JPH09512707A - 必須領域に外来ポリヌクレオチドを有する組換えポックスウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している欠陥ポックスウイルスは特にタンパク質の製造及びワクチンに使用できる。組換えウイルスによって産生されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを欠陥ポックスウイルスに挿入し、プロモーターの転写調節下におく。欠陥ポックスウイルスは、必須領域の欠失機能を宿主細胞、トランスジェニック動物又はヘルパーウイルスによって補完すると生存可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】 必須領域に外来ポリヌクレオチドを有する 組換えポックスウイルス 組換えポックスウイルスは、例えば動物、植物、原生動物、菌類、細菌及びウ イルスといったような種々の由来源に由来する外来遺伝子を発現するためのベク ターとして使用されてきた。組換えポックスウイルスはまた、キメラ遺伝子及び 合成由来源からの遺伝子の発現にも使用できる。典型的には、キメラ遺伝子及び 合成遺伝子は、天然の配列に由来する又はその配列に基づくＤＮＡ配列である。 例えば、レトロウイルス由来のものを含むＲＮＡ転写体から形成されたｃＤＮＡ 配列は、組換えポックスウイルスベクターを用いて発現することができる。 現在使用されているポックスウイルスベクターは、ウイルスの生存能力にとっ て必須ではないゲノム領域に挿入された外来ＤＮＡを含む。外来遺伝子を発現す るこれらのポックスウイルスは通常、相同的組換えによって細胞培養でウイルス を増殖させるために必須ではないゲノム領域に外来配列を挿入することにより構 築する。Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９： ４９２７−３１（１９８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７４１５−１９（１９８２）参照。好ましくは 、直接的分子クローニングによって組換えポックスウイルスを構築し得る。欧州 特許第０５６１ ０３４号；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９９７７−８１（１９９２）；Ｍｅｒｃ ｈｌｉｎｓｋｙ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１９０：５２２−２６（１９９２） 参照。非必須領域に外来ＤＮＡを挿入したウイルスは宿主生物内で自律的に増殖 し得るため、それぞれの宿主に対して感染性を保持する。 非必須領域産物の不在は、組換えポックスウイルスの生存能力を不当に損なう ことはない。しばしば原型ポックスウイルスとみなされるワクシニアの場合は、 挿入用の主要非必須領域の一つがチミジンキナーゼ遺伝子である。外来遺伝子を ワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子に挿入すると、ウイルス中にその遺伝子産物 は存在しない。それにもかかわらず、組換えワクシニアは生存能力を維持する。 別のポックスウイルスを別の非必須領域で類似の操作にかけることもできる。例 えば、組換え鳥類ポックス（ａｖｉｐｏｘ）、例えば鶏痘は、外来ＤＮＡを非必 須領域に挿入した場合に得られた。 組換えワクシニアは、大量発現系で、また他の様々な用途で、生ワクチンとし て使用できる。Ｍｉｎｅｒ及びＨｒｕｂｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ ８：２０−２５（ １９９０）参照。しかしながら、タンパク質を大量発現させるためのこれら組換 えウイルスの使用にはかなりの危険が伴う。なぜなら、ウイルスは感染能力を保 持するからである。従って、組換えワクシニアを取り扱う場合には、コストのか かる安全対策と面倒な処理とが必要とされる。例えば、総ての媒体、液体及び汚 染された実験器具の熱的不活性化、並びにウイルスを扱う総ての人員の特別な訓 練が必要となる。これらの繁雑な措置の必要を最小限度に押さえるために、幾つ かの方法が考えられてきた。例えば、高度に弱毒化したワクシニア株が開発され た。これらの高度に弱毒化した株は感染力が制限されている。従って、これらの 高度に弱毒化した株でのタンパク質生産が試みられた。残念ながら、高度に弱毒 化したウイルス株は増殖が遅く且つ制限されているため、大量タンパク質生産に は余り適さないことが多い。 高度に弱毒化したポックスウイルスの他に、別のウイルスの弱化株（ｉｍｐａ ｉｒｅｄ ｓｔｒａｉｎ）が知られている。 例えば、弱化レトロウイルスは、弱化ウイルスを補助することができるヘルパー 細胞系中で増殖できる。Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮ Ｄ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０），３３ −３９；Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ ３３：１５３−５９（１９８３）参照。しかし ながら、レトロウイルスは宿主細胞のゲノム中に組込むことによって増殖する低 分子ＲＮＡ含有ウイルスであるため、発現ベクター又はワクチンとして使用する のに適していない。 補助細胞中で増殖した弱化アデノウイルスは、Ｅｌｉｏｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒｏｌ．７１：２４２５−３１（１９９０）に記載のようにワクチンとして使 用されてきた。アデノウイルスは、ワクシニアウイルスと異なり、感染細胞の核 内で複製され、狭い宿主範囲を有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。また、ヘル パー細胞中での弱化ヘルペスウイルスの増殖も報告されている。ＰＣＴ公開ＷＯ ９４／０３５９５号、ＷＯ９４／２１８０７号及びＷＯ９２／０５２６３号参照 。ヘルペスウイルスも感染細胞の核内で複製される。そのままのヘルペスＤＮＡ 、例えばアデノウイルスＤＮＡは感染性である。従って、これらのウイルスのプ ロモーターは宿主細胞内で正常に機能する。 ポックスウイルスと対照的に、ヘルペス及びアデノウイルスは核ウイルスであ る。しかしながら、核ウイルスから誘導した欠陥ウイルスは、相同的組換えを介 して宿主細胞から欠陥領域を救出する能力を有する。このような組換え事象は望 ましいものではなく、危険である。なぜなら、欠陥ウイルスは潜在的に野生型状 態に戻ることができ、その結果感染力及び毒力が増加すると共に、挿入した外来 遺伝子が消失するからである。 より安全な組換え体発現系及びワクチンの必要に鑑み、基本的に異なる組換え ポックスウイルスの開発が要求されている。本明細書に記載の方法は、外来遺伝 子をポックスウイルスの必須領域に挿入することからなる。ポックスウイルスの 必須領域の産物の欠損は、別の由来源、例えば組換え宿主細胞、ヘルパーウイル ス又はトランスジェニック動物の同じ又は類似の産物によって補完される。 従って本発明は、目的の一つとして、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのような外来 ポリヌクレオチドを発現することができる組換えポックスウイルスを提供する。 本発明の別の目的は、ポックスウイルスゲノムの必須領域によって付与される 機能を欠失しているために欠陥性である組換 えポックスウイルスを提供することにある。 本発明の別の目的は、ポックスウイルスゲノムの必須領域に挿入された外来ポ リヌクレオチドを有する欠陥ポックスウイルスを提供することにある。 本発明の更に別の目的は、必須領域の全部又は一部が欠失している欠陥ポック スウイルスを提供することにある。 本発明の別の目的は、ワクチンとして使用できる欠陥ポックスウイルスを提供 することにある。 本発明の更に別の目的は、欠陥ポックスウイルスの欠失機能を補完することが できる宿主細胞、ヘルパーウイルス又はトランスジェニック動物を提供すること にある。 本発明のこれらの目的及び他の目的を達成するために、本発明の一態様では、 親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している欠陥ポッ クスウイルスであって、プロモーターの転写調節下にある外来ポリヌクレオチド を含む欠陥ポックスウイルスを提供する。即ち、該欠陥ポックスウイルスは親ポ ックスウイルスから誘導したものであるが、親ポックスウイルスに通常存在する 機能を欠失している。 プロモーターは、欠陥ポックスウイルス又は感染宿主の酵素 で作動可能なものでなければならない。このようなプロモーターとしては、ポッ クスウイルスプロモーター、及びポックスウイルスプロモーターに基づく合成プ ロモーターが挙げられる。外来ポリヌクレオチドは必須領域に挿入し得、又は必 須領域の一部もしくは全部を置換し得る。 また、外来ポリヌクレオチドをウイルス内に挿入する前に、マーカーで必須領 域を置換することもできる。その後で外来ポリヌクレオチドをマーカーに挿入す るか、又は外来ポリヌクレオチドでマーカーを置換すればよい。好ましくは、親 ポックスウイルスはワクシニアであり、欠失すべき必須機能は、読取り枠Ｉ７Ｌ 、Ｆ１８Ｒ、Ｆ１３Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ６Ｒ、Ａ８Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ、 Ａ１０Ｌ及びＡ３Ｌでコードされるか、又は１４キロダルトンのエンベロープタ ンパク質もしくは２５キロダルトンの構造タンパク質をコードする読取り枠でコ ードされる。 本発明は別の態様で、欠陥ポックスウイルスの欠失機能を補完する能力を有す る細胞系、トランスジェニック動物及びヘルパーウイルスを提供する。前記補完 能力は、組換えウイルスの欠失機能を補完する産生物をコードする遺伝子を発現 可能なよ うに組込むことによって付与される。 本発明は更に別の態様で、タンパク質の製造方法を提供する。この方法は、親 ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している欠陥ポック スウイルスを供給するステップを含み、前記欠陥ポックスウイルスが、産生すべ きタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが プロモーターの転写調節下にある。プロモーターは、欠陥ポックスウイルス又は 感染宿主で作動可能なものでなければならず、このようなプロモーターとしては ポックスウイルスプロモーターが挙げられる。ポリヌクレオチドは親ポックスウ イルスの必須領域に挿入し得る。別の実施態様では、マーカー、例えばｇｐｔ遺 伝子によって必須領域の一部もしくは全部を置換し、次いでポリヌクレオチドを マーカーに挿入するか又はポリヌクレオチドでマーカーの一部もしくは全部を置 換し得る。その結果マーカーの機能が喪失すれば、そのポリヌクレオチドが欠陥 ポックスウイルス内に配置されたことになる。 本発明は更に別の態様で、欠陥ポックスウイルスを含むワクチンを提供する。 これらの欠陥ポックスウイルスは、病原体に対する抗原をコードするポリヌクレ オチドを含む。本発明のワ クチンに適したポックスウイルスは、本発明の他の欠陥ポックスウイルスと同じ 又は類似の方法で構築できる。 本発明の前述の態様及び他の態様は、本明細書における開示によって当業者に 明らかにされよう。 第１図はプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌの構築を簡単に示している。 第２図は、プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。 第３図は、プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。 第４図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ８Ｌ−３’／２の構築を簡単に示してい る。 第５図は、プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。 第６図は、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。 第７図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ及びｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’の構 築を簡単に示している。 第８図は、プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨの構築を簡単 に示している。 第９図は、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。 第１０図は、プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｊ１Ｒの構築を簡単に示している。 第１１図は、プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。 第１２図は、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ＺＧの構築を簡単に示している。 第１３図は、プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨの構築を簡単に示している。 第１４図は、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌｆ−ＺＧの構築を簡単に示している。 第１５図は、プラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌの構築を簡単に示している。 本発明は、その一態様で、タンパク質を製造するための欠陥ポックスウイルス の使用に関する。本発明の「欠陥ポックスウイルス」は、欠陥ポックスウイルス の基である親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失してい るポック スウイルスである。従って欠陥ポックスウイルスは、別の由来源による欠失機能 の補完なしには生存又は感染することはできない。「必須領域（ｅｓｓｅｎｔｉ ａｌ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、親ポックスウイルスの生存力又は感染力に必要な ポックスウイルスゲノムの領域である。「補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏ ｎ）」という用語は、別の由来源、例えば宿主細胞、トランスジェニック動物又 はヘルパーウイルスによる欠失機能の回復を意味する。従って欠陥ポックスウイ ルスは、親ポックスウイルスを非生存性又は非感染性にした形態であり、補完体 の存在下で生存可能又は感染性になることができる。 親ポックスウイルスは天然のポックスウイルス、又は天然ポックスウイルスに 由来するポックスウイルスであり得る。好ましくは、親ポックスウイルスは、ワ クシニアのウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ＝ＷＲ）株又 はその関連株のような速増殖性野生型ウイルスである。 欠陥ウイルスは、天然ポックスウイルス又は天然ポックスウイルス由来のポッ クスウイルス等の親ポックスウイルスに基づく（から誘導される）。親ポックス ウイルスとして使用するための天然ポックスウイルス由来ポックスウイルスは、 領域特異 的及び部位特異的突然変異誘発を介する遺伝子工学、ｉｎ ｖｉｖｏ組換え、突 然変異誘発物質の存在下もしくは不在下で宿主細胞を介するウイルスの継代のよ うな方法、並びにこれらの方法の任意の組合わせによって得ることができる。欠 陥ポックスウイルスは、必須領域の欠陥の導入が可能な任意の種類のポックスウ イルスをベースとし得る。 欠陥ポックスウイルスはタンパク質発現系として使用できる。本発明の欠陥ポ ックスウイルスによって産生されたタンパク質は、外来ポリヌクレオチド、例え ば遺伝子、又はＲＮＡ転写体のｃＤＮＡ型（ｃＤＮＡ ｖｅｒｓｉｏｎ）、でコ ードされる。「外来ポリヌクレオチド」という用語は、欠陥ポリヌクレオチドの 由来源である親ポックスウイルス内には通常存在しないポリヌクレオチド、又は 欠陥ポックスウイルスの由来源である親ポックスウイルスにおけるものとは異な る位置もしくは形態で存在するポリヌクレオチドを意味する。外来ポリヌクレオ チドは種々の由来源、例えば動物、植物、原生植物、菌類、細菌及びウイルスに 由来し得る。 本発明の欠陥ポックスウイルスは、欠陥ポックスウイルス内での外来ポリヌク レオチドの転写を調節するために、欠陥ポッ クスウイルス又は欠陥ポックスウイルスに感染した宿主で作動可能なプロモータ ーを含み得る。「プロモーター」とは、転写を開始及び／又は指令できるヌクレ オチド配列である。本発明では、欠陥ポックスウイルスで、又は感染宿主内で作 動可能な任意のプロモーターを使用し得る。「作動可能（ｏｐｅｒａｂｉｌｉｔ ｙ）」という用語は、転写酵素によるプロモーターの認識可能性又は読取り可能 性を意味する。典型的には、プロモーターはポックスウイルスプロモーター、又 はポックスウイルス由来プロモーターをベースとする合成プロモーターである。 欠陥ウイルスは、ポックスウイルスの必須領域に挿入された外来ポリヌクレオ チドを少なくとも一つ有し得る。プロモーターは、ポリヌクレオチドをプロモー ターの転写調節下におくために、プロモーターとポリヌクレオチドとが一緒に挿 入されるように、外来ポリヌクレオチドに結合し得る。あるいは、外来ポリヌク レオチドの転写を調節するプロモーターを、外来ポリヌクレオチドの転写を調節 できるような位置で欠陥ポックスウイルス内に予め存在させておいてもよい。 必須領域は、補完源のゲノムと欠陥ウイルスとの間で相同的組換えが生起し得 ないように、欠陥ウイルスのゲノムから完全 に欠失させ得る。このような欠失を有する欠陥ウイルスは、補完源、例えばトラ ンスで必須領域の機能を付与するヘルパー細胞系の存在下でしか増殖できない。 欠陥ウイルスの純粋ストックはヘルパー細胞系では増殖できるが、正常細胞及び 生物内での増殖は不可能である。この種のウイルスの宿主範囲は、欠陥ウイルス の欠陥を補完するために特別に工学的に操作されたヘルパー細胞系に限定され得 る。欠陥ポックスウイルスでは、マーカー遺伝子を用いて必須領域を置換するこ とができる。次いで、相同的組換えにより、外来ポリヌクレオチドをマーカー内 に挿入するか、又は外来ポリヌクレオチドでマーカーの全部又は一部を置換し得 る。この方法は、目的の挿入体を含むポックスウイルスの選択系を提供する。 この種のマーカーの一つはｇｐｔ遺伝子である。該遺伝子は、Ａ９細胞（マウ スＬＭ（ＴＫ−）細胞の誘導体）又はＳＴＯ細胞（６−チオグアニンに対して耐 性であり、逆ｇｐｔ選択を可能にする）のような補完細胞系で逆ｇｐｔ選択のた めに使用し得る。この系は、所望の欠陥ウイルスの純粋ストックを得るための迅 速且つ効率的な方法を提供する。純粋ストックを得るのに通常必要とされる多数 回のプラーク精製は、野生型 ウイルスの能動殺害によって回避される（ｇｐｔ選択のような優性選択操作（ｄ ｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）では達成できない ）。 本発明は、極めて大量のタンパク質発現に有用である。本発明の欠陥ポックス ウイルスはワクチン接種にも使用できる。例えば、適当な必須遺伝子が不活性化 しても、欠陥ウイルスは細胞内に侵入して不稔的生活環を開始する能力を保持す る。このような遺伝子は生活環の後半に必要とされる遺伝子であり、従ってウイ ルスは依然として自己のＤＮＡを複製することができ、場合によっては未熟粒子 を形成し、外来ポリヌクレオチドを含むゲノム情報を発現することができる。こ の点で、これらの欠陥ウイルスは“不活生ワクチン（ｄｅａｄ ｌｉｖｅ ｖａ ｃｃｉｎｅ）」の効果を有し得る。Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｖａｃ ｃｉｎｅ ６：４６６−６８（１９８８）。ワクチンとして使用される欠陥ポッ クスウイルスは、抗原をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。抗原は、生 物よって外来であると認識される分子である。これらの抗原は、抗原に暴露され た生物から免疫応答を誘発できる。抗原には、細菌、ウイルス、菌類及び原生動 物に由来するタンパク質が含まれる。 ワクチンとして使用する欠陥ウイルスを構築するための好ましい親ワクシニア株 は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−３２５）のようなワクチン株 である。 本発明の欠陥ポックスウイルスは、欠陥ウイルスの欠失した必須機能を補完す ることができる宿主細胞内で増殖できる。典型的には、これらの宿主細胞は、欠 失機能を補完するように特別に工学的に操作された細胞系に由来する。典型的に は、宿主細胞は、必須領域が宿主によって発現されるように、又は細胞内の必須 領域が宿主細胞の感染時に誘導され得るように、宿主細胞内に挿入された同じ又 は類似のポックスウイルス必須領域を有する。 補完並びにその後のウイルス及びタンパク質産生のために選択する細胞系は、 取り扱いが容易であり、ウイルスプラークを形成させ、産生物の機能に必要な総 てのステップを実施することができるようなものでなければならない。ベロ（Ｖ ｅｒｏ）細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ８１）及びマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞 はこれらの要件を満たし、宿主として適当である。ｔｋ遺伝子欠失ウイルスの負 の選択は、ＴＫ陰性ベロ細胞上で実 施し得る。ＴＫ陰性ベロ細胞は、ブロモ−デオキシウリジンの存在下で細胞系の サブクローニングを繰り返すことにより得られる。ベロ細胞は高細胞密度に増殖 でき、組換えタンパク質の産生にうまく使用されている（Ｂａｒｒｅｔｔら，Ａ ＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．５：１５９−７１（１９８９）） 。 Ａ９細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．４）、即ちマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞系誘 導体も６−チオグアニンに対して耐性であり、逆ｇｐｔ選択を可能にする。これ は、欠陥ウイルスを分離するために直接選択圧を適用する上で有用な特徴である 。Ｉｓａａｃｓら，Ｖｉｒｏｌ．７８：６２６−３０（１９９０）。 補完遺伝子の組込みを容易にするために、ハイグロマイシンホスホトランスフ ェラーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような優性選択マ ーカーを使用する。一つのプラスミドに外来遺伝子を結合するか、あるいは同時 形質転換操作を適用し得る（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １６：７７７−７８５ （１９７９））。単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような別の選択マーカ ーをマウスＬＭ（ＴＫ−）細胞と一緒に使用してもよい。 補完のためにポックスウイルス必須領域を制御するプロモーター（補完物質（ ｃｏｍｐｅｌｅｎｔａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ））は、それぞれの細胞系で活性で なければならない。好ましいプロモーターはＳＶ４０に由来する。ＳＶ４０はマ ウスＬ細胞及びベロ細胞中で活性を示す強い構成プロモーターを有する。永久（ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）細胞系中での発現に通常使用される別のプロモーターとし ては、Ｇｕｎｎｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ４：４８３１−３５（１９８７）に記載のアクチンプロモーター、及びＢｏｓｈ ａｒｔら，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−３０（１９８５）に記載のヒトサイトメガ ロウイルスプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは本発明でも使用 し得る。 ワクシニア感染細胞に特に適し得る転写系は、ヒト７０ｋＤ熱ショックタンパ ク質（Ｈｓｐ７０）由来プロモーターを非翻訳上流領域と共に含む。Ｈｕｎｔ及 びＭｏｒｉｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ：６４５５−５９（１９８５）参照。他の多くの遺伝子の発現と異なり、Ｈｓｐ ７０合成は、ワクシニア感染細胞内のワクシニアウイルス宿主タンパク質遮断に よって悪影響を受けない。 Ｊｉｎｄａｌ及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３５７−６２（１９９ ２）参照。 補完に適した別の宿主としては、補完性ポックスウイルス遺伝子を保有するウ シパピローマウイルス（例えばＡＴＣＣ ３７１１０）ベクターを含むプラスミ ドでトランスフェクションされたマウスＣ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １ ６１６）又はその誘導体が挙げられる。この系における相同的組換えの危険を最 小限度に抑えるために、補完性ポックスウイルス遺伝子は欠陥ウイルスのそれと は異なる属に由来するものが好ましい。このようなヘルパーウイルス法を用いる と、補完性ポックスウイルス遺伝子は宿主細胞が欠陥ポックスウイルスに感染し た時にだけ活性化される。 欠陥ポックスウイルスの増殖に使用し得る別の宿主としては、ワクシニア必須 遺伝子を導入したトランスジェニック動物（以後「補完性トランスジェニック動 物」と称する）が挙げられる。この種の動物は、補完性トランスジェニック動物 内でポックスウイルス必須遺伝子を発現するために選択したプロモーターに応じ て、総ての体細胞又は好ましい組織内で補完機能を付与し得る。動物、好ましく はマウスは、ポックスウイルス感染の研 究及び関連研究のための安全なモデルを構成する。所定の器官における導入遺伝 子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の選択的発現は、組織特異的遺伝子発現の研究及び／ 又は特定器官の選択的機能もしくは機能障害の研究を可能にできる。 トランスジェニック動物を作る方法は当業者に公知である。例えば、トランス ジェニック動物は、マイクロインジェクション、胚性幹細胞の形質転換又はレト ロウイルスベクターの使用によって形成できる。適当な方法はＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩ ＶＣＨ，１９９３）に詳述されている。 補完物質として適当な必須遺伝子産物は、一般的には、ポックスウイルス生活 環の後期に必要とされる遺伝子産物を包含する。この種の遺伝子産物の具体例と しては、形態形成又は他の複製後事象に関与する遺伝子産物、並びに酵素及び調 節タンパク質が挙げられる。 適当な補完物質である必須遺伝子産物の一つは、読取り枠（ｏｒｆ）Ｉ７Ｌに よってコードされる４７−ｋＤａタンパク質（１７タンパク質）であり、これは ウイルスゲノム構成に関与すると考えられている。Ｋａｎｅ及びＳｃｈｕｍａｎ ，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６７：２６８９−９８（１９９３）。１７タンパク質はウイルス核 で被包されている。ｔｓ１６として知られている温度感受性（ｔｓ）突然変異が 存在する。Ｃｏｎｄｉｔら，Ｖｉｒｏｌ．１２８：４２９−４３（１９８３）。 従って、１７遺伝子は必須遺伝子の従来の要件、即ち条件致死変異株（温度感受 性）の存在という要件を満たす。 本発明で適当な補完物質である必須遺伝子産物のなかには、Ｄ１３Ｌ ｏｒｆ によってコードされる６５ｋＤａタンパク質がある。このタンパク質は感染の後 期に発現される。発現が阻止されても複製は影響を受けないが、ウイルス形態形 成は初期段階で阻止される。Ｚｈａｎｇ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１８７：６ ４３−５３（１９９２）。補完物質として適当な別の必須遺伝子産物は、Ｌａｉ ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２１７４−８０（１９９０）に記載の ワクシニア１４ｋＤａエンベロープタンパク質、Ｗｅｉｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ．Ｖ ｉｒｏｌ．５６：５３４−４０（１９８５）に記載のワクシニア２５ｋＤａ主要 構造タンパク質、並びにＰ４ａ及びＰ４ｂのような他の構造タンパク質である。 補完物質として使用できる別の必須遺伝子産物は、ＷＲ野生 型ウイルスのＦ１８Ｒ ｏｒｆ（ワクシニアのコペンハーゲン株のＦ１７Ｒとし て知られている）によってコードされる、Ｗｉｔｔｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４ ９：３７１−７８（１９８４）に記載の１１ｋＤａリンタンパク質である。Ｇｏ ｅｂｅｌら，Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７−６６（１９９０）参照。Ｆ１８Ｒ ｏｒｆによってコードされる１１ｋＤａリンタンパク質は、正しいビリオン組み 立てに必要な必須遺伝子である。Ｚｈａｎｇ及びＭｏｓｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６ ５：６１０１−１０（１９９１）参照。Ｆ１８Ｒ及びＦ１７Ｒ ｏｒｆ内の条件 致死ワクシニア変異株は、特定の条件下で異常な内部構造を有する未熟粒子を形 成する。しかしながらＦ１８Ｒはｏｒｆ Ａと重なり合い、従って通常は第一に 選択すべき必須領域ではない。Ｇｏｅｂｅｌら、前出文献。 酵素及び調節タンパク質も補完物質として使用できる。なぜなら、これらのタ ンパク質は触媒量で存在させるだけでよく、このような量は補完細胞系によって 容易に供給できるからである。ワクシニアウイルス初期転写因子（ＶＥＴＦ）の サブユニットはこの点で適当な物質である。ＶＥＴＦは「初期」ワクシニア遺伝 子の転写開始にとって必須である。ＶＥＴＦを欠くワ クシニアＲＮＡポリメラーゼはｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡ鋳型を転写する ことができない。Ｂｒｏｙｌｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０７ ５４−６０（１９８８）参照。この因子は、ワクシニアＷＲゲノムのＤ６Ｒ及び Ａ８Ｌ遺伝子ｏｒｆによってそれぞれコードされる７７ｋＤａポリペプチド及び ８２ｋＤａポリペプチドを有するヘテロダイマーである。Ｇｅｒｓｈｏｎ及びＭ ｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４４０１− ０５（１９９０）参照。ＶＥＴＦタンパク質は感染の後期に発現され、発生期の ウイルス粒子中にパッケージされる。従って、ＶＥＴＦ発現細胞から分離された Ｄ６Ｒ又はＡ８Ｌ遺伝子を欠失する欠陥ウイルスは、それ以上のタンパク質合成 制限なしに、非補完性細胞系上で完全な生活環を更に実施することができる。タ ンパク質合成は、このような欠陥ウイルスを「不活生ワクチン」として使用する ための必須要件である。 「不活生ワクチン」は、哺乳動物宿主の免疫に使用されてきた、外来遺伝子を 発現する鳥類ポックスウイルスを含む。哺乳動物宿主ではウイルスは増殖せず、 不稔的生活環を実施する。それにもかかわらず、この種のワクチンは特定Ｔ細胞 の免疫応 答を刺激する。Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、前出文献参照。ＶＥＴＦを 欠く欠陥ウイルスは、不稔的生活環を実施することしかできないウイルスと比べ て、野生型宿主内で更に生活環を実施することができ、従って抗原をより多く産 生できるため、望ましい。 補完に適した別のウイルス因子はＲＮＡポリメラーゼ関連タンパク質ＲＡＰ９ ４又は初期転写特異性因子である。ＲＡＰ９４はｏｒｆ Ｈ４Ｌによってコード され（Ａｈｎ及びＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：ＵＳ Ａ ８９：３５３６−４０（１９９２））、解離可能なウイルスＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼのサブユニットである。該サブユニットは、初期段階遺伝子の 転写を開始させるために、ＲＮＡポリメラーゼ複合体にプロモーター特異性を付 与する。該サブユニットは補完物質としてＶＥＴＦサブユニットと同じ要件を満 たす。ＲＡＰ９４は感染後期に合成され、発生期ウイルス中にパッケージングさ れて、次の感染ラウンドで初期転写を仲介する。従って、Ｈ４Ｌ遺伝子を欠く表 現型的に完全なウイルス粒子は、それ以上のタンパク質合成制限を伴わずに、非 補完性宿主内で更にもう１ラウンドの感染を実施することができる。 条件致死変異株の存在（Ｃｏｎｄｉｔ及びＭｏｔｙｔｚｃａ，Ｖｉｒｏｌ．１１ ３：２２４−４１（１９８１））は、Ｈ４Ｌが必須遺伝子であることを示すもの である。該タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体の別の成分と比べて、モル 未満（ｓｕｂｍｏｌａｒ）在することが判明している。Ａｈｎ及びＭｏｓｓ、前 出文献。従って、補完性細胞系内のＲＡＰ９４の低発現レベルは、欠陥ウイルス の増殖に影響しない。 欠陥ウイルスを補完するために使用し得る別の遺伝子はＪ１Ｒ遺伝子である。 これは、細胞培養でのウイルス増殖にとって必須の遺伝子である。その遺伝子産 物はまだ同定されてないが、このｏｒｆはワクシニアウイルスゲノム上でチミジ ンキナーゼ遺伝子に隣接して位置するため、かなり注目すべきものである。ｏｒ ｆ Ｊ１Ｒと隣接チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の少なくとも一部とを含む 配列が欠失すると、補完性細胞系に依存すると共に、ＬＫ（ＴＫ−）細胞又はｔ ｋ−陰性ベロ細胞のようなｔｋ−陰性細胞上で負の選択によって選択できるウイ ルスが得られる。欠陥ウイルスの純粋ストックはこのようなさらなる選択操作に よって迅速に得られる。 Ｊ３Ｒ遺伝子は、Ｊ１Ｒ ｏｒｆと同じ意味で注目に値する。 ｔｋ−陰性細胞上での負の選択は、Ｊ３Ｒ ｏｒｆ及び隣接Ｊ２Ｒ ｏｒｆ（チ ミジンキナーゼ）が同時に欠失しているために実施できる。Ｊ３Ｒ遺伝子は、ｍ ＲＮＡの５’キャップ構造の形成に必要とされ且つ長いポリ（Ａ）テールの形成 を刺激するポリ（Ａ）ポリメラーゼサブユニット（ＶＰ３９）をコードする。Ｇ ｅｒｓｈｏｎら，Ｃｅｌｌ ６６：１２６９−７８（１９９１）；Ｓｃｈｎｉｅ ｒｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２８９７ −０１（１９９１）。 本発明の欠陥ポックスウイルスは、非必須領域に挿入体を有する組換えウイル スに使用されるものと同じ多くの方法で製造できる。例えば、相同なフランキン グ領域（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を介するｉ ｎ ｖｉｖｏ組換えを使用し得る。Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：４９２７−３１（１９ ８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら，上記文献７９：７４１５−１９（１９８２）参照。 欠陥ポックスウイルスを製造するための別の方法は、直接的分子クローニング及 び異種パッケージング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐａｃｋ ａｇｉｎｇ）である。欧州特許第０ ５６１ ０３４号；Ｓｃｅｉｆｌｉｎｇｅ ｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９９７７−８ １（１９９２）：Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ及びＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌ．１９０： ５２２−２６（１９９２）参照。 本発明では、必須遺伝子内又は必須遺伝子の以前の位置（マーカーによる置換 を含む欠失に起因して消滅した位置）に非反復（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位を有す る欠陥ポックスウイルスをクローニングビヒクルとして使用し得る。あるいは、 所望であれば選択マーカーを含むウイルスの必須遺伝子を非反復制限部位でフラ ンキングして、必須遺伝子及びマーカー（存在すれば）の同時切除を可能にする こともできる。同時切除後は、ウイルスベクターへの外来ポリヌクレオチドの連 結を容易にする強制クローニング（ｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ）で、１個以 上の外来ポリヌクレオチドの挿入を行うのが好ましい。 必須領域内に又は必須領域に隣接して非反復部位を有する親ウイルスのベクタ ーアーム（ｖｅｃｔｏｒ ａｒｍ）は、外来ポリヌクレオチドに連結して、ヘル パーウイルスとしての鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）と共に補完性細胞系中にパッケー ジングし 得る。ＦＰＶは哺乳動物細胞内で生活環を完了することができず、増殖できない ため、このウイルスは次のプラークアッセイで重大な汚染物質とはならない。し かしながら、挿入体のない再連結欠陥ウイルスはプラークを形成し得る。但しこ の問題は、ベクターアームを注意深く形成し、挿入体をウイルス内に強制クロー ニングすることによって解決される。以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に 説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明をよ り明らかにするためのものである。 実施例１：Ｉ７Ｌタンパク質（ｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧ）を欠く欠陥ワクシニアウイル ス及びベロ細胞をベースとする補完性細胞系（Ｖ−Ｉ７Ｌ）の構築 補完性細胞系Ｖ−Ｉ１７Ｌの構築 ヘルパー細胞系の構築の最初のステップは、一般的なＰＣＲ仲介法による大腸 菌発現プラスミド及び真核生物発現プラスミド内への１７Ｌ ｏｒｆのクローニ ングであった。大腸菌における１７Ｌ ｏｒｆの発現は、抗Ｉ７Ｌタンパク質抗 体を得るためにウサギを免疫感作するためのタンパク質の迅速産生を可能にする 。前記抗体は、後で永久細胞系中のＩ７Ｌタンパク質 を同定するために使用し得る。 この目的のために、Ｉ７Ｌ ｏｒｆをＰＣＲで増幅し、次いでプラスミドｐＣ ＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングする。プライマーｏ Ｉ７−１（５’−ＡＧＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＡＧ−３’）（配列番号：１）及びｏＩ７−２（５’−ＡＴ Ｃ ＣＣＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＣ Ｔ−３’）（配列番号：２）を用いてＩ７Ｌ遺伝子を１．３ｋｂフラグメントと して増幅した。このフラグメントをプライマーｐＣＲIIに挿入して、ｐＣＲ−Ｉ ７Ｌを形成した。プラスミドｐＣＴ−Ｉ７ＬはＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII遺伝子フ ラグメントの由来源であり、該フラグメントは後で強制クローニングによってプ ラスミドｐＲＳＥＴ−Ｂ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に挿入して、ｐＲ ＳＥＴ−１７Ｌを形成した（第１図）。プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｉ７Ｌは、Ｔ７ プロモーターの下流のＩ７Ｌ ｏｒｆを過発現させた。Ｔ７プロモーターの制御 下の発現はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。該ポリメラーゼは、プラス ミド担持大腸菌にバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を感染させることに よ って得られる。 Ｉ７Ｌタンパク質は、Ｍ１３ｍｐ１８／Ｔ７に感染しプラスミドｐＲＳＥＴ− Ｉ７Ｌを有するＪＭ１０９大腸菌細胞内で過発現された。ｌａｃプロモーターの 誘導は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）でバクテリオファージＭ１ ３ｍｐ１８／Ｔ７内のＴ７ポリメラーゼの発現を推進する。この特定実施例で使 用する大腸菌発現系はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手した ものであり、親プラスミドｐＲＳＥＴ Ａ、ｐＲＳＥＴ Ｂ及びｐＲＳＥＴ Ｃ 並びにＭ１３ベースのヘルパーファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を含む。本発明で は他の適当な発現系も使用できる。 発現後に細菌溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。Ｉ ７Ｌタンパク質を含んでいるバンドを検出し、ゲルから切除し、電気溶離した（ ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。ウサギを電気溶離物質及び完全フロイントアジ ュバントで免疫感作した（投与当たり３０ｍｇタンパク質、ｉ．ｍ．）。１ケ月 後、不完全フロイントアジュバント中で同じ投与量で動物に追加抗原刺激を与え 、抗体の発生をウェスタンブロットで観察する。 ウェスタンブロットは本質的に、Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０−５４（１９７９）に記載のように実 施し得る。第一抗体はウサギ抗１７Ｌ抗体（上述）であり、希釈率１：１００で 使用する。第二抗体は、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ （ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用する。試薬（Ｂ ＣＩＰ及びＮＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．のものであ る。 プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌ由来のＮｃｏＩ−ＳｍａＩ遺伝子フラグメントは発 現プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨの一部である。第２図参照。プラスミドｐ ＥＤＨ１（第２図）は、内部リボソーム結合部位（ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）、ジ ヒドロホレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）及びハイグロマイシン（ｈｐｈ）遺伝 子を含むＥＤＨ遺伝子カセットをＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩフラグメントとして含む 。このプラスミドｐＥＤＨ１は、更に４つの制限部位（ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、Ｓ ｗａＩ及びＤｒａＩ）を部位ＳｐｅＩとＮｏｔＩとの間でＥＤＨ遺伝子カセット の下流に挿入した、プラスミドｐＢ４／ＥＤＨＰｒｏ（Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ 、論文）に由来する。ｐＥＤＨ１のＥＤＨ 遺伝子カセットは、ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩフラグメントとして、プラスミドｐＳ Ｖ−Ｉ７Ｌの非反復制限部位ＳｍａＩ及びＳａｌＩの間に挿入した。この構築に よって、プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨが得られた。 プラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌは、ｐＣＲ−Ｉ７Ｌの１．３ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｓｍ ａＩフラグメントをプラスミドｐＳＶ−ＢｂｓのＢｂｓＩ−ＳｍａＩ部位間に挿 入することによって得られた。プラスミドｐＳＶ−ＢｂｓはプラスミドｐＳＶβ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）の誘導体であり、β−ガラクトシダーゼ 遺伝子を欠失しているが、単一のＢｂｓＩ部位を含んでいる。ＢｂｓＩ部位は、 オリゴヌクレオチドｏＢｂｓ−１（５’−ＣＴＡ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＧＣ Ａ ＡＡ ＡＡＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＴＣ ＴＴＣ Ａ −３’）（配列番号：３）及びｏＢｂｓ−２（５’−ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＣＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＡＡ ＡＡＧ Ｃ−３’）（配列番号：４）を含むリンカーによって導入する。リンカ ーは、プラスミドｐＳＶβのＡｖｒII及びＨｉｎｄIII部位間に挿入した。第２ 図参照。 ｐＳＶ−Ｉ７Ｌ−ＥＤＨでは、Ｉ７Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初 期プロモーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、 ｄｈｆｒ及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子であり、永久細胞系内の目的の遺伝 子の効率的なスクリーニング及び増幅を可能にする。Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ， Ｓ．Ｅ． ｉａ。但し、本発明の実施はこのマーカーの使用に限定されない。 前記プラスミドをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトラン スフェクションする。ベロ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。Ｇｒａｈ ａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−６７（１９７３） の方法でプラスミドｐＳＶ−Ｉ７Ｌ ＥＤＨを細胞にトランスフェクションし、 ハイグロマイシンＢをベースとする選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、 ２５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ）中でインキュベートした。１０〜１４日 後にコロニーが目で観察できるようになった。これらのコロニーを増殖し、２回 サブクローニングし、次いで更に特性を 調べた。永久ｈｐｈ陽性細胞系をハイグロマイシンＢの存在下で選択した。該細 胞系を更にＰＣＲ分析で特性検査し、補完性遺伝子構築物（Ｉ７Ｌ）の存在を調 べた。ウェスタンブロットを用いて、目的の遺伝子、Ｉ７Ｌ−タンパク質が発現 されているかどうかを調べる。最終的補完性細胞系はＶ−Ｉ７Ｌと称する。欠陥ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧの構築 Ｉ７Ｌ産物を欠くウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐ ＣＲ−Ｉ７Ｌｆを第３図に示すように構築した。このプラスミドはｐＣＲIIベク ターをベースとし、一方の側に約０．５ｋｂのフランキング領域を含むＩ７Ｌ− ｏｒｆを含んでいる。プライマーｏＩ７−３（５’−ＡＧＧ ＡＧＴ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＧＧ Ａ−３’）（配列番号：５）及びｏＩ７−４ （５’−ＧＡＣ ＡＴＡ ＧＧＴ ＡＴＡ ＧＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ−３’）（ 配列番号：６）を使用して約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を得、これをｐＣＲIIプラ スミド内にサブクローニングしてｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆを形成した。 大腸菌遺伝子ｌａｃＺ及びｇｐｔを含む二重遺伝子カセットをＳｍａＩフラグ メントとしてプラスミドｐＬＧｂから切除し、 Ｉ７Ｌ−ｏｒｆ内に位置する単一のＨｐａＩ部位に挿入した。これは、その結果 得られるプラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧのｐＣＲ−Ｉ７Ｌ遺伝子を不活性化 する。 プラスミドｐＬＧｂは、プラスミドｐ１Ｔａ及びｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）をベースとするｐ２Ｔから得た。まず、ｐＴＺ１９Ｒの大きいＰｖｕII ベクターフラグメントを、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−１Ｔ（１） ：５’−ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＴＣ Ａ３’（配列番号：７）及びＰ−１Ｔ（２） ：５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧＣ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＡＡ ＡＣＴ（配列番号：８）と連結した。その結果得られ たｐ１ＴａをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開裂した。次いで、開裂したｐ１Ｔａ をアニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−２Ｔ（１）：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＣＧ ＴＡＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＴＴ ＡＡＡ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＧＡ−３’（配列番号：９）及びＰ−２Ｔ（２）：５’−ＡＡＴ ＴＴＣ Ｃ ＣＧ ＧＧＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＴＴＡ Ａ ＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＡＣＧ ＴＡＧ−３’（配列番号：１０）に連結した。 その結果得られたプラスミドｐ２ＴをＳｍａＩで開裂した。大腸菌遺伝子ｌａｃ Ｚ及びｇｐｔを含む二重遺伝子カセットを、ＨｉｎｄIII、ＳａｌＩ及びクレノ ーポリメラーゼ処理フラグメントとして挿入した。二重遺伝子カセットは、プラ スミドｐＴＮａ及び関連プラスミドをベースとするプラスミドｐＺｇｐｔ−ａか ら得られる。 ｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧウイルスを構築するために、ＣＶ−１細胞内でのｉｎ ｖｉ ｖｏ組換えにより、プラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＺＧをＷＲ株ワクシニアウイ ルス中に挿入した。まず、５×１０⁶個のＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞の ワクシニアＷＲを感染させ、１時間増殖させ、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｉ ７Ｌｆ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトランスフェクションし、次いで ３日間増殖させた。Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、前出文献参照。ウ イルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ， Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６２：１８４９−５４（１９８８））及びブループラークスク リーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓ．５ ：３４０３−０９（１９８５））の存在下でプラーク細胞に使用する。 欠陥ウイルスはＶ−Ｉ７Ｌ細胞内だけで増殖し、ｇｐｔ及びｌａｃＺ陽性であ り、野生型ウイルスは両方の細胞系で増殖するが、ｇｐｔ及びｌａｃＺ陰性であ る。精製を１０回行う。次いで、精製した欠陥ウイルスをより大量に増殖させ、 サザンブロットで調べる。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在 すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞及び野生型細胞 上の欠陥ウイルスのプラークアッセイによって、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完 性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査で、欠陥ウイルスは非 病原性であることが確認される。 実施例２：補完性細胞系Ｖ−Ｉ７Ｌ内でＨＩＶ ｅｎｖ ｇｐ１６０遺伝子（ｄ −Ｉ７Ｌ ＭＮ）を発現する欠陥ワクシニアウイルスの構築 新規の系における外来遺伝子の発現を明らかにするために、ＨＩＶ ＭＮ株の ＨＩＶ ｇｐ１６０遺伝子を必須領域Ｉ７Ｌ に挿入する。そのために、プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２のＳｍａＩフラグメント から遺伝子カセットを得る。プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２は、強い半合成ポック スウイルスプロモーターＳｅｐによって制御されるＨＩＶ−１ ｇｐ１６０ＭＮ 配列と、Ｐ７．５ｇｐｔ遺伝子を含む選択カセットとを含んでいる。Ｆａｌｋｎ ｅｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８４９−５４（１９８８）参照。 プラスミドｐＳｅｐ−ＳＴ２を構築するために、まずプラスミドｐＳｅｐ（１ ）を構築した。ｐＳｅｐ（１）を得るために、後期鶏痘ウイルスプロモーターＰ ２（欧州特許出願公開第０５３８ ４９６ Ａ１号、Ｄｏｒｎｅｒら）を合成初 期プロモーター配列と組合わせることによって、半合成ポックスウイルスプロモ ーターＳｅｐを構築した。要約すれば、ＨｐａＩ／ＮｃｏＩ消化ベクターｐＳ２ ｇｐｔ−Ｐ２（欧州特許出願公開第０ ５６１ ０３４ Ａ２号）を、アニーリ ングしたオリゴヌクレオチドＰ−Ｓｅｐ（３）及びＰ−Ｓｅｐ（４）と連結した 。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、Ｐ−Ｓｅｐ（３）：５’−ＣＴＣＧＴ ＡＡＡＡＡ ＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴ ＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴ ＡＴＴＧＣＡＣＧ ＧＴ ＣＧＣＧＡ−３’（配列 番号：１１）及びＰ−Ｓｅｐ（４）：５’−ＣＡＴＧＧＴＡＣＧＴ ＡＣＣＧＴ ＧＣＡＡＴ ＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴ ＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡ ＴＴＴＴＴＡＣＧ ＡＧ−３’（配列番号：１２）であった。得られたプラスミドをｐＳｅｐ（１） と名付けた。ｐＳｅｐ−ＳＴ２を得るために、まずＨＩＶ１−ＭＮｅｎｖ遺伝子 を含むプラスミドｐＭＮｅｎｖ２（欧州特許出願公開第０ ５６１ ０３４ Ａ ２号に記載）に由来する２．６５ｋｂのＳｔｕＩ／ＰｖｕIIフラグメントをＳｎ ａＢＩ直線化プラスミドｐＳｅｐ（１）と連結した。得られたプラスミド、即ち Ｓｅｐ−プロモーターに対して適切な方向に挿入体を含むプラスミドをｐＳｅｐ −ｇｐ１６０ｍｎと名付けた。ｇｐ１６０−ｏｒｆ内に位置する点突然変異を修 復するために、ｐＳｅｐ−ｇｐ１６０ｍｎの１．９ｋｂ ＮＳｉＩ／ＳａｌＩフ ラグメントをプラスミドｐＭＮ−ＳＴ２由来の等価フラグメントで置換した。得 られたプラスミドをｐＳｅｐ−ＳＴ２と名付けた。プラスミドｐＭＮｅｎｖ１及 びｐＭＮ−ＳＴ２はＭａｒｖｉｎ Ｒｅｉｔｚ（Ｎ．Ｃ．Ｉ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から入手した。 ｐＳｅｐ−ＳＴ２由来のカセットはＨＩＶ ｇｐ１６０遺伝 子及び大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含み、これをｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆの単一のＨｐａＩ部 位に挿入するとプラスミドｐＣＲ−Ｉ７Ｌｆ−ＭＮが得られる。このプラスミド を、ＷＲ野生型ウイルスを含有するＣＶ−１細胞内でのｉｎ ｖｉｖｏ組換え実 験で使用してウイルス未精製ストツクを得る。該ストツクは、（１）２回のクロ スオーバー事象を経て組換えウイルスとなった欠陥ウイルスと、（２）１回のク ロスオーバー事象を経たウイルスと、（３）野生型ヘルパーウイルスとの混合物 である。クロスオーバー事象の総合的説明は、Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ，Ｊ ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３１０８−１１（１９９０）に記載されている。 このウイルス混合物を、実施例１に記載のように純度検査した補完性細胞内で プラーク精製する。但し、プラークアッセイはｇｐｔ−選択のみに基づく。得ら れたウイルスをｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮと名付け、Ｖ−Ｉ７Ｌ細胞内での組換えｇｐ１ ６０の発現に使用する。ｇｐ１６０を発現するために、ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−Ｍ Ｎをその補完性細胞系と組合わせて使用する。Ｖ−Ｉ７Ｌ細胞に０．１ｐｆｕの ｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮを感染させ、３日間増殖させる。前出のＴｏｗｂｉｎらの方法 で、抗−ｇｐ ４１モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットにより組換えタンパク質 を検出する。マウスで動物実験を行い、ｄ−Ｉ７Ｌ−ＭＮが非病原体であるがそ れでも免疫応答を刺激することができることを明らかにする。 実施例３：初期転写因子の大サブユニットを欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ− Ａ８Ｌ−ＺＧ）及び該ウイルスを増殖させるための補完性細胞系の構築 ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ａ８Ｌ）の構築 ＶＥＴＦ因子は、ワクシニア−ＷＲゲノムのＤ６Ｒ及びＡ８Ｌ ｏｒｆでそれ ぞれコードされる７７ｋＤポリペプチド及び８２ｋＤポリペプチドからなるヘテ ロダイマーである。Ｇｅｒｓｈｏｎ及びＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４４０１−０５（１９９０）。ＶＥＴＦタンパク 質は感染後期に発現され、発生期ウイルス粒子中にパッケージングされる。ＶＥ ＴＦを欠く欠陥ウイルスは、不稔的生活環を実施することしかできないウイルス と比べて、野生型宿主内で更に生活環を実施することができるため望ましいもの である。 Ｄ６Ｒサブユニットは可能なＡＴＰ結合部位を含み、初期プ ロモーターＤＮＡ配列に結合することが判明している。Ｂｒｏｙｌｅｓ及びＬｉ ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６７７−８０（１９９３）参照。温度感受性突然変 異をＤ６Ｒ遺伝子までマッピングした。補完性細胞系における望ましくないタン パク質−ＤＮＡ相互作用を回避するためにＡ８Ｌ ｏｒｆを選択した。 ヘルパー細胞系の構築の最初のステップは、ＰＣＲ仲介法によりＡ８Ｌ ｏｒ ｆを大腸菌発現プラスミド及び真核生物発現プラスミド内にクローニングする操 作であった。大腸菌内でのｏｒｆの発現は、永久細胞系中でタンパク質を同定す るために後で使用される抗ＶＥＴＦ大サブユニット抗体を得るためにウサギを免 疫感作するためのタンパク質の迅速産生を可能にした。 この目的のために、Ａ８Ｌ−ｏｒｆをＰＣＲで増幅し、プラスミドｐＣＲII内 にクローニングした。プライマーｏＡ８−９ｔ（５’−ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＡＧ ＴＣＣ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＧＴ ＡＴＴ Ａ−３’）（配列番号：１３）及びｏＡ８−２ｔ（５’−Ａ ＧＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＴＴ Ｇ ＴＧ ＣＴＣ ＴＴＣ−３’）（配列番号：１４）を用いて、Ａ８Ｌ遺伝子を２ ．１ｋｂフラ グメントとして増幅した。このフラグメントをプラスミドｐＣＲII（ＩｎＶｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入して、ｐＣＲ−Ａ８Ｌｔを形成した。 プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｔは、０．９ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ遺伝子 フラグメントの由来源である。ＢａｍＨＩ部位（Ａ８Ｌ遺伝子内に存在）及びＥ ｃｏＲＩ部位（ｐＣＲIIの多重クローニング部位によって導入）を開裂してフラ グメントを得、これを強制クローニングによりプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｂ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に挿入してプラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ８Ｌ−３’ ／２を形成した。第４図参照。該プラスミドは、Ｎ’末端６−ヒスチジン−ｔａ ｇと融合した、ＶＥＴＦ大サブユニットのＣ’末端部分をコードする融合遺伝子 を含む。切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ａ８Ｌタンパク質は、プラスミドｐＲＳ ＥＴ−Ａ８Ｌ−３’／２を含む大腸菌（ＪＭ１０９株）細胞内で過発現された。 その後、ＩＰＴＧの存在下で細菌にヘルパーファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７を 感染させた。これは、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８／Ｔ７内のＴ７ポリメ ラーゼの発現を推進するｌａｃプロモーターを誘導する。ｈｉｓ−ｔａｇを含む 組換え 切頭型Ａ８Ｌタンパク質を、ニッケル−ＮＴＡカラムでのアフィニティクロマト グラフィーで、製造業者のプロトコル（Ｄｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に従い、細菌 溶解物から精製した。完全フロイントアジュバント中に乳濁させた精製物質を用 いてウサギを免疫感作した（投与当たり８０ｍｇタンパク質、ｓ．ｃ．及びｉ． ｍ．）。１ケ月後、同じ投与量で動物に追加抗原刺激を与え、抗体の発生をウェ スタンブロットで観察した。 ウサギ抗血清の特性を調べるために、細菌溶解物中のＡ８Ｌタンパク質をウェ スタンブロットで検出した。ウェスタンブロットは本質的に前出のＴｏｗｂｉｎ らの方法で実施した。第一抗体はウサギ抗Ａ８Ｌタンパク質抗体であり、希釈率 １：１００で使用した。第二抗体は、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗 ウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用し た。試薬（ＢＣＩＰ及びＮＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ ．のものである。 発現プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨを得るために、Ａ８Ｌ遺伝子を２．１ ｋｂ ＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ遺伝子フラグメントとしてプラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ ｔから分離した。部位Ｐｓ ｔＩ及びＳｔｕＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＡ８−９ｔ及びｏＡ８−２ｔに よって導入した。このフラグメントと、ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミド ｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ遺伝子フラグメントとを、制限部位 ＡｐａＩ、ＡｖｒIII、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ 、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩを含む多重クローニング部位（ｍｓｃ）に よるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の置換により、ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）に由来するＰｓｔＩ−ＣｌａＩ切断発現ベクターｐＳＶＭＣＳ＃５１ 内に連結した。そのために、ベクターｐＣＭＶβをＮｏｔＩで切断し、再連結し て、プラスミドｐＣＭＶを形成した。このプラスミドをＳａｌＩ及びＨｉｎｄII Iで切断し、クレノーポリメラーゼで処理し、再連結して中間プラスミドを得た 。このプラスミドをＸｈｏＩで切断し、制限部位ＡｐａＩ、ＡｖｒIII、Ｓｐｅ Ｉ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ及び ＣｌａＩをコードする二本鎖リンカーを挿入してプラスミドｐＳＶＭＣＳ＃５１ を形成した。第５図参照。 プラスミドｐＳＶ−Ａ８Ｌ−ＥＤＨ内で、Ａ８Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロ モーターによって制御される。永久細胞系を 得るための選択マーカーは、実施例１に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ 遺伝子を含む融合遺伝子である。 前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法でプラスミドｐＳＶ−Ａ ８Ｌ−ＥＤＨをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトランスフ ェクションし、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２５０μｇ／ｍｌハ イグロマイシン）中でインキュベートし、更に実施例１に記載のように処理した 。永久ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ陽性細胞系を抗生物質ハイグ ロマイシンＢの存在下で選択した。５回の継代後、Ａ８Ｌ遺伝子の０．５ｋｂセ グメントに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによって外来ＤＮＡの組込みを 明らかにした。 ウェスタンブロットを用いて、所期の遺伝子、ＶＥＴＦ大サブユニットが発現 されているかどうかを調べる。最大レベルのＶＥＴＦ大サブユニットを発現する 細胞系を更にＰＣＲ分析にかけて特性を調べ、補完性細胞系として使用し、Ｖ− Ａ８Ｌと名付ける。欠陥ウイルスｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧの構築 ウイルスｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ− ＺＧを第６図に簡単に示すように構築した。Ａ８Ｌ ｏｒｆの両側のフランキン グ領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．７ｋｂ）をＰＣＲで増幅し、プラスミドｐＣＲ II内にサブクローニングして、それぞれｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌ及びｐＣＲ−Ａ８ Ｌ−ｆｒを得た。 Ａ８Ｌ ５’−フランキング領域の増幅のためのＰＣＲプライマーは、ｏＡ８ −８（５’−ＡＧＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＣ−３’） （配列番号：１５）及びｏＡ８−５（５’−ＧＡＡ ＣＧＴ ＴＡＡ ＣＡＴ ＴＴＡ ＴＡＴ ＣＧＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡＡ ＴＣ−３ ’）（配列番号：１６）であった。Ａ８Ｌ ３’−フランキング領域用のプライ マーはｏＡ８−４（５’−ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＣＧＣ ＣＧ−３’）（配列番号：１７）及びｏＡ８−６（５’−ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡ Ａ ＴＴＧ ＴＡＡ ＡＴＴ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡ Ａ ＡＴＡ ＡＡＴ Ａ−３’）（配列番号：１８）であった。ｐＣＲ−Ａ８Ｌ −ｆｌ由来の０．７ｋｂ Ｎ ｏｔＩ−ＳｐｅｌフラグメントとしてのＡ８Ｌ ５’−フランキング領域を、ｐ ＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｒ内でＡ８Ｌ ３’フランキング領域のすぐ上流の部位Ｎｏｔ Ｉ及びＸｂａＩ間に連結して、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓを得た 。 クローニング操作を更に実施するのを容易にするために、希少（ｒａｒｅ）制 限部位ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ及びＲｓｒIIを含む合成リンカーを、ｐＣ Ｒ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓ内のＡ８Ｌ−フランキング領域の間に連結した。該リ ンカーの構築に使用したオリゴヌクレオチドは、ｏＡ８−１１（５’−ＡＡＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ−３’）（配列番号 ：１９）及びｏＡ８−１２（５’−ＡＡＴ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＧＴ Ｔ−３’）（配列番号：２０）である。その 後、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ｆｌａｎｋｓをＭｕｎＩ及びＨｐａＩで直線化 した（二つの部位はそれぞれＰＣＲプライマーｏＡ８−５及びｏＡ８−６によっ て導入）。その結果得られたプラスミドｐｄＡ８Ｌを実施例１に記載のプラスミ ドｐＬＧｂ由来の３．９ｋｂ ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ −Ａ８Ｌｆ−ＺＧを形成した。この構築物では、相同的 組換えを介する補完性細胞系による欠陥ウイルスの救出を防止するために、Ａ８ Ｌ ｏｒｆを完全に欠失させる。 ｄ−Ａ８Ｌ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−Ｚ ＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入した。プラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌｆ−ＺＧは ＣＶ−１細胞内でのｉｎ ｖｉｖｏ組換えに使用した。まず、５×１０⁶個のＣ Ｖ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキュ ベートし、前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法に従って、２０ μｇのプラスミドｐＣＲ−Ａ８Ｌ−ＺＧを含むリン酸カルシウム沈降物でトラン スフェクションし、３日間増殖させた。 その結果、野生型ウイルス（ヘルパー）と欠陥ウイルスとを含む未精製ストッ クが得られた。欠陥ウイルスの純粋ストックを得るために、欠陥ウイルスを補完 することができるＶ−Ａ８Ｌ細胞内でプラークアッセイを実施した。ウイルス未 精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１９８８） 、前出文献）及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、 前出文献）の存在下でＶ−Ａ８Ｌ細胞上でのプラークアッセイに使用した。プラ ーク精製は １０回繰り返す。精製した欠陥ポックスウイルスはより大量に増殖させ、サザン ブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが存在すれ ば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞上及び野生型細胞上 での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠陥ウイルスの宿主範囲が補完性 細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査では、欠陥ウイルスが非 病原性であることが確認される。 実施例４：初期転写因子の小サブユニットを欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ− Ｄ６Ｒ−ＺＧ）及び補完性細胞系の構築 ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ｄ６Ｒ）の構築 初期転写因子ＶＥＴＦの小サブユニットは大きさ７７ｋＤのポリペプチドであ る。実施例３に記載のように、ＶＥＴＦは可能なＡＴＰ結合部位を含み、初期プ ロモーターＤＮＡ配列に結合することが判明している。Ｂｒｏｙｌｅｓ及びＬｉ 、前出文献。Ｄ６Ｒ ｏｒｆを補完用に選択した。なぜなら、温度感受性突然変 異がこの遺伝子に対しマッピングされているからである。これは必須遺伝子を決 定するための要素である。Ｓｅｔｏら、Ｖｉｒｏｌ．１６０：１１０−１９（１ ９８７）。 ヘルパー細胞系Ｖ−Ｄ６Ｒの構築の最初のステップは、一般 的には、実施例３の細胞系Ｖ−Ａ８Ｌの構築と同じである。まず、Ｄ６Ｒ ｏｒ ｆをＰＣＲ仲介法によってプラスミドｐＣＲII（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ ．）内にクローニングした。得られたプラスミドは、真核生物発現ベクター及び 大腸菌発現プラスミドを構築するためのＤ６Ｒ遺伝子フラグメントの由来源であ る。大腸菌内でのｏｒｆの発現は、永久細胞系内のタンパク質を同定するために 後で使用される抗ＶＥＴＦ小サブユニット抗体を得るためにウサギを免疫感作す るためのタンパク質を迅速に産生させる。 この目的のために、プライマーｏＤ６−１（５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＡＴ ＡＧＡ ＴＴＴ−３’）（配列番号 ：２１）及びｏＤ６−２（５’−ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＴＧＧ ＡＧＡ Ａ ＧＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＧＴＴ−３’）（配列番号：２２）を用いてＰＣＲによ りＤ６Ｒ−ｏｒｆを１．９ｋｂフラグメントとして増幅し、ｐＣＲII中にクロー ニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒを形成した。 第７図に示すように、大腸菌発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’は、ｐ ＣＲ−Ｄ６Ｒ由来の１．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ フラグメントをベクターｐＲＳＥＴ−Ｂ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内 に連結することによって構築した。プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｄ６Ｒ−３’は、最 初の１００個のアミノ酸を欠失しているＶＥＴＦ小サブユニットに融合したＮ’ 末端６−ヒスチジン−ｔａｇをコードする融合遺伝子を含む。細菌発現、組換え タンパク質のｔａｇ仲介精製、及び抗ＶＥＴＦ小サブユニット抗体の産生を実施 例３に記載のように実施した。発現プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨは下記の ように構築した：プラスミドをＰｓｔＩ及びＳｍａＩで切断することにより１． ９ｋｂ遺伝子フラグメントＤ６Ｒ ｏｒｆをｐＣＲ−Ｄ６Ｒから分離し、強制ク ローニングによってベクターｐＳＶＭＣＳ＃５１（Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ、前 出文献）内に連結してプラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒを形成した。部位ＰｓｔＩ及び ＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＤ６−１（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧ ＡＡＴＡＣＣＧＧＡＡ ＴＴＡＴＡＧＡＴＴＴ−３’）（配列番号：２１）及 びｏＤ６−２（５’−ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴ ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡ ＣＣＡＣ ＧＴＴ−３’）（配列番号：２２）によって導入した。ＥＤＨ遺伝子カセットを 含むプラスミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ 遺伝子フラグメントをＳｍａＩ−ＣｌａＩ切断ｐＳＶ−Ｄ６Ｒに連結して、発現 プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨを形成した。第８図参照。 プラスミドｐＳＶ−Ｄ６Ｒ−ＥＤＨでは、Ｄ６Ｒ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロ モーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例 １に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を有する融合遺伝子である。 補完性細胞系を構築するためのトランスフェクション及びスクリーニング操作は 実施例３と同じである。欠陥ウイルスｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧの構築 ウイルスｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ− ＺＧを第９図に簡単に示すようにクローニングした。Ｄ６Ｒ ｏｒｆの両側のフ ランキング領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．６ｋｂ）をＰＣＲ仲介法によって増幅 し、プラスミドｐＣＲII内にサブクローニングしてそれぞれｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆ ｌ及びｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｒを得た。Ｄ６Ｒ ５’フランキング領域の増幅のた めのＰＣＲプライマーは、ｏＤ６−３（５’−ＴＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＣＧ ＴＣＧ−３’）（配列番号：２３）及びｏＤ６−５（５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＡＴ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ −３’）（配列番号：２４）である。Ｄ６Ｒ ３’フランキング領域用のプライ マーはｏＤ６−４（５’−ＴＡＣ ＡＧＴ ＡＣＣ ＣＧＡ ＡＴＣ ＴＣＴ ＡＣ−３’）（配列番号：２５）及びｏＤ６−６（５’−ＡＣＡ ＡＴＴ ＧＧ Ｔ ＡＴＴ ＡＡＧ ＴＡＴ ＡＡＣ ＧＡＣ ＴＣＣ−３’）（配列番号：２ ６）である。ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ由来の０．６ｋｂ ＳａｃＩ−ＳｐｅＩフラ グメントとしてのＤ６Ｒ ５’フランキング領域を、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌ内で Ｄ６Ｒ ５’フランキング領域のすぐ下流の部位ＳａｃＩ及びＸｂａＩの間に連 結してプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓを得た。クローニング操作を更 に実施するのを容易にするために、希少制限部位ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ 及びＲｓｒIIを含む合成リンカーをｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓ内のＤ６Ｒフ ランキング領域間に連結した。該リンカーの構築に使用したオリゴヌクレオチド はｏＡ８−１１及びｏＡ８−１２である。実施例３参照。そのためにプラスミド ｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ｆｌａｎｋｓをＳａｌＩで直線化し、クレノーポリメラーゼで 処理し、ＭｕｎＩで切断する（前記二つの制限部位はそ れぞれＰＣＲプライマーｏＤ６−５及びｏＤ６−６によって導入する）。その結 果得られたプラスミドｐｄＤ６Ｒを、実施例１に記載のプラスミドｐＬＧｂ由来 の３．９ｋｂ ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−Ｚ Ｇを形成する。この構築物では、相同的組換えに起因する補完性細胞系による欠 陥ウイルスの救出を防止するために、Ｄ６Ｒ ｏｒｆを完全に欠失させる。 ｄ−Ｄ６Ｒ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｄ６ＲＦ− ＺＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入する。プラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒｆ−ＺＧ はＣＶ−１細胞内でのｉｎ ｖｉｖｏ組換えに使用する。まず、５×１０⁶個の ＣＶ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキ ュベートし、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｄ６Ｒ−ＺＧを含むリン酸カルシウ ム沈降物でトランスフェクションし（前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法）、３日間増殖させる。その結果、野生型ウイルス（ヘルパー）と欠 陥ウイルスとを含む未精製ストックが得られる。欠陥ウイルスの純粋ストックを 得るために、欠陥ウイルスを補完することができるＶ−Ｄ６Ｒ−細胞内でプラー クアッセイを実施する。ウ イルス未精製ストックを調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１ ９８８）、前出文献）及びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒ ｔｉら，前出文献）の存在下でＶ−Ｄ６Ｒ細胞上でのプラークアッセイに使用す る。プラーク精製は１０回繰り返す。精製した欠陥ウイルスをより大量に増殖し 、サザンブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず、予測されたバンドが 存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。補完性細胞上及び野生 型細胞上での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠陥ウイルスの宿主範囲 が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物の検査では、欠陥ウイ ルスが非病原性であることが確認される。 実施例５：Ｊ１Ｒ遺伝子産物を欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧ ）及び補完性細胞系の構築 ベロ細胞をベースとするヘルパー細胞系（Ｖ−Ｊ１Ｒ）の構築 最初のステップは大腸菌におけるＪ１Ｒ ｏｒｆの発現であった（ＩｎＶｉｔ ｒｏｇｅｎ ｐＲＳＥＴ−ベクター系を使用）。まず、プライマーｏＪ１Ｒ−１ （５’−ＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣ ＡＣＡＡＣＣＡＧＴＡ ＴＣＴＣＴＴ−３’） （配列番号：２７）及びｏＪ１Ｒ−２（５’−ＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡ ＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴ ＧＴＴＣＡＣＴＴＴＡ−３’）（配列番号：２８）を 用いて得たＪ１Ｒ ＰＣＲ産物をｐＣＲIIベクター内にクローニングすることに よりプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒを構築した。次いで、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラ グメントをｐＲＳＥＴ−Ｂ内に挿入して大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｊ１Ｒ を形成した（第１０図）。このプラスミドを使用すると、Ｊ１Ｒタンパク質が大 量に得られた。このタンパク質は特に、ウサギ体内では免疫原性ではなかった。 このようにして、永久細胞系内でタンパク質を更に同定するための抗体を、合成 Ｊ１Ｒペプチドと担体タンパク質ＫＬＨとの結合体に対して得た。Ｊ１Ｒタンパ ク質のアミノ酸位置１１８〜１３２に対応するアミノ酸配列ＳＬＡＴＴＡＩＤＰ ＩＲＹＩＤＰを有する合成ペプチドをＫＨＬ（米国Ｐｉｅｒｃｅ社の予備活性化 ＫＬＨ）に結合した。完全フロイントアジュバント中の精製結合体を用いてウサ ギを免疫感作した（投与当たり１００ｍｇのタンパク質、ｓ．ｃ．及びｉ．ｍ． ）。１ケ月後、同量の投与量で動物を追加刺激し、抗体の発生をウェスタンブロ ットで観察した。 タンパク質はウェスタンブロットで検出する。ウェスタンブロットは本質的に 前出のＴｏｗｂｉｎらの方法で実施する。第 一抗体はウサギ抗Ｊ１Ｒタンパク質抗体であり、希釈率１：１００で使用する。 第二抗体はアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲａ ｄ，Ｉｎｃ．）であり、希釈率１：１０００で使用する。試薬（ＢＣＩＰ及びＮ ＢＴ）及び染色プロトコルはＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）のものである。 ベロ細胞内に形質転換するための発現プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨ（第 １１図）を得るために、完全Ｊ１Ｒ遺伝子をコードする０．５ｋｂ ＮｃｏＩ− ＳｍａＩ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒから分離した。部位Ｎ ｃｏＩ及びＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＪ１Ｒ−１及びｏＪ１Ｒ−２ （前出）によって導入した。このフラグメントをＢｂｓＩ切断発現ベクターｐＳ Ｖ−Ｂｂｓ内に連結した（実施例１参照）。ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラス ミドｐＥＤＨ１に由来するＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ遺伝子をＳｍａＩ−ＣｌａＩ切 断ｐＳＶ−Ｊ１Ｒに挿入して、ｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨを形成した。第１１図参 照。プラスミドｐＳＶ−Ｊ１Ｒ−ＥＤＨではＪ１Ｒ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロ モーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例 １に 記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子である。 前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの方法でプラスミドｐＳＶ−Ｊ １Ｒ−ＥＤＨをサル腎臓ベロ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）にトランスフ ェクションし、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２５０μｇ／ｍｌハ イグロマイシン）中でインキュベートし、更に実施例１の記載のように処理した 。永久ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ陽性細胞系を抗生物質ハイグ ロマイシンＢの存在下で選択した。５回の継代後に、Ｊ１Ｒ遺伝子の０．５ｋｂ セグメントに特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲにより、外来ＤＮＡの組込 みを確認した。ウェスタンブロットを用いて、目的の遺伝子、Ｊ１Ｒタンパク質 が発現されたかどうかを調べる。最も高いレベルのＪ１Ｒタンパク質を発現する 細胞系の特性をサザンブロットで検査し、補完性細胞系として使用し、Ｖ−Ｊ１ Ｒと名付ける。欠陥ウイルスｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧの構築 ウイルスｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ− ＺＧを第１２図に簡単に示すようにクロー ニングした。Ｊ１Ｒ ｏｒｆと約０．５ｋｂの両側のフランキング配列とを含む １．５ｋｂ遺伝子フラグメントをＰＣＲによってワクシニアウイルス（ＷＲ株） から増幅し、プラスミドｐＣＲII中にサブクローニングしてｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆを 得た。 ＰＣＲプライマーは、ｏＪ１−３（５’−ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＴＴＧ ＡＡＴ−３’）（配列番号：２９）及びｏＪ１−４（５’−Ｃ ＧＡ ＴＴＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＣＣ−３’）（配列番号： ３０）であった。完全Ｊ１Ｒ遺伝子と隣接チミジンキナーゼ遺伝子の最初の４０ 個のヌクレオチドとを欠失させる操作もＰＣＲ仲介法で実施した。欠失すべき配 列を除く完全プラスミドｐＣＲ−Ｊ１ＲｆをＰＣＲで増幅して６ｋｂ産生物を得 た。ＰＣＲ産物をポリヌクレオチドキナーゼ処理し、次いで再連結することによ り、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ｆｌａｎｋｓを形成した。この反応に使用した プライマーｏＪ１−５（５’−ＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡ ＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡ ＡＧＡＡＣＡＴＣＧ−３’）（配列番号：３１）及びｏＪ１−６（５’−ＣＡＧ ＴＴＡＡＣＴＴ ＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡ ＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴ−３’）（配列 番号：３２）は制限部位ＭｕｎＩ及びＨｐａＩを導入す る。プラスミドをこれらの部位で開裂し、リンカー（実施例３に記載のｏＡ８− １１及びｏＡ８−１２）を挿入してｐｄＪ１Ｒを得た。実施例３と同様に、ｌａ ｃＺ−ｇｐｔ二重マーカーカセットをｐｄＪ１ＲのＳｍａＩ部位に連結して、組 換えベクターｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ−ＺＧを形成した。（このプラスミドのみが、欠 陥ウイルスへの隣接Ｌ５Ｒ ｏｒｆの組込みに必要なＪ１Ｒ遺伝子の４０個の塩 基対を５’末端に含む。） ｄ−Ｊ１Ｒ−ＺＧウイルスを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−Ｚ ＧをワクシニアウイルスＷＲに挿入した。プラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒｆ−ＺＧは ＣＶ−１細胞中でのｉｎ ｖｉｖｏ組換えに使用した。まず、５×１０⁶個のＣ Ｖ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞のワクシニアＷＲを感染させ、１時間インキュ ベートし、２０μｇのプラスミドｐＣＲ−Ｊ１Ｒ−ＺＧを含むリン酸カルシウム 沈降物でトランスフェクションし（前出のＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅ ｂの方法）、３日間増殖させた。 この操作の結果、野生型（ヘルパー）ウイルスと欠陥ウイルスとを含む未精製 ストックが得られた。欠陥ウイルスの純粋ストックを得るために、欠陥ウイルス を補助することができる Ｖ−Ｊ１Ｒ−細胞中でプラークアッセイを実施した。ウイルス未精製ストックを 調製し、ｇｐｔ選択（Ｆａｌｋｎｅｒ及びＭｏｓｓ（１９８８）、前出文献）及 びブループラークスクリーニング（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，前出文献）の存 在下でＶ−Ｊ１Ｒ細胞上でのプラークアッセイに使用し、これと交互にＢＵｄＲ （Ｍａｃｋｅｔｔら、前出文献）の存在下でｔｋ陰性Ｖ−Ｊ１Ｒ細胞上でのプラ ークアッセイを行った。プラーク精製は１０回繰り返す。精製した欠陥ウイルス をより大量に増殖させ、サザンブロットで検査する。野生型ウイルスが存在せず 、予測されたバンドが存在すれば、正しい欠陥ゲノムが形成されたことになる。 補完性細胞上及び野生型細胞上での欠陥ウイルスのプラークアッセイにより、欠 陥ウイルスの宿主範囲が補完性細胞系に限定されていることが確認される。動物 の検査では、欠陥ウイルスが非病原性であることが確認される。 実施例６：Ｈ４Ｌ遺伝子産物を欠く欠陥ワクシニアウイルス（ｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧ ）及び補完性細胞系の構築 補完用にはＨ４Ｌ ｏｒｆを選択する。なぜなら、条件致死温度感受性突然変 異がこの遺伝子に対しマッピングされているからである。Ｓｅｔｏら，前出文献 。 ヘルパー細胞系Ｖ−Ｈ４Ｌの構築ステップは一般的には実施例３の細胞系Ｖ− Ａ８Ｌの構築と同じである。まず、Ｈ４ＬｏｒｆをＰＣＲ仲介法でプラスミドｐ ＣＲII（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングした。得られたプ ラスミドは、第１３図に示すようなベロ細胞発現ベクターｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤ Ｈを構築するためのＨ４Ｌ遺伝子フラグメントの由来源である。永久細胞系内で Ｈ４Ｌ遺伝子産物（ＲＡＰ９４）を同定するための抗体を、合成ペプチドのＫＬ Ｈ結合体に対して得る。前記結合体は、Ｈ４Ｌ ｏｒｆのアミノ酸位置２４２〜 ２５８に対応する合成ペプチドＫＩＹＫＮＳＦＳＥＤＨＮＮＳＬＤ（Ｋａｎｅ及 びＳｃｈｕｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５７５２−６２（１９９２））を活 性化ＫＬＨ（ＫＬＨ結合キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に結合する ことによって製造した。この結合体を、実施例５と類似の抗Ｈ４Ｌ抗体の産生に 使用した。 ベロ細胞発現ベクターを構築するために、プライマーｏＨ４−１（５’−ＡＣ Ｃ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＡＴ−３’）（配列番 号：３３）及びｏＨ４−２（５’−ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＣＡＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＣＴＣ−３’）（ 配列番号：３４）を用いてＰＣＲによりＨ４Ｌ−ｏｒｆを２．４ｋｂフラグメン トとして増幅し、ｐＣＲII内にクローニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌを形 成した。発現プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨは下記のように構築した：プラ スミドをＮｃｏＩ及びＳｍａＩで切断してｐＣＲ−Ｈ４ＬからＨ４Ｌ ｏｒｆを ２．４ｋｂ遺伝子フラグメントとして分離し、強制クローニングによってベクタ ーｐＳＶ−Ｂｂｓ（実施例１参照）に連結してプラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌを得た 。部位ＮｃｏＩ及びＳｍａＩはそれぞれＰＣＲプライマーｏＨ４−１及びｏＨ４ −２によって導入した。ＥＤＨ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＥＤＨ１に由 来するＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ遺伝子フラグメントをＳｍａＩ−ＳａｌＩ切断ｐＳ Ｖ−Ｈ４Ｌに連結して発現プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨを形成した。第１ ３図参照。 プラスミドｐＳＶ−Ｈ４Ｌ−ＥＤＨではＨ４Ｌ−ｏｒｆはＳＶ４０初期プロモ ーターによって制御される。永久細胞系を得るための選択マーカーは、実施例１ に記載のようなｄｈｆｒ遺伝子及びｈｐｈ遺伝子を含む融合遺伝子である。補完 性細胞系 を構築するためのトランスフェクション及びスクリーニング操作は実施例３に記 載のように、但しＨ４Ｌに特異的な試薬を用いて実施した。欠陥ウイルスｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧの構築 ウイルスｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧを構築するために、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌｆ− ＺＧを第１４図に簡単に示すようにクローニングした。Ｈ４Ｌ ｏｒｆの両側の フランキング領域（大きさ０．５ｋｂ〜０．６ｋｂ）をＰＣＲ仲介法によって増 幅し、プラスミドｐＣＲII内にサブクローニングして、それぞれｐＣＲ−Ｈ４Ｌ −ｆｌ及びｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｒを形成した。 Ｈ４Ｌ ５’フランキング領域を増幅するためのＰＣＲプライマーは、ｏＨ４ −３（５’−ＣＣＴ ＴＴＡ ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＡ ＧＡＴ ＣＧＣ−３’） （配列番号：３５）及びｏＨ４−５（５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＧＴ ＴＡＡ ＡＧ ＴＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＴＡ ＧＧＡ−３’）（配列番号： ３６）である。Ｈ４Ｌ ３’フランキング領域を増幅するためのＰＣＲプライマ ーは、ｏＨ４−４（５’−ＧＣＴＡＡＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＣＣＣ ＴＣＣ Ｔ Ｇ−３’）（配列番号：３７）及びｏＨ４−６（５’−ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＴ Ｔ ＡＡＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＴＴ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＧＣ ＡＴ−３’） （配列番号：３８）である。ｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｒ由来の０．５ｋｂ ＳａｌＩ −ＳｐｅＩフラグメントとしてのＨ４Ｌ ３’フランキング領域を、ｐＣＲ−Ｄ ６Ｒ−ｆｌ内のＨ４Ｌ ５’フランキング領域のすぐ下流の部位ＳａｌＩ及びＸ ｂａＩ間に連結して、プラスミドｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌａｎｋｓを形成した。 クローニング操作を更に実施するのを容易にするために、希少制限部位Ｓｍａ Ｉ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ及びＲｓｒIIを含む合成リンカーをｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆ ｌａｎｋｓのＨ４Ｌフランキング領域間に連結した。リンカーの構築に使用した オリゴヌクレオチドはｏＡ８−１１及びｏＡ８−１２である。次いでプラスミド ｐＣＲ−Ｈ４Ｌ−ｆｌａｎｋｓをＭｕｎＩ及びＨｐａＩで直線化した（これら二 つの部位はそれぞれＰＣＲプライマーｏＨ４−５及びｏＨ４−６によって導入す る）。得られたプラスミドｐｄＨ４Ｌを実施例１に記載のプラスミドｐＬＧｂに 由来する３．９ｋｂ ＳｍａＩ二重遺伝子カセットと連結して、ｐＣＲ−Ｈ４Ｌ ｆ−ＺＧを形成した。この構築物では、相同的組換えに起因する補完性細胞系に よる欠陥ウイルスの救出を回 避するために、Ｈ４Ｌ ｏｒｆを完全に欠失させる。 ｉｎ ｖｉｖｏ組換え及びプラーク精製によるｄ−Ｈ４Ｌ−ＺＧウイルスの構 築は実施例１に記載の方法で実施する。 実施例７：熱ショック誘導性Ｉ７Ｌ機能を有する補完性細胞系の構築 ワクシニア宿主タンパク質遮断（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）の効果は細胞の種類毎に 異なる。これは補完の効果に影響を及ぼし、従って欠陥ウイルスの純粋ストック を得るのに必要なプラーク精製量と宿主細胞系で得ることができる力価とを決め る。補完をより効果的にするために、補完機能をコードする必須読取り枠を７０ ｋｄヒト熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）遺伝子（Ｈｕｎｔ＆Ｍｏｒｉｍｏ ｔｏ，前出文献）のプロモーターの下流にクローニングする。Ｈｓｐ７０遺伝子 の転写はワクシニア感染によって誘導され、Ｈｓｐ７０をワクシニアビリオン組 み立てに使用することが提案された（Ｊｉｎｄａｌ及びＹｏｕｎｇ、前出文献） 。 最初のステップはＰＣＲ法によるＨｓｐ７０プロモーターのクローニングであ る。オリゴヌクレオチドｏＨＳ−１、５’−ＴＡＣＧＴＡＴＧＧＡ ＧＡＣＣＡ ＡＣＡＣＣ ＣＴＴＣＣ− ３’（配列番号：３９）及びｏＨＳ−２、５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴ ＣＧＧ ＧＴＴＣＣＣＴ ＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣ ＧＧ−３’（配列番号：４０）を、ヒ トＨｓｐ７０プロモーター配列を得るための鋳型として、ヒトＤＮＡ（Ｃｌｏｎ ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）と一緒に使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲIIベクター（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にクローニングしてプラスミドｐＣＲ−Ｈｓｐ を形成する。ＳｎａＢＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメントを用いてプラスミ ドｐＳＶ−Ｂｂｓ（実施例１参照）内のＳＶ４０プロモーターを置換すると、こ のプラスミド内に存在するＳＶ４０イントロンの除去後にプラスミドｐＨＳが得 られる。このベクターは、ｐＳＶ−Ｉ７Ｌ（実施例１）のＮｃｏＩ−ＳｍａＩフ ラグメントをｐＨＳに連結することによりＩ７Ｌのような読取り枠を挿入してプ ラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌを形成するために使用する。第１５図参照。 補完性細胞系を構築するために、同時形質転換操作（Ｗｉｇｌｅｒ、前出文献 ）を実施する。ベロ細胞内へのトランスフェクションの実験で、適当な選択マー カー、例えばプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ上に存在するネオマイシン耐性遺伝子 （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐ ｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））をプラスミドｐＨＳ−Ｉ７Ｌと一 緒に使用する。細胞をＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの前述の方法でト ランスフェクションし、抗生物質Ｇ４１８を含む選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウ シ胎児血清、５００μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８）中でインキュベートする。１０〜 １４日後、コロニーが観察できるようになる。これらのコロニーを増殖させ、２ 回サブクローニングし、次いで更に特性を調べる。細胞系の特性をＰＣＲ分析で 更に検査し、補完性遺伝子構築物の存在を調べる。特性ウェスタンブロットを用 いて、目的の遺伝子、Ｉ７Ｌ−タンパク質が誘導時に発現されることを明らかに する。最終補完性細胞系をＶＨｓｐ−Ｉ７Ｌと名付ける。この細胞系の特性を実 施例１の方法で調べる。欠陥ウイルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧ／Ｈｓｐの構築は、ウイ ルスｄ−Ｉ７Ｌ−ＺＧについて実施例１で説明したように行う。但し補完には細 胞系ＶＨｓｐ−Ｉ７Ｌを使用し、プラーク精製は５回だけ行って欠陥ウイルスを 得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠く欠陥ポック スウイルスであって、プロモーターの転写調節下の外来ポリヌクレオチドを含む 前記欠陥ポックスウイルス。 ２． 前記プロモーターが前記欠陥ポックスウイルスの酵素で作動し得る請求項 １に記載の欠陥ポックスウイルス。 ３． 前記プロモーターがポックスウイルスプロモーターである請求項１に記載 の欠陥ポックスウイルス。 ４． 前記外来ポリヌクレオチドが前記必須領域に挿入されている請求項１に記 載の欠陥ポックスウイルス。 ５． 前記必須領域が前記欠陥ポックスウイルスから欠失している請求項１に記 載の欠陥ポックスウイルス。 ６． マーカーが前記必須領域を置換している請求項５に記載の欠陥ポックスウ イルス。 ７． 前記外来ポリヌクレオチドが前記マーカーに挿入されている請求項６に記 載の欠陥ポックスウイルス。 ８． 前記親ポックスウイルスがワクシニアである請求項１に記載の欠陥ポック スウイルス。 ９． 前記必須領域がＩ７Ｌ、Ｆ１８Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ６Ｒ、Ａ８Ｌ、Ｊ１Ｒ、 Ｊ３Ｒ、Ｈ４Ｌ、Ａ１０Ｌ及びＡ３Ｌの中から選択した読取り枠である請求項８ に記載の欠陥ポックスウイルス。 １０． 前記必須領域が、１４キロダルトンエンベロープタンパク質又は２５キ ロダルトン構造タンパク質をコードする読取り枠である請求項８に記載の欠陥ポ ックスウイルス。 １１． 請求項１から１０のいずれか一項に記載の欠陥ポックスウイルスの欠失 機能を補完する能力を有する細胞系。 １２． 前記能力が前記欠陥ポックスウイルスの親ポックスウイルスの必須領域 によって付与される請求項１１に記載の細胞系。 １３． 前記能力が前記欠陥ポックスウイルスの親ポックスウイルスの必須領域 によって付与され、前記必須領域がポックスウイルス感染によって誘導されたプ ロモーターによって調節される請求項１２に記載の細胞系。 １４． 前記プロモーターがＨｓｐ７０プロモーターである請求項１３に記載の 細胞系。 １５． 請求項１から１０のいずれか一項に記載の欠陥ポック スウイルスの欠失機能を補完する能力を有するトランスジェニック動物。 １６． 前記能力が前記欠陥ポックスウイルスの親ポックスウイルスの必須領域 によって付与される請求項１５に記載のトランスジェニック動物。 １７． 請求項１から１０のいずれか一項に記載の欠陥ポックスウイルスの欠失 機能を補完する能力を有するヘルパーウイルス。 １８． 前記能力が前記欠陥ポックスウイルスの親ポックスウイルスの必須領域 によって付与される請求項１７に記載のヘルパーウイルス。 １９． タンパク質を製造する方法であって、親ポックスウイルスの必須領域に よって付与される機能を欠く欠陥ポックスウイルスを供給するステップを含み、 前記欠陥ポックスウイルスが前記タンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド を含み、前記ポリヌクレオチドがプロモーターの転写調節下にある前記方法。 ２０． 前記プロモーターが前記欠陥ポックスウイルスの酵素で作動し得る請求 項１９に記載の方法。 ２１． 前記プロモーターがポックスウイルスプロモーターである請求項１９に 記載の方法。 ２２． 前記供給ステップを、前記ポリヌクレオチドを前記親ポックスウイルス の必須領域に挿入することによって実施する請求項１９に記載の方法。 ２３． 前記供給ステップを、前記親ポックスウイルスの前記必須領域を前記ポ リヌクレオチドで置換することによって実施する請求項１９に記載の方法。 ２４． 前記供給ステップを、前記親ポックスウイルスの前記必須領域をマーカ ーで置換することによって実施する請求項１９に記載の方法。 ２５． 前記ポリヌクレオチドを前記マーカー内に挿入する請求項２４に記載の 方法。 ２６． 前記ポリヌクレオチドで前記マーカーを置換する請求項２４に記載の方 法。 ２７． 前記マーカーがｇｐｔ遺伝子である請求項２４に記載の方法。 ２８． 親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠く欠陥ポッ クスウイルスを含むワクチンであって、前記 欠陥ポックスウイルスが抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌ クレオチドがプロモーターの転写調節下にある前記ワクチン。 ２９． 前記プロモーターが前記欠陥ポックスウイルスの酵素で作動し得る請求 項２８に記載のワクチン。 ３０． 前記プロモーターがポックスウイルスプロモーターである請求項２８に 記載のワクチン。 ３１． 前記親ポックスウイルスがワクシニアである請求項２８に記載のワクチ ン。 ３２． ワクチンの製造方法であって、親ポックスウイルスの必須領域によって 付与される機能を欠く欠陥ポックスウイルスを供給するステップを含み、前記欠 陥ポックスウイルスが抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌク レオチドがプロモーターの転写調節下にある前記方法。 ３３． 前記プロモーターが前記欠陥ポックスウイルスの酵素で作動し得る請求 項３２に記載のワクチン製造方法。 ３４． 前記プロモーターがポックスウイルスプロモーターである請求項３２に 記載のワクチン製造方法。 ３５． 前記親ポックスウイルスがワクシニアである請求項 ３２に記載のワクチン製造方法。 ３６． プロモーターの転写調節下にある外来ポリヌクレオチドを含む欠陥ポッ クスウイルスであって、前記欠陥ポックスウイルスがその由来源である親ポック スウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している前記欠陥ポックス ウイルス。 ３７． ワクチンの製造方法であって、プロモーターの転写調節下にある外来ポ リヌクレオチドを含む欠陥ポックスウイルスを供給するステップを含み、前記欠 陥ポックスウイルスがその由来源である親ポックスウイルスの必須領域によって 付与される機能を欠失している前記方法。 ３８． プロモーターの転写調節下にある外来ポリヌクレオチドを含む欠陥ポッ クスウイルスを含むワクチンであって、前記欠陥ポックスウイルスがその由来源 である親ポックスウイルスの必須領域によって付与される機能を欠失している前 記ワクチン。 ３９． ワクチンを製造するための請求項１から１０のいずれか一項に記載の欠 陥ポックスウイルスの使用。