JPH095328A

JPH095328A - 脱窒細菌類の抗体感作ラテックス、および検出方法

Info

Publication number: JPH095328A
Application number: JP17539895A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Omura; 浩大村; Koichi Okumura; 剛一奥村; Fumiko Nagai; 冨美子長井; Mitsuyo Wada; 光代和田; Hisao Atobe; 久男跡部; Masami Yagishita; 正美柳下
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1995-06-19
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1997-01-10
Also published as: EP0778466A4; WO1997000448A1; EP0778466A1

Abstract

(57)【要約】【目的】活性汚泥、水中、土壌中の脱窒細菌類を簡便に
検出する方法に用いる脱窒細菌類の検出用抗体感作ラテ
ックス、および、当該抗体感作ラッテクスを使用する脱
窒細菌類の検出方法を提供する。【構成】脱窒細菌類に特異的な抗体をラテックス粒子に
吸着させた脱窒細菌類の検出用抗体感作ラテックス。ラ
テックス粒子として、比重１．５ｇ／ｃｃ前後の高比重
ラテックス粒子、平均１．０μｍ前後のラテックス粒子
が使用される。【効果】従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要と
されていた、脱窒細菌類の検出・定量を容易にかつ簡便
に行うことが可能である。また、脱窒細菌類に対する特
異的な抗体を１種もしくは任意の複数種を用いることに
より、活性汚泥、水中、土壌中などの活性のある目的微
生物を同定し、その菌数を迅速かつ適正に測定する方法
を確立することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、活性汚泥、水中、土壌
中などに存在する脱窒細菌類を簡便に検出する方法に使
用される脱窒細菌類の検出用抗体感作ラテックス、およ
び、当該抗体感作ラテックスを使用する脱窒細菌類の検
出方法に関するものであり、更に詳しくは、従来、長期
間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた脱窒細菌
類の検出、定量を簡便な操作で、正確に実施することを
可能にすると共に、活性汚泥、水中、土壌中などにおけ
る活性のある目的微生物の動向を的確に管理する方法を
確立することを可能にする脱窒細菌類の検出用抗体感作
ラテックス、および脱窒細菌類の検出方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】従来、活性汚泥や土壌中の脱窒細菌類を
簡便に検出する方法としては、一般に、試料を採取し、
１０日から１４日間の培養期間を経た後、窒素含有ガス
発生の有無から脱窒細菌類を検出する方法が知られてお
り、かかる測定方法を利用することによって、活性汚泥
や土壌中の活性（硝酸、亜硝酸の還元による、窒素ガ
ス、亜酸化窒素ガスの生成）のある目的微生物（脱窒細
菌類）の動向を管理することが行われていた。

【０００３】しかし、当該方法は、脱窒細菌類の検出、
測定に、熟練を要したり、また、かなりの日数がかかる
ことから、測定結果から目的とする微生物の動向を管理
するための迅速な対応がとりにくかった。

【０００４】また、脱窒細菌類の中には、亜酸化窒素の
還元酵素を欠く菌株も存在し、その場合、亜酸化窒素
は、溶解度が大きいので、ガスの発生の有無の確認がで
きず、試料によっては正確な判断ができないなどの不都
合が生じることもあった。

【０００５】一方、本発明者らは、これまでに、硝酸菌
または亜硝酸菌について、抗体を用いる検出方法を開発
し、本方法により硝酸菌または亜硝酸菌を、迅速に検出
する方法を提供している。（特開平５−３２２８９６号
公報）更に、当該抗体をラテックス粒子に吸着させた抗体感作
ラッテクスを使用することで、更に容易に硝酸菌、亜硝
酸菌の検出を行う方法についても提供してきた。（特願
平６−７６３３６号）

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】この様な状況を踏ま
え、本発明者らは、更に、活性汚泥、水中、土壌中など
に存在する脱窒細菌類を簡便かつ迅速に検出する方法を
開発することを目的として鋭意検討を行った。

【０００７】その結果、本発明者らは、脱窒細菌類に特
異的な抗体を作製し、当該抗体をラテックス粒子に吸着
させた抗体感作ラテックスを用いることにより、簡単な
操作で、正確に脱窒細菌類を検出・定量できることを見
出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、活性汚泥、水中、土
壌中などの脱窒細菌類を簡便に検出することを可能にす
る新規な脱窒細菌類の検出用抗体感作ラテックスを提供
することを目的とするものである。

【０００９】また、本発明は、上記検出用抗体感作ラテ
ックスを利用することによって、活性汚泥、水中、土壌
中などに存在する脱窒素細菌類を簡便に検出および定量
する方法を提供することを目的とするものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決する本発
明は、脱窒細菌類に特異的な抗体をラテックス粒子に吸
着させたことを特徴とする脱窒細菌類の抗体感作ラテッ
クス、である。また、本発明の他の態様は、前記ラテッ
クス粒子が、比重１．５ｇ／ｃｃ前後の高比重ラテック
ス粒子である前記の脱窒細菌類の抗体感作ラテックス、
である。また、本発明の他の態様は、前記ラテックス粒
子が、平均粒径１．０μｍ前後のラテックス粒子である
前記の脱窒細菌類の抗体感作ラテックス、である。更
に、本発明の他の態様は、前記の脱窒細菌類の抗体感作
ラテックスを使用することを特徴とする脱窒細菌類の検
出方法、である。

【００１１】本発明で云う脱窒素細菌類とは、脱窒素活
性、すなわち硝酸、亜硝酸の還元により、窒素ガス、亜
酸化窒素ガスの生成を行わせる作用を有する微生物であ
り、幾つかの種が知られている。本発明の抗体を用いた
脱窒細菌類の検出方法では、当該抗体は一般的に種に特
異的であるから、脱窒素細菌類すべての抗体を作成し、
それらを用いることが原則であるが、通常の活性汚泥や
土壌中などの脱窒素細菌類の測定においては、必ずしも
すべての抗体を用いる必要はなく、例えば、以下に示さ
れるように、本発明において好適なものとして選択され
た標準株に対する抗体を組み合わせて使用することで、
十分目的を達することができる。

【００１２】本発明では、抗体を調製するための脱窒細
菌類の標準株として、例えば、アグロバクテリウムラ
ジオバクター（Agrobacterium radiobacter ）ＩＦＯ
１３５３２Ｔ株、アルカリゲネスデニトリフィカンス
（Alcaligenes denitrificans ）ＩＦＯ１５１２５Ｔ
株、バシラスリケニフォルミス（Bacillus lichenifo
rmis）ＩＦＯ１２２００Ｔ株、フラボバクテリウム
（Flavobacterium sp.）ＩＦＯ１５１２８株、フラボ
バクテリウム（Flavobacterium sp.）ＩＦＯ１５１４
７株、パラコッカスデニトリフィカンス（Paracoccus
denitrificans）ＩＦＯ１４９０７株、シュードモナ
ススタッゼリ（Pseudomonas stutzeri）ＩＦＯ１４
１６５Ｔ株、シュードモナスフルオレセンス（Pseudo
monas fluorescens ）ＩＦＯ１４１６０Ｔ株、シュー
ドモナスピケッティ（Pseudomonas picketti）ＪＣＭ
５９６９Ｔ株、チオバシラスデニトリフィカンス
（Thiobacillus denitrificans）ＪＣＭ３８７０株、
シュードモナスアエルギノサ（Pseudomonas aerugino
sa）ＩＦＯ１２６８９Ｔ株、アルカリゲネスファエ
カリスＩＦＯ１３１１１Ｔ株が好適なものとして用
いられるが、他の脱窒細菌類の菌株を用いても同様に抗
体を調製し得ることは言うまでもない。本発明は、前記
の如く、上記標準株に対する抗体を適宜組み合わせて使
用することにより好適に実施されるが、それに限らず、
他の脱窒細菌類の菌株に対する抗体を組み合わせて使用
することも適宜可能である。

【００１３】これらの菌に特異的な抗体は、公知の方法
（特開平５−３２２８９６号公報に記載の方法等）によ
り製造した抗血清を、更に、プロテインＡカラムキット
等の適宣の精製手段で精製して使用される。

【００１４】すなわち、上記脱窒細菌類に特異的な抗体
を調製するには、まず、それぞれの菌類を適当な液体培
地を用いて培養し、必要に応じて殺菌し、集菌し、抗原
とする。次いで、この抗原を、例えば、ウサギに耳静脈
に注射により投与し、抗体価の上昇を確認した上で、全
採血し、遠心分離などの適宣な処理を施した後、５６℃
で不活化を行い、抗血清とする。

【００１５】更に、プロテインＡカラムキット等の適宣
の精製手段で精製することによって調製される。

【００１６】次いで、上記特異的な抗体を吸着させる担
体のラテックス粒子や、また、感作ラテックスの製造方
法等は、既に本発明者らが報告した方法（特願平６−７
６３３６号）に従い調製することができる。

【００１７】すなわち、前記ラテックス粒子として、比
重が約１．０〜１．５ｇ／cc、好ましくは１．５ｇ／ｃ
ｃ前後の高比重ラテックス粒子が好適なものとして用い
られ、更に、平均粒径は約０．８〜２．２μｍ、好まし
くは平均１．０μｍ前後のラテックス粒子が好適なもの
として用いられる。このようなラテックス粒子として
は、例えば、バクトラテックス０．８ｌ（Ｄｉｆｃｏ社
製、平均粒径０．８ｌμｍ、比重１．０ｇ／ｃｃ）、お
よびＨ０９０１，Ｈ０９０２，Ｈ２００２（日本合成ゴ
ム社製、平均粒径・比重は、それぞれ、０．９４μｍ・
１．５ｇ／ｃｃ、０．９８μｍ・１．５ｇ／ｃｃおよび
２．２２μｍ・１．５ｇ／ｃｃ）等の市販製品が例示さ
れるが、これに限らず、これらと同効のものであればそ
の種類を問わず使用することが可能である。本発明者ら
が検討したところによれば、後述するように、比重が
１．０ｇ／ｃｃ程度のラテックス粒子に感作したもので
は、顕微鏡下での観察で凝集像の判断を行う方法（顕微
鏡ラテックス法）の場合は、判断することが十分に可能
であるが、肉眼で判断する方法（マイクロタイター法）
の場合は、凝集像の判断が難しいことがわかった。これ
に対して、比重が１．５ｇ／ｃｃ前後の高比重ラテック
ス粒子に感作したものでは、凝集したラテックス粒子は
速やかに沈降し、肉眼でも容易にかつ正確に判断を行う
ことができるので、本発明においては、比重１．５ｇ／
ｃｃ前後の高比重ラテックス粒子が好適なものとして使
用される。また、後述するように、ラテックス粒子の平
均粒径は１．０μｍ前後のものを用いると、感度の高い
感作ラテックスが得られるので、本発明においては、平
均粒径１．０μｍ前後のラテックス粒子が好適なものと
して使用される。

【００１８】また、抗体感作ラテックスは、適当な緩衝
液で希釈したラテックス粒子の懸濁液と抗体の緩衝液溶
液とを混合することにより得られるが、この場合、当該
緩衝液としては、例えば、塩化アンモニウム緩衝食塩
液、ＰＢＳ緩衝液、グリシン緩衝食塩液等が利用可能で
あり、中でもグリシン緩衝食塩液が、抗体感作ラテック
スの凝集性、自己凝集の起こりにくさなどから好適であ
る。また抗体感作ラテックスの濃度は、０．０５〜１．
０％で用いるのがよいが、好ましくは０．１〜０．５
％、より好ましくは０．２５％前後で用いるのがよい。

【００１９】また、感作時の抗体タンパク質の濃度は、
０．０５％〜０．３％が適当であり、それ以外では感度
の低下や、抗体感作ラテックスの自己凝集により、陽性
・陰性の判断が付けにくくなる傾向がある。

【００２０】更に、感作ラテックス反応を行う場合の温
度については、０℃〜６０℃の範囲で反応を行うが、室
温または室温よりやや高めの温度（〜４０℃）で反応を
行うと、感度の良い感作ラテックスが得られる。

【００２１】これらの感作ラテックスを用いて、脱窒細
菌類の検出、菌数の測定を行うには、適当な段階に希釈
したサンプル液と、感作ラテックス溶液とを混合し、凝
集像が観察される希釈度を確認し、一方で、菌液の標準
サンプルを用いた混合試験を行い、その結果との比較か
ら、菌数を算出すればよい。

【００２２】本発明においては、この具体的方法とし
て、肉眼で簡便に判断することが可能なマイクロタイタ
ー法を利用することが可能である。すなわち、Ｕ型のマ
イクロタイタープレートに、緩衝液で段階的に希釈した
抗原またはサンプルの溶液をサンプリングし、各穴に抗
体感作ラテックスを分注し、室温で３〜１５時間静置し
た後、肉眼または１０倍程度のルーペを用い、観察・判
定することが可能である。

【００２３】具体的には、緩衝液のみの場合の凝集像を
陰性とし、各穴の凝集像を判定し、陽性の凝集像を示し
た比験穴の希釈倍率と標準抗原を用いた凝集試験の結果
から、菌数を計算する。

【００２４】本発明においては、このほかにも、本発明
に係る抗体感作ラテックスと、比験サンプルとを、スラ
イドグラス上で混合し、光学顕微鏡的に凝集像の成否を
判断する方法（顕微鏡ラテックス法）等、脱窒細菌類の
抗体を吸着させた抗体感作ラテックスを用いる様々な検
出・定量方法に利用できることは云うまでもない。

【００２５】なお、従来、一般に、抗体を吸着させる担
体としてラテックス粒子が存在することは知られている
が、これを実際に脱窒細菌類の検出・同定に使用した例
はこれまで報告されておらず、その有効性は本発明者ら
によって初めて検討されたものである。

【００２６】特に、活性汚泥、水中、土壌中などの活性
（硝酸、亜硝酸の還元による、窒素ガス、亜酸化窒素ガ
スの生成）のある目的微生物を同定し、その菌数を迅速
かつ適正に管理する方法を確立することを可能にし得る
との知見は、本発明者らによって初めて得られたもので
ある。

【００２７】

【実施例】以下、実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は当該実施例により何ら限定されるも
のではない。

【００２８】１．抗原用菌体溶液の製造脱窒細菌類として、アグロバクテリウムラジオバクタ
ー（ＩＦＯ１３５３２Ｔ株）、アルカリゲネスデニ
トリフィカンス（ＩＦＯ１５１２５Ｔ株）、バシラス
リケニフォルミス（ＩＦＯ１２２００Ｔ株）、フラ
ボバクテリウム（ＩＦＯ１５１２８株）、フラボバク
テリウム（ＩＦＯ１５１４７株）、パラコッカスデ
ニトリフィカンス（ＩＦＯ１４９０７Ｔ株）、シュー
ドモナススタッゼリ（ＩＦＯ１４１６５Ｔ株）、シュ
ードモナスフルオレセンス（ＩＦＯ１４１６０Ｔ
株）、シュードモナスピケッティ（ＪＣＭ５９６９
Ｔ株）を使用し、当該脱窒細菌類は、坂口フラスコを用
い、表１のそれぞれの培養条件で振盪培養（培地１００
ｍｌ）を行った。

【００２９】チオバシラスデニトリフィカンスについ
ては、表１の培養条件で、静置培養（培地１リットル）
とした。

【００３０】なお、培地組成は、表１中、培地１は、Ｎ
ＰＹ培地で、組成は、ポリペプトン１０ｇ、イーストエ
キス２ｇ、塩化ナトリウム５ｇから成り、以上を蒸留水
１リットルに溶解し、ｐＨ７に調製したものをオートク
レーブで加圧滅菌し利用した。

【００３１】培地２は、ＬＢ培地で、組成は、トリプト
ン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、
グルコース１ｇ、１Ｍトリス１０ｍｌ，１Ｍ硫酸マ
グネシウム７水和物１ｍｌから成り、以上を蒸留水１リ
ットルに溶解し、ｐＨ７に調製したものを加圧滅菌し利
用した。

【００３２】培地３は、ＮＢ培地で、組成は、肉エキス
１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇから
成り、以上を蒸留水１リットルに溶解し、ｐＨ７に調製
したものを加圧滅菌し利用した。

【００３３】培地４は、ＳＣＹ改培地で、組成は、しょ
糖１ｇ、バクトカジトン０．７５ｇ、イーストエキス
０．２５ｇ、トリプシン消化ペプトン０．２５ｇ、ビタ
ミンＢ₁０．０００４ｇ、ビタミンＢ₁₂０．００００１
ｇから成り、以上を蒸留水１リットルに溶解し、ｐＨ７
に調製したものを加圧滅菌し利用した。

【００３４】培地５は、ＴＳＢＹＥ培地で、組成は、ト
リプシン消化大豆エキス１０ｇ、イーストエキス１０
ｇ、塩化ナトリウム３ｇから成り、以上を蒸留水１リッ
トルに溶解し、ｐＨ７に調製したものを加圧滅菌し利用
した。

【００３５】培地６は、Ｓ８培地で、組成は、リン酸２
水素カリウム１．８ｇ、リン酸水素２ナトリウム１．２
ｇ、硫酸アンモニウム０．１ｇ、硝酸カリウム５ｇ、硫
酸マグネシウム７水和物０．１ｇ、塩化鉄６水和物０．
０３ｇ、硫酸マンガン５水和物０．０３ｇ、塩化カルシ
ウム２水和物０．０４ｇ、炭酸ナトリウム０．５ｇから
成り、以上を蒸留水０．９リットルに溶解し、ｐＨ７に
調製したものを加圧滅菌し、１０％チオ硫酸ナトリウ
ム１００ｍｌを加え１リットルとし利用した。

【００３６】菌の増殖が最大になったと考えられる時点
で培養を停止し、遠心分離により濃縮した後、０．８５
％生理食塩水により洗浄し、等量の０．６％ホルムアル
デヒドと混合し、３７℃一夜放置して菌を殺菌後、０．
８５％生理食塩水により洗浄し、吸光度（ＯＤ５５０）
≒０．５の濃度になるように生理食塩水を用いて調製
し、供試抗原とした。

【００３７】

【表１】

【００３８】２．対応する抗ウサギ血清の製造ＫＢＬ：Ｊｗ（日本白色種）ウサギ２羽を用い、抗原濃
度を濁度で調整（ＯＤ６６０≒０．５）した脱窒細菌類
の抗原溶液を、１羽、１回あたり０．５ｍｌ耳静脈に注
射した。７〜１０日毎に４〜６回注射し、３回目以後、
酵素抗体法で抗体価を測定した。抗体価の上昇が認めら
れない場合に、心臓から全採血を行った。５６℃で不活
化を行い、脱窒細菌類に対応する抗血清とした。

【００３９】３．各抗血清の特異性に関する試験製造した１０種の脱窒細菌類に対する抗血清の、抗原に
対する特異性について酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ法）
による発色反応によって比較した。

【００４０】すなわち、脱窒細菌類を含む検査用溶液
（炭酸・重炭酸緩衝溶液）をマイクロタイタープレート
に分注（１００μｌ／ウェル）し、５℃で１６時間放置
して吸着させた。０．０５％トライトンＸ−１００を含
む加リン酸緩衝液（緩衝液１）で洗浄し、次いで、前記
実施例で調製した抗血清（０．０５％トライトンＸ−１
００および１％ＢＳＡを含む加リン酸緩衝液（緩衝液
２））を９０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１．５時間
放置した。緩衝液１で洗浄し、次いで、酵素標識抗体と
してのペルオキシターゼ標識抗ウサギ−ヤギＩｇＧを１
００μｌ／ウェル添加し、遮光して３７℃で１．５時間
放置した。緩衝液１で洗浄し、次いで、基質として、過
酸化水素を含むＯ−フェニレンジアミンの加クエン酸緩
衝溶液を１００μｌ／ウェル添加し、遮光して３７℃で
１０分放置し、発色させた。２．５Ｍ硫酸を５０μｌ／
ウェル添加し、反応を停止し、４９２ｎｍで吸光度を測
定した。

【００４１】指数は、ある抗原と同一抗原で作製した抗
血清のＥＬＩＳＡ法を応用した呈色反応による吸光度
（ＯＤ４９２＝０．５）を示す希釈倍率の逆数（ＥＬＩ
ＳＡ価）を１００％とした時の、その他の抗原との特異
性を指数で示した。結果を、表２から表１１に示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】

【表５】

【００４６】

【表６】

【００４７】

【表７】

【００４８】

【表８】

【００４９】

【表９】

【００５０】

【表１０】

【００５１】

【表１１】

【００５２】表２、表３、表４、表５、表６、表７、表
８、表９、表１０、表１１から明らかな通り、作製した
抗血清１０種類は、ほとんどの場合、高い特異性を有す
ること、そして、これらの高い特異性を有する抗血清
は、当該抗体の各細菌に対する凝集反応等の反応特性を
直接指標として、あるいは当該反応特性に相関する発色
反応を指標として、また、検出用抗体感作ラテックスを
用いて、活性汚泥、水中、土壌中などの脱窒細菌類を簡
便に検出するのに有用であることが判明した。

【００５３】４．抗体感作ラテックスの製造前記により製造した抗血清を、プロテインＡカラムキッ
ト（アマシャム（Amersham）社製）で精製した後、０．
１Ｍグリシン緩衝食塩液（ｐＨ８．２）を用いて、適当
なタンパク質濃度になるように希釈した。

【００５４】この抗血清１容にラテックスＨ０９０２溶
液（日本合成ゴム社製、粒径０．９８μｍ、比重１．５
ｇ／ｃｃ）１容を加え、よく混和した後、３７℃で１時
間放置して抗体をラテックスに吸着させた。その後、１
％ＢＳＡを含む緩衝液を加え反応を停止させた。余剰の
抗体を遠心洗浄して除いた後、ラテックス濃度が０．２
５％になるように保存液を懸濁させた。

【００５５】５．凝集反応試験本発明に係る感作ラテックス抗体を用いて、マイクロタ
イター法により、脱窒細菌類の菌数の測定を行った。

【００５６】また、比較対照試験として、平板プレート
法を用い、０．８５％生理食塩水で試料を１／１０濃度
で１０段階希釈し、ＬＢ培地で作製したプレートに塗布
し、生成したコロニー数から測定した実測定を基準値と
し、また、試験管各群５本、１／１０濃度で１０段階希
釈による最確数法（ＭＰＮ法）による測定値を比較対照
群とした。

【００５７】６．感作時における最適抗体タンパク質濃
度の検討感作時における最適抗体タンパク質濃度の検討を行っ
た。各脱窒菌抗体について、感作に用いる抗体タンパク
質濃度は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、
０．０８、０．１（ｍｇ／ｍｌ）の６点で、それぞれ検
討した。

【００５８】その他の条件は、高比重ラテックスはＨ０
９０２を用い、感作温度は３７℃とし、感作時間は６０
分、緩衝液は、緩衝液グリシン緩衝食塩液を用い、感作
ラテックス濃度は０．２５％、凝集反応時間は、３時間
〜１５時間とした。

【００５９】また、比較する菌数は、独立栄養細菌であ
るチオバシラスデニトリフィカンズは、菌の増殖が遅
い為、血球計算盤を用いて顕微鏡下で測定した。

【００６０】脱窒細菌類の、アグロバクテリウムラジ
オバクター（ＩＦＯ１３５３２Ｔ株）、アルカリゲネ
スデニトリフィカンス（ＩＦＯ１５１２５Ｔ株）、
バシラスリケニフォルミス（ＩＦＯ１２２００Ｔ
株）、フラボバクテリウム（ＩＦＯ１５１２８株）、
フラボバクテリウム（ＩＦＯ１５１４７株）、パラコ
ッカスデニトリフィカンス（ＩＦＯ１４９０７Ｔ
株）、シュードモナススタッゼリ（ＩＦＯ１４１６
５Ｔ株）、シュードモナスフルオレセンス（ＩＦＯ
１４１６０Ｔ株）、シュードモナスピケッティ（ＪＣ
Ｍ５９６９Ｔ株）は、従属栄養細菌である為、コロニ
ー数から生菌数の判別が可能な平板プレート法を用いて
測定した。

【００６１】菌数は、それぞれ、アグロバクテリウム
ラジオバクターが１．３×１０⁸CFU/ml、アルカリゲネ
スデニトリフィカンスが２．６×１０⁸CFU/ml、バシ
ラスリケニフォルミスが４．４×１０⁸CFU/ml、フラボ
バクテリウム（ＩＦＯ１５１２８株）が２．５×１０
⁷CFU/ml、フラボバクテリウム（ＩＦＯ１５１４７
株）が２．５×１０⁷CFU/ml、パラコッカスデニトリ
フィカンスが１．４×１０⁸CFU/ml、シュードモナス
スタッゼリが１．３×１０⁸CFU/ml、シュードモナス
フルオレセンスが１．０×１０⁸CFU/ml、シュードモナ
スピケッティが６．５×１０⁸CFU/ml、チオバシラス
デニトリフィカンスが３．６×１０⁷CFU/mlをもとの
菌数として、希釈系列を調製した。その結果を、表１２
に示す。

【００６２】

【表１２】

【００６３】表１２から明らかな通り、脱窒細菌類にお
いては０．０５ｍｇ／ｍｌより低い濃度で感作した場合
は、感度が低下する傾向を示した。

【００６４】７．脱窒細菌類菌体、実試料による公定法
との比較本発明に係る感作ラテックス抗体の有効性を確認するた
めに、マイクロタイター法により、脱窒細菌類の菌数の
測定を行った。

【００６５】また、比較対照試験として、平板プレート
法を用い、０．８５％生理食塩水で試料を１／１０濃度
で１０段階希釈し、ＬＢ培地で作製したプレートに塗布
し、生成したコロニー数から測定した実測定を基準値と
し、また、試験管各群５本、１／１０濃度で１０段階希
釈による最確数法（ＭＰＮ法）による測定値と比較し
た。脱窒菌保存株を用いた比較検討の結果を表１３、
現場試料の測定の結果を表１４に示す。

【００６６】

【表１３】

【００６７】

【表１４】

【００６８】表１３〜１４から明らかなように、保存株
を用いた純粋培養系では、平板プレート法、マイクロタ
イター法、ＭＰＮ法の何れにおいてもよく一致した定量
値を示した。このことは、脱窒細菌抗体を用いたマイク
ロタイター法が正確に菌数を定量でき、かつ公定法に比
べより簡便性にすぐれ、また、迅速な定量法であること
を示唆する結果となった。

【００６９】また、現場試料の測定の結果は、ＭＰＮ法
の定量結果がマイクロタイター法に比べやや少ない値と
なった。

【００７０】最確数法は、培養により選択的に目的の菌
体を増殖させ、菌数を定量するシステムであるが、得ら
れるデータが不正確になる場合がある。この原因として
は次のことが考えられる。脱窒細菌類の定量によく用いられるギルテイ培地は、
主にシュードモナス属系脱窒細菌の生育を支持し、選択
性は高いが最終計数値としてはやや低めに出てくる。基質として硝酸イオンを用いているため、硝酸還元酵
素を持たない脱窒菌（Flavobacterium属等）は定量する
ことができない。亜酸化窒素還元酵素を欠く脱窒菌の場合は、最終還元
物として亜酸化窒素ガスを生成するが、亜酸化窒素は溶
解度が大きくダーラム管の中にガスが貯らないため、陽
性であることが判定できない。また、最近では、培養により微生物の量をモニターする
手法は、実際の量よりも１〜２オーダー低い値が出るこ
とが明らかとなっている。以上のことから、純粋培養系
では値が一致したにもかかわらず、実試料においてラテ
ックス法とＭＰＮ法とに２〜３オーダーの違いが生じた
原因はＭＰＮ法において、・ギルテイ培地を用いたため、試験管内においてシュー
ドモナス属が優先種となりアルカリゲネス属の増殖が押
さえられた、・実試料を培養依存的に定量したため、定量値が低下し
た、と考えられた。またそれゆえ、菌の増殖に依存しない脱
窒菌特異的抗体を感作させたラテックスを用いる定量方
法の開発は非常に重要であると考えられる。

【００７１】しかしながら、活性汚泥、水中、土壌中な
どの活性（硝酸、亜硝酸の還元による、窒素ガス、亜酸
化窒素ガスの生成）のある目的微生物を同定し、その菌
数を迅速かつ適正に管理する方法を確立することを目的
とする今回の開発目標に関しては、本発明の脱窒細菌類
の検出用抗体感作ラテックス粒子によるマイクロタイタ
ー法は、より優れた方法であり、これらの目的に充分使
用し得るものであることが確認できた。

【００７２】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、脱窒細
菌類に特異的な抗体をラテックス粒子に吸着させた脱窒
細菌類の検出用抗体感作ラテックスに係るものであり、
当該抗体感作ラテックスを用いることにより、従来、長
期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、脱窒
細菌類の検出・定量を容易にかつ簡便に行うことを可能
とするものである。

【００７３】また、本発明は、脱窒細菌類に対する特異
的な抗体を作製し、これらの１種もしくは任意の複数種
を用いることにより活性汚泥、水中、土壌中などの活性
（硝酸、亜硝酸の還元による、窒素ガス、亜酸化窒素ガ
スの生成）のある目的微生物を同定し、その菌数を迅速
かつ適正に測定することを可能にするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者長井冨美子東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内 (72)発明者和田光代東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内 (72)発明者跡部久男東京都立川市一番町２−６−37 (72)発明者柳下正美千葉県流山市西深井623−２

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脱窒細菌類に特異的な抗体をラテックス
粒子に吸着させたことを特徴とする脱窒細菌類の抗体感
作ラテックス。
【請求項２】前記ラテックス粒子が、比重１．５ｇ／
ｃｃ前後の高比重ラテックス粒子である請求項１記載の
脱窒細菌類の抗体感作ラテックス。
【請求項３】前記ラテックス粒子が、平均粒径１．０
μｍ前後のラテックス粒子である請求項１または２記載
の脱窒細菌類の抗体感作ラテックス。
【請求項４】請求項１、２または３記載の脱窒細菌類
の抗体感作ラテックスを使用することを特徴とする脱窒
細菌類の検出方法。