JPH0956384A - 細胞の標識方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の目的は，標識化のための前処理操作を
必要とせず，単に発光基質と混合するだけで，フローサ
イトメトリーなどにより標識された細胞が検出できる細
胞の標識方法を提供することにある。 【解決手段】細胞膜上で発現する遺伝子と分泌型の発光
酵素の遺伝子を結合し，細胞表面で融合蛋白として発現
させることを特徴とする細胞の標識方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，発光酵素との融合
蛋白を細胞膜上で発現させ、発光基質の添加により光学
的信号によって細胞分画可能な細胞の標識方法および標
識細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子操作の手法として，転写制御配列
の解析や遺伝子導入効率の測定などの目的で，レポータ
ー遺伝子を細胞に導入して，その遺伝子上にコードされ
た酵素を発現させ，この酵素活性を測定することによっ
て，その発現レベルを測定することが行われている。こ
のようなレポーター遺伝子としては，ＣＡＴ（Chloramp
henicol Acetyltransferase)を発現するcat 遺伝子やβ
−galactosidase を発現するlac Ｚ遺伝子などが知られ
ているが，細胞外に分泌されているので個々の細胞の発
現レベルを測定することはできない。また測定には抗菌
活性や発色反応を用いるため、感度には限界があり、こ
れらの酵素を細胞膜上で発現させても個々の細胞を分画
することはできない。

【０００３】近年，昆虫のホタル由来のルシフェラーゼ
が新しいレポーター遺伝子として用いられるようにな
り，発光測定の長所を活かした高感度の測定が可能にな
っているが，ホタル・ルシフェラーゼは分泌型でないた
め，細胞膜上で発現させることはできず、細胞を破砕し
て酵素活性を測定する必要があり、個々の細胞を非破壊
で分画して回収し、細胞の発現レベルを測定することも
できない。

【０００４】また、細胞分画を行う方法としては、細胞
表面の抗原を認識する抗体を蛍光標識し，この標識抗体
と目的とする細胞を結合させ、この蛍光色素をレーザー
光で発光させ、光学的信号によって細胞分画を行うフロ
ーサイトメトリーが広く用いられている。しかしこの細
胞標識方法では蛍光標識抗体を作製し、これと細胞を反
応させた後に分画する必要があり、操作が繁雑である。
さらに、該標識方法は個々の細胞の発現レベルとは無関
係なため、個々の細胞の発現レベルを確認するには非常
に多くの細胞を分画して測定する必要があり効率が悪
い。

【０００５】以上のように、非破壊的な方法により、特
別な標識操作を必要とせず、光学的信号により細胞を分
画できる細胞の標識方法は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は，標識
化のための前処理操作を必要とせず，非破壊的な方法に
より、単に発光基質と混合するだけで，発生する光学的
信号によりフローサイトメトリーや電荷結合素子（ＣＣ
Ｄ）カメラを用いた画像処理システムなどにより細胞分
画が可能な細胞の標識方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は細胞膜で
発現する遺伝子と分泌型発光酵素の遺伝子を結合し、該
酵素を細胞膜上で融合蛋白として発現させることを特徴
とする細胞の標識方法、標識細胞および酵素発現レベル
の測定法により達成される。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の発光酵素は、目的とする
酵素が細胞膜上で発現するには、酵素蛋白が細胞膜を通
過する分泌型であることが必要であり、例えば海洋産の
甲殻類ウミホタルが産生するルシフェラーゼが挙げら
れ、ウミホタル・ルシフェラーゼは基質のルシフェリン
を酸化して発光するが，その発光反応は基質と酸素以外
はなんらの因子も必要としない単純な系である（ＷＯ９
０／１５４２号公報）。酵素の最低検出感度としては約
１０⁵ 分子であり，非常に高感度な検出系として期待さ
れている。

【０００９】本発明における細胞膜上で発現する遺伝子
とは、例えば細胞の形質膜に存在する受容体（具体的に
はホルモン、神経伝達物質、成長因子、オータコイド、
サイトカイン、内因性蛋白、細菌毒素、ウイルス、抗
原、免疫グロブリンなどに対する受容体が挙げられる）
の細胞膜貫通領域の遺伝子である。中でも上皮細胞増殖
因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor，以下
ＥＧＦＲという）の膜貫通領域の遺伝子が好ましく用い
られる。

【００１０】ＥＧＦＲは，主に上皮細胞の細胞膜上に存
在する膜蛋白質で，細胞外にある上皮細胞増殖因子（Ｅ
ＧＦ）と結合する領域と細胞内にあるチロシンキナーゼ
・領域からなり，その二つの領域を疎水性のヘリックス
構造をとる細胞膜貫通領域が繋いでいる。この細胞膜貫
通領域を、ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子のカルボ
キシ末端（Ｃ末端）に結合してキメラ化することによっ
て，Ｃ末端に付加された細胞膜貫通領域が細胞膜に固定
され，結果としてウミホタル・ルシフェラーゼがＣ末端
で細胞膜に固定化され，細胞表面が酵素活性が発現し，
ルシフェラーゼ標識された細胞が得られる。

【００１１】なお本発明で用いられる細胞としては遺伝
子操作により発現が可能な動物細胞であり、例えばＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。

【００１２】上述の手法で得られる標識細胞はフローサ
イトメトリーなどの光学的信号によって細胞分画が可能
である。フローサイトメトリー（ＦＣＭ）はセル・ソー
ター機能により、蛍光色素で標識された細胞を１個１個
遊離した形で細い管を通過させ、これにレーザー光線を
あてて、それにより発した細胞の大きさを反映する散乱
光と標識色素による蛍光の二つの光を検出して、細胞の
大きさの測定と細胞の分画を行うものである。

【００１３】本発明により得られたウミホタル・ルシフ
ェラーゼ標識細胞をＦＣＭに適用する場合は、細胞を注
入する水流に発光基質（ルシフェリン）を混合すること
で細胞表面のルシフェラーゼによる発光が検出できるの
で、レーザーには基質が蛍光発色しない長波長を用い、
散乱光によって細胞の検出を行い、検出された細胞が発
光している場合のみセル・ソーターで分離し、回収する
ことによって発現レベルの高い細胞のみを選択的に分画
することが可能になった。

【００１４】さらに、冷却ＣＣＤを接続した顕微鏡と画
像解析装置を組み合わせた画像処理システムを用いるこ
とにより、本発明で標識された細胞から、マイクロマニ
ュプレーターにより発現レベルの高い細胞のみを選択的
に分離することも可能になった。

【００１５】本発明の標識細胞の発光量を測定すること
により酵素発現レベルの測定が可能となり、遺伝子操作
における転写制御配列の解析や遺伝子導入効率の測定に
有効に用いられる。

【００１６】

【実施例】以下，本発明の実施例を示すが本発明はこれ
らに限定されるものではない。

【００１７】実施例１ プラスミドｐＳＶ−ＶμＭｅΔＣＨ１(T.Shindo, H. Ue
da, F. Makishima, E.Suzuki and H. Nishimura; Soma
t. Cell Mol. Genet., 18, 553-558(1992)) を制限酵素
ＢａｍＨＩで切断し、抗ＮＰ抗体μ鎖（マウス免疫グロ
ブリンＨ鎖ＶＮＰ遺伝子(Michael S. Neuberger, EMBO
J., 2, 1373 − 1378(1983)))のＣＨ４領域と上皮細胞
増殖因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor ：
以下ＥＧＦＲと略記する）の細胞膜貫通領域を含む１８
５１ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。

【００１８】この断片をｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ切断
部位に挿入し、プラスミドｐＵＣＥＧＦＲを作製した。

【００１９】実施例２ Ｃ末端にＳａｌＩ切断部位を持つルシフェラーゼｃＤＮ
Ａ断片の作製 ルシフェラーゼｃＤＮＡのＣ末端に制限酵素ＳａｌＩを
導入するため、次の２種類の配列を持つＤＮＡ断片をＰ
ＣＲプライマーとして合成した。

【００２０】ｃＬｕｃＣＴｆｏｗ（配列番号１） ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣ
ＣＣＣＣ−３’ ｃＬｕｃＣＴｒｅｖ（配列番号２） ５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＧ
ＴＡＣＴ−３’ プライマーｃＬｕｃＣＴｆｏｗはルシフェラーゼｃＤＮ
Ａ中のＳｐｈＩ切断部位から下流部分の配列であり、Ｓ
ｐｈＩ切断部位の５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位
を導入した配列である。

【００２１】プライマーｃＬｕｃＣＴｒｅｖはルシフェ
ラーゼｃＤＮＡの終止コドンの１塩基前のＡから始まる
配列ＡＴＡＡＡＴを制限酵素ＳａｌＩ切断部位に変える
ための配列を含む。

【００２２】プラスミドｐＳＰＴ１８（ベーリンガー・
マンハイム社製）にウミホタル・ルシフェラーゼｃＤＮ
Ａを導入したプラスミドｐＳＴＣＬ８１（ＷＯ９０／１
５４２号公報）を鋳型とし、上記の２種類のＤＮＡ（ｃ
ＬｕｃＣＴｆｏｗ、およびｃＬｕｃＣＴｒｅｖ）を用い
てＰＣＲを行った。その結果、ルシフェラーゼｃＤＮＡ
のＣ末端部分を含む２７２塩基対から成りるＤＮＡ断片
ｃＬｕｃＣＴを得た。

【００２３】プラスミドｐＨＳＧ３９７（宝酒造社製）
をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで二重切断した。一方、ＰＣＲ
増幅断片ｃＬｕｃＣＴを同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩ
とＳａｌＩで二重切断し、上記のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ
で切断したｐＨＳＧ３９７と連結し、ｐＨＳＧ３９７中
にルシフェラーゼＣ末端部分をコードする配列を持つプ
ラスミドｐＨＳＧｃＬｕｃＣＴを作製した。

【００２４】実施例３ ＥＧＦＲ細胞膜貫通領域断片の作製 ＥＧＦＲの細胞膜貫通領域を得るため、下記の１種類の
ＤＮＡを合成した。

【００２５】ＣＨ４（配列番号３） ５’−ＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＡＣＡＧＧＴＡＡＡＣＣＣ
−３’ このＤＮＡはＥＧＦＲの細胞膜貫通領域の５’側にある
抗体μ鎖のＣＨ４領域の５’側の末端配列ＧＴＣＣＡＣ
の第４番目の塩基ＣをＧに変えることでＳａｌＩ切断部
位を導入したものであり、実施例２で作製したＣ末端部
分にＳａｌＩ切断部位を持つルシフェラーゼｃＤＮＡと
連結することで、翻訳フレームを一致させることができ
る。

【００２６】ＥＧＦＲの細胞膜貫通領域を得るため、上
記ＣＨ４プライマーと、ｐＵＣ１１９中に存在する配列
と相補的であるＭ１３ ＲＶ Ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社
製）とを用い、実施例１で作製したプラスミドｐＵＣＥ
ＧＦＲを鋳型としてＰＣＲを行い、７４７塩基対から成
るＥＧＦＲ細胞膜貫通領域を含むＰＣＲ断片ＥＧＦＲｔ
ｍを得た。

【００２７】この断片ＥＧＦＲｔｍはＥＧＦＲの膜貫通
領域をコードする配列の下流にｐＵＣ１１９由来のマル
チクローニング部位の一部（ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）を持つ。

【００２８】この断片ＥＧＦＲｔｍを制限酵素ＳａｌＩ
で切断し、実施例２で作製したプラスミドｐＨＳＧｃＬ
ｕｃＣＴのＳａｌＩ切断部位に挿入した。ルシフェラー
ゼのＣ末端部分をコードする配列と同一方向に、ＥＧＦ
Ｒの細胞膜貫通領域をコードする配列が挿入されたプラ
スミドをスクリーニングし、ルシフェラーゼのＣ末端部
分にＥＧＦＲの細胞膜貫通領域を持ったプラスミドｐＨ
ＳＧｃＬｕｃＣＴＥＧＦＲｔｍを作製した（図１）。

【００２９】実施例４ ルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ膜貫通領域融合蛋白発現ベク
ターの作製 ベクターｐＳＴＣＬ８１よりルシフェラーゼｃＤＮＡ全
体を制限酵素ＫｐｎＩで切り出し、発現ベクターｐｃＤ
ＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＫｐｎＩ切断部
位に組み込み、プラスミドｐｃｃＬｕｃを作製した。

【００３０】このプラスミドｐｃｃＬｕｃをルシフェラ
ーゼｃＤＮＡ中に１カ所存在する制限酵素ＣｌａＩ、お
よびマルチクローニング部位中に切断部位が存在する制
限酵素ＢａｍＨＩで二重切断し、ＣｌａＩ切断部位から
Ｃ末端側のルシフェラーゼをコードする領域を除去し
た。

【００３１】一方、プラスミドｐＳＴＣＬ８１を、ルシ
フェラーゼ中にそれぞれ切断部位が一カ所ずつ存在する
制限酵素ＣｌａＩ、ＳｐｈＩで二重切断し、これらの二
つの制限酵素部位の間のルシフェラーゼをコードする領
域を切り出した。

【００３２】さらに、実施例３で作製したプラスミドｐ
ＨＳＧｃＬｕｃＣＴＥＧＦＲｔｍを制限酵素ＳｐｈＩ、
ＢａｍＨＩで二重切断し、ルシフェラーゼのＣ末端部分
／ＥＧＦＲの細胞膜貫通領域をコード領域を含む配列ｃ
ＬｕｃＣＴＥＧＦＲｔｍを切り出した。

【００３３】これら、三つのＤＮＡ断片を結合し、ルシ
フェラーゼｃＤＮＡの下流にＣＨ４領域をコードする領
域を介してＥＧＦＲの細胞膜貫通領域をコードする配列
が結合した発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥＧＦＲｔｍを作
製した（図２）。

【００３４】この発現ベクターから発現されるウミホタ
ル・ルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白の塩基配列より
推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示した。

【００３５】実施例５ ＣＯＳ−１細胞による融合蛋白の発現 実施例４において作製した発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥ
ＧＦＲｔｍをＣＯＳ−１細胞に導入し、融合蛋白を発現
させた。

【００３６】すなわち、発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥＧ
ＦＲｔｍ ＤＮＡを精製後、ＣＯＳ−１細胞に導入し
た。トランスフェクション後、１０% の牛胎児血清（Ｇ
ＩＢＣＯ社製）を含む１０ｍｌのダルベッコ変法イーグ
ル培地（日水製薬社製）を用いて５日間培養した。

【００３７】培養終了後、細胞は培養容器よりはがし、
ＰＢＳ緩衝液によって洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液に再懸
濁した。

【００３８】実施例６ フローサイトメトリーによるＣＯＳ−１細胞表面の融合
蛋白の発現の確認 ＣＯＳ−１細胞の細胞膜上に発現したルシフェラーゼ／
ＥＧＦＲ融合蛋白は、抗ルシフェラーゼ抗体を用いて確
認を行った。

【００３９】すなわち、実施例５で作製した融合蛋白発
現細胞のＰＢＳ懸濁液にウサギ抗ルシフェラーゼ抗体を
加え、反応させた。細胞をＦＡＣＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ
ａｎｋｓ※（ｐＨ７．４）、２％ ＢＳＡ、０．２％
ＮａＮ３）を洗浄後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ
抗体を反応させた。この細胞をＦＡＣＳ Ｍｅｄｉｕｍ
で洗浄し、ＦＡＣＳ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁した。

【００４０】この細胞懸濁液をフローサイトメトリーに
よって解析し、細胞表面のルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融
合蛋白の発現を調べた（図３）。この結果、蛍光強度の
シフトしたピークが観察され、ＣＯＳ−１細胞表面上に
ルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白が発現していること
が確認された。

【００４１】実施例７ ルミノメーターによる細胞表面の融合蛋白のルシフェラ
ーゼ活性の確認 実施例６で確認した細胞表面に発現しているルシフェラ
ーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白がルシフェラーゼ活性を持つこ
とをルミノメーターによって調べた。すなわち、遺伝子
の導入後、培養した細胞の懸濁液、および破砕上清に分
けて、そのルシフェラーゼ活性を測定した。

【００４２】実施例５に従って遺伝子を導入後、３日間
培養したＣＯＳ−１細胞は培養容器よりはがし、ＰＢＳ
緩衝液によって洗浄した。全細胞の１／２を２５０μｌ
のＰＢＳに懸濁し、細胞懸濁液とした。

【００４３】一方、残りの細胞はプロテアーゼ阻害剤で
あるｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（和光純薬社製）、及びａｐｒ
ｏｔｉｎｉｎ（和光純薬社製）をそれぞれ最終濃度５μ
ｇ／ｍｌになるように加え、超音波破砕機（Ｂｒａｎｓ
ｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０）を用いて１分間破砕
した。この破砕液を４℃において１５，０００ｒｐｍで
５分間遠心し、その遠心上清を細胞抽出液とした。

【００４４】これらの細胞懸濁液、細胞抽出液にそれぞ
れ２μｌのウミホタル・ルシフェリン溶液 （０．１μ
ｇ／ｍｌ）を混合し、発生するフォトン数をフォトン・
カウンター（ＡＴＰ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅ
ｌ ２０００、ＳＡＩ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を
用い、６秒間測定した（図４）。

【００４５】この結果、細胞懸濁液においてはコントロ
ールに比べてルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白発現細
胞において明らかに高いルシフェラーゼ活性が測定され
た。一方、細胞抽出液中では細胞懸濁液に比べて非常に
低いルシフェラーゼ活性しか観察されず、ルシフェラー
ゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白はその大半が細胞膜上で発光活性
を保持した形で発現していることが確認された。

【００４６】実施例８ ＣＨＯ細胞による融合タンパクの発現 実施例４において作製した発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥ
ＧＦＲｔｍをＣＨＯ細胞に導入し、融合蛋白を発現させ
た。

【００４７】すなわち、発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥＧ
ＦＲｔｍとｐＳＶ２ｄｈｆｒを１０：１に比率で混合
し、ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−) にコトランスフェクトし
た。トランスフェクトした細胞は、ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅを含まないαＭＥＭ（１０％透析ＦＣＳ添加）で選択
し、ｐＳＶ２ｄｈｆｒが導入された細胞をクローニング
し、細胞膜上にルシフェラーゼが発現しているものを、
実施例７と同様にして、そのルシフェラーゼ活性によっ
てスクリーニングした。得られたルシフェラーゼ発現細
胞株はｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含むαＭＥＭ（１０％透
析ＦＣＳ添加）で培養した。

【００４８】実施例９ フローサイトメトリーによるＣＨＯ細胞表面の融合蛋白
の発現の確認 ＣＨＯ細胞の細胞膜上のルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合
蛋白の発現は、実施例６と同様にして確認した。

【００４９】すなわち、実施例８で作製した融合蛋白発
現細胞のＰＢＳ懸濁液を、実施例６と同様にしてウサギ
抗ルシフェラーゼ抗体で標識し、フローサイトメトリー
によって解析した（図５）。この結果、蛍光強度のシフ
トしたピークが観察され、ＣＨＯ細胞表面上にルシフェ
ラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白が発現していることが確認さ
れた。

【００５０】

【発明の効果】本発明によって、細胞膜で発現する遺伝
子と分泌型発光酵素の遺伝子を結合し、該酵素を細胞膜
上で融合蛋白として発現させることが可能となった。本
発明により得られた標識細胞は、標識化のための前処理
操作を必要とせず，非破壊的な方法により、単に発光基
質と混合するだけで、発生する光学的信号によって細胞
分画が可能となった。

【００５１】特に、細胞膜にルシフェラーゼを固定して
発現できることから、細胞から培地成分を容易に除去す
ることが可能となり、ウミホタル・ルシフェリンが培地
成分によってわずかに非特異的に発光することを防ぐこ
とも可能となった。

【００５２】本発明によれば、従来、培地中に分泌発現
していたウミホタル・ルシフェラーゼを細胞膜上に発現
させることにより、細胞をルシフェラーゼによって標識
することが可能となった。すなわち、本発明によれば、
細胞を何らかの反応によって標識する過程を経ることな
くルシフェラーゼで直接に標識することができ、単にウ
ミホタル・ルシフェリン、ウミホタル・ルシフェリン誘
導体、もしくはウミホタル・ルシフェラーゼによって発
光するその他の物質などを単に混合することで、上記ル
シフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白で標識された細胞を極
めて迅速に検出できる。

【００５３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型： 核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CGGAATTCGC ATGCGCTCTG ACCCCC 26

【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型： 核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GCGTCGACTG GCATTCAGGT GGTACT 26

【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型： 核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GGACAAGTCG ACAGGTAAAC CC 22

【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：597 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 1 −555 S Vargula luciferase 556 −571 S murine IgM heavy chain CH4 domein 572 −592 S EGFR transmembrane domein 593 −595 S EGFR cytoplasmic domein 配列 Met Lys Leu Ile Ile Leu Ser Ile Ile Leu Ala Tyr Cys Val Thr Val 1 5 10 15 Asn Cys Gln Asp Ala Cys Pro Val Glu Ala Glu Ala Pro Ser Ser Thr 20 25 30 Pro Thr Val Pro Thr Ser Cys Glu Ala Lys Glu Gly Glu Cys Ile Asp 35 40 45 Thr Arg Cys Ala Thr Cys Lys Arg Asp Ile Leu Ser Asp Gly Leu Cys 50 55 60 Glu Asn Lys Pro Gly Lys Thr Cys Cys Arg Met Cys Gln Tyr Val Ile 65 70 75 80 Glu Cys Arg Val Glu Ala Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Phe Tyr Gly Lys 85 90 95 Arg Phe Asn Phe Gln Glu Pro Gly Lys Tyr Val Leu Ala Arg Gly Thr 100 105 110 Lys Gly Gly Asp Trp Ser Val Thr Leu Thr Met Glu Asn Leu Asp Gly 115 120 125 Gln Lys Gly Ala Val Leu Thr Lys Thr Thr Leu Glu Val Val Gly Asp 130 135 140 Val Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Ala Asp Pro Ile Thr Val Asn Gly 145 150 155 160 Gly Ala Asp Pro Val Ile Ala Asn Pro Phe Thr Ile Gly Glu Val Thr 165 170 175 Ile Ala Val Val Glu Ile Pro Gly Phe Asn Ile Thr Val Ile Glu Phe 180 185 190 Phe Lys Leu Ile Val Ile Asp Ile Leu Gly Gly Arg Ser Val Arg Ile 195 200 205 Ala Pro Asp Thr Ala Asn Lys Gly Leu Ile Ser Gly Ile Cys Gly Asn 210 215 220 Leu Glu Met Asn Asp Ala Asp Asp Phe Thr Thr Asp Ala Asp Gln Leu 225 230 235 240 Ala Ile Gln Pro Asn Ile Asn Lys Glu Phe Asp Gly Cys Pro Phe Tyr 245 250 255 Gly Asn Pro Ser Asp Ile Glu Tyr Cys Lys Gly Leu Met Glu Pro Tyr 260 265 270 Arg Ala Val Cys Arg Asn Asn Ile Asn Phe Tyr Tyr Tyr Thr Leu Ser 275 280 285 Cys Ala Phe Ala Tyr Cys Met Gly Gly Glu Glu Arg Ala Lys His Val 290 295 300 Leu Phe Asp Tyr Val Glu Thr Cys Ala Ala Pro Glu Thr Arg Gly Thr 305 310 315 320 Cys Val Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Asp Thr Phe Asp Lys Ala Arg 325 330 335 Tyr Gln Phe Gln Gly Pro Cys Lys Glu Leu Leu Met Ala Ala Asp Cys 340 345 350 Tyr Trp Asn Thr Trp Asp Val Lys Val Ser His Arg Asp Val Glu Ser 355 360 365 Tyr Thr Glu Val Glu Lys Val Thr Ile Arg Lys Gln Ser Thr Val Val 370 375 380 Asp Leu Ile Val Asp Gly Lys Gln Val Lys Val Gly Gly Val Asp Val 385 390 395 400 Ser Ile Pro Tyr Ser Ser Glu Asn Thr Ser Ile Tyr Trp Gln Asp Gly 405 410 415 Asp Ile Leu Thr Thr Ala Ile Leu Pro Glu Ala Leu Val Val Lys Phe 420 425 430 Asn Phe Lys Gln Leu Leu Val Val His Ile Arg Asp Pro Phe Asp Gly 435 440 445 Lys Thr Cys Gly Ile Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Ser Thr Asp Asp 450 455 460 Phe Phe Asp Ala Glu Gly Ala Cys Ala Leu Thr Pro Asn Pro Pro Gly 465 470 475 480 Cys Thr Glu Glu Gln Lys Pro Glu Ala Glu Arg Leu Cys Asn Ser Leu 485 490 495 Phe Asp Ser Ser Ile Asp Glu Lys Cys Asn Val Cys Tyr Lys Pro Asp 500 505 510 Arg Ile Ala Arg Cys Met Tyr Glu Tyr Cys Leu Arg Gly Gln Gln Gly 515 520 525 Phe Cys Asp His Ala Trp Glu Phe Lys Lys Glu Cys Tyr Ile Lys His 530 535 540 Gly Asp Thr Leu Glu Val Pro Pro Glu Cys Gln Ser Thr Gly Lys Pro 545 550 555 560 Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly 565 570 575 Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 580 585 590 Arg Arg Arg Leu Asp 595

【図面の簡単な説明】

【図１】 ルシフェラーゼＣ末端部分／ＥＧＦＲ膜貫通
領域融合断片を持つプラスミドｐＨＳＧｃＬｕｃＣＴＥ
ＧＦＲｔｍの作製

【図２】 ウミホタル・ルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ膜貫
通領域融合タンパク発現ベクターｐｃｃＬｕｃＥＧＦＲ
ｔｍの作製の作製

【図３】 フローサイトメトリーによるＣＯＳ−１細胞
膜上のルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白の発現確認

【図４】 融合蛋白遺伝子を導入した細胞の細胞懸濁液
および細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性

【図５】 フローサイトメトリーによるＣＨＯ細胞膜上
のルシフェラーゼ／ＥＧＦＲ融合蛋白の発現確認

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞膜で発現する遺伝子と分泌型発光酵素
   の遺伝子を結合し、該酵素を細胞膜上で融合蛋白として
   発現させることを特徴とする細胞の標識方法。
2. 【請求項２】細胞膜で発現する遺伝子が受容体の細胞膜
   貫通領域の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載
   の標識方法。
3. 【請求項３】受容体が上皮細胞増殖因子受容体であるこ
   とを特徴とする請求項２記載の標識方法。
4. 【請求項４】分泌型発光酵素の遺伝子がウミホタル・ル
   シフェラーゼである請求項１記載の標識方法。
5. 【請求項５】細胞が動物細胞であることを特徴とする請
   求項１記載の標識方法。
6. 【請求項６】動物細胞がＣＯＳ−１細胞またはＣＨＯ細
   胞であることを特徴とする請求項５記載の標識方法。
7. 【請求項７】細胞膜で発現する遺伝子と分泌型発光酵素
   の遺伝子を結合し、該酵素を細胞膜上で融合蛋白として
   発現させて得られる標識細胞。
8. 【請求項８】細胞膜で発現する遺伝子と分泌型発光酵素
   の遺伝子を結合し、該酵素を細胞膜上で融合蛋白として
   発現させ、その発光量を測定することを特徴とする酵素
   発現レベルの測定方法。