JPH09512909A - クリプトコックス症発症の可能性の高い免疫無防備患者を識別するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はクリプトコックス症発症の可能性の高い個人を識別する方法を提供し、その方法は該個人の血清中のグルクロノキシロマンナンに対するＩｇＧのレベルを測定するステップを含んでいる。また、血清級のグルクロノキシロマンナンに対する抗休を検出する種々の方法と、免疫無防備化する個人の血清中のグルクロノキシロマンナンに対する抗体の存在を評価するためのキットも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 クリプトコックス症発症の可能性の高い免疫無防備患者を識別するための方法 発明の背景発明の分野 本発明は一般的には免疫学、感染症、およびＡＩＤＳ研究の分野に関するもの である。より具体的には、本発明はクリプトコックス症発症の可能性の賜いＩＡ ＤＳおよびその他の免疫抑制患者を識別するための新しい方法に関するものであ る。関連技術の説明 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の顕著な特徴のひとつは、ほとんどの死が ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染自体によるものではないという事実であ る。実際、ほとんどの死は正常で健康な個人にはほとんど発生しない種々の日和 見的な原生動物類、菌類、バクテリア、ウイルスによって引き起こされる。最も 一般的な日和見感染としてはニューモシステス・カリニイ、トキゾプラズマ・ゴ ンジイ、マイコバクテルイムｓｓｐ、ヒト・サイトメガロウイルス、イースト菌 クリプトコッカス・ネフローマンスなどがある。 クリウトコッカス・ネフローマンスは我々の生活環境のいたるところに存在す るイースト菌である。多くの人がこのイースト菌に感染しているが、彼らの免疫 システムがその発症を防いでいる可能性がある。免疫機能の喪失は、多くの場合 それまで潜在していた部位、おそらくは肺から血液、そして 最終的には髄膜への拡大をもたらす可能性がある。 ＡＩＤＳ患者のケアにおいて前進が見られている。寿命はほぼ二倍になり、Ａ ＩＤＳ患者の生活も質的に改善されてきている。ＡＩＤＳ患者の措置における重 要な前進は、ニューモシステス性肺炎を予防するために抗生物質を予防的に使用 することが可能になった点である。すべてのＡＩＤＳ患者に抗ニューモシステス 性 予防薬を投与する計画は、ほとんど（７０％）のＡＩＤＳ患者がニューモシス テス性 肺炎を起こすと予想されるので、効果的である。 ＡＩＤＳ患者におけるクリプトコックス症の予防的措置は大きな可能性を有し ているが、上の計画はニューモシステス・カリニイ症を措置する場合の計画とは 異なっていなければならない。クリプトコックス症はＡＩＤＳ患者の５−１５％ で発症すると予想される。ＡＩＤＳ患者のわずか１５％にクリプトコックス症が 発症するのであれば、すべてのＡＩＤＳ患者にクリプトコックス症に関する予防 的措置を行うことは現実的ではない。その代わりに、ＡＩＤＳ患者の予防的措置 はクリプトコックス症発症の可能性が非常に高いＡＩＤＳ患者を識別する手段の 開発に依存することになるであろう。 先行技術では、クリプトコックス症発症の可能性の高いＡＩＤＳ患者やその他 の重度の免疫無防備患者を識別するための手段が十分ではない。本発明はこの分 野における長年のニーズおよび願望に応えるものである。 本発明の要約 本発明のひとつの実施の形態において、患者の血清内のグルクロンオキシロマ ンナンに対する抗体のレベルを測定するステップを含むクリプトコックス症発症 の可能性が高い個人を識別するための方法が提供される。 本発明の別の実施の形態においては、ベンゾキノンを用いてｐＨ８．５程度に 多糖類を活性化するステップと、上記活性化された多糖類をｐＨ７．５程度で疎 水性リガンドに結合するステップと、上記修正ＧＸＭをｐＨ７．０程度で該固体 相に結合するステップで構成される、抗原に結合する抗体のアッセイに有益な固 体相に多糖類グルクロンオキシロマンナンを結合するための方法が提供される。 本発明の別の実施例においては、抗原でコーティングされたマイクロタイター ・プレートのウェルをＰＢＳ−ツイーンで希釈された血清を用いて２５°Ｃで９ ０分間培養するステップと、上記ウェルから患者の血清を取り出して該ウェルを ＰＢＳ−ツイーンで洗浄して未結合の抗体を取り出すステップと、ヒトＩｇＧに 特異な希釈された酵素接合抗体を用いて２５°Ｃで３０分間培養するステップと 、上記ウェルから酵素接合抗体を取り出し、ＰＢＳ−ツイーンで上記ウェルを洗 浄することによって未結合酵素接合抗体を取り除くステップと、上記酵素接合抗 体に適した基質を加えて２５°で３０分間培養するステップと、停止液を加えて 上記酵素生成物の光学的密度を測定するステップとで構成される、血清内のグル クロンオキシロマンナンに対する抗体を検出するための方 法が提供される。 本発明のさらに別の実施の形態においては、固体相と、上記固体相にグルクロ ンオキシロマンナンを疎水的に結合させることができる疎水性リガンドと、酵素 インジケータ・システムと、そして、上記酵素結合抗体に適した基質とで構成さ れる、クリプトコックス症発症の可能性が高い個人の血清内のグルクロンオキシ ロマンナンに対する抗体の存在を評価するためのキットが提供される。 本発明のさらに別の実施の形態において、該個人の血清内のグルクロンオキシ ロマンナンに対する抗体のレベルを測定するステップと、抗クリプトコッカス腫 瘍剤を投与するステップで構成される、クリプトコックス症発症の可能性の高い 個人を措置するための方法が提供される。 本発明のその他の側面、特徴、および利点は、以下の、開示の目的のために提 供される本発明の現段階で好ましい実施の形態の説明を参照することによって明 らかになるであろう。 図面の簡単な説明 上に述べたような本発明の特徴、利点、および目的、および以下の説明で明ら かになるその他の特徴、利点、目的が達成されるように、そして詳細に理解でき るように、添付図面に示す本発明のいくつかの実施の形態を参照して、上に簡単 に説明した発明についてさらに具体的に説明する。しかしながら、添付図面は本 発明の好ましい実施の形態を示すもので あって、その範囲の限定を意図するものではない点に留意されたい。 図１はイミュロンＩプレートに対する¹²⁵Ｉでラベルしたチラミン化グルクロ ンオキシロマンナン（Ｔ−ＧＸＭ）の結合に対するコーティング緩衝液調製の影 響を示している。データは種々の量のＴ−ＧＸＭを加えた後の結合Ｔ−ＧＸＭの 量（左側）およびウェルに結合した付加Ｔ−ＧＸＭの割合として示してある。Ｔ −ＧＸＭは０．０５Ｍ炭酸緩衝液（最上列）、リン酸緩衝液（中央）、またはク エン酸緩衝液（一番下）で希釈された。これらの緩衝液はそのままの形態（三角 ）、０．１Ｍ ＮａＣｌで補強した形態（四角）、または０．９５Ｍ ＮａＣｌ で補強した形態（丸）で用いられた。示されている結果は４つの同じ条件のウェ ルの平均値である。 図２は培養時間および温度の、Ｔ−ＧＸＭのイミュロンＩプレートへの結合に 対する影響を示している。結合力学は各時間間隔で結合した量（左側）、および Ａ₀を結合Ｔ−ＧＸＭの予想最大量およびＡを各時間間隔に使える結合容量であ る偽ファースト・オーダー・プロットとして示されている。ウェルは４°Ｃ（丸 ）、２０°Ｃ（四角）、または３７°Ｃ（三角）の温度で、１０μｇ／ｍｌの放 射性物質でラベルしたチラミン化ＧＸＭを０．９５Ｍ ＮａＣｌで含有するリン 酸コーティング緩衝液を用いて時間をいろいろに変えて培養した。示されている 結果は三つの同じ条件のウェルの平均値 である。 図３はイミュロンＩプレートでの保持に対する保存時間および条件の影響を示 している。ウェルはＴ−ＧＸＭでコーティングされ、（ｉ）ＰＢＳ−ツイーンで 洗浄した後、乾燥保存（丸）、（ｉｉ）ＰＢＳ−ツイーンで洗浄した後希釈水で 洗浄して、乾燥保存（四角）、また（ｉｉｉ）ＰＢＳ−ツイーンで洗浄した後、 ＰＢＳ−ツイーンで覆って保存（三角）した。示された保存時間後、すべてのウ ェルをＰＢＳ−ツイーンで洗浄して、結合Ｔ−ＧＸＭの量を判定した。示されて いる結果は４つの同じ条件のウェルの平均値である。 図４は、４０名の正常な成人ドナーから得た血清中の抗ＧＸＭ抗体を示してい る。各ポイントはＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ重鎖、またはカッパ、またはラ ムダ軽鎖を有する抗体に関して評価された個別血清サンプルを示している。 図５は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，およびＩｇＧ４サブクラスに関する 正常なヒト血清のアッセイを示している。分析対象に選び出された血清は＞１／ ５０の抗ＧＸＭＩｇＧ抗体タイターを有していた。 図６はＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行のいろいろの段階で得られた血清内の 抗ＧＸＭ抗体の発生頻度および特性を示している。血清はＣＤ４カウントが＞５ ００μ／ｌ（左側）の個人１０名、ＣＤ４カウントが２００−４９９／μｌ（中 央）の個人２０名、およびＣＤ４カウントが＜２００／μｌ（右側）の個人１０ 名から得られた。 発明の詳細な説明 本発明においては、『免疫無防備化』という用語は、患者におけるＴリンパ球 機能が失われて、その患者が広がっているクリプトコックス症に対する感作性を 増大してしまっている状態を意味する。 クリプトコッカス・ネオフォルマンスは日和見的作用を発揮するイースト菌で 多糖莢膜によって取り囲まれている。この莢膜の主要な構造的成分はグルクロノ キシルオマンナン（ＧＸＭ）と呼ばれる多糖類で、マンノース、キシロース、グ ルクロン酸、およびＯ−アセチル基で構成されている。抗莢膜および／または抗 ＧＸＭ抗体は補体固定、マウス体内に棲息する腹膜マクロファージおよびヒト好 中球による細胞食作用のためのオプソニン化、ヒトの天然キラー細胞の抗クリプ トコッカス活性の増強、および、イン・ビボでの受動的免疫化を介してのクリプ トコッカスの除去(clearance)などの種々の生物学的活性を有している。 クリプトコッカスＧＸＭなどの負の電荷を持った莢膜性多糖類は固体相におい て免疫アッセイのために通常用いられるポリスチレン・プレートにはあまり接着 しない。多糖類のポリスチレンに結合しやすくし、抗莢膜性抗体の測定を可能に することが報告されている先行技術に基づく方式としては以下のようなものがあ る：（ｉ）負の電荷を持った多糖類との多重の弾力的結合を形成するポリ−Ｌ− リシンでプレートを前もってコーティングする；（ｉｉ）多糖類をポリ−Ｌ−リ シンと共有結合させ、それがポリスチレン・プレートと結合する方法；（ｉｉｉ ）接着性を大幅に増大させるチラミンへの多糖類の共有結合；（ｉｖ）負の電荷 を持った多糖類の正の電荷を持ったメチル化蛋白質との共有結合；（ｖ）固体相デリビタイズ 蛋白質への多糖類の共有結合あるいは蛋白質に多糖類を結合させた 後スチレン・プレートに加える方法；（ｖｉ）多糖類をビオチニル化して、その 後アビジンでコーティングしたプレートに結合させる方法：および（ｖｉｉ）不 動態化を促進するコーティング条件下で多糖類を直接受動的に結合させる方法。 付着を促進する試薬に多糖類を共有結合させる方法は、通常、アミノ酸を含有 する化合物へ結合させるための多糖類の活性化のステップを含んでいる。活性化 の手順は以下のステップを含んでいる：（ｉ）その多糖類の水酸基に反応基、も っとも好ましくはイミドカーボネートおよびシアネート・エステルを導入するた めのシアノゲン・ブロマイドによる多糖類の処理；（ｉｉ）適切な求核試薬を用 いて濃縮できるアルデヒド基を発生させるための多糖類の過ヨウ素酸塩による限 定的酸化；および（ｉｉｉ）多糖類の塩化シアンによる措置。 ベンゾキノンによる活性化は、その活性化がｐＨ＜８．５の領域で達成できる ので、シアノゲン・ブロマイドによる活性化など他の手順よりはっきりと優れた 利点を持っている。クリプトコッカス菌の多糖類を、チアノゲン・ブロマイドに よる活性化に必要とされるよりアルカリ性の高いｐＨ，あるいは過ヨウ素酸塩に よって酸化された多糖類がアミノ基に結合される場合に通常用いられる水素化硼 素ナトリウムによってつくりだされるアルカリ性ｐＨ領域で容易に加水分解され るＯ−アセチル基でデコレート（ｄｅｃｏｒａｔｅ）される。 本発明はチラミンをベンゾキノン活性化多糖類に結合させるステップを含んで おり、チアミン化されたＧＸＭ（Ｔ−ＧＸＭをポリスチレンまたは塩化ポリビニ ル・マイクロタイター・プレートへの結合をより容易にする条件を定義している 。 本発明は以下のことを示す：（ｉ）正常な成人ボランティアのグループ内での 抗ＧＸＭ抗体の出現頻度および免疫グロブリン・クラスの特徴付け；（ｉｉ）正 常なボランティアの結成に見いだされるＩｇＧサブクラスの判定；および（ｉｉ ｉ）ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行には抗ＧＸＭ抗体生産の量的および質的な 影響が伴うということ。本発明は一部の正常な個人が高いレベルの抗ＧＸＭ抗体 を有しており、基本的にはすべての個人が容易に検出できる抗ＧＸＭ ＩｇＭを 有していることを示す。この抗莢膜性ＩｇＧは基本的にはｉｇＧ２サブクラスで あって，ＩｇＧ１抗体は一部の個人の結成に見いだされる。最後に、ＨＩＶのＡ ＩＤＳへの進行にはＩｇＭクラスの抗ＧＸＭ抗体の選択的なロスが伴うが、Ｉｇ Ｇクラスの抗ＧＸＭ抗体のロスはほとんど、あるいはまった くない。 本発明においては、該個人の結成内のグルクロンオキシロマンナンに対する抗 体のレベルを測定するステップを含む、クリプトコックス症発症の危険性が高い 個人を識別する方法が提供される。さらに、該個人の血清内のグルクロンオキシ ロマンナンに対する抗体のレベルを測定するステップと、抗クリプトコッキス・ ネオフォルマンス剤を投与するステップで構成されるクリプトコックス症発症の 可能性の高い個人を措置するための方法が提供される。 明らかに、本発明によるこれらの方法は、どの個人に対しても適用することが できるが、免疫無防備化されていて、したがって、クリプトコックス症発症の可 能性の高い個人に適用するのが最も好ましい。一般的に、本発明の方法はＴリン パ球機能が不全あるいは抑圧されている免疫無防備化されたいずれの個人に対し てでも適用することができる。ひとつのクラスの免疫無防備化された個人はヒト 免疫不全ウイルスに感染された個人である。免疫無防備化された個人の別のグル ープは獲得免疫不全症候群、アドネラル・コルコシスステロイド、サルコイドシ ス、およびリンパ腫の過剰使用で構成されるグループから選択された病理学的状 態にある人々である。 一般的に、本発明による方法は選択された個人の血清内のグルクロンオキシロ マンナンに対する抗体のレベルを測定する。好ましくは、測定される抗体はＩｇ Ｇである。 本発明はまた、固体相、ＧＸＭの上記固体相に対する疎水性結合を可能にさせ る疎水性リガンド、酵素インジケータ・システム、およびその酵素と結合した抗 体に適した基質で構成される、免疫無防備化された個人の血清内のグルクロンオ キシロマンナンに対する抗体の存在を判定するためのキットを提供する。 本発明によって提供されるキットの使用においては、クリプトコッカスのグル クロンオキシロマンナンが固体相に不動態化されるので、ＧＸＭは抗クリプトコ ッカス抗体で認識されるエピトープを修正、ブロック、劣化させずに上記固体相 にしっかりと結合する。一般的に、この固体相はＧＸＭに結合するものであれば いずれも固体相であってもよい。好ましくは、この固体相はポリスチレンまたは 塩化ポリビニル・プレートであり、別の固体相としては他の形状の紙、磁性ビー ズまたはプラスチック性ディップ・スティックである。 不動態化の好ましい方法はＧＸＭを、ＧＸＭの上記固体相への疎水性結合を可 能にする疎水性リガンドへの結合する方法である。この疎水性リガンドはヒトの 血清内で発生する抗体によって認識されていはいけない。チラミンは好ましいリ ガンドである。ＧＸＭの上記疎水性リガンドへの結合は共有結合にするものでな ければならず、また、アルカリに対して反応性を示す側鎖の加水分解を行わせな いような方法で行われる必要がある。抗原の最善の濃度、マイクロタイター・プ レートをコーティングするための最善のｐＨ、およびコーテ ィングを行うための最善の温度は、当業者が本発明の開示を読めばすぐ分かるで あろう。 本発明のキットはまた、ヒトＩｇＧ重鎖に固有の抗体などの酵素インジケータ ・システムを含んでいる。好ましくはこれらの抗体はワサビダイコン・ペロキシ ダーゼでラベルしたヤギ（またはヒツジ）の抗体である。他の酵素インジケータ ・システムは先行技術においてよく知られている。一般的に酵素に結合した酵素 活性に適した基質が含まれる。こうした基質の代表的な例は３、４’、５、５’ −テトラメチル・ベンジジン、および過酸化水素（ＴＭＢマイクロウェル・ベロ キサイド基質システム）である。この技術分野の通常の技術を有する人物であれ ば他の別の基質も見出すことができるであろう。 本発明はさらに、ＰＢＳツイーンで希釈された血清で２５°Ｃの温度で抗原で コーティングしたマイクロタイター・プレートのウェルを培養するステップと、 それらウェルから患者の血清を取り出して、未結合の抗体を取り除くために上記 ウェルをＰＢＳ−ツイーンで洗浄するステップと、ヒトＩｇＧに固有の希釈され た酵素接合抗体を用いて２５°Ｃの温度下で３０分間洗浄されたウェルを培養す るステップと、ＰＢＳ−ツイーンで洗浄して上記ウェルから酵素接合された抗体 を取り出すステップと、その酵素接合された抗体に適切な基質を加えて２５°Ｃ の温度で２０分間培養するステップと、そして堪能停止溶液を加えてその酵素生 成物の光学的な密度 を測定するステップとを含む、血清内のグルクロンオキシロマンナンに対する抗 体を検出する方法を提供する。 非特有的結合に関する比較対照群として、ヒトの血清のアリコットを、抗原で コーティングしたウェルで培養する前に４μｇ／ｍｌ ＧＸＭで予備培養した。 その後、抗原中和された患者の血清を上に述べた方法で固体相上で不動態化され た抗原で培養する。 以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明するためのものであって、い かなる意味でも本発明を限定するものではない。 実施例１ クリプトコッカスのグルクロオキシロマンナン クリプトコッカスＧＸＭを、Ｃｈｅｒｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ ．Ｉｍｍｕｎ．５９：５９（１９９１）に記述された手順の修飾を行なうことに より単離した。簡単に言えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンスのセロタイ プＡ菌種２４０６４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒ ｅｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、ジェラトリ・シェカーで１００ｒｐｍ、３０°Ｃ 、４日間、液状の合成培地で成長させた。ホルムアルデビドを最終濃度が１％に なるように添加し、酵母細胞を殺した。酢酸ナトリウム結晶および氷酢酸を、最 終濃度がそれぞれ１０％および１％になるよう添加し、１０，０００ｘｇの条件 で遠心分離器にかけ酵母細胞を除去した。多糖類を、２．５容量の９５％のエタ ノールを加えることにより、その上澄液により沈降させて、その沈降物を遠心分 離器にかけて収集した。多糖類沈降物を０．２Ｍ ＮａＣｌ中に約５ｍｇ／ｍｌ の濃度で溶解し、溶液を遠心分離器にかけて清澄にした。ヘキサデシルトリメチ ルアンモニウム・ブロマイド（ＣＴＡＢ）を加え（３ｍｇ ＣＴＡＢ／ｍｇ多糖 ）、０．０５％ＣＴＡＢ２容量を撹拌しながらゆっくり加えた。そのＧＸＭ−Ｃ ＴＡＢ複合物を遠心分離器にかけて収集し、０．２Ｍ ＮａＣｌ中約５ｍｇ／ｍ ｌの濃度で再溶解させた。多糖類を上記のエタノールおよびＣＴＡＢを用いて再 沈降させた。最終的に多糖類をエタノールで沈降させ、脱イオン水て透析し、乾 燥凍結した。 実施例２ チラミンのＧＸＭへの結合 ＧＸＭを、Ｋｏｚｅｌ ａｎｄ Ｈｅｒｍｅｒａｔｈ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、１０７：５３（１９８８）およびＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４３ ：８７９（１９８４）に記述されたベンゾキノン活性化手順にしたがって、いく つか修飾して用いてチラミンに共有結合した。ＧＸＭを脱イオン水（１０ｍｇ／ ｍｌ）で溶解し、等量の０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．５）に混合した 。ペンゾキノン（０．２５容量、無水エタノール中）を加えて２０％エタノール 中ベンゾキノンの最終濃度が５０ｍＭになるようにし、ＧＸＭを用いて室温で６ ０分間培養した。多糖類のＯ−アセチル基がアルカリ性加水分解により失われる 可能性があるの で、ｐＨは８．５以上であってはならず、培養時間は６０分を越えてはならない 。酢酸ナトリウム結晶（１０％ｗ／ｖ）および氷酢酸（１０％ｗ／ｖ）を加え、 ９５％エタノールの２容量を加えてＧＸＭを沈降させる。その沈降物を遠心分離 器にかけて収集し、酢酸緩衝液（１０％酢酸ナトリウムおよび１％氷酢酸）中、 約２ｍｇのＧＸＭ／ｍｌの濃度で溶解させ、２容量のエタノールを加えて再沈降 させた。その沈降物を遠心分離器にかけて収集し、０．５ＭのＮａＣｌを含む０ ．１モルのリン酸ナトリウム液（ｐＨ７．５）に４ｍｇ ＧＸＭ／ｍｌの濃度で 溶解した。そのＧＸＭを同じ緩衝液および０．１Ｍリン酸ナトリウム液（ｐＨ７ ．５）で透析した。 ベンゾキノンによって活性化されたＧＸＭを、その活性化された多糖類（約２ ｍｇ／ｍｌ）を等量の塩酸チラミン（０．１モルのリン酸ナトリウム液中１ｍｇ ／ｍｌ、ｐＨ７．５）と混合することによってチラミンに結合して、混合物を室 温で一昼夜培養した。酢酸ナトリウムの結晶および氷酢酸を上記のように加え、 チラミン化ＧＸＭを９５％エタノールの２容量を加えて沈降させた。その沈降物 を遠心分離器にかけて収集し、０．５Ｍモ ＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸ナ トリュウム（ｐＨ７．５）に約４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、０．５ＭのＮａＣ ｌおよび０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む０．１モルのリン酸 ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して連続的に透析を行った。ＧＸＭ濃度をフェノ ール・硫酸アッセイにより測定し、チラミン結合ＧＸＭを ２ｍｇ／ｍｌに希釈し、濾過により殺菌し、４°Ｃで保存する。 ＧＸＭのチラミン化の程度を、基準として塩酸チラミン、ブランクとしてベン ゾキノンで活性化された多糖類を用いて２８０ｎｍでその光学的密度を測定する ことにより判定した。クリプトコッコスＧＸＭが子量を５００、０００と想定す れば、３０モル程度のチラミンが各モルのＧＸＭと結合したことになる。 実施例３ Ｔ−ＧＸＭのスチレン・プレートへの結合に関するアッセイ チラミン化ＧＸＭを、ヨードゲン（Ｐｉｅｒｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． 、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、）法により¹²⁵Ｉでラベルした。放射性物質でラベルされ たＧＸＭを、セファデックスＧ−２５を介して濾過を行い遊離沃素から分離した 。一般的に、ＧＸＭの４ｍｇを３．０ｘ１０⁶ｃｍｐ／μｇの比活性にラベルし た。¹²⁵ＩでラベルされたＧＸＭをラベルしていないＧＸＭと混合し、２．５ｘ １０⁵ｃｐｍ／μｇの比活性を有するＧＸＭを生成した。 Ｔ−ＧＸＭをプレートの結合に用いる培養条件は実験手順に従って種々変更し た。コーティング・ステップ後、プレートをＰＢＳ−ツイーン（８ｇのＮａＣｌ 、０．２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄．２．９ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄Σ１２Ｈ₂Ｏ、０．２ｇのＫ Ｃｌ、脱イオン水１リットルあたり０．５ｍｌのツイーン）を用いて６回洗浄し た。ウエルを分離して、ＧＸＭの結 合量をガンマー計測器で測定した。種々の条件の基でのＧＸＭの結合量の統計的 な比較は、統計的有意差判定基準としてＰ＜０．０５を用いるｔテストでおこな った。 実施例４ Ｔ−ＧＸＭ不動化の最適条件 Ｔ−ＧＸＭのイミュロンＩプレートへの結合におけるｐＨおよびイオン強度の 重要性を示すために、（ｉ）０．０５Ｍの炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、（ｉｉ） ０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および１０ｍＭのＥＤＴＡ、および （ｉｉｉ）０．０５Ｍのクエン酸、ｐＨ４．５、のいずれかの中で６２５−２０ ，０００ｎｇ．ｍｌの範囲の濃度でＴ−ＧＸＭを調製した。コーティング液は、 （ｉ）そのまま、（ｉｉ）塩化ナトリウムを０．１Ｍまで添加する、および（ｉ ｉｉ）塩化ナトリウムを０．９５Ｍまで添加する、の３つの条件で用いた。この Ｔ−ＧＸＭを用いて、プレートを室温で一昼夜培養した。ウエルを洗浄して非結 合Ｔ−ＧＸＭを除去し、Ｔ−ＧＸＭの吸着量を測定した。そのデータを結合Ｔ− ＧＸＭ／ウエルでナノグラム単位で計算した。 図１は、炭酸塩あるいはリン酸塩緩衝液に取り込まれた結合ＧＸＭの量を示し ている。 炭酸塩およびリン酸塩緩衝液中の最大結合量は約１００−１５０ｎｇ／ウエル であった。クエン酸緩衝液を使用すると結合量が基本的に低減するため、結合の 最大値として約５０ｎｇ／ウエルが観察された。ＮａＣｌを０．１Ｍまで取り込 むとＮａＣｌを加えないで同じ緩衝液内での結合より、リン酸緩衝液内で起きる 結合がかなり高められた。同様に０．１ＭのＮａＣｌで同じ緩衝液を用いた場合 より、０．９５ＭのＮａＣｌ用いた場合のリン酸緩衝液で起き結合がかなり大き い。イオン強度が大きくしても、炭酸塩またはクエン酸緩衝液における結合を増 強する効果は示さない。 実施例５ 時間および温度に関する条件 コーティングの時間および温度の影響について調べた。イミュロンＩプレート のウエルを０．９５ＭのＮａＣｌを含有するリン酸コーティング液に１０μｇ／ ｍｌの放射性物質でラベルしたＴ−ＧＸＭ１００ｍμｌを用いて培養した。その プレートを１、２、４、８、２４または４８時間、４°Ｃ、２０°Ｃ、３７°Ｃ の温度下で培養した。そのプレートを洗浄し、Ｔ−ＧＸＭの結合量を測定した。 図２は、実験を行なったいかなるコーティング時間においても、２０°Ｃまた は３７°Ｃで結合のレベルに明確な違いがないことを示している。２０°Ｃまた は３７°Ｃで４８時間プレートを培養すると、２４時間培養した場合以上の結合 は観察されなかった。４°Ｃでの培養の場合、プレートをの培養時間≧２時間で ２０°Ｃまたは３７°Ｃの温度下でコーティングした場合に起こるよりも、結合 量がかなり低下した。この実験結果に基づいて、19.5の培養は、２０°Ｃ、２４ 時間の条件で、プレートをＴ−ＧＸＭで培養した。 １ｎ（Ａ／Ａ0）対時間（図２）のプロットでは、Ａは、任意の時間での空結 合容量 であり、Ａ₀は全結合容量（ここでは２０°Ｃまたは３７°Ｃで４８時間 培養されたＴ−ＧＸＭの結合量として定義されている）であり、０°Ｃ、２０° Ｃまたは３７°Ｃでのコーティングされたプレートの場合、線形的な結果が示さ れている。このことは、結合が、各コーティング温度で、結合が単一の一定した 次速度特性で起きることを示している。結合は、２０°Ｃ（疑似一次速度定数〜 ２．７ｘ１０^-3）または３７°Ｃ（疑似一次速度定数〜２．６ｘ１０^-3）のどち らかで結合するより、４°Ｃ（疑似一次速度定数〜３．２ｘ１０^-4）の場合の方 がずっと遅かった。 実施例６ ポリスチレン・プレート上でのＴ−ＧＸＭ不動態化の安定性 イミューロンＩプレートに対するＴ−ＧＸＭの結合の安定性を評価するために 、種々の溶離剤および解離剤について調査した。ウェルを０．９５Ｍ Ｎａｃｌ を含有したリン酸コーティング緩衝剤内で１０μｍ／ｍｌ放射性物質でラベルし たＴ−ＧＸＭ１００μｌを用いて室温で２４時間コーティングした。そのウェル をＰＢＳ−ツイーンで６回洗浄して、各ウェルに１００μｌの溶離剤を加え、そ の後２０°Ｃの温度で１時間培養した。ウセルをＰＢＳ−ツイーンで６回洗浄し てから結合チラミン化ＧＸＭの量を判定した。その結果をＰＢＳで処理したウェ ルに対する取り出されたチラミン化ＧＸＭのパーセンテージで示す。表Ｉはチラ ミン化したＧＸＭがほとんどの解離剤による溶離に対して著しく抵抗性が高いこ とを示している。アルカリ性緩衝液あるいはカオトロピック塩で措置した場合に 有意な溶離が起きた。しかしながら、プレートから溶離されるＴ−ＧＸＭの量は ＰＢＳで培養されたプレートの場合の量を３５％以上上回ることはなかった。 種々の条件下で保存した後、不動態化されたＴ−ＧＸＭの安定性について判定 した。ポリスチレン・プレートのウェルを０．９５Ｍ ＮａＣｌを含んだリン酸 コーティング緩衝液内で１０μｇ／ｍｌ放射性物質でラベルしたＴ−ＧＭＸ１０ ０μｌを用いて室温でで２４時間コーティングした。その後ウェルをＰＢＳ−ツ イーンで洗浄して、（ｉ）ＰＢＳ−ツイ ーンを除去してからプレートを乾燥状態で保存、（ｉｉ）プレートをさらに二回 希釈液で洗浄してから乾燥状態で保存、（ｉｉｉ）プレートを１００μｌＰＢＳ −ツイーンで覆って保存した。４つのウェルをいろいろの時間間隔で取り出して ＰＢＳ−ツイーンで洗浄し、その後、結合チラミン化多糖類の量を判定した。Ｐ ＢＳ−ツイーンで洗浄後乾燥保存した場合（半減期〜４６日）、およびＰＢＳ− ツイーンで覆って保存した場合（半減期〜４７日）のいずれもプレートからもＴ −ＧＸＭが徐々に失われた。蒸留水で洗浄することでＰＢＳ−ツイーンを取り除 くと、プレートを６４日保存した後でも結合Ｔ−ＧＸＭのロスはほとんどなかっ た（推定半減期は１０００日以上）。 チラミンに対する結合に対する莢膜性多糖類の活性化はＣＮＢｒ、シアン酸塩 素、および過ヨウ素酸塩を用いることによって達成される。本発明は、ベンゾキ ノンによる活性化も免疫学的アッセイにおいて使用するために多糖類をチアミン 化する上で有効な手段であることを示している。ベンゾキノ ンにはこの活性化手順に関していくつかの特徴がある。第一に、ベンゾキノンに よる活性化は別の手順で必要とされるよりは低いｐＨ（＜８．５）で行われる。 Ｏ−アセチル化はＧＸＭの抗原性の重要な成分であるので、このことは特別の重 要性を有している。Ｏ−アセチル基はｐＨ＞８．５で多糖類から簡単に失われて しまう。第二に、ベンゾキノンによる活性化はクロモフォールを多糖類に導入し て、活性化手順のモニタリングを容易にしてくれる。 ポリスチレン・プレートに結合するＴ−ＧＸＭの量は蛋白質を用いた場合の結 合とほぼ同様である。０．９５ Ｍ ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液でコーテ ィングされたＴ−ＧＸＭの結合部位の飽和は５０−１００ｎｇ／ｃｍ²で発生し た。蛋白質を用いた場合とＴ−ＧＸＭを用いた場合の結果の差はＧＸＭの高度に 水和された性質によって容易に説明がつく。多糖類が非常に水和されやすいとい う事実は、すべての利用可能な部位を満たすためには重力ベースで必要とされる 多糖類の量がより少ないことを示唆する。 Ｔ−ＧＸＭがポリスチレンに結合する効率においては温度が重要なファクター である。４°Ｃでの結合での偽一次速度係数は２０°Ｃあるいは３７°Ｃでの結 合に対する速度係数の６分の１程度であった。 本発明はＴ−ＧＸＭがかなりのしつこさでポリスチレンと結合することを示し ている。プレートがＴ−ＧＸＭをかなり取り除くことができる溶離液はほとんど なかった。結合の長 さは結合したＴ−ＧＸＭをほとんど失わずにプレートを長期的に保存することを 可能にした。チラミン基の導入はその分子をより疎水性にして、ポリスチレンに 対する吸着度がより大きくなった。しかしながら、ＧＸＭ１モルあたり約３０モ ルのチラミンを用いることによって、個々のＧＸＭ分子による結合の多価的性質 は結合の長さで有意なファクターとなる可能性が高い。疎水性モイアティの多く がその分子の内部に存在している蛋白質とは違って、ＧＸＭの伸長された性質は チラミン基のすべてではないとしても、ほとんどのものがポリスチレンの表面に 結合できるようにするらしい。 実施例７ クリプトコッカスの細胞およびＧＸＭ ＧＸＭを実施例１および２に述べたように単離した。 ベンゾキノンで活性化したＧＸＭは、活性化された多糖類（約４ｍｇ／ｍｌ） を等量のチラミン・ハイドロクロライド（０．１ Ｍリン酸ナトリウム内に１ｍ ｇ／ｍｌ、ｐＨ ７．５）に混合することによってチラミンに結合され、室温で 一昼夜培養された。ナトリム・アセテートの結晶と氷酢酸を上に述べたように加 え、チラミンと結合したＧＸＭを二体積の９５％エタノールを付加することによ って析出された。沈殿物を遠心分離で集めて、０．５ Ｍ ＮａＣｌを含有する ０．１Ｍリン酸ナトリム（ｐＨ ７．５）内に約４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して 、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．１Ｍリン酸ナトリム（ｐＨ ７．５）を含有した０ ．１Ｍリン酸ナトリ ムに対して連続的に透析を行った。ＧＸＭ濃度はＤｕｂｏｉｓら、Ａｎａｌ．Ｃ ｈｅｍ．２８：３５０−３５６（１９５６）によって述べられたフェノール−硫 酸アッセイで判定し、チラミンと結合したＧＸＭは２ｍｇ／ｍｌに希釈され、ろ 過滅菌した後、４°Ｃで保存した。 実施例８ 抗クリオコッカス抗体に関するＥＬＩＳＡアッセイ イミュロンＩマイクロタイター・プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖａ）のウェルを１００ｎｇの チラミン化ＧＸＭ（Ｔ−ＧＸＭ）を１００μｌのコーティング緩衝液（０．０５ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．４、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有）に解かしたも ので４°Ｃの温度で一昼夜コーティングした。これらのウェルをブロッキング緩 衝液（０．０５Ｍ２リン酸ナトリウム、ｐＨ ７．４）で３回洗浄して、０．０ ５％ツイーンをブロッキング緩衝液に解かしたもの３００μｌを用いて９０分間 ブロックした。チラミン化ＧＸＭでコーティングしたプレートをＰＢＳ−ツイー ン（０．０５％ツイーン２０を含有したＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、１：５の 希釈から始めて、ＰＢＳ−ツイーン内のヒトの血清を二倍づつ連続的に希釈して 、９０分間培養した。ネガティブ・コントロールとして、すべての血清を４μ ＧＸＭ／ｍｌを含有するＰＢＳ−ツイーン内で希釈して、チラミン化ＧＸＭ（Ｇ ＸＭで中和した血清）でコーティングしたウェルに付 加する前に３０分間培養した。血清またはＧＸＭで中和した血清で培養した後、 ウェルをＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄して、ワサビダイコン・ペロキシダーゼ（ ＨＲＰＯ）でラベルした第二の抗体を用いて室温で９０分間培養した。 この第二の抗体はＨＲＰＯでラベルした、親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ重鎖（ １／１６，０００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ． Ｎｏ．２０４０−０５）、ＨＲＰＯでラベルした親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＭ重 鎖（１／１５，０００：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａ ｔ．ｎｏ．２０２０−０５）、ＨＲＰＯでラベルした親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇ Ａ重鎖（１／１２，０００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃａｔ．ｎｏ．２０５０−０５）、ＨＲＰＯでラベルした親和性精製ヤギ抗ヒト ・カッパ（１／１０，０００：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，ｃａｔ．ｎｏ．２０６０−０５）、または親和性精製抗ヒト・ラムダ（１／５ ０００：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．ｎｏ．２０ ７０−０５）である。第二の抗体は８倍に希釈して用いられ、精製ＩｇＧ（抗Ｉ ｇＧ，抗カッパ、あるいは抗ラムダ）、ＩｇＭ（抗ＩｇＭ）、またはＩｇＡ（抗 ＩｇＡ）でコーティングされたウェルで２．５のＯＤ₄₅₀ をつくり出した。この プレートをＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄して、１００μｌのＴＭＢマイクロウエ ル・ペロキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｒｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）で３０分間培養した。 この反応は１００μｌの１Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄を付加して停止された。セレス９００酵 素免疫吸着剤アッセイ・ワークステーション（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｎｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４５０ｎｍで３０分間 以内で吸着度の読み取りを行った。すべてのＥＬＩＳＡアッセイは、ＧＸＭ中和 コントロールを含めて二重で行われた。二重のウェルから平均を計算し、血清を ＧＸＭで予備培養しなかった場合に得られるＯＤ₄₅₀からＧＸＭで中和した血清 から得られたＯＤ₄₅₀を差し引くことによって特殊ＯＤ₄₅₀で計算した。このデー タをタイター・モードでＫｉｎｅｔｉｃａｌｃＥＩＡ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．１２（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ ｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。このデータのベスト・フィットは４パラメ ータ演算法で判定され、タイター閾値は０．５に設定された。これらの条件下で 、バックグラウンド（ＧＸＭで中和されたもの）との比較で０．５のＯＤ₄₅₀を つくりだす血清希釈が最終点として報告された。１／５の血清希釈で０．５以下 のＯＤ₄₅₀の血清はネガティブとして報告された。マウス・モノクローナルＩｇ Ｇ１抗体を標準として用いて、約５００ｐｇの抗体が０．５のＯＤ₄₅₀をつくり だした。 上に述べたＥＬＩＳＡアッセイを修正して、抗ＧＸＭ ＩｇＧ抗体のＩｇＧサ ブクラスを判定した。この修正されたア ッセイで、プレートをＧＸＭでコーティングして、上に述べたような血清希釈液 あるいはＧＸＭを含有するＰＢＳ−ツイーン内で希釈された血清で培養した。こ のウェルを洗浄して、ヒトＩｇＧ１（１／２．０００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ；Ｃａｔ ｎｏ．４１１４５１）、ＩｇＧ２（１／８０００； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：Ｃａｔ．ｎｏ．４１１４６１），ＩｇＧ３（１／４０． ０００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：Ｃａｔ ｎｏ．４１１４８１）、あるいはＩｇ Ｇ４（１／５０，０００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；４１１４９２）に特異的な最 善の状態に希釈されたマウッス・モノクローナル抗体を用いて室温で９０分間培 養した。その後ＰＢＳ−ツイーンでプレートを洗浄して、１００μｌのペロキシ ダーゼで培養したヤギ抗マウスＩｇＧ（１／４５００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃ．，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．ｎｏ．１ ０３０− ０５）で培養し、洗浄した後、上に述べたような基質で培養した。その結果をバ ックグランド（ＧＸＭで中和されたもの）を基準として補正された、０．５のＯ Ｄ₄₅₀をつくりだした血清希釈液として報告された。 実施例９ 正常なドナーからの血清における抗ＧＸＭ抗体の発生と免疫グロブリン・クラス ＩｇＧ，ＩｇＭ、およびＩｇＡクラスの抗体のレベルを判定するために血清を 調べた。血清は４０名の正常な成人ボラ ンティアから得た。この血清については、カッパまたはラムダ軽鎖を有する抗体 の発生およびそのレベルについても調べられた。図４は２８％の結成がタイター＞ １／１０のＩｇＧ抗体を有しており、９８％がタイター＞のＩｇＭ抗体を有し ており、そしてわずか１つの血清サンプルがタイター＞１／１０のＩｇＡ抗体を 有していることを示している。９８％がタイター＞１／１０のカッパ鎖を有する 抗体を有しており、４５％がタイター＞１／１０のラムダ鎖を有する抗体を含ん でいた。 さらに抗ＧＸＭ ＩｇＧのＩｇＧサブクラスを判定するために、＞１／５０の ＩｇＧ抗体タイターを有する５つの血清について調べた。結果（図５参照）は、 各セラが検出可能な程度のＩｇＧ２サブクラスの抗ＧＸＭ抗体を含んでいること を示している。これらの血清のうちの２つは検出可能なレベルのＩｇＧ１抗体も 含んでいた。これらの血清のいずれも、検出できるレベルのＩｇＧ３またはＩｇ Ｇ４サブレベルの抗ＧＸＭ抗体を含んでいなかった。 実施例１０ ＨＩＶ陽性ドナーからの血清内の抗ＧＸＭ抗体の特徴付け ｉ）ＨＩＶ陽性で、ＣＤ４カウントが＞５００細胞／μｌ，ｉｉ）ＨＩＶ陽性 でＣＤ４カウントが２００−４９９細胞／μｌの範囲、およびｉｉｉ）ＨＩＶ陽 性でＣＤ４カウントが＜２００細胞／μｌの患者の血清内の種々の重鎖および軽 鎖アイソタイプを有する抗ＧＸＭ抗体の出現およびそのレベ ルについて検査した。陽性タイターが＞１／１０の抗体タイターと定義された。 図６はＨＩＶ陽性ドナーからの血清の分析結果を示している。正常なドナーに おける陽性タイターの出現頻度（図４）とＨＩＶ陽性ドナーにおけるそれ（図６ ）との比較を表ＩＩに示した。ＣＤ４レベルが２００以下の患者では抗ＧＸＭＩ ｇＧの出現の頻度はより低い。しかしながら、この差は有意差ではなかった。Ｉ ｇＭクラスの抗ＧＸＭは、ＣＤ４のレベルとは関係なく、ＨＩＶ陽性ドナーにお けるより、正常な個人における方がより頻度が高かった。同様に、カッパ軽鎖を 有する抗ＧＸＭ抗体はＨＩＶ陽性ドナーにおける方が正常な個人におけるより頻 度が低かった。タイター＞１／１０の個人の頻度でなく実際の抗体のレベルを比 較すれば、別の違いが認められた可能性はある。その結果、種々の個人グループ の中のそれぞれのタイターをマン・ホイットニー・ランク・サム・テストで比較 した。ひとつの例外を除いて、このテストで判定された有意差は、そのデータを 陽性タイターの頻度で評価した場合とまったく同じであった。例外は、ＣＤ４レ ベルが２００以下のＨＩＶ陽性患者からの血清に見られたラムダ軽鎖を有する抗 体のタイターのかなりの（ｐ＜０．０１）の低下（正常な個人と比較しての）で あった。 実施例ＩＩ ＡＩＤ患者の血清の遡及的分析 本発明はクリプトコッカス・ネオフォルマスの大型莢膜性 多糖類との反応性を示す抗体の検出に高度の感度をしめす評価方法を提供する。 本発明による方法は、このイースト菌が多糖類との反応性を示すＩｇＧ抗体の形 態の免疫学的『足跡』を残すので、潜在的な感染の存在を判定する。したがって 、抗体の存在は潜在的なクリプトコックス症感染の存在を示唆し、したがって、 ＡＩＤＳを有する患者におけるクリプトコックス症発症の高い可能性を示唆する 。抗体に関するアッセイ 血清をクリプトコッカス・ネオフォルマスの主要セロタイプ固有多糖類である グルクロノキシロマンナンに対する抗体の存在に関して調査する。この多糖類は そのイースト菌を取り囲む莢膜性多糖類の主要成分である。標準マイクロ・タイ ター・プレートで不動態化されたＧＸＭに対する抗体を酵素免疫吸着アッセイで 評価した。不動態化には、プレートに対する強力な付着のために必要な疎水性を 増大しつつ、多糖類の抗原構造を保持する方法でＧＸＭを化学的に修飾すること が必要である。このアッセイはチラミンのＧＸＭに対する結合を可能にするよう なベンゾキノン結合手順を用いる。こうした方法で修正された多糖類はポリスチ レンおよび塩化ポリビニル・プレートとかなりしっかりと結合する。患者の血清のアッセイ 血清を入手して、（１）ＨＩＶに感染した患者で、一度ＨＩＶ感染がＡＩＤＳ に進行した場合にクリプトコックス症を発症した患者と、（２）発症しなかった 患者の二つのカテゴ リーに分類した。ＩｇＧ抗体が観察される頻度は、クリプトコックス症を発生し なかった患者グループより、クリプトコックス症を発生した患者グループの方が かなり高い。 本発明は正常な成人ドナーから得た血清で発生する抗ＧＸＭ抗体に関する新し い情報を提供してくれる。血清内での抗クリプトコックスＩｇＧ抗体発生の頻度 は正常なドナーの９８％であり、ＩｇＧ抗体は正常なドナーの２８％で発生した 。本発明はすべてのカテゴリーのＨＩＶ陽性患者でのＩｇＭクラスの抗ＧＸＭ抗 体の発生を劇的に減少する。同様の減少が、カッパ軽鎖を有する抗体の発生にお いても認められた。対照的に、ラムダ軽鎖を有する抗体をつくりだすＨＩＶ陽性 患者の割合は減少しなかった。種々のステージのＨＩＶ感染の患者においてＩｇ Ｇ抗体の発生の有意な減少は認められなかった。このことはＡＩＤＳの進行で劣 化された免疫システムにおいてもクリプトコックス症発症の可能性に関するＩｇ Ｇ抗体マーカーが失われないことを示している。 タイプ２Ｙ依存抗原に対する応答性の低下は、これまでにもＨＩＶ感染の過程 の比較的初期に発生することが認められている。肺炎球菌莢膜ワクチンに対する 免疫反応に関するこれまでの研究で，しつこい全体的リンパアデノパシーを有す るＨＩＶ陽性患者においてＩｇＧ２、ＩｇＭ、およびＩｇＡ応答が損なわれてい ることが認められているが、ＩｇＧ１応答の喪失は認められていない。したがっ て、抗ＧＸＭ抗体の減少はＩｇＧ２の選択的ロスが原因なのかもしれない。この ことは検査された５つの正常な血清の内の２つでＩｇＧ１の発生が認められたこ とと関連性をもっているのであろう。 正常なヒト血清における抗ＧＸＭ抗体に対する抗原性刺激については分かって いない。抗体が［発生したのは］その環境内で遭遇したクロス反応性抗原による 刺激のせいなのかもしれない。いくつかのバクテリア性莢膜と反応性を示す『天 然の』抗体は腸内および鼻咽頭器官のクロス反応性抗原に対する露出が原因であ る可能性がある。グルクロン酸およびＯ−アセチル基は多くの多糖類の共通の成 分である。したがって、いたるところに存在する抗ＧＸＭ ＩｇＭ抗体がこれら の成分のひとつと反応している可能性がある。一方、キシロースは多くの植物に おいては共通に認められるにもかかわらず、バクテリア莢膜において特徴的には 認められない。ＩｇＧ抗ＧＸＭ抗体は自然か、あるいは準臨床レベルでの感染の いずれかでクリプトコッカスに対する露出を示している可能性がある。したがっ て、抗ＧＸＭ ＩｇＧは潜在的なクリプトコックス症感染およびＨＩＶ感染ある いは他の免疫無防備患者におけるクリプトコックス症発症の可能性を示している 。 本明細書で述べたすべての患者および出版物は、本発明が関係する分野の当業 者の理解できるレベルのものである。すべての特許および出版物は、それらを参 照することによって個々の出版物が具体的に、そして個別に組み込まれているの と同様に、本明細書に組み込まれている。 この分野の当業者は、本発明が上記の課題の実行と、ここに述べられている目 的および利点、およびそれらと本質的に付随する目的および利点を達成するのに 適合していることを容易に理解できるであろう。上に述べた実施例は、ここに述 べられている方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物と共に現段階での 好ましい実施の形態を示すものであり、具体例であって、本発明の範囲の限定を 意味するものではない。当業者なら、特許請求の範囲で定義されている本発明の 精神の範囲内で変更や他の使用法を容易に想起できるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年６月２０日 【補正内容】 特許請求の範囲 １．クリプトコックス症発症の可能性の高い個人を識別するための方法において 、該個人の血清内のグルクロンオキシロマンナンに対する抗体のレベルの測定す るステップを含む方法。 ２．該個人が免疫無防備化されていることを特徴とする請求項１の方法。 ３．該免疫無防備化されている個人が後天性免疫不全、生理的な状態を越えた副 腎コルチコステロイド、サルコイドーシス、およびリンパ腫で構成されるグルー ブから選択される病理状態にあることを特徴とする請求項２の方法。 ４．該個人がヒト免疫不全ウイルスによって感染されていることを特徴とする請 求項１の方法。 ５．該抗体はＩｇＧであることを特徴とする請求項１の方法。 ６．該ＩｇＧ抗体がサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体であることを特徴と する請求項１の方法。 ７．該抗体が酵素結合免疫吸着アッセイによって測定されることを特徴とする請 求項１の方法。 ８．固体相、ＧＸＭの上記固体相に対する疎水性結合を可能にする疎水性リガン ド、酵素インジケータ・システム、そして上記酵素結合抗体に適した基質で構成 される、クリプトコックス症発症の可能性の高い個人の血清内のグ ルクロンオキシロマンナンに対する抗体の存在を評価するためのキット。 ９．（キャンセル） 10．（キャンセル） 11．（キャンセル） 12．（キャンセル） 13．（キャンセル） 14．（キャンセル） 15．（キャンセル） 16．（キャンセル）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトの血清中のグルクロンオキシロマンナンの抗体レベルを測定するステッ プを含むことを特徴とする、クリプトコックス症発症の可能性の高い人の識別方 法。 ２．上記個人が免疫無防備患者であることを特徴とする、請求項１の方法。 ３．該免疫無防備患者が、後天性免疫不全症候群、生理学的な量を上回る副腎コ ルチコステロイド、サルコイド−ジス、およびリンパ腫で構成されるグループか ら選択される病理学的状態にあることを特徴とする、請求項２の方法。 ４．該個人がヒト免疫不全ウイルスで感染していることを特徴とする、請求項１ の方法。 ５．該抗体がＩｇＧであることを特徴とする、請求項１の方法。 ６．該ＩｇＧ抗体がサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体であることを特徴と する、請求項５の方法。 ７．該抗体が酵素結合免疫吸着アッセイによって測定されることを特徴とする、 請求項１の方法。 ８．クリプトコックス症発症の可能性の高い個人の血清中のグルクロノキシロマ ンナンにおける抗体の存在を評価するためのキットにおいて、固体相、ＧＸＭの 上記固体相への疎水性結合を可能にする疎水性リガンド、酵素インジケータ・シ ステム、および上記酵素結合抗体に適した基質によって構成されるキット。 ９．ＰＢＳ−ツイーン内で希釈された血清を用いて２５°Ｃの温度で９０分間、 抗原でコーティングしたマイクロタイター・プレートのウェルを培養するステッ プと， 上記ウェルから患者の血清を取り出し、該ウェルをＰＢＳ−ツイーンで洗浄し て未結合抗体を取り除くステップと、 希釈されたヒトＩｇＧに固有の酵素接合抗体を用いて２５°Ｃの温度で３０分 間、洗浄されたウェルを培養するステップと、 ＰＢＳ−ツイーンで上記ウェルを洗浄してそれらウェルから酵素接合抗体を取 り除くステップと、 上記酵素接合抗体に適切な基質を加えてから、２５°Ｃの温度で３０分間培養 するステップと、そして 停止液を加えてから酵素生成物の光学的密度を測定するステップとで構成され る、グルクロノキシロマンナンに対する抗体を検出する方法。 １０．該個人の血清中のグルクロノキシロマンナンに対する抗体のレベルを測定 するステップと、 抗クリプトコックス腫剤を投与するステップとで構成される、クリプトコック ス症発症の可能性が高い個人を措置するための方法。 １１．該個人が免疫無防備化されていることを特徴とする、請求項１０の方法。 １２．該免疫無防備化された個人が、後天性免疫不全症候群、生理学的な量を超 えた副腎コルチコステロイド、サルコ イドーシス、およびリンパ腫で構成されるグループから選択される病理学的状態 にあることを特徴とする、請求項１１の方法。 １３．該個人がヒト免疫不全ウイルスに感染していることを特徴とする、請求項 １０の方法。 １４．該抗体がＩｇＧであることを特徴とする、請求項１０の方法。 １５．該ＩｇＧ抗体がサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体であることを特徴 とする、請求項１４の方法。 １６．該抗体が酵素結合免疫吸着アッセイで測定されることを特徴とする、請求 項１０の方法。