JPH095241A - 化学発光分析試薬の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 本発明は、化学発光分析用のルミノール試薬
組成物に関し、長期保存においても化学発光量が低下し
にくい安定な組成物の提供を目的とする。 【構成】 本発明は、ルミノール試薬に無機アジドを
０．０１〜０．１％含有せしめることにより、試薬の保
存安定性を高める方法及び安定性の高い試薬組成物に関
る。 【効果】 本発明により、ルミノール試薬の保存安定性
が向上し、全自動化学発光酵素免疫測定装置への適用が
容易となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、化学発光分析試薬の安
定化試薬および方法に関るものである。更に詳しくは安
定化した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物
試薬および２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合
物試薬の安定化技術に関るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、化学発光を測定系とする全自動分
析装置ならびに分析用試薬が、いくつか開発され、臨床
検査室で容易に化学発光測定を利用する環境が整いつつ
ある。これらの測定系に用いられる代表的な化学発光物
質は、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４フタラジ
オン（ルミノール）、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−
１，４フタラジオン（イソルミノール）等の２，３−ジ
ヒドロ−１，４フタラジオン化合物、ジオキセタンおよ
びアクリジニウムエステル等が知られている。ルミノー
ル、イソルミノールは、主としてペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）を標識とした競合法またはサンドウィッチ法のＥ
ＩＡで用いられる。ジオキセタンは、アルカリフォスフ
ァターゼを標識としたＥＩＡで、アクリジニウム化合物
は、それ自体を標識とした化学発光法で用いられてい
る。

【０００３】ルミノールおよびイソルミノールは、容易
かつ比較的安価に入手可能な原料であり、フェノール化
合物等の増感物質によって十分な発光強度が得られる。
一般的な測定は、抗体または抗原を結合した固相と検体
およびＰＯＤ標識抗体または抗原とを反応させ、サンド
ウィッチ型の結合物を形成させる。続いて過剰のＰＯＤ
標識抗体または抗原を洗浄により除いた後、過酸化水素
水および増感物質を含むルミノールまたはイソルミノー
ル溶液を加えて、放出される光の量を測定することから
なる。

【発明が解決しようとする問題点】

【０００４】２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
合物は溶解直後の非特異発光が高いため、化学発光分析
には、１週間程度エイジングした溶解試薬を使用しなけ
ればならない。ところが長期保存した溶液を用いると、
保存状態が低温（４℃）であっても、発光強度が次第に
低下してしまう欠点があった。発光強度の低下はＳ／Ｎ
比の低下につながる。

【問題点を解決するための手段】

【０００５】本発明の課題は、２，３−ジヒドロ−１，
４フタラジオン化合物による発光試薬を溶液状態で安定
化する技術を提供する事にある。そしてその課題は、
２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物含有発光
試薬に無機アジドを０．０１〜０．１％の範囲で添加す
ることによって解決される。この濃度範囲以上の無機ア
ジドの添加は、反応中にＰＯＤ活性を阻害して発光強度
の低下をもたらすおそれが生じる。一方、この濃度範囲
以下の無機アジド添加は、測定中の発光強度を安定化す
る作用が期待できるものの（特開平６−３４６３０）、
長期保存した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
合物溶液の安定化には寄与しない場合がある。

【０００６】無機アジドとしては、アジ化ナトリウム、
アジ化カリウム等のアルカリ金属アジドおよびアジ化バ
リウム等のアルカリ土類金属アジドが使用されるが、特
に好ましいのは、アジ化ナトリウムである。アジ化ナト
リウムは広く一般に防腐剤として用いられているが、本
発明の安定化効果は、雑菌汚染を防止することによって
達せられたものではない。

【０００７】溶液組成物の安定化技術として、しばしば
特定の緩衝液およびｐＨの効果が取り上げられている
が、本発明の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
合物溶液の安定化技術においては、緩衝液の種類は特に
問わない。りん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、くえん酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常用いられる緩
衝液から１種またはこれらの２種を組合わせたものから
適宜選べばよい。緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲内に調
整されていれば、安定化効果は変わらない。ｐＨ３以下
の酸性条件ではアジ化ナトリウムが分解されるので、安
定化効果は得られない。

【０００８】２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
合物発光試薬中の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオ
ン化合物濃度は特に限定されるものではなく、試薬構成
の量的比に合わせて任意に選べばよい。全自動化学発光
分析機ＡＬ−１０００（栄研化学販売）用試薬では、洗
浄した固相ビーズにＰＯＤ基質である過酸化水素水とル
ミノール発光試薬をそれぞれ１００μｌ分注するシステ
ムであり、このシステムに適合する発光試薬の適当なル
ミノール濃度は０．００１〜１０ｍＭであり、好ましく
は０．０１〜１ｍＭである。化学発光エンハンサ−は、
試薬構成上ならびに測定操作の簡便化のため、２，３−
ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物発光試薬に共存さ
せる方が望ましい。フェノール系エンハンサーとして
は、４−ヨードフェノール、４−フェニルフェノール、
２−クロロ−４−フェニルフェノールが特に有効とされ
るが（特公平３−５５３９）、これらのエンハンサーは
いずれも、０．０１〜１０ｍＭの濃度範囲で２，３−ジ
ヒドロ−１，４フタラジオン化合物と同一溶液中に共存
させることができる。

【０００９】以下に実施例を述べる。

【実施例１】 ＣＥＡ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定
化効果 無機アジド無添加ルミノ−ル試薬と無機アジド添加ルミ
ノ−ル試薬をそれぞれ４℃、３７℃に２週間および１カ
月間保存し、ルミスポットＣＥＡ（栄研化学製・登録商
標）の指示書に記載されたプロトコ−ルにしたがって、
全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００により
免疫反応を実施した。ＣＥＡの酵素免疫反応後のペルオ
キシダ−ゼ活性を各種ルミノ−ル試薬により測定し、発
光強度を比較した。

【００１０】１−（ａ）固相化抗体 市販の抗ＣＥＡウサギポリクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ
製）をＰＢＳで希釈して１μg／ｍｌとした抗体溶液中
にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工
業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後生理食塩水
で洗浄し、０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬
して固相化抗体を得た。

【００１１】１−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体 市販の抗ＣＥＡモノクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ製）を石
川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰＯＤ
（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、ＰＯＤ
標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２００
を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２５０
倍に希釈して使用した。

【００１２】１−（ｃ）発光試薬１、２ ３０％過酸化水素水（和光純薬工業製）０．３ｍｌを
０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝液１０００ｍｌに溶
解し、過酸化水素試薬とした。ルミノール（東京化成
製）２２５ｍｇおよびｐ−ヨードフェノール（和光純薬
工業製）１１ｍｇを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝
液１０００ｍｌに溶解し、一部はそのままルミノール試
薬Ａとし、一部はさらにアジ化ナトリウム（和光純薬工
業製）を０．０２５％となるように加えルミノール試薬
Ｂとした。

【００１３】１−（Ｃ）免疫学的測定法 試料として市販精製ＣＥＡ（ＳＣＲＩＰＰＳ社）を用い
これを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に希釈して免
疫反応に供した。測定は全自動化学発光酵素免疫測定装
置ＡＬ−１０００にて行った。プロトコ−ルは次の通り
である。各免疫反応用チュ−ブにあらかじめ抗体不溶化
固相を１コづつ入れておき、その中に被検試料６０μｌ
と希釈液２００μｌを添加し、３７℃約７分反応させ
た。反応後溶液を吸引除去して、ビ−ズをＰＢＳで洗浄
し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび希釈液１７０μｌを
加え３７℃，約７分反応させた。反応後溶液を除去し、
ビ−ズを洗浄した後、前記の過酸化水素試薬、１００μ
ｌおよびルミノール試薬Ａ、１００μｌまたはルミノー
ル試薬Ｂ、１００μｌを加え、発光強度（３秒間の積算
値）を測定した。

【００１４】結果を表１に示す。表中の数値は、検体が
精製ＣＥＡの場合は発光の計測値を、また検体が血清の
場合はＣＥＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右に
示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する比
率である。低濃度の精製ＣＥＡにおいて、アジ化ナトリ
ウムの顕著な効果が認められた。血清測定値はそれぞれ
の試薬でキャリブレーションを行った後の測定のため、
アジ化ナトリウム添加効果は小さくなるが、測定値の正
確性は明らかに無添加試薬より良好との結果が得られ
た。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【実施例２】 ＡＦＰ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定
化効果 前記発光試薬２−Ａと発光試薬２−Ｂをそれぞれ４℃、
３７℃に２週間および１カ月間保存し、ルミスポットＡ
ＦＰ（栄研化学製・登録商標）の指示書に記載されたプ
ロトコ−ルにしたがって、全自動化学発光酵素免疫測定
装置ＡＬ−１０００により免疫反応を実施した。ＡＦＰ
の酵素免疫反応後のペルオキシダ−ゼ活性を各種ルミノ
−ル試薬により測定し、残存発光強度を比較した。

【００１７】２−（ａ）固相化抗体 市販の抗ＡＦＰウサギポリクロ−ナル抗体（ＵＣＢ社
製）をＰＢＳで希釈して１μg／ｍｌとした抗体溶液中
にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工
業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後、生理食塩
水で洗浄し０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬
して固相化抗体を得た。

【００１８】２−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体 市販の抗ＡＦＰモノクロ−ナル抗体（ザイメット社製）
を石川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰ
ＯＤ（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、Ｐ
ＯＤ標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２
００を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１
０００倍に希釈して使用した。

【００１９】２−（ｃ）免疫学的測定法 試料として市販ＡＦＰ標準（日本バイオテスト研究所
製）を用いこれを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に
希釈して免疫反応に供した。測定は全自動化学発光酵素
免疫測定装置ＡＬ−１０００（栄研化学）にて行った。
プロトコ−ルは次の通りである。各免疫反応用チュ−ブ
にあらかじめ抗体不溶化固相を１コづつ入れておき、そ
の中に被検試料２０μｌと希釈液２５０μｌを添加し、
３７℃約７分反応させた反応後溶液を吸引除去して、ビ
−ズをＰＢＳで洗浄し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび
希釈液１７０μｌを加え３７℃、約７分反応させた。反
応後溶液を除去し、ビ−ズを洗浄した後下記の各化学発
光試薬を２００μｌ加え、発光強度（３秒間の積算値）
を測定した。

【００２０】結果を表２に示す。表中の数値は、検体が
ＡＦＰ標準品の場合は発光の計測値を、また検体が血清
の場合はＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右
に示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する
比率である。ＡＦＰにおいてもＣＥＡと同様に、アジ化
ナトリウムを添加したルミノール試薬の安定性は顕著に
向上している。

【００２１】

【表２】

【発明の効果】本発明により、２，３−ジヒドロ−１，
４フタラジオン化合物試薬の保存安定性が向上し、全自
動化学発光酵素免疫測定装置への適用が容易となる。

Claims (6)

【整理番号】 Ｐ−０００３１８ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
   合物の化学発光をシグナルとする化学発光分析用の試薬
   組成物において、無機アジドを０．０１〜０．１％含む
   の試薬組成物。
2. 【請求項２】無機アジドがアジ化ナトリウムである請求
   項１に記載の試薬組成物。
3. 【請求項３】発光増強剤を含む請求項１に記載の試薬組
   成物。
4. 【請求項４】化学発光をシグナルとする化学発光分析用
   の試薬組成物において、無機アジドを０．０１〜０．１
   ％含有させる２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
   合物試薬組成物の安定化方法。
5. 【請求項５】無機アジドがアジ化ナトリウムである請求
   項４に記載の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化
   合物試薬組成物の安定化法。
6. 【請求項６】発光増強剤を含む請求項４に記載の２，３
   −ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬組成物の安
   定化法。