗−ＦｙｎおよびＩ¹²⁵プロテインＡでのブロットを作製した。図１２に示されるように、リン酸化されたＩｇ−αは非リン酸化Ｉｇ−αと比較すると一層効果的にＦｙｎに結合した。Ｉｇ−βはリン酸化されたＩｇ−αと同定度の効率でＦｙｎに結合した。これらの結果により、ホスホチロシン依存的相互作用の特異性はＱＴＡＴもしくはＤＣＳＭモチーフにより決定されるのではないことが示唆される。実施例５この実施例は、Ｆｙｎの特異的酵素活性がリン酸化されたＩｇ−αへの結合の際に増加することを示す。Ｉｇ−αペプチドに結合する免疫反応性Ｆｙｎの触媒活性を決定するために、ペプチドを基にするインビトロキナーゼアッセイを用いてＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３溶解物（実施例１に記載の要領で調製された）のＩｇ−α ＡＲＨ１吸着物における活性を測定した。ペプチドのチロシン１８２もしくはチロシン１９３、あるいは１８２プラス１９３がリン酸化されている非リン酸化Ｉｇ−αもしくはＩｇ −βをこの実験に用いた。Ｆｙｎを、ウサギ抗−Ｆｙｎ抗体（５μｇ抗体／試料）およびプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と共に行う２５℃下での逐次的な１時間のインキュベーションによりＦｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３（約２×１０⁶細胞等量／試料）細胞の溶解物から免疫沈降化させた。等量のビーズ結合化吸着物（既述の要領で調製した）もしくはＦｙｎ免疫沈降物（１μＭ〜１ｍＭの濃度でのリン酸化Ｉｇ−αペプチドと共に１時間予備インキュベートした後）を２度キナーゼ用緩衝液で洗浄し、ペレット化させ、チロシン１４２を取り囲むＴＣＲ−ζ鎖の一部分に相当する２ｍＭの外因性標的分子（ＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬ）、１０μＭＡＴＰ、および１０μＣｉの［ γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）を含む５０μｌのキナーゼ用緩衝液中に再懸濁させ、そして１０分間３０℃でインキュベートした。その後に各反応混合物を１２μｌの２５％トリクロロ酢酸でクエンチングさせ、そしてＷｈａｔｍａｎＰ８１ホスホセルロース上にブロットさせた。その後にブロットを７５ｍＭのリン酸中で数回洗浄し、そしてアセトンで乾燥させた。乾燥させたブロットをＢｅｃｋｍａｎ（モデルＬＳ５８０１）ベータシンチレーションカウンター上での液体シンチレーションにより計数した。免疫反応性Ｆｙｎについて既に検査してある等量の試料をキナーゼ活性についてアッセイする際には、酵素活性の曲線は一つを例外として免疫反応性Ｆｙｎのレベルに相関していた（図１３を参照されたい）。免疫反応性Ｆｙｎの相対的増加量（２４倍）と二重リン酸化されたＩｇ−αに結合したＦｙｎ酵素活性の相対的増加量（＞６０倍）との間には矛盾が存在し、このことによりこのペプチドに結合したＦｙｎは非リン酸化Ｉｇ−αに結合したものと比較すると一層触媒活性が強いことが示唆される。リン酸化されたＩｇ−αによるＦｙｎ活性のこの顕著な亢進を定量化するために、Ｉｇ−αホスホロ−ＡＲＨ１ペプチドがインビトロでＦｙｎを活性化する能力を分析した。Ｆｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物からの免疫精製化Ｆｙｎ（実施例１に記載される要領で調製される）を定常量で、増加濃度の二重リン酸化Ｉｇ −αか、あるいはリン酸化を回避する目的でＡＲＨ１チロシン１８２もしくは１９３が予めフェニルアラニンに変化させてあるＩｇ−αに添加した。Ｆｙｎ⁺ＮＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０⁶細胞等量／試料）から調製されたＦｙｎを含む抗− Ｆｙｎビーズに、増加量のリン酸化Ｉｇ−αペプチド、あるいはチロシン１８２および１９３が予めフェニルアラニンに変化させてある等価ペプチドを添加し、その後に２５℃で１時間インキュベートした。その後にキナーゼ活性をアッセイした。図１４に示されるように、Ｆｙｎの比活性はリン酸化Ｉｇ−αとのインキュベーションによりほぼ３倍増加したが、対応するＩｇ−αとのインキュベーションでは増加は見られなかった。Ｆｙｎ活性の増加は用量依存的かつ可飽和的であり、そして低濃度（５μＭ）のペプチドで検出可能であった。まとめると、実施例１〜５に記載される結果により、Ｆｙｎは配列ＤＣＳＭを含むＡＲＨ１モチーフに結合することが可能であることが示される。それに加え、そのＤＣＳＭ配列をフランクするチロシン残基のリン酸化はＦｙｎの刺激化にとって重要である。実施例６この実施例はペプチドが、ＬｙｎとＦｙｎとのＰＩ−３Ｋへの結合を阻害する能力がＰＩ−３Ｋ内に含まれる２つの高プロリン領域を反映することを示す。高プロリン配列ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴ（ｐ８５ α−サブユニット［８０−１０４］およびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡ（ｐ８５ α−サブユニット［２２９−３１８］を有する２本のペプチドを合成した。これらのペプチドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３０Ａ上で合成した。ペプチド配列および純度はアミノ酸加水分解分析により確認した（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社Ｐｉｃｏ−Ｔａｇシステム、一文字アミノ酸コード記号：Ｋ、リシン；Ｉ、イソロイシン；Ｓ、セリン；Ｐ、プロリン；Ｔ、スレオニン；Ｒ、アルギニン；Ｖ、バリン；Ｇ、グリシン；Ｎ、アスパラギン；Ｅ、グルタミン酸；Ｑ、グルタミン）。ｐ５６^lyn （［Ｌｙｎ１−１３１］）およびｐ８９^fyn（［Ｆｙｎ１−１４４］）ペプチドはそれらのキナーゼの各々のＳＨ３ドメインを含み、これらを臭化シアン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連結させ、そしてこれらを用いて、ｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９ −３１８］の存在もしくは非存在下でＰＩ−３Ｋを含むＫ４６Ｂリンパ腫細胞の洗剤溶解物を探索した。これらの直接連結化させたビーズは以下の要領で作製した。ｐ８９^fynおよびｐ５６^l ^yn のＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いてＫ４６ｃＤＮＡ鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた：各プライマーは後続のクローニングを容易にさせる非反復の制限部位（下線を施してある、ＢａｍＨＩ：ＧＧＡＴＣＣ；ＥｃｏＲＩ：ＧＡＡＴＴＣ）をコードする。その後にこのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩもしくはＥｃｏＲＩのいずれかで消化させ、そしてｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内に連結させた。ＤＮＡ配列分析を実施してそのＰＣＲ生成産物の精度を確認した（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ２．０、Ｕ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．社）。このｐＧＥＸ− ３Ｘ構築物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ（ＢＲＬ −Ｇｉｂｃｏ社）内にトランスフェクトさせ、そして融合蛋白質を、１リットルの対数期の細胞（Ｏ．Ｄ．５９５＝０．３７５）を０．２ｍＭのイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導することにより調製した。培養物を回収し、そして細胞を遠心分離によりペレット化させた。この細胞ペレットを、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０２％のアジ化ナトリウムを含む５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、そして融合蛋白質をその細胞から単離した。その後に融合蛋白質をビーズ（２ｍｌの５０：５０スラリー）に結合させ、そして１５０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＣａＣｌ₂中、３０μＭの因子Ｘａ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）で一晩３０℃下で開裂させた。その後に開裂化ペプチドを４ｍｌの総容積中でビーズから洗いだし、Ｓｐｅｅｄ− Ｖａｃにより２ｍｌに濃縮し、そしてその後に全融合蛋白質について同等の融合蛋白質数対ビーズ容積比を維持させて４００μｌの５０：５０スラリーの臭化シアン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に直接連結させた（室温で２時間）。その後に残りの反応性基を更に２時間室温で０．２Ｍグリシン中でそのビーズをインキュベートすることにより遮断した。その後にそのビーズを徹底的に洗浄して非結合化ペプチドを除去し、そして０．０２％のアジ化ナトリウムを含む溶解用緩衝液中に保存した。結合性実験およびペプチド阻害実験は以下の要領で実施した。Ｋ４６細胞（試料当たり１×１０⁷細胞等量）の清澄化溶解物［１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＦ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニン（２ｍｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（２ｍｇ／ｍｌ）、およびα−１−アンチトリプシン（２ｍｇ／ｍｌ）］を調製し、そしてＦｙｎ［１−１４４］もしくはＬｙｎ［１−１３１］（１０ｍｌの５０：５０スラリー）のいずれかの融合蛋白質でコートしたビーズと共にインキュベートした。ｐ８５の高プロリンペプチドをビーズ上のＬｙｂおよびＦｙｎ融合蛋白質のものの２００、２０、および２倍の濃度で吸着物に添加し、そして一晩インキュベートした。直接的に連結させたグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ペプチドビーズ吸着物を対照として用いた。その後にこれらのビーズを溶解用緩衝液中で５回洗浄し、同一緩衝液中に再懸濁させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により溶出分離させた。その後に蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転移させ、そしてｐ８５に対する抗体（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．社）での探索を行った。可溶化細胞（１×１０⁶細胞等量）からの清澄化溶解物を対照（ＷＣＬ）として参入させた。膜を、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）中で完全に洗浄し、そしてその後にアルカリ性ホスファターゼ（Ｆｉｓｈｅｒ社）と複合体形成させたウサギＩｇＧに対するヤギ抗体と共にインキュベートした。この膜を再度洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ標的分子（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社）で顕色させた。図１５ＡはＦｙｎ［１２−１４４］へのｐ８５ペプチド結合を説明し、そして図１５ＢはＬｙｎ［２７−１３１］へのｐ８５ペプチド結合を説明する。融合蛋白質が２倍濃度で存在する際には、ｐ８５［８０−１０４］はＰＩ−３ＫのＦｙｎへの結合を約９０％阻害した（走査型デンシトメトリーにより測定した）。ｐ８５［８０−１０４］とｐ８５［２９９−３１８］との両ペプチドは、それらのペプチドがＬｙｎもしくはＦｙｎ融合蛋白質のものの２０および２００倍の濃度で存在する場合にＰＩ−３Ｋとの結合を完全に遮断した。Ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドは、そのペプチドの濃度がＦｙｎ融合蛋白質のものの２００倍である際にＦｙｎとのＰＩ−３Ｋの結合を阻害するが、低濃度では検出可能な結合の阻害は全く示さなかった（図１５Ａ）。類似の結果がＬｙｎのＳＨ３に連結させたビーズを用いても観察されたが、例外は、ｐ８５［８０−１０４］とｐ８５［２９９−３１８］との両方による阻害が弱めであったことであり（図１５Ｂ）、このことによりＦｙｎがＬｙｎと比較するとｐ８５については低めの親和性を有することがあることが示唆される。これらの所見により、ｐ８５内での８０−１０４配列の認識はＰＩ−３ＫへのＳＨ３結合にとって必須であることが示される。ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインとのＰＩ−３Ｋの結合を媒介する際の高プロリンｐ８５配列の十分性を決定するためには、ｐ８５［８０−１０４］とｐ８５［２９９−３１８］とのペプチトをＣｎＢｒ−活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂビーズに連結させ、そしてこれを用いてＫ４６細胞の溶解物を探索した（先に記載の要領で）。そのビーズ上のそのペプチドによる結合を受けた蛋白質を試料用緩衝液中で沸騰させることにより溶出させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）に供し、ナイロン膜に転移させ、そして抗 −Ｆｙｎ抗体および抗−Ｌｙｎ抗体での免疫ブロットを実施した。図１６Ａはｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］に対するＦｙｎの結合性を示す。図１６Ｂはｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］に対するＬｙｎの結合性を示す。ＬｙｎとＦｙｎとに対するｐ８５［８０−１０４］の結合性は検出が容易であった。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドは検出可能な結合性活性を全く示さなかった。免疫反応性ＬｙｎもしくはＦｙｎはマウスＣｓｋ蛋白質の残基１〜１８を含む対照ペプチドには結合しなかった。従ってＰＩ−３Ｋの残基８０〜１０４に広がる高プロリン領域はｐ８５へのＳｒｃ−ファミリーキナーゼＳＨ３の結合を媒介するに十分な情報を含む。ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインへのｐ８５［８０−１０４］の結合が直接的相互作用であるかどうかを決定するために、切断されたＬｙｎ−およびＦｙｎ−ＧＳＴ融合蛋白質を発現する細菌の洗剤溶菌物をｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］に連結させたビーズで探索した。ＧＳＴとのＬｙｎ［１−２７］、Ｌｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１３１−２４３］、およびＦｙｎ［１−２７］融合物は、Ｌｙｎ［１−１３１］およびＦｙｎ［１−１４４］について既述されるものと類似の様式で調製した。ｐ５９^fynおよびｐ５６^lyn ペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマー対を用いるＫ４６ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた：各プライマーは、ｐＧＥＸ−３Ｘ内への後続クローニングを容易にさせる非反復の制限部位（下線を施してある、ＢａｍＨＩ：ＧＧＡＴＣＣ；ＥｃｏＲＩ：ＧＡＡＴＴＣ；ＳｍａＩ：ＣＣＣＧＧＧ）をコードする。各々のＧＳＴ− 融合蛋白質を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を２ｍｌの培養物から回収した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質（Ｌｙｎ［１−２７］、Ｌｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１３１−２４３］、Ｆｙｎ［１−２７］、およびＦｙｎ［１−１４４］）を含む細菌溶菌物をｐ８５［８０−１０４］で吸着させ（１０μｌの５０：５０スラリー）、そしてｐ８５［２９９−３１８］ペプチドを製造業者により提供された説明事項に従ってｍｌの活性化ビーズ当たり２ｍｇの比率でセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂビーズに連結させた。吸着物を溶菌用緩衝液で完全に洗浄し、同一緩衝液中に再懸濁させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）により分画化させた。蛋白質をクーマシーブルー染色により可視化させた。ｐ８５［８０−１０４］ペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルのクーマシー染色により決定したところ、ＳＨ３ドメインを含むＬｙｎおよびＦｙｎ融合蛋白質のみと結合した（Ｌｙｎ［２７−１３１］、Ｌｙｎ［１−１３３］、およびＦｙｎ［１−１４４］；図１７Ｃ）。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドはｐ８５［８０−１０４］と同一の蛋白質と結合した（図１７Ｄ）。グルタチオン−Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズでの吸着を実施して、各細菌溶菌物が等量のＧＳＴ融合蛋白質を含むことを確認した（図１７Ｂ）。グリシン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズでの対照吸着により、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズへの非特異的結合は生じなかったことが確認された（図１７Ａ）。これらのデータにより、ＰＩ−３Ｋのｐ８５サブユニット内の高プロリン領域は、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインとの選択的かつ直接的結合を介在することが可能であることが示される。実施例７この実施例はＰＩ−３Ｋ活性におけるＳＨ３結合性の効果を示す。ｐ８５サブユニットに対する抗体（１μｌの全抗血清、ｕｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社）を清澄化させたＫ４６細胞（試料当たり１×１０⁷細胞）の溶解物に添加した。その後に免疫複合体を４０μｌの（５０：５０スラリー）プロティンＡビーズ（Ｐａｒｍａｃｉａ社）で沈殿させた。吸着物を洗浄し、そして等量部に分割し、そしてこれを実施例６に記載される要領で因子ＸａでのＧＳＴ−融合蛋白質の開裂により調製される様々な濃度のＬｙｎ［２７−１３１］、Ｆｙｎ［１−１４４］、もしくはＢｌｋ［１−１０８］ペプチドを含む溶解用緩衝液に添加した。４℃で一晩のインキュベーションの後、吸着物をＰＡＮ緩衝液［１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＰＩＰＥＳｐＨ７、および２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン］中で完全に洗浄した。その後に５μｌの洗浄化ビーズの５０：５０スラリーを、０．２ｍｇ／ｍｌの超音波処理化ホスファチジルイノシトール（Ｓｉｇｉｎａ社もしくはＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社）、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、５μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ、および１０μＭＡＴＰを含む１０μｌ中、３０℃で１５分間インキュベートした。この反応を１００μｌの１ＭＨＣｌの添加により停止させ、そのリン脂質を２００μｌのＣＨＣｌ₃−メタノール（１：１）で抽出し、有機相を８０μｌのＨＣｌ−メタノール（１：１）で洗浄し、そして凍結乾燥させた。その後にこのリン脂質を２×５μｌのＣＨＣｌ₃−メタノール（１：１）中に溶解し、１％のシュウ酸カリウムに予め浸してあるシリカゲル（ＳｉｌｉｃａＧｅｌ）６０プレート（Ｓｉｇｍａ社）上にスポットし、そしてＣＨＣｌ₃− メタノール−４ＭＮＨ₄ＯＨ（９：７：２）を含む緩衝液中の上昇薄層クロマトグラフィーにより分離させた。リン脂質標準（Ｓｉｇｍａ社）を同一プレート上での分離にかけた。放射ラベル化脂質はオートラジオグラフィーにより検出し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒスキャナーおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社）で定量化した。結果が図１８に示される。ＬｙｎおよびＦｙｎの両方に由来するポリペプチドを含むＳＨ３は各々約７倍および５倍ＰＩ−３Ｋの活性を増加させる一方で、ＰＩ−３Ｋとは結合しないＢｌｋは全く効果を示さなかった。この活性化は約１０ μＭのペプチドの存在下では最大限度の半分であり、そして１００μＭｐ８５［８０−１０４］の添加により遮断された。対照実験ではＬｙｎおよびＦｙｎのＮ−末端の独特な領域の断片はＰＩ−３Ｋ活性を刺激しなかった。これらのデータにより、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメインは直接的にＰＩ−３Ｋ活性を刺激することが可能であることが示されるが、これは恐らくｐ８５サブユニット内の高プロリン領域への結合によるものと思われる。この活性化はｐ８５のサブユニットのリン酸化およびｐ８５へのホスホチロシン−含有性ペプチドの結合性の両方には無関係である。このデータにより、抗−ホスホチロシンに対する抗体でのｐ８５の沈降性の増加を誘導したと報告される抗原レセプター刺激は、ＰＩ− ３Ｋのリン酸化自体よりもむしろＰＩ−３Ｋとリン酸化されたｓｒｃ−ファミリーキナーゼおよび／またはＣＤ１９との結合の増加を反映することがあることが示唆される。実施例８この実施例は、Ｂ細胞抗原レセプターが媒介するＰＩ−３Ｋの活性化の際のＳＨ３−ｐ８５［８０−１０４］の相互作用の重要性を記載する。ＰＩ−３Ｋは、Ｂ細胞抗原レセプターに特異的な抗体で刺激していない、もしくは刺激した精製された非活性化Ｂ細胞（非活性化マウスＢ細胞（ｐ＞１．０６２）はパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配沈降法により単離された）から免疫沈降化させた。その後に免疫沈降化させたＰＩ−３Ｋの活性を評定した。抗原レセプターの連結により約７倍のＰＩ−３Ｋの活性の増加がもたらされ、この増加は１分目で最大値に達した（図１９）。非活性化Ｂ細胞に透過性処理を施してｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］ペプチドが細胞内に侵入するのを可能にさせ、そしてその後に抗原レセプターに特異的な抗体（抗−ＩｇＭおよび抗−ＩｇＤ）を用いて１分間刺激化させた。細胞（試料あたり５×１０⁷細胞）に、マイアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液［１０ｍＭＭｎＣｌ₂、２ｍＭＥＧＴＡ、および２０ｍＭＣａＣｌ₂（３０ｎＭにまでＣａ⁺²で緩衝化させた）、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および２８５μｇ／ｍｌ α−リソホスファチジルコリン、パルミトイル］単独でか、もしくは１．４ｍＭｐ８５［８０−１０４］およびｐ８５［２９９−３１８］を含むマイアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液中、氷上で１分間の透過性処理を施した。細胞を３７℃で２分間暖めた後に、リン酸緩衝化食塩水単独（白抜き棒）、もしくは５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗−ＩｇＤ（ＪＡ１２）および抗−ＩｇＭ（ｂ −７−６）（黒塗り棒）を含むそのリン酸食塩水の存在下、３７℃で５分間インキュベートした。その後に細胞を遠心分離により回収し、緩衝液（０．５ｍｌ）を含む１％ＮＰ−４０中で溶解し、そして氷上で３０分間インキュベートした。核を遠心分離（１４，０００ｇ、１５分間）により除去した。各試料に５μｌ（５０：５０スラリー）のプロテインＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）およびｐ８５に対する４μ ｌの抗血清（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．社）を添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。吸着物を１％ＮＰ−４０溶解用緩衝液で５回洗浄し、次いでＰＡＮ緩衝液で２回洗浄した。その後に各沈降物の部分（５μｌの５０：５０スラリー）を除去し、そしてＰＩ−３Ｋ酵素活性についてのアッセイを実施した。ｐ８５［８０−１０４］の存在下では、抗−ＩｇによるＰＩ−３Ｋ活性の刺激化は完全に遮断された（図１９）。ｐ８５［２９９−３１８］ペプチドはＰＩ− ３Ｋ活性のレセプター媒介性活性化には検出可能な効果を全く示さなかった。Ｂ細胞リンパ腫株Ｋ４８μｍ１７を用いた際には本質的に同一な結果が取得された。免疫ブロットにより、等量のｐ８５が各沈殿物中に存在することが確認された。ホスホチロシンに対する抗体（Ａｂ−２、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）での二重ブロットの探索によってはｐ８５の検出可能なリン酸化は全く示されなかった。このことにより、観察されたＰＩ−３Ｋ活性の増加およびその後のＢＣＲ刺激化はｐ８５のチロシンリン酸化とは独立したものであることが示唆される。抗−ＣＤ３刺激化により誘導されるＰＩ−３Ｋの活性化もやはりチロシンのリン酸化とは独立したものである。これらの所見により、ＰＩ−３Ｋの活性化は直接的なＳｒｃ−ファミリーキナーゼのＳＨ３ドメイン結合およびその後の抗原レセプターの連結を介して生じることが示唆される。実施例９この実施例は、ＳｈｃがＩｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフに結合することを示す。Ａ．リン酸化されたＩｇ−αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１、ならびに非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフに結合するＳｈｃ完全な細胞質ドメインおよびＡＲＨ１モチーフペプチドを、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．（ＥＭＢＯＪ．１３：１９１１−１９１９、１９９４）に記載される要領で細菌により発現されるＧＳＴ融合蛋白質からの開裂により取得した。幾つかの事例ではペプチドを、インシュリンレセプターキナーゼ（ＩｎｓｕｌｉｎＲｅｃｅｐｔｏｒＫｉｎａｓｅ）のＢサブユニット（ＢＩＲＫ）（Ｈｅｒｒｅｒａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：５５６０−５５６８、１９８８、に記載される）の切断された組換え体形態を用いてリン酸化させた。ＧＳＴペプチドをグルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに吸着させ、それをキナーゼ用緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ［ｐＨ７．４］、５ｍＭＭｎＣｌ₂、２ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭＮａ₃ＶＯ₄）中で洗浄し、そして０．５ｍＭＡＴＰ（トレーサーとしての１μＣｉ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ）および０．１単位のＢＩＲＫ（１単位は、ＰＬＣγ１を基にするペプチドＲＲＮＰＧＦＹＶＥＡＮＰＭＰ内に１ｎモルリン酸／分を取り込ませるのに必要なキナーゼの量として特定される）を含むキナーゼ用緩衝液（０．５ｍｌ）中でインキュベートした。この反応を３０℃で１２〜１６時間進行させた。その後にペプチドを因子Ｘａ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＧＳＴから開裂させ、そしてセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に等モル量で直接連結させた。リン酸化の化学量論は典型的には２０〜２５％であった。別法では合成のリン酸化および非リン酸化合成ペプチドをＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｃ．社（ＦｏｒｔＣｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）から購入した。用いたＡＲＨ１ペプチドの配列は；であった。リン酸化チロシンは（ｐ）により示される。Ｂリンパ腫Ｋ４６Ｊ、Ｊ５５８Ｌμｍ３形質細胞腫、野生型ＮＩＨ−３Ｔ３、およびＦｙｎ⁺ＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞株を、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５％の非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補足してあるＩＭＤＭ中で培養した。ＩｇＭ抗−Ｈ２ｋ^kを発現するＫ４６Ｊを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で増殖させた。ニトロフェニル（ＮＰ）−特異的レセプターを発現するＪ５５８Ｌμｍ３を、１μｇ／ｍｌのミコ安息香酸、１５μｇ／ｍｌのヒポキサンチン、２５０μｇ／ｍｌのキサンチンの存在下で培養した。刺激化細胞は以下の要領で調製した。Ｋ４６Ｊ細胞（５０×１０⁶／ｍｌ）を抗−μ（ｂ−７−６）ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）で１時間、３７℃で刺激した。対数期のＪ５５８Ｌμｍ３形質細胞腫細胞（５０×１０⁶／ｍｌ）をＮＰ₁₂−ＢＳＡ（５０μｇ／ｍｌ）で３７℃下１分間刺激化させ、そして即座に溶解した。刺激化および非刺激化のＫ４６ＪおよびＪ５５８Ｌμｍ３、ならびにＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１％ＮＰ−４０溶解用緩衝液：１％ＮＰ−４０、１０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、各２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプシン、α−１アンチトリプシン、１０ｍＭＮａＦ、２ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、中で溶解し、そして氷上で１５分間インキュベートした。溶解物（０．５ｍｌ）をエッペンドルフ管中、×１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。Ｉｇ−α蛋白質を既述の清澄化溶解物から、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ｖ／ｖで２０μｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ）に直接連結させてある抗−Ｉｇ−α抗体（１０μｇ）を用いて免疫沈降させた。この免疫沈降混合物を４℃で３０分間インキュベートした。同時に免疫沈降させた蛋白質を最初に２０ｍＭｐ−ＮＰＰ（０．１ｍｌ）で３０分間、氷上で溶出させ、そしてその後にＩｇ−αをＬａｅｍｍｌｉ試料用緩衝液で溶出させた。吸収は更に、清澄化溶解物を：ペプチドを保持しないセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｃｏｎ）、Ｉｇ−αもしくはＩｇ−βの全細胞質ドメイン（ＦＣＤ）、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−ζ、あるいは非リン酸化およびリン酸化（ｐＩｇ−α）ＡＲＨ１モチーフペプチド、と共にインキュベートすることにより実施した。細胞溶解物（０．５ｍｌ中の２０×１０⁶細胞）を４℃で２時間、グルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ｖ／ｖの２０μ ｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連結させたＧＳＴもしくはＧＳＴ／Ｇｒｂ２の全長融合蛋白質（１０μｇ）か、あるいはＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ｖ／ｖの２０μｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に直接連結させた様々な合成ペプチドおよび細菌により発現されるペプチド（２０μｇ）を用いて沈殿させた。吸収物を溶解用緩衝液で迅速に洗浄し、そしてＬａｅｍｍｌｉ試料用緩衝液で溶出させた。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２融合蛋白質の沈降化は、非リン酸化およびリン酸化されたＡＲＨ１ペプチド（１０μｇ）を連結させてあるセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５０％ｖ／ｖの６μｌ）を用い、これをＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２ドメイン融合蛋白質を含む細菌溶菌物（０．５ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートして実施した。この免疫沈降物および吸着物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画化した。分画化した蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上に転移し、そして５％のウシ血清アルブミンを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水を用いて２時間遮断した。その後にこのブロットを以下の抗体と共にインキュベートした：モノクローナル抗−ホスホチロシン（Ａｂ２；ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）、抗−ｐ８５、ウサギ抗−ＳＨＣ（ＵＢＩ社）、およびウサギ抗−Ｉｇ−α 。抗−ＳＨＣおよび抗−Ｉｇ−α抗体を用いる免疫複合体形成は、アルカリ性ホスファターゼヤギ抗−ウサギ−Ｉｇ（ＳＢＡ社）を用いて検出した。抗−ｐＴｙｒ抗体を用いる免疫複合体形成は、セイヨウカラシパーオキシダーゼヤギ抗− マウス−Ｉｇ（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＡ）を用いて検出した。図２０に示される結果は、ｐ−ＮＰＰ溶出物を等量で分画化し、そして抗−ＳＣＨでの免疫ブロットを行ったことを示している。図２１に示される結果は、Ｓｈｃがチロシンリン酸化Ｉｇ−α細胞質ドメイン（Ｉｇ−αＦＣＤおよびｐＩｇ−αＦＣＤ）に、そしてＡＲＨ１モチーフ（Ｉｇ−αＡＲＨ１およびｐＩｇ−αＡＲＨ１）に結合することを示す。Ｓｈｃはチロシンリン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−βに、そして非リン酸化Ｉｇ−αに結合した。結合は特異的であることが見いだされ、それは非リン酸化Ｉｇ−β、ＣＤ３ε、およびＴＣＲ−ζ ＡＲＨ１ペプチドへの結合が全く検出されなかったためである。それに加え、ＰＩ−３Ｋのｐ８５サブユニットの非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１への結合は検出されなかった。従ってこのデータにより、Ｓｈｃはリン酸化されたＩｇ −αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１ペプチドには結合するが、非リン酸化Ｉｇ−β、ＣＤ３ε、およびＴＣＲ−ζ ＡＲＨ１ペプチドには結合しないことが示される。Ｓｈｃが非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドに結合する能力は、チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている突然変異化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドを用いてＳｈｃを吸着させ（Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．、前述、に記載される）、そして抗−Ｓｈｃ抗体での免疫ブロットを行うことにより確認した。これらの結果により、野生型ペプチドと比較する際に等量のＳｈｃが突然変異化ペプチドと結合したことが示される。Ｂ．２つの個別のメカニズムによりＩｇ−α ＡＲＨ１モチーフに結合するＳｈｃ細胞溶解物をセクションＡに記載される要領で調製した。吸着は、得られる清澄化溶解物を用い、その溶解物をチロシンリン酸化（ｐ）および非リン酸化Ｉｇ −αおよびＩｇ−β ＡＲＨ１ペプチドセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズと共に、５０ｍＭｐ−ＮＮＰの非存在下（−）もしくは存在下（＋）でインキュベートすることにより、ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２ドメイン融合蛋白質を含むＫ４６Ｊ細胞からの溶解物もしくは細菌溶菌物について実施した。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２ドメインの融合物はグルタチオンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ上で吸着させた（Ｇｌｕｔ）。この吸着化蛋白質を溶出し、分画化し、そしてセクションＡに記載される要領で抗−ＳＨＣ（図２２ａ）もしくは抗−ホスホチロシン（抗−ｐＴｙｒ、図２２ｂ）抗体を用いて免疫ブロットを行うか、あるいはクーマシーブリリアントブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）（図２２ｃ）で染色した。図２２に示される結果は、非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドへのＳｈｃ結合性はｐ−ＮＰＰによっては遮断されなかったことを示し（図２２ａ）、このことによりホスホチロシンはその相互作用の際には独立していることが示される。それとは逆に、ｐ−ＮＰＰはホスホ−Ｉｇ−β ＡＲＨ１ペプチドへのＳｈｃの結合性を阻害した（図２２ａ）。図２２ｂを参照にすると、等量のＳｈｃが刺激化および非刺激化細胞（右側パネル）の溶解物中のホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドと結合することが見いだされたが、チロシンリン酸化Ｓｈｃと結合するホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ１は刺激化細胞の溶解物内にのみ検出された（左側パネル）。従ってＳｈｃチロシンリン酸化はホスホ−Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチドに結合する能力については検出可能な影響を全く有さない。図２２ｃを参照にすると、チロシンリン酸化Ｉｇ−αおよびＩｇ−βは両者ともｐ−ＮＰＰ感受性様式でＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２に結合したが、それらはＧＳＴ単独では結合しなかった。ＧＳＴ／ＳＨＣ−ＳＨ２を含むレーンにおいて追加的クーマシーブルー（ＣｏｏｍｓｓｉｅＢｌｕｅ）染色化バンドが存在しないことにより、この結合が直接的なものであることが示される。Ｃ．ＡＲＨ１モチーフ内のアミノ酸配列ＤＣＳＭにより指令され、かつＡＲＨ１モチーフチロシンリン酸化およびｓｒｃ−ファミリーキナーゼの結合を必要とはしない非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフとのＳｈｃの結合Ｉｇ−αのＤＣＳＭがＩｇ−βのＱＴＡＴで置換されており、そしてその逆も生じているＩｇ−αとＩｇ−βとのスイッチ突然変異体は、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．、前述、に開示される方法を用いて調製した。それに加え、アミノ酸配列ＡＣＳＭ、ＤＡＳＭ、ＤＣＡＭ、およびＤＣＳＡを含む突然変異体を、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．、前述、に開示される方法に従って作製した。この結果により、４つのアミノ酸配列ＤＣＳＭがＳｈｃに対する非リン酸化Ｉｇ−α ＡＲＨ１ペプチド結合についての特異性を付与することが示された。それに加え、ＤＣＳＭ配列への単一アミノ酸配列改変はＳｈｃへのそのペプチドの結合性を破壊することがなかった。従って、Ｉｇ−α ＡＲＨ１モチーフ内のＤＣＳＭ配列はＳｈｃに結合する。まとめると、これまでのデータにより、ＳｈｃはＤＣＳＭ配列を介してＩｇ− α ＡＲＨ１モチーフと結合することが示される。このデータは更に、Ｉｇ−α およびＩｇ−β ＡＲＨ１モチーフのリン酸化状態がそのペプチドに結合するＳｈｃの能力に影響を及ぼしうることを示す。実施例１０この実施例は、ｓｒｃ−ファミリーのチロシンキナーゼ、ｓｙｋ−ファミリーのチロシンキナーゼ、アダプター分子、および脂質キナーゼの特異的ＩＴＡＭ結合を示す。Ａ．透過性処理を施したＢ細胞内でのチロシンリン酸化を誘導する二リン酸化ＩＴＡＭモチーフのチロシンがフェニルアラニンに変化させててある非リン酸化ＩＴＡＭもしくは二リン酸化ＩＴＡＭに対応する合成ペプチドを、ＨＢＴＵ活性エステル（ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社、ＣｏｌｏｒａｄｏＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）でのｆ−ｍｏｃ化学法を用いて作製した。野生型ＩＴＡＭに対応するペプチド配列は：、である。リン酸化ペプチドを構築するために、ホスホチロシン（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社）を各位置でチロシンに置換した。ペプチドを９０分間の、９０％ＴＦＡ、２．５％アミノール（ａｍｉｎｏｌ）、および２．５％エタンジチオール中でのインキュベーションにより脱保護化し、Ｃ１８カラム上での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、そして質量分析法により分析して予想質量を確認した。必要に応じてペプチドを、充填化ビーズのミリリットル当たりに２ｍｇのペプチドで、製造業者の指示事項に従って臭化シアン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に連結させた。連結させたゲル溶出液のＨＰＬＣ分析に基づくと連結化効率は全事例において＞９０％であった。５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ストレプトマイシン、ペニシリン、２−メルカプトエタノール、およびＬ−グルタミンを補足してあるイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）の改変化ダルベッコー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）培地（ＩＭＤＭ）中、３７℃下、７．５％ＣＯ₂中で継代したＪ５５８Ｌμｍ３細胞を遠心分離により回収し、補足成分なしのＩＭＤＭ培地中で洗浄し、そしてＣａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：３９８２−３９８６、１９９１）により以前に記載される要領での透過性処理を施した。簡潔に記載すると、細胞（試料当たり２×１０⁷細胞）を、５００μｌのマイアー（Ｍｉｒｅ’ｓ）緩衝液（１０ｍＭＭｎＣｌ₂、１０ｍＭＭｇＯＡｃ、２ｍＭＥＧＴＡ、および２９６μＭＣａＣｌ₂［Ｃａ⁺²を３０ｎＭに緩衝化させてある］、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、および２８５μ／ｍｌ α−リソホスファチジルコリン、パルミトイル）（単独もしくは様々な濃度のＩＴＡＭペプチド（１μＭ〜１ｍＭ）を含む）中、３７℃で５分間インキュベートした。その後に細胞を遠心分離により回収し、１％ＮＰ−４０溶解用緩衝液（０．５ｍｌ）中で溶解し、そして遠心分離（１２，０００×ｇで１０分間）により核を除去した。増加濃度の二リン酸化ｐＩＴＡＭペプチドおよび非リン酸化ＩＴＡＭを透過性処理を施した細胞に添加した。その濃度液には、０、１μＭ、１０μＭ、１００ μＭ、および１ｍＭのペプチドが含まれる。細胞をそのペプチドと共に様々な時間（０、１５秒、３０秒、４５秒、１分、２分、および５分を含む）インキュベートした。蛋白質チロシンリン酸化の誘導を免疫ブロットにより、実施例９に記載される方法を用いて分析した。これらの結果により、全てのｐＩＴＡＭは透過性処理を施したＪ５５８Ｌμｍ３細胞内の蛋白質チロシンリン酸化を誘導することが可能であることが示された。誘導化は溶解させた細胞では観察されなかった。測定可能な誘導性リン酸化は１００μＭもしくはそれを上回る濃度のｐＩＴＡＭで観察され、かつ１５秒目に観察可能となった。非リン酸化ＩＴＡＭは全細胞性蛋白質チロシンリン酸化に検出可能な影響を及ぼすことがなかった。まとめると、これらの結果により、リン酸化された全てのＩＴＡＭは細胞性蛋白質チロシンリン酸化を開始することが可能である一方で、非リン酸化ペプチドはそうではないことが示される。Ｂ．透過性処理を施したＢ細胞中でＬｙｎを活性化するがＳｙｋは活性化しない二リン酸化ＩＴＡＭ透過性処理を施したＪ５５８Ｌμｍ３細胞をセクションＡに記載される方法を用いて調製した。その後にそのような細胞を、１ｍＭのＣＤε ｐＩＴＡＭペプチドで５分間刺激化させた。刺激化細胞の溶解物は遠心分離により細胞を回収し、それらを補足物を含まないＩＭＤＭ培地中で洗浄し、そしてそれらを溶解用緩衝液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ［ｐＨ７．５］、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、０．４ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＦ、ならびに各１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、およびα−１アンチトリプシン）中に再懸濁させた。この溶解物を氷上で１０分間インキュベートし、そして１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離により粒子状核／細胞骨格構成成分を除去した。その後にＬｙｎおよびＳｋｙ蛋白質を、２×１０⁷細胞からの溶解物を５０μ ｇの抗−Ｌｙｎ抗体もしくは５０μｇの抗−Ｓｋｙ抗体と共に０℃下で１時間インキュベートして免疫複合体を形成させ、そしてその後にその溶解物を、５μｌの抗血清で予備吸着させた５μｌのプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と共に４℃下で２時間、反転による定常的な混合を行いながらインキュベートすることによりその免疫複合体を回収した。その後に吸着物を１ｍｌの氷冷溶解物緩衝液で３度洗浄し、そして５０μｌの還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液中に再懸濁させることにより溶出した。試料を５分間沸騰させ、その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８もしくは１０％ゲル）にかけた。その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により推奨される条件に従い半乾燥式ブロット装置を用いてＰＶＤＦ膜に転移させた。電気泳動的に転移させた蛋白質を含む膜を、５％の無脂肪乾燥乳もしくは無リン酸塩ウシ血清アルブミンのいずれかを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）を用いて４℃で一晩遮断させ、そしてその後に最初にマウスＩｇＧ₁モノクローナル α−ホスホチロシン（１：１０００；ＡＢ２、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）抗体での探索を行った。その後に膜をＴＢＳもしくは０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴＢＳで交互に数回洗浄し、セイヨウカラシパーオキシダーゼに複合体形成させた希釈化プロテインＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）もしくはラット抗−マウスＩｇＧ₁（ＪａｃｋｓｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ社）と共にインキュベートし、そして再度洗浄した。免疫反応性蛋白質を強化ケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により可視化させた。その後に膜を、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、および６２．５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．７）を含む緩衝液中、５６ ℃下で３０分間かけてはぎとり、その後にα−Ｌｙｎ（１：５００）もしくはα −Ｓｋｙ（１：５００）抗体での再探索を行った。これらの結果は、ＬｙｎおよびＳｋｙ免疫沈降物の抗−ホスホチロシン免疫ブロットによりＬｙｎの誘導性リン酸化は示されるがＳｋｙについてはそうではないことを示している。抗−Ｌｙｎおよび抗−Ｓｋｙ抗体を用いる後続の免疫ブロットにより、抗−ホスホチロシンブロット化試料中に存在するＬｙｎもしくはＳｋｙの量が等価であることが示された。免疫沈降化させたＬｙｎもしくはＳｋｙのキナーゼ活性をその後に、以下のキナーゼアッセイを用いて検査した。免疫沈降化させたＬｙｎおよびＳｋｙをインビトロキナーゼ緩衝液（１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＨｅｐｅｓ［ｐＨ７．０］、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、および１ｍＭＰＭＳＦ）中で２度洗浄し、そしてＬｃｋキナーゼ自己リン酸化部位ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧの一部分に相当する２ｍＭの外因性基質、１０μＭＡＴＰ、および１０μ Ｃｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ−Ｄｕｐｏｎｔ社）を含む２５μｌのキナーゼ用緩衝液中に再懸濁させ、そして３０℃で１０分間インキュベートした。別法では５μｌのＳＦ９−Ｌｙｎ溶解物を、親和性精製したＬｙｎの代わりに用いた。必要に応じてＳｆ９−Ｌｙｎ溶解物をＩＴＡＭペプチド（濃度は１μＭ〜１ｍＭに変化する）と共に４℃で１時間予備インキュベートし、その後に基質／ＡＴＰを含む反応ミックスの添加を行った。各反応をトリクロロ酢酸（５％の最終濃度）でクエンチングさせ、そしてＷｈａｔｍａｎｐ８１ホスホセルロース上にブロットした。ブロットを過剰量の７５ｍＭのリン酸で４回洗浄し、アセトンで脱水し、そして液体シンチレーション分光測光法により定量化した。Ｓｆ９−ＬｙｎＫ_mおよびＶ_maxの決定は、基質濃度（その反応ミックス内に存在する）が１００μＭ〜１０ｍＭに変化することを必要とする。これらの結果により、免疫沈降化させたＬｙｎの酵素活性は、ＣＤ３ε ｐＩＴＡＭペプチドで刺激化させた浸透性処理を施した細胞内では３倍上昇した一方で、非リン酸化ＣＤ３ε ＩＴＡＭペプチドは何の効果も有さなかったことが示される。浸透性処理単独では、非活性化Ｊ５５８Ｌμｍ３細胞溶解物から免疫沈降させたＬｙｎと比較した場合にＬｙｎの活性には検出可能な効果は全く示されなかった。Ｓｙｋ活性化はＣＤ３ε ＩＴＡＭペプチドの存在下では検出されなかった。この結果により、ｐＩＴＡＭはｓｒｃ−ファミリーのキナーゼを刺激化しうることが示される。Ｃ．二リン酸化ＩＴＡＭによるＬｙｎの直接的活性化ｐＩＴＡＭを、ｐＩＴＡＭペプチドをバキュロウイルスＳＦ９細胞により発現されるＬｙｎ蛋白質に添加することにより、ｓｒｃ−ファミリーのキナーゼ活性を直接調節する能力について検査した。マウスｐ５６^lynの全コーディング領域に広がるＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＫ４６ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた：第一鎖ｃＤＮＡの産生およびＰＣＲ反応は既述の要領で実施した（Ｐｌｅｉｍａｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４２６８−４２７２、１９９４）。その後にこのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで開裂し、ｐＳＫＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）内にクローン化させ、そしてＤＮＡ配列分析により配列を確認した。その後にＬｙｎをコードするＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片をバキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）内にサブクローン化させた。この構築物を、製造業者の説明事項（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に従ってＢａｃｕｌｏｇｏｌｄトランスフェクションキットを用いてＳｆ９細胞内にトランスフェクトさせた。細胞をＳｆ９００ＩＩ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で維持し、そしてウイルスを製造業者のプロトコール（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に従って継代した。Ｌｙｎ蛋白質（Ｓｆ９−Ｌｙｎ）を作製するためには６×１０⁶のＳｆ９細胞を５の感染多重度での組換えウイルスで感染させた。感染化Ｓｆ９細胞を７２時間増殖させ、その後に１％ＮＰ−４０溶解用緩衝液中で溶解させた。Ｌｙｎ（１×１０⁶細胞／ｍｌの全細胞溶解物の５μｌ）をｐＩＴＡＭと共に予備インキュベートし、そしてＬｙｎがＬｃｋの自己リン酸化部位ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧをリン酸化する能力を、先のセクションＢに記載されるキナーゼを用いてアッセイした。これらの結果により、Ｉｇ−α ｐＩＴＡＭによるＬｙｎの活性化は用量依存的かつ可飽和性の両方であった一方で、非リン酸化Ｉｇ −αの飽和用量はＬｙｎ活性に殆ど影響を及ぼすことがなかったことが示される。６．７μＭＩｇ− α ｐＩＴＡＭを用いると有意な活性化が観察された。ＬｙｎのＶ_maxは０．０７４２ｐモル／分／μｌ（溶解物）から０．１３７ｐモル／分／μｌ（溶解物）への２倍の増加を示した一方で、Ｋ_mは無変化のままに留まった。その後にｐＩＴＡＭＩｇ−α、Ｉｇ−β、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、ＦｃεＲＩγ、およびＦｃεＲＩβを、各３００μＭのペプチドを用いて検査した。ｐＩＴＡＭがＬｙｎを活性化する能力は様々であった。各々の非リン酸化相対物と比較すると、Ｉｇ−α ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を５．１倍増加させ、ＦｃεＲＩ β ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を３．９倍増加させ、Ｉｇ−β ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を３．４倍増加させ、そしてＦｃεＲＩγ ｐＩＴＡＭはＬｙｎ活性を３．１倍増加させた。Ｄ．特異的エフェクター結合性活性を示すニリン酸化ＩＴＡＭ様々なｐＩＴＡＭのＰＩ−３Ｋｐ８５サブユニット、Ｓｋｙ、Ｌｙｎ、およびＳｈｃへの結合特異性を、２ｍｇ（ペプチド）／ｍｌ（ｐＩＴＡＭペプチド連結化ビーズ）を２×１０⁷のＫ４６Ｂリンパ腫細胞から調製されたＮＰ−４０溶解物をセクションＡに記載される要領でインキュベートすることにより検査した。溶解用緩衝液中で徹底的に洗浄した後にｐＩＴＡＭ結合性蛋白質を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液を用いてそのビーズから溶出させ、電気泳動により分画化させ、ＰＶＤＦ膜に転移させ、そして全ウサギ抗血清 α−Ｌｙｎ（１：５００）、α−Ｓｙｋ（１：５００）、およびα−ＰＩ−３Ｋ（ｐ８５サブユニット、１：１０００、ＵＢＩ社）を用いて免疫ブロットを行い、そしてウサギ抗血清 α−Ｓｈｃ（１：５００、ＵＢＩ社）抗体を親和性精製した。図２３に示される結果により、Ｉｇ−α、Ｉｇ−β、およびＦｃＥＲ１β ｐＩＴＡＭは優先的にＬｙｎに結合する一方で、ＴＣＲζｃ、ＣＤ３ε、およびＦｃεＲＩγは優先的にＳｙｋに結合することが示される。ｐＩＴＡＭ−Ｓｈｃ結合性パターンはＬｙｎのものに類似していた一方で、ＰＩ−３ＫはＦｃ６ＲＩγ およびＩｇ−α ｐＩＴＡＭの両方に強い結合性を示した。この比較分析により、様々なｐＩＴＡＭ配列とエフェクター分子間の相互作用の特異性が示される。本発明の様々な態様が詳細に記載されていると同時に、これらの態様の改変物および適用法が当業者に思い浮かぶであろうことは明白である。しかしながらそのような改変物および適用法は、以下の請求の範囲に記載される本発明の範囲内に含まれることが特に理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年６月２０日【補正内容】請求の範囲１．細胞を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨのアミノ酸モチーフを有するペプチドもしくはそのミメトープを含み、かつそのペプチドのサイズが１５〜２６アミノ酸残基の範囲にわたる化合物の有効量と接触させることを含む、シグナル変換を調節するための方法。２．前記アミノ酸モチーフが、ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。３．前記アミノ酸モチーフが、ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ、ＤＨＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ、ＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ、ＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。４．アミノ酸モチーフが両方のＹ残基でリン酸化される、請求の範囲１、２、もしくは３の内のいずれか一つの方法。５．アミノ酸モチーフが、ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびシグナル変換アダプター分子からなる群より選択される細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、もしくは４の内のいずれか一つの方法。６．アミノ酸モチーフが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群から選択される細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、４、もしくは５の内のいずれか一つの方法。７．前記方法が：ａ）自己リン酸化が可能なｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼを仮想的疎外性化合物と接触させて反応混合物を形成させること；ｂ）前記反応混合物を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフもしくはそのミメトープからなり、かつ前記モチーフ中のチロシン残基がリン酸化されている刺激性化合物と接触させること；およびｃ）前記仮想的疎外性化合物が前記ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼの前記刺激性化合物による活性化を阻害する能力を、前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの自己リン酸化を決定することにより評定すること、を含む、ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの活性化の刺激化を阻害することが可能な化合物を同定するための方法。８．前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群より選択される、請求の範囲７の方法。９．細胞を、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことにより前記チロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断することが可能なペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させることを含む、シグナル変換を調節するための方法。１０．前記高プロリンドメインが、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴおよびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＲＫＰＴＴＶＡからなる群より選択される、請求の範囲９の内の一つに記載れる方法。１１．細胞を、一般式（ｐＹ）ＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸ（ｐＹ）ＸＸΨ［式中、各ｐＹはホスホチロシンもしくはそのミメトープを表し、各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、そしてΨはロイシンもしくはイソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表す］で表されるＡＲＨ１モチーフを有するペプチドを含む化合物の有効量と接触させることを含む、シグナル変換を調節するための方法。１２．化合物をインビボで、ある動物の細胞と、その化合物をその動物に投与することにより接触させる、請求の範囲１もしくは１１の内のいずれかの方法。１３．（ｉ）一般式Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹ₂ＸＸΨ ［式中、Ｙ₁およびＹ₂の各々は独立にチロシンもしくはホスホチロシン、あるいはそれらのミメトープを表し、各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、そして Ψはロイシンもしくはイソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表す］で表されるＡＲＨ１モチーフを有するペプチド；ならびに（ｉｉ）動物への輸送に薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤される）、を含む薬剤学的調製物。１４．ＡＲＨ１モチーフが、一般式Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹ₂ＸＸ Ψ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ ＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ₂ＸＸΨの内の一つで表される、請求の範囲１３の調製物。１５．ＡＲＨ１モチーフがＮＬＹ₁ＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹ₂ＥＤＩ、ＤＨＹ₁ ＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹ₂ＤＥＩ、ＤＲＬＹ₁ＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹ₂ＳＥＬ、ＤＡＶＹ₁ＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹ₂ＥＴＬ、ＤＧＬＹ₁ＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹ₂ ＤＡＬ、ＮＰＤＹ₁ＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹ₂ＳＧＬ、もしくはそれらのミメトープの内の一つで表される、請求の範囲１３の調製物。１６．Ｙ₁およびＹ₂の両方がホスホチロシンもしくはそのミメトープを表す、請求の範囲１３〜１５の内のいずれかの調製物。１７．ペプチドが３キロダルトンもしくはそれを下回る分子量を有する、請求の範囲１３〜１５の内のいずれかの調製物。１８．ペプチドが１５〜２６アミノ酸残基の長さである、請求の範囲１３〜１５の内のいずれかの調製物。１９．ペプチドがｓｒｃ−ファミリーキナーゼのキナーゼ活性を刺激化する、請求の範囲１３もしくは１６の内のいずれかの調製物。２０．ペプチドが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ、およびＳｈｃアダプターからなる群より選択される蛋白質と特異的に結合する、請求の範囲１３の調製物。２１．ペプチドがミリスチル化および／またはプレニル化される、請求の範囲１３の調製物。２２．薬剤学的に適する担体がリポソームを含む、請求の範囲１３の調製物。２３．一つのＡＲＨ１モチーフを含むペプチドが、有効量ではレセプター（一つもしくは複数）による細胞内シグナル伝達を通して少なくとも部分的に媒介される障害の症状を軽減するのに薬剤学的に適する状態で製剤され、そしてその障害が、癌、自己免疫性疾患、免疫不全性疾患、免疫増殖性疾患、アレルギー性応答、および炎症性応答からなる群より選択される、請求の範囲１３の調製物。２４．（ｉ）一般式Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ ＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹ₂ＸＸΨ、Ｙ1ＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹ₂ＸＸΨ、Ｙ₁ＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹ₂ＸＸΨ、もしくはＹ₁ＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹ₂ＸＸΨ ［式中、Ｙ₁およびＹ₂の各々は独立にホスホチロシンもしくはそれらのミメトープを表し、各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、 Ψはロイシンもしくはイソロイシン、あるいはそれらのミメトープを表し、そして各Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ａ、Ｒ、Ｎ、およびＥは対応するアミノ酸残基もしくはそれらのミメトープを表す］の内の一つで表されるＡＲＨ１モチーフを有するペプチドの実質的に純粋な調製物；ならびに（ｉｉ）動物への輸送に薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤される）、を含む薬剤学的調製物。２５．（ｉ）ＳＨ３結合性ドメインに特異的に結合する高プロリン（ＰＲ）モチーフを含むペプチド、および（ｉｉ）薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤される）、を含む薬剤学的調製物。２６．ＰＲモチーフが一般式ＰＰＸＰＸＰＸＰＰＸＰＸＰもしくはＰＸＰＸＸＰＰＸＰＰＸＰ［式中、各Ｘは独立にいずれかのアミノ酸もしくはそれらのミメトープを表し、そして各Ｐはプロリン残基もしくはそれらのミメトープを表す］の内の一つで表される、請求の範囲２５の調製物。２７．ＰＲモチーフがＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴおよびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡからなる群より選択される、請求の範囲２５の調製物。２８．ペプチドが１２〜４０アミノ酸残基の長さである、請求の範囲２５もしくは２６の内のいずれかの調製物。２９．ペプチドがＳＨ３ドメインに特異的に結合する、請求の範囲２５の調製物。３０．ペプチドがｓｒｃ−ファミリーキナーゼのＳＨ３ドメインに特異的に結合する、請求の範囲２９の調製物。３１．薬剤学的に適する担体がリポソームを含む、請求の範囲２５の調製物。３２．ペプチドが、有効量ではＳＨ３ドメインを有する蛋白質による細胞内シグナル伝達を通して少なくとも部分的に媒介される障害の症状を軽減するのに薬剤学的に適する状態で製剤される、請求の範囲２５の調製物。３３．ペプチドがホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの活性化を特異的に阻害する、請求の範囲２５もしくは３２のいずれかの調製物。３４（ｉ）一般式ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨ で表されるＡＲＨ１モチーフ、もしくはＳＨ３結合性ドメインに特異的に結合する高プロリン（ＰＲ）モチーフを含むペプチドをコードする発現性コーディング配列を含む発現ベクター；ならびに（ｉｉ）薬剤学的に適する担体（この担体と共にそのペプチドが製剤される）、を含む薬剤学的調製物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 35/74 ＡＤＹ 9283−4ＣＡ６１Ｋ 35/74 ＡＤＹＡ 35/78 9159−4Ｃ 35/78 Ｘ 38/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 48/00 ＡＢＡ 38/45 ＡＢＣ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/55 ＡＢＥ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/705 48/00 ＡＢＡ 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ // Ｃ０７Ｋ 14/705 9051−4Ｃ 37/64 ＡＢＥＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ 37/52 ＡＢＣＣ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者クラーク，マーカス・アールアメリカ合衆国イリノイ州60611シカゴ・ノースマツクラーグコート400・アパートメント2007

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨのアミノ酸モチーフを有するペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させることを含む、シグナル変換を調節するための方法。２．前記アミノ酸モチーフが、ＹＸＸＬＸＸＸＤＣＳＭＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＴＡＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＴＫＤＴＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＱＲＤＬＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＹＳＰＩＹＸＸΨ、ＹＸＸＬＸＸＸＮＱＥＴＹＸＸΨ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。３．前記アミノ酸モチーフが、ＮＬＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ、ＤＨＴＹＥＧＬＮＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ、ＤＲＬＹＥＥＬＮＨＶＹＳＰＩＹＳＥＬ、ＤＡＶＹＴＧＬＮＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ、ＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ、ＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ、もしくはそれらのミメトープからなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１に記載の方法。４．アミノ酸モチーフが両方のＹ残基でリン酸化されている、請求の範囲１、２、もしくは３の内のいずれか一つの方法。５．アミノ酸モチーフが、ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼ、脂質キナーゼ、およびシグナル変換アダプター分子からなる群より選択される細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、もしくは４の内のいずれか一つの方法。６．アミノ酸モチーフが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群から選択される細胞性構成成分に結合する、請求の範囲１、２、３、４、もしくは５の内のいずれか一つの方法。７．前記方法が：（ａ）自己リン酸化が可能なｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼを仮想的疎外性化合物と接触させて反応混合物を形成させること；（ｂ）前記反応混合物を、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフもしくはそのミメトープからなり、かつ前記モチーフ中のチロシン残基がリン酸化されている刺激性化合物と接触させること；および（ｄ）前記仮想的疎外性化合物が前記ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼの前記刺激性化合物による活性化を阻害する能力を、前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの自己リン酸化を決定することにより評定すること、を含む、ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼの活性化の刺激化を阻害しうる化合物を同定するための方法。８．前記ｓｒｃ−ファミーチロシンキナーゼが、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、およびＺａｐ７０からなる群から選択される、請求の範囲７の方法。９．細胞を、チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合することが可能なペプチドもしくはそのミメトープを含む化合物の有効量と接触させ、そのことにより前記チロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断することを含む、シグナル変換を調節するための方法。１０．前記高プロリンドメインが、ＫＫＩＳＰＰＴＰＫＰＲＰＰＲＰＴＰＶＡＰＧＳＳＫＴおよびＮＥＲＱＰＡＰＡＴＰＰＫＰＰＫＰＴＴＶＡからなる群より選択される、請求の範囲９の内の一つに記載れる方法。１１．細胞内のシグナル変換を調節するための治療用組成物であって、前記組成物が、ＹＸＸＬＸＸＸＸＸＸＸＹＸＸΨアミノ酸モチーフを有するペプチドもしくはそのミメトープ、および薬剤学的に許容される賦形剤を含む治療用組成物。１２．細胞内のシグナル変換を調節するための治療用組成物であって、前記組成物がチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、そのことにより前記チロシンキナーゼへのエフェクターの結合を遮断しうるペプチドもしくはそのミメトープを含む治療用組成物。