JPH0959298A - アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質 - Google Patents
アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質Info
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- JPH0959298A JPH0959298A JP7236150A JP23615095A JPH0959298A JP H0959298 A JPH0959298 A JP H0959298A JP 7236150 A JP7236150 A JP 7236150A JP 23615095 A JP23615095 A JP 23615095A JP H0959298 A JPH0959298 A JP H0959298A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】アロエ（学名 Aloe arborescens Miller var.
natalensis Berger）からレクチン蛋白質を分離、精製
し、その全アミノ酸配列の決定と、生理活性の解明を行
う。 【解決手段】アロエの葉皮の部分を分離し、これを常法
にしたがい均質化、ゲルろ過、塩析等することにより、
レクチン蛋白質を分離、精製した。得られたレクチン蛋
白質を断片化シ、ペプチドマップを作成して全アミノ酸
配列を決定した。該レクチン蛋白質はウサギの赤血球に
対してのみ凝集活性を示し、リンパ球に対して幼若化活
性を示し、さらにマンノース及びその置換体に対しての
み結合特異性を示した。
natalensis Berger）からレクチン蛋白質を分離、精製
し、その全アミノ酸配列の決定と、生理活性の解明を行
う。 【解決手段】アロエの葉皮の部分を分離し、これを常法
にしたがい均質化、ゲルろ過、塩析等することにより、
レクチン蛋白質を分離、精製した。得られたレクチン蛋
白質を断片化シ、ペプチドマップを作成して全アミノ酸
配列を決定した。該レクチン蛋白質はウサギの赤血球に
対してのみ凝集活性を示し、リンパ球に対して幼若化活
性を示し、さらにマンノース及びその置換体に対しての
み結合特異性を示した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アロエ（Aloe）か
ら単離した新規なレクチン蛋白質に関する。
ら単離した新規なレクチン蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】レクチンとは動植物あるいは細菌で見い
だされる免疫学的産物にあらざる糖結合性蛋白質で、結
合価が２以上で動植物細胞を凝集し、多糖類や複合脂質
を沈降させ、その結合特異性を単糖やオリゴ糖を用いた
阻止試験で規定することができるものをいう。多種類の
レクチンが発見されてその性質が解明され、生化学、免
疫学、医学等の広範囲の分野で利用されている。
だされる免疫学的産物にあらざる糖結合性蛋白質で、結
合価が２以上で動植物細胞を凝集し、多糖類や複合脂質
を沈降させ、その結合特異性を単糖やオリゴ糖を用いた
阻止試験で規定することができるものをいう。多種類の
レクチンが発見されてその性質が解明され、生化学、免
疫学、医学等の広範囲の分野で利用されている。
【０００３】レクチンのなかには凝集素としての性質を
有するものがある。すなわち細胞表面に結合し、複数の
細胞を架橋し、集結させる。レクチンは複数の結合価を
有しており、細胞どうしを架橋して凝集塊を作る。例え
ば小麦胚凝集素（ＷＧＡ）は小麦胚リパーゼ中に存在
し、癌細胞を正常細胞に比べ強く凝集する。また赤血球
を特異的に凝集させるものもある。
有するものがある。すなわち細胞表面に結合し、複数の
細胞を架橋し、集結させる。レクチンは複数の結合価を
有しており、細胞どうしを架橋して凝集塊を作る。例え
ば小麦胚凝集素（ＷＧＡ）は小麦胚リパーゼ中に存在
し、癌細胞を正常細胞に比べ強く凝集する。また赤血球
を特異的に凝集させるものもある。
【０００４】また、レクチンのなかには幼若化活性（mi
togen活性）を有するものもある。すなわち抗原非特異
的にリンパ球を幼若化し、分裂を誘起させるものであ
り、リンパ球の芽球化の引き金となるカルシウムの細胞
内への流入、イノシトールリン脂質代謝の亢進を引き起
こす。例えばフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ
等は小リンパ球を幼若化させ、細胞分裂や抗体その他の
活性物質の産生、放出を行わしめる。
togen活性）を有するものもある。すなわち抗原非特異
的にリンパ球を幼若化し、分裂を誘起させるものであ
り、リンパ球の芽球化の引き金となるカルシウムの細胞
内への流入、イノシトールリン脂質代謝の亢進を引き起
こす。例えばフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ
等は小リンパ球を幼若化させ、細胞分裂や抗体その他の
活性物質の産生、放出を行わしめる。
【０００５】またレクチンは糖類等と特異的に結合す
る。すなわちレクチンは細胞表面にある糖蛋白、プロテ
オグリカン、糖脂質等と特異的に結合する。例えばミヤ
コグサ種子に含まれるレクチンはフコースと、大豆に含
まれるレクチンはα−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミンと特異的に結合する。レクチンは
かかる糖類との特異的結合性を利用して、細胞膜上の糖
を含んだ分子の存在個所の決定や分離のための試薬とし
て利用されている。例えば病気によって変化するヒト血
中の糖蛋白質構造の糖鎖部分をレクチンを用いて酵素レ
ベルで認識する臨床診断法等が研究されている。
る。すなわちレクチンは細胞表面にある糖蛋白、プロテ
オグリカン、糖脂質等と特異的に結合する。例えばミヤ
コグサ種子に含まれるレクチンはフコースと、大豆に含
まれるレクチンはα−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミンと特異的に結合する。レクチンは
かかる糖類との特異的結合性を利用して、細胞膜上の糖
を含んだ分子の存在個所の決定や分離のための試薬とし
て利用されている。例えば病気によって変化するヒト血
中の糖蛋白質構造の糖鎖部分をレクチンを用いて酵素レ
ベルで認識する臨床診断法等が研究されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところでレクチンを生
化学、免疫学、医学等の分野で利用するためには、でき
るだけ限定された対象に対して糖結合特異性や凝集素と
しての性質を示すことが望ましい。
化学、免疫学、医学等の分野で利用するためには、でき
るだけ限定された対象に対して糖結合特異性や凝集素と
しての性質を示すことが望ましい。
【０００７】特にグルコース及びマンノースの両者に特
異的に結合するレクチンはコンカナバリンＡ等多数知ら
れているが、マンノース及びその置換体のみに特異的に
結合するレクチンは少ない。
異的に結合するレクチンはコンカナバリンＡ等多数知ら
れているが、マンノース及びその置換体のみに特異的に
結合するレクチンは少ない。
【０００８】また、特定の動物の赤血球にのみ強い凝集
活性を示すレクチンは少ない。例えば藻類由来のある種
のレクチンはウマ赤血球に対して最も強い活性を示す
が、ウサギ、モルモット、ヒツジに対しても活性を示
し、赤血球の種類による差異があまり認められない。
活性を示すレクチンは少ない。例えば藻類由来のある種
のレクチンはウマ赤血球に対して最も強い活性を示す
が、ウサギ、モルモット、ヒツジに対しても活性を示
し、赤血球の種類による差異があまり認められない。
【０００９】さらにレクチンの多方面での利用を可能に
するためには、レクチン蛋白質の全アミノ酸配列を解明
することが望まれる。
するためには、レクチン蛋白質の全アミノ酸配列を解明
することが望まれる。
【００１０】一方近年、アロエの栄養学的、生理学的性
質が注目を集めるようになってきたが、植物由来のレク
チンは従来タチナタマメから精製されるコンカナバリン
Ａやインゲンマメから精製されるインゲンマメレクチン
（ＰＨＡ）等が研究の主体であり、アロエ由来のレクチ
ンはこれまでほとんど研究されなかった。
質が注目を集めるようになってきたが、植物由来のレク
チンは従来タチナタマメから精製されるコンカナバリン
Ａやインゲンマメから精製されるインゲンマメレクチン
（ＰＨＡ）等が研究の主体であり、アロエ由来のレクチ
ンはこれまでほとんど研究されなかった。
【００１１】そこで、本発明は、植物由来であり、さら
に詳しくはアロエ葉皮から単離され、全アミノ酸配列の
決定された所定のアミノ酸配列を有し、レクチンとして
の特定の生理活性を有する物質を提供することを基本的
課題とする。さらに本発明は、種特異性の凝集活性を示
すこと、あるいは特定の細胞に対して幼若化活性を示す
こと、あるいは単一の糖類に対して特異的活性を示すこ
と、のうち、少なくとも１の活性を示すレクチンを提供
することを課題とする。
に詳しくはアロエ葉皮から単離され、全アミノ酸配列の
決定された所定のアミノ酸配列を有し、レクチンとして
の特定の生理活性を有する物質を提供することを基本的
課題とする。さらに本発明は、種特異性の凝集活性を示
すこと、あるいは特定の細胞に対して幼若化活性を示す
こと、あるいは単一の糖類に対して特異的活性を示すこ
と、のうち、少なくとも１の活性を示すレクチンを提供
することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的に
したがい鋭意研究を重ねた結果、植物由来であり、具体
的にはアロエ葉皮から単離され、その全アミノ酸配列の
決定された所定のアミノ酸配列を有する蛋白質を見いだ
した。該蛋白質は、レクチンとしての特定の生理活性を
有するレクチン蛋白質であり、１０９アミノ酸残基より
なり、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるもの
である。またアロエ葉皮から単離することによって、レ
クチン活性を有する蛋白質を見いだした。さらにアロエ
葉皮由来の蛋白質であって、レクチンとしての生理活
性、すなわち特定の種に対してのみ凝集活性を示すこ
と、あるいは特定の細胞に対して幼若化活性を示すこ
と、あるいは糖類に対する活性が、単一の糖類に対して
のみ特異的活性を示すこと、の少なくとも１の活性を有
する蛋白質を見いだした。
したがい鋭意研究を重ねた結果、植物由来であり、具体
的にはアロエ葉皮から単離され、その全アミノ酸配列の
決定された所定のアミノ酸配列を有する蛋白質を見いだ
した。該蛋白質は、レクチンとしての特定の生理活性を
有するレクチン蛋白質であり、１０９アミノ酸残基より
なり、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるもの
である。またアロエ葉皮から単離することによって、レ
クチン活性を有する蛋白質を見いだした。さらにアロエ
葉皮由来の蛋白質であって、レクチンとしての生理活
性、すなわち特定の種に対してのみ凝集活性を示すこ
と、あるいは特定の細胞に対して幼若化活性を示すこ
と、あるいは糖類に対する活性が、単一の糖類に対して
のみ特異的活性を示すこと、の少なくとも１の活性を有
する蛋白質を見いだした。
【００１３】請求項１記載の発明は、配列番号１に記載
されたアミノ酸配列、で特定されるアロエ葉皮由来のレ
クチン蛋白質である。
されたアミノ酸配列、で特定されるアロエ葉皮由来のレ
クチン蛋白質である。
【００１４】請求項２及び３は、アロエ葉皮由来のレク
チン活性を有する蛋白質についてのものである。
チン活性を有する蛋白質についてのものである。
【００１５】請求項２記載の発明は、アロエ葉皮から単
離されたレクチン活性蛋白質である。
離されたレクチン活性蛋白質である。
【００１６】請求項３記載の発明は、請求項２記載の単
離が、アロエ葉皮部を均質化し、溶剤により沈澱した沈
澱物を溶解し、該溶解物をクロマトグラフィーにより分
画し、該分画により得られたレクチン活性物質を塩析
し、沈澱物を溶解させてこれをクロマトグラフィーにか
け、レクチン活性分画を溶出させ、該レクチン活性分画
を透析後、クロマトグラフィーにより分画、精製したも
のであるレクチン活性蛋白質である。
離が、アロエ葉皮部を均質化し、溶剤により沈澱した沈
澱物を溶解し、該溶解物をクロマトグラフィーにより分
画し、該分画により得られたレクチン活性物質を塩析
し、沈澱物を溶解させてこれをクロマトグラフィーにか
け、レクチン活性分画を溶出させ、該レクチン活性分画
を透析後、クロマトグラフィーにより分画、精製したも
のであるレクチン活性蛋白質である。
【００１７】請求項４〜７は、アロエ葉皮由来の蛋白質
であって、レクチンとしての生理活性を有する蛋白質に
ついてのものである。
であって、レクチンとしての生理活性を有する蛋白質に
ついてのものである。
【００１８】請求項４記載の発明は、ウサギの赤血球に
対してのみ凝集活性を示す、アロエ葉皮由来のレクチン
活性蛋白質である。
対してのみ凝集活性を示す、アロエ葉皮由来のレクチン
活性蛋白質である。
【００１９】請求項５記載の発明は、リンパ球に対して
幼若化活性を有する、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋
白質である。
幼若化活性を有する、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋
白質である。
【００２０】請求項６記載の発明は、糖類に対する特異
的結合性が、マンノース及びその置換体に対してのみで
ある、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質である。
的結合性が、マンノース及びその置換体に対してのみで
ある、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質である。
【００２１】請求項７記載の発明は、前記マンノースの
置換体がメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドである、レ
クチン活性蛋白質である。
置換体がメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドである、レ
クチン活性蛋白質である。
【００２２】該レクチン蛋白質のかかる特定の性質を利
用することにより、例えばウサギの血液の検出、リンパ
球の分裂誘起、マンノースの検出等を容易に行えること
となった。
用することにより、例えばウサギの血液の検出、リンパ
球の分裂誘起、マンノースの検出等を容易に行えること
となった。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の第一の視点は、アロエ葉
皮から単離し、その全アミノ酸配列を決定した、レクチ
ン活性を有する蛋白質に関するものである。また本発明
の第二の視点は、アロエ葉皮から単離した、レクチン活
性を有する蛋白質に関するものである。さらに本発明の
第三の視点は、アロエ葉皮由来のレクチンとしての生理
活性を有する蛋白質に関するものである。以下順を追っ
て説明する。
皮から単離し、その全アミノ酸配列を決定した、レクチ
ン活性を有する蛋白質に関するものである。また本発明
の第二の視点は、アロエ葉皮から単離した、レクチン活
性を有する蛋白質に関するものである。さらに本発明の
第三の視点は、アロエ葉皮由来のレクチンとしての生理
活性を有する蛋白質に関するものである。以下順を追っ
て説明する。
【００２４】レクチン蛋白質の単離：アロエのゲル状の
部分すなわち葉肉の部分を除いた、葉皮の部分のみを使
用した。この葉肉の部分を洗浄、均質化した後、溶剤で
蛋白質を沈澱させた。この沈澱物を緩衝液で溶解後、ゲ
ルろ過し、レクチン活性分画を得た。この分画を硫酸ア
ンモニウム等で塩析し、レクチン活性分画を沈澱させ
た。これを緩衝液に溶解し、イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ、食塩の段階的濃度勾配（Stepwise）により
レクチン活性分画を溶出させ、脱塩透析した後、再度ゲ
ルろ過を行い精製レクチン蛋白質を得た。該レクチン蛋
白質は赤血球凝集活性、あるいはリンパ球幼若化活性、
あるいは糖結合特異性、のレクチン活性を示した。また
該レクチン蛋白質の分子量は３５０００であった。
部分すなわち葉肉の部分を除いた、葉皮の部分のみを使
用した。この葉肉の部分を洗浄、均質化した後、溶剤で
蛋白質を沈澱させた。この沈澱物を緩衝液で溶解後、ゲ
ルろ過し、レクチン活性分画を得た。この分画を硫酸ア
ンモニウム等で塩析し、レクチン活性分画を沈澱させ
た。これを緩衝液に溶解し、イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ、食塩の段階的濃度勾配（Stepwise）により
レクチン活性分画を溶出させ、脱塩透析した後、再度ゲ
ルろ過を行い精製レクチン蛋白質を得た。該レクチン蛋
白質は赤血球凝集活性、あるいはリンパ球幼若化活性、
あるいは糖結合特異性、のレクチン活性を示した。また
該レクチン蛋白質の分子量は３５０００であった。
【００２５】アミノ酸配列の決定：精製レクチン蛋白質
をシアノーゲンブロマイドで限定分画した後、トリプシ
ンで酵素限定分解し、逆相クロマトグラフィーにより１
８個のペプチド分画を得た。また精製レクチン蛋白質を
還元し、Ｓ−ピリジルエチル化し、逆相クロマトグラフ
ィーによりアセトニトリルの直線勾配で蛋白質を分画Ｉ
と分画IIに分離した。分画Ｉをシアノーゲンブロマイド
で限定分解し、２つのペプチドを得た。また分画IIをア
クロモバクタープロテアーゼＩで酵素限定分解し、５つ
のペプチドを得た。さらに分画Ｉ及び分画IIをＢＮＰＳ
−スカトールで限定分解し、それぞれ２つのペプチドを
得た。上記の分画から気相シーケンサーを用いてアミノ
酸配列を決定し、ペプチドマップを作成し、全アミノ酸
配列を決定した。該レクチン蛋白質は分子内にＳ−Ｓ結
合を有する１０９アミノ酸残基よりなる。
をシアノーゲンブロマイドで限定分画した後、トリプシ
ンで酵素限定分解し、逆相クロマトグラフィーにより１
８個のペプチド分画を得た。また精製レクチン蛋白質を
還元し、Ｓ−ピリジルエチル化し、逆相クロマトグラフ
ィーによりアセトニトリルの直線勾配で蛋白質を分画Ｉ
と分画IIに分離した。分画Ｉをシアノーゲンブロマイド
で限定分解し、２つのペプチドを得た。また分画IIをア
クロモバクタープロテアーゼＩで酵素限定分解し、５つ
のペプチドを得た。さらに分画Ｉ及び分画IIをＢＮＰＳ
−スカトールで限定分解し、それぞれ２つのペプチドを
得た。上記の分画から気相シーケンサーを用いてアミノ
酸配列を決定し、ペプチドマップを作成し、全アミノ酸
配列を決定した。該レクチン蛋白質は分子内にＳ−Ｓ結
合を有する１０９アミノ酸残基よりなる。
【００２６】アロエ葉皮からのレクチン活性を有する蛋
白質の単離：アロエのゲル状の部分すなわち葉肉の部分
を除いた、葉皮の部分のみを使用した。この葉肉の部分
を洗浄、均質化した後、溶剤で蛋白質を沈澱させた。こ
の沈澱物を緩衝液で溶解後、ゲルろ過し、レクチン活性
分画を得た。この分画を硫酸アンモニウム等で塩析し、
レクチン活性分画を沈澱させた。これを緩衝液に溶解
し、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、食塩の段階
的濃度勾配（Stepwise）によりレクチン活性分画を溶出
させ、脱塩透析した後、再度ゲルろ過を行い精製レクチ
ン蛋白質を得た。該レクチン蛋白質は赤血球凝集活性、
あるいはリンパ球幼若化活性、あるいは糖結合特異性、
のレクチン活性を示した。
白質の単離：アロエのゲル状の部分すなわち葉肉の部分
を除いた、葉皮の部分のみを使用した。この葉肉の部分
を洗浄、均質化した後、溶剤で蛋白質を沈澱させた。こ
の沈澱物を緩衝液で溶解後、ゲルろ過し、レクチン活性
分画を得た。この分画を硫酸アンモニウム等で塩析し、
レクチン活性分画を沈澱させた。これを緩衝液に溶解
し、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、食塩の段階
的濃度勾配（Stepwise）によりレクチン活性分画を溶出
させ、脱塩透析した後、再度ゲルろ過を行い精製レクチ
ン蛋白質を得た。該レクチン蛋白質は赤血球凝集活性、
あるいはリンパ球幼若化活性、あるいは糖結合特異性、
のレクチン活性を示した。
【００２７】生理活性の測定：赤血球凝集活性、リンパ
球幼若化活性、糖に対する結合特異性について検討し
た。赤血球凝集活性は精製レクチン蛋白質をトリプシン
処理し、各種の動物の赤血球について測定した。リンパ
球幼若化活性は一定量のリンパ球をマイクロプレートに
まいた後、レクチン等を添加し、所定時間経過後ホルマ
ザンの生成率を測定することにより求めた。糖に対する
結合特異性は各種の糖を段階的に希釈し、これに凝集活
性１６に調製されたレクチンを添加し、レクチンの凝集
活性を阻害する最小の糖濃度として表した。これらの結
果からレクチン蛋白質はウサギ赤血球に対してのみ凝集
活性を有し、またリンパ球幼若化活性を有し、さらに糖
類について、マンノース及びその置換体に対してのみ結
合特異性を有することが確認される。
球幼若化活性、糖に対する結合特異性について検討し
た。赤血球凝集活性は精製レクチン蛋白質をトリプシン
処理し、各種の動物の赤血球について測定した。リンパ
球幼若化活性は一定量のリンパ球をマイクロプレートに
まいた後、レクチン等を添加し、所定時間経過後ホルマ
ザンの生成率を測定することにより求めた。糖に対する
結合特異性は各種の糖を段階的に希釈し、これに凝集活
性１６に調製されたレクチンを添加し、レクチンの凝集
活性を阻害する最小の糖濃度として表した。これらの結
果からレクチン蛋白質はウサギ赤血球に対してのみ凝集
活性を有し、またリンパ球幼若化活性を有し、さらに糖
類について、マンノース及びその置換体に対してのみ結
合特異性を有することが確認される。
【００２８】
【実施例】以下本発明の実施例を説明する。ただし以下
の記載は本発明をなんら限定するものではない。
の記載は本発明をなんら限定するものではない。
【００２９】アロエ葉皮からのレクチン活性を有する蛋
白質の単離：キダチアロエ（Aloe arborescens Miller
var. natalensis Berger. 三重県久居市の藤田保健衛生
大学の生薬研究塾の薬用植物園で栽培）３ｋｇからゲル
状部分を除いた葉皮部分のみを分離し、蒸留水でよく洗
浄した後均質化した。この均質化した液をファットマン
GF/A（Whatman International社製）でろ過し、そのろ
液に−２０℃のアセトンを ２倍量添加し、生じた沈澱
物を遠心分離して収集した後凍結乾燥した。この凍結乾
燥物をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で溶解した。次にこの
溶解液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（φ11.5×50cm）
でゲルろ過を行い、レクチン活性分画を得た。この分画
を８０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、レクチン活性
分画の沈澱を生成した。この沈澱物を遠心分離して収集
した後５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ８．０）
で溶解し、これをイオン交換クロマトグラフィー（What
man DE-52, φ1.6×14cm）で食塩濃度を０〜０．５Ｍま
で変化させたステップワイズ法で溶出させた。レクチン
活性分画は食塩濃度０．３５Ｍで溶出した。このレクチ
ン活性分画を蒸留水で脱塩透析し、生じた沈澱物を凍結
乾燥した。この乾燥物を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０， ０．５ＭＮａＣｌを含む）で溶解
し、この溶解液をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＨＲ１０／３
０（ファーマシア社製）でゲルろ過してレクチン蛋白質
を精製した。このレクチン蛋白質の分子量をｎａｔｉｖ
ｅ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Davis, B. J (1964) Electro
phoresis II Methods and Application to human serum
proteins. Ann. N. Y. Acad.Sci. 121, 404-427）及び
ゲルろ過法（ｐＨ８．０に調製された、１０ｍＭリン酸
ナ トリウム緩衝液中に０．５ＭＮａＣｌを含有した溶
液で等張化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＨＲ１０／３０
（ファーマシア社製）を使用し、該緩衝液の流速を０．
７５ｍｌ／ｍｉｎで測定）で求めた。図３において
（１）は市販の牛血清アルブミン（シグマ社製）、
（２）は市販の卵白アルブミン（シグマ社製）、（３）
は市販のミオグロビン（シグマ社製）の分子量検定用蛋
白質の分子量を示している。レクチン蛋白質の分子量は
３５０００であった。
白質の単離：キダチアロエ（Aloe arborescens Miller
var. natalensis Berger. 三重県久居市の藤田保健衛生
大学の生薬研究塾の薬用植物園で栽培）３ｋｇからゲル
状部分を除いた葉皮部分のみを分離し、蒸留水でよく洗
浄した後均質化した。この均質化した液をファットマン
GF/A（Whatman International社製）でろ過し、そのろ
液に−２０℃のアセトンを ２倍量添加し、生じた沈澱
物を遠心分離して収集した後凍結乾燥した。この凍結乾
燥物をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で溶解した。次にこの
溶解液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（φ11.5×50cm）
でゲルろ過を行い、レクチン活性分画を得た。この分画
を８０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、レクチン活性
分画の沈澱を生成した。この沈澱物を遠心分離して収集
した後５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ８．０）
で溶解し、これをイオン交換クロマトグラフィー（What
man DE-52, φ1.6×14cm）で食塩濃度を０〜０．５Ｍま
で変化させたステップワイズ法で溶出させた。レクチン
活性分画は食塩濃度０．３５Ｍで溶出した。このレクチ
ン活性分画を蒸留水で脱塩透析し、生じた沈澱物を凍結
乾燥した。この乾燥物を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０， ０．５ＭＮａＣｌを含む）で溶解
し、この溶解液をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＨＲ１０／３
０（ファーマシア社製）でゲルろ過してレクチン蛋白質
を精製した。このレクチン蛋白質の分子量をｎａｔｉｖ
ｅ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Davis, B. J (1964) Electro
phoresis II Methods and Application to human serum
proteins. Ann. N. Y. Acad.Sci. 121, 404-427）及び
ゲルろ過法（ｐＨ８．０に調製された、１０ｍＭリン酸
ナ トリウム緩衝液中に０．５ＭＮａＣｌを含有した溶
液で等張化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＨＲ１０／３０
（ファーマシア社製）を使用し、該緩衝液の流速を０．
７５ｍｌ／ｍｉｎで測定）で求めた。図３において
（１）は市販の牛血清アルブミン（シグマ社製）、
（２）は市販の卵白アルブミン（シグマ社製）、（３）
は市販のミオグロビン（シグマ社製）の分子量検定用蛋
白質の分子量を示している。レクチン蛋白質の分子量は
３５０００であった。
【００３０】アミノ酸配列の決定：以下の操作によりア
ミノ酸配列を決定した。
ミノ酸配列を決定した。
【００３１】精製レクチン蛋白質のシアノーゲンブロマ
イドによる限定分解：精製レクチン蛋白質３．５ｎｍｏ
ｌに、シアノーゲンブロマイド２０ｍｇを予め１ｍｌの
ギ酸で溶解した溶液２００μｌを添加して限定分画した
後、Ｗｉｌｌｉａｍ．Ｅ．Ｂらの方法にしたがい（Will
iam, E. B., and Wold, F. (1973) Biochemistry. vol.
12, 828-834）１ｍｇ／ｍｌのトリプシン１．６μｌ
（７０ｐｍｏｌ相当量）で酵素限定分解した。この分解
物を逆相の高速液体クロマトグラフィー（Synchropak R
P-8）により分離し、１８個のペプチドを得た。図５
は、シアノーゲンブロマイドで限定分解し、続いてトリ
プシン処理を行い、各断片を逆相のクロマトグラフィー
で溶出させた際の溶出パターンを示したものである。こ
の試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列を分析 した。クロ
マトグラフィーで溶出させた各ペプチドを、保持時間の
短いものから順にＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３、−−−、Ｍ
Ｔ１８とすると、これらのうち主なペプチドの、解読し
たＮ末端側アミノ酸配列は次のようになる。ＭＴ５はTh
r Asp Gly Asn Leu Val Val Gln Asn Ser Ala Asn Arg
である。ＭＴ６はAla Thr Leuである。ＭＴ８マイナー
（ｍｉｎｏｒ）はAla Thr Leu Xaa Thr Asp GlyAsn Leu
IleまたはVal Valである。ＭＴ８メジャー（ｍａｊｏ
ｒ）はIle Ile Trp Gln Ser Asn Thr Glyである。ＭＴ
１０はGly Asp Tyrである。ＭＴ１１はGlnHis Asp Xaa
Asn Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Pro Thr Trp Al
a Ser AsnThr Gly Gly Leu Ala Leu His Xaa Argであ
る。ＭＴ１２はAsn Gly Asn Val ValIle Val Gly Pro P
ro Ileである。ＭＴ１３はIle Ile Trp Gln Ser Phe Th
r Glyである。ＭＴ１５はIle Ile Trp Gln Ser Asn Thr
Gly Thr Gly Thr Asn Gly Asp Tyr Leu Leu Val Leu G
ln Lysである。ＭＴ−１６はAsn Gly Asp Val Valであ
る。ＭＴ１７マイナー（ｍｉｎｏｒ）はIle Ile Trp Gl
n Ser Phe Thr Gly Thr Gly Thr である。ＭＴ１７メジ
ャー（ｍａｊｏｒ）はAsp Asn Ile Leu Tyr Ser Ser Gl
u Val Leu Hisである。ここでXaaはそのアミノ酸残基を
解読できなかったことを表す。「または」で接続した部
分があるのは本発明に係るレクチン蛋白質がヘテロジナ
イズであること、すなわち所定の位置のアミノ酸残基が
異なるレクチンが混在していることを示している。以下
の解析においても同様である。
イドによる限定分解：精製レクチン蛋白質３．５ｎｍｏ
ｌに、シアノーゲンブロマイド２０ｍｇを予め１ｍｌの
ギ酸で溶解した溶液２００μｌを添加して限定分画した
後、Ｗｉｌｌｉａｍ．Ｅ．Ｂらの方法にしたがい（Will
iam, E. B., and Wold, F. (1973) Biochemistry. vol.
12, 828-834）１ｍｇ／ｍｌのトリプシン１．６μｌ
（７０ｐｍｏｌ相当量）で酵素限定分解した。この分解
物を逆相の高速液体クロマトグラフィー（Synchropak R
P-8）により分離し、１８個のペプチドを得た。図５
は、シアノーゲンブロマイドで限定分解し、続いてトリ
プシン処理を行い、各断片を逆相のクロマトグラフィー
で溶出させた際の溶出パターンを示したものである。こ
の試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列を分析 した。クロ
マトグラフィーで溶出させた各ペプチドを、保持時間の
短いものから順にＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３、−−−、Ｍ
Ｔ１８とすると、これらのうち主なペプチドの、解読し
たＮ末端側アミノ酸配列は次のようになる。ＭＴ５はTh
r Asp Gly Asn Leu Val Val Gln Asn Ser Ala Asn Arg
である。ＭＴ６はAla Thr Leuである。ＭＴ８マイナー
（ｍｉｎｏｒ）はAla Thr Leu Xaa Thr Asp GlyAsn Leu
IleまたはVal Valである。ＭＴ８メジャー（ｍａｊｏ
ｒ）はIle Ile Trp Gln Ser Asn Thr Glyである。ＭＴ
１０はGly Asp Tyrである。ＭＴ１１はGlnHis Asp Xaa
Asn Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Pro Thr Trp Al
a Ser AsnThr Gly Gly Leu Ala Leu His Xaa Argであ
る。ＭＴ１２はAsn Gly Asn Val ValIle Val Gly Pro P
ro Ileである。ＭＴ１３はIle Ile Trp Gln Ser Phe Th
r Glyである。ＭＴ１５はIle Ile Trp Gln Ser Asn Thr
Gly Thr Gly Thr Asn Gly Asp Tyr Leu Leu Val Leu G
ln Lysである。ＭＴ−１６はAsn Gly Asp Val Valであ
る。ＭＴ１７マイナー（ｍｉｎｏｒ）はIle Ile Trp Gl
n Ser Phe Thr Gly Thr Gly Thr である。ＭＴ１７メジ
ャー（ｍａｊｏｒ）はAsp Asn Ile Leu Tyr Ser Ser Gl
u Val Leu Hisである。ここでXaaはそのアミノ酸残基を
解読できなかったことを表す。「または」で接続した部
分があるのは本発明に係るレクチン蛋白質がヘテロジナ
イズであること、すなわち所定の位置のアミノ酸残基が
異なるレクチンが混在していることを示している。以下
の解析においても同様である。
【００３２】精製レクチン蛋白質からの分画Ｉ、分画II
の生成：精製レクチン蛋白質４００ｐｍｏｌをトリ−Ｎ
−ブチルフォスフィン２０μｌで還元し、さらに４−ビ
ニルピリジン１０μｌによりＳ−ピリジルエチル化し
（Usami, Y., Fujimura, Y., Suzuki, M., Ozeki, Y.,
Nishio, K., Fukui, H., and Titani, K. (1993) Prima
ry structure of two-chain botrocetin, a von Willeb
rand factor modulatorpurified from the venom of Bo
throps jararaca. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90, 928
-932）、逆相の高速液体クロマトグラフィー（Synchrop
ak RP-8）によりアセトニトリル０〜６０重量％の直線
勾配で蛋白質を分画Ｉと分画IIに分離した。図４は逆相
の高速液体クロマトグラフィーで溶出したパターンを示
している。１は分画Ｉを、２は分画IIを示している。こ
の試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列を分析した。分画
Ｉの解読したＮ末端側アミノ酸配列はAsp Asn Ile Leu
Tyr Ser Ser Glu Val LeuXaa Glu Asn Gln Tyr Ile Ser
Tyr Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Met Gln His AspCys As
n Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Proである。また
分画IIの解読したＮ末端 側アミノ酸配列はGly Asp Tyr
Leu Leu Val Leu Gln Lys Asn Gly Asn Val Val Ile V
al Gly Pro Pro Ile Trp Ala Thr Glyである。
の生成：精製レクチン蛋白質４００ｐｍｏｌをトリ−Ｎ
−ブチルフォスフィン２０μｌで還元し、さらに４−ビ
ニルピリジン１０μｌによりＳ−ピリジルエチル化し
（Usami, Y., Fujimura, Y., Suzuki, M., Ozeki, Y.,
Nishio, K., Fukui, H., and Titani, K. (1993) Prima
ry structure of two-chain botrocetin, a von Willeb
rand factor modulatorpurified from the venom of Bo
throps jararaca. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90, 928
-932）、逆相の高速液体クロマトグラフィー（Synchrop
ak RP-8）によりアセトニトリル０〜６０重量％の直線
勾配で蛋白質を分画Ｉと分画IIに分離した。図４は逆相
の高速液体クロマトグラフィーで溶出したパターンを示
している。１は分画Ｉを、２は分画IIを示している。こ
の試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列を分析した。分画
Ｉの解読したＮ末端側アミノ酸配列はAsp Asn Ile Leu
Tyr Ser Ser Glu Val LeuXaa Glu Asn Gln Tyr Ile Ser
Tyr Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Met Gln His AspCys As
n Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Proである。また
分画IIの解読したＮ末端 側アミノ酸配列はGly Asp Tyr
Leu Leu Val Leu Gln Lys Asn Gly Asn Val Val Ile V
al Gly Pro Pro Ile Trp Ala Thr Glyである。
【００３３】分画Ｉの限定分解：約１２５ｐｍｏｌの分
画ＩにＧｒｏｓｓ，Ｅ．の方法にしたがい（Gross, E.
(1967) Methods Enzymol. vol.11, 238-255）、シアノ
ーゲンブロマイド１０ｍｇを予め１ｍｌのギ酸で溶解し
た溶液１００μｌを添加して限定分解し、２つのペプチ
ド、Ｈ−Ｍメジャー（ｍａｊｏｒ）及びＨ−Ｍマイナー
（ｍｉｎｏｒ）を得た。またこれとは別に、３００ｐｍ
ｏｌの分画ＩをＯｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓらの方法にしたがい
（Omenn, G.S., Fontana, A., and Anfinsen,C. B. (19
70) J. of Biol. Chem. vol.245, 1895-1902）、まず８
０μｌの氷酢酸に溶解した後、０．５ｍｇのＢＮＰＳ−
スカトールで限定分解し、２つのペプチド、Ｈ−Ｗメジ
ャー（ｍａｊｏｒ）及びＨ−Ｗマイナー（ｍｉｎｏｒ）
を得た。この試料を気相シーケンサー（Applied Biosys
tems社 470A）を用いて、Ｎ末端側 アミノ酸配列を分析
した。各ペプチドの解読したＮ末端側アミノ酸配列は次
の通りである。Ｈ−ＭメジャーはAsp Asn Ile Leu Tyr
Ser Ser Glu Val LeuHis Glu Asn Gln Tyr Ile Ser Tyr
Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Metである。Ｈ−Ｍマイナー
はGln His Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly
Asn Pro ThrTrp Ala Xaa Asn Thr Gly Gly Leu Ala Xaa
His Cys Arg Ala Thr Leuである。Ｈ−Ｗ メジャーはA
la Ser Asn Thr Gly Gly Leu Ala Leu His Cys Arg Ala
ThrLeu Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val Gln Asn Se
r Ala Asn Arg Ileである。Ｈ−Ｗ マイナーはAsp Asn
Ile Leu Tyr Ser Ser Glu Val Xaa Xaa Glu Asn GlnTyr
Ile Ser Tyr Gly Pro Xaa Glu Phe Ileである。
画ＩにＧｒｏｓｓ，Ｅ．の方法にしたがい（Gross, E.
(1967) Methods Enzymol. vol.11, 238-255）、シアノ
ーゲンブロマイド１０ｍｇを予め１ｍｌのギ酸で溶解し
た溶液１００μｌを添加して限定分解し、２つのペプチ
ド、Ｈ−Ｍメジャー（ｍａｊｏｒ）及びＨ−Ｍマイナー
（ｍｉｎｏｒ）を得た。またこれとは別に、３００ｐｍ
ｏｌの分画ＩをＯｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓらの方法にしたがい
（Omenn, G.S., Fontana, A., and Anfinsen,C. B. (19
70) J. of Biol. Chem. vol.245, 1895-1902）、まず８
０μｌの氷酢酸に溶解した後、０．５ｍｇのＢＮＰＳ−
スカトールで限定分解し、２つのペプチド、Ｈ−Ｗメジ
ャー（ｍａｊｏｒ）及びＨ−Ｗマイナー（ｍｉｎｏｒ）
を得た。この試料を気相シーケンサー（Applied Biosys
tems社 470A）を用いて、Ｎ末端側 アミノ酸配列を分析
した。各ペプチドの解読したＮ末端側アミノ酸配列は次
の通りである。Ｈ−ＭメジャーはAsp Asn Ile Leu Tyr
Ser Ser Glu Val LeuHis Glu Asn Gln Tyr Ile Ser Tyr
Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Metである。Ｈ−Ｍマイナー
はGln His Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly
Asn Pro ThrTrp Ala Xaa Asn Thr Gly Gly Leu Ala Xaa
His Cys Arg Ala Thr Leuである。Ｈ−Ｗ メジャーはA
la Ser Asn Thr Gly Gly Leu Ala Leu His Cys Arg Ala
ThrLeu Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val Gln Asn Se
r Ala Asn Arg Ileである。Ｈ−Ｗ マイナーはAsp Asn
Ile Leu Tyr Ser Ser Glu Val Xaa Xaa Glu Asn GlnTyr
Ile Ser Tyr Gly Pro Xaa Glu Phe Ileである。
【００３４】分画IIの限定分解：約２７０ｐｍｏｌの分
画IIを、正木らの方法にしたがい（Masaki, T., Tanab
e, M., Nakamura, K., and Soejima, M. (1981) Biochi
m. Biophys. Acta. vol.660, 51-55）、１０ｎｇ／μｌ
のアクロモバクタープロテアーゼＩ、８．３μｌで酵素
限定分解し、前述の逆相の高速液体クロマトグラフィー
を用いて５つのペプチドを得た。図６はアクロモバクタ
ープロテアーゼＩを用いて限定分解した分画を逆相の高
速液体クロマトグラフィーを用いて溶出させたパターン
を示したものである。クロマトグラフィーで溶出させた
これらの各ペプチドを、保持時間の短いものから順にＬ
−Ｋ６、Ｌ−Ｋ７、Ｌ−Ｋ８、Ｌ−Ｋ９、Ｌ−Ｋ１０と
する。またこれとは別に、３００ｐｍｏｌの分画IIをＯ
ｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓらの方法にしたがい、まず８０μｌの
氷酢酸に溶解した後０．５ｍｇのＢＮＰＳ−スカトール
で限定分解し、２つのペプチドＬ−Ｗメジャー（ｍａｊ
ｏｒ）及びＬ−Ｗマイナー（ｍｉｎｏｒ）を得た。この
試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列 を分析した。各ペ
プチドの解読したＮ末端側アミノ酸配列は次の通りであ
る。Ｌ−Ｋ６はGly Asp Tyr Leu Leu Valである。Ｌ−
Ｋ７はGly Asp Tyrである。Ｌ−Ｋ８はAsn GlyAsn Val
Val Ile Val Gly Pro Pro Ile Xaa Ser Thr Gly Thr Gl
y Argである。Ｌ−Ｋ９はAsn Gly Asn Val Val Ile Val
Gly Pro Pro Ile Xaa Ala Thr Gly Thr Gly Argであ
る。Ｌ−Ｋ１０はAsn Gly AspまたはAsn Valである。Ｌ
−ＷメジャーはAlaまたはSer Thr Gly Thr Gly Argであ
る。Ｌ−ＷマイナーはGly Asp Tyr Leu Leu Val Leu Gl
n Lys Asn Gly Asn Val Val Ile Val Gly Pro Pro Ile
Xaa Ala Thr Glyである。
画IIを、正木らの方法にしたがい（Masaki, T., Tanab
e, M., Nakamura, K., and Soejima, M. (1981) Biochi
m. Biophys. Acta. vol.660, 51-55）、１０ｎｇ／μｌ
のアクロモバクタープロテアーゼＩ、８．３μｌで酵素
限定分解し、前述の逆相の高速液体クロマトグラフィー
を用いて５つのペプチドを得た。図６はアクロモバクタ
ープロテアーゼＩを用いて限定分解した分画を逆相の高
速液体クロマトグラフィーを用いて溶出させたパターン
を示したものである。クロマトグラフィーで溶出させた
これらの各ペプチドを、保持時間の短いものから順にＬ
−Ｋ６、Ｌ−Ｋ７、Ｌ−Ｋ８、Ｌ−Ｋ９、Ｌ−Ｋ１０と
する。またこれとは別に、３００ｐｍｏｌの分画IIをＯ
ｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓらの方法にしたがい、まず８０μｌの
氷酢酸に溶解した後０．５ｍｇのＢＮＰＳ−スカトール
で限定分解し、２つのペプチドＬ−Ｗメジャー（ｍａｊ
ｏｒ）及びＬ−Ｗマイナー（ｍｉｎｏｒ）を得た。この
試料を気相シーケンサー（Applied Biosystems社 470
A）を用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列 を分析した。各ペ
プチドの解読したＮ末端側アミノ酸配列は次の通りであ
る。Ｌ−Ｋ６はGly Asp Tyr Leu Leu Valである。Ｌ−
Ｋ７はGly Asp Tyrである。Ｌ−Ｋ８はAsn GlyAsn Val
Val Ile Val Gly Pro Pro Ile Xaa Ser Thr Gly Thr Gl
y Argである。Ｌ−Ｋ９はAsn Gly Asn Val Val Ile Val
Gly Pro Pro Ile Xaa Ala Thr Gly Thr Gly Argであ
る。Ｌ−Ｋ１０はAsn Gly AspまたはAsn Valである。Ｌ
−ＷメジャーはAlaまたはSer Thr Gly Thr Gly Argであ
る。Ｌ−ＷマイナーはGly Asp Tyr Leu Leu Val Leu Gl
n Lys Asn Gly Asn Val Val Ile Val Gly Pro Pro Ile
Xaa Ala Thr Glyである。
【００３５】上記の結果からペプチドマップを作成し
（図１）、アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸
配列は、配列番号１に示すものである。
（図１）、アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸
配列は、配列番号１に示すものである。
【００３６】該レクチン蛋白質は分子内にＳ−Ｓ結合を
有する１０９アミノ酸残基よりなる。Ｎ末端側から６３
残基はイソロイシンまたはバリン、７６残基はアスパラ
ギンまたはフェニルアラニン、９４残基はアスパラギン
またはアスパラギン酸、１０４残基はセリンまたはアラ
ニンである。このように精製レクチン蛋白質は、アミノ
酸配列が部分的に異なる状態（すなわちヘテロジナイ
ズ）で存在する。なおＳ−Ｓ結合の存在は、Cys残基が
２つしか存在しないこと、及び電気泳動法により確認し
た。
有する１０９アミノ酸残基よりなる。Ｎ末端側から６３
残基はイソロイシンまたはバリン、７６残基はアスパラ
ギンまたはフェニルアラニン、９４残基はアスパラギン
またはアスパラギン酸、１０４残基はセリンまたはアラ
ニンである。このように精製レクチン蛋白質は、アミノ
酸配列が部分的に異なる状態（すなわちヘテロジナイ
ズ）で存在する。なおＳ−Ｓ結合の存在は、Cys残基が
２つしか存在しないこと、及び電気泳動法により確認し
た。
【００３７】赤血球凝集活性の測定：赤血球はヒツジ、
ウサギ、ヒトの赤血球を使用した。まず新鮮な赤血球を
トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ：１５０ｍＭのＮａＣｌを含
有する１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．４）で
数回洗浄した。この洗浄した各種動物の赤血球につい
て、佐々木らの方法（Sasaki, H., and Aketa, K. (198
1) Purification and distribution of a lectin in se
a urchin (AnthocidarisCrassispina) egg before and
after fertilization Exp. Cell, Res. vol.135, 15-1
9）にしたがってトリプシン処理し、さらにグルタルア
ルデヒド固定を行った。すなわち該赤血球を０．１％ト
リプシン（シグマ社製、タイプIII）−ＴＢＳ溶液中で
１０％の浮遊液とし、３７℃で１時間保持した。その後
２０倍量のＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、１５０ｍＭの塩化
ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４）で４回洗浄し、１％グルタルアルデヒド−ＰＢＳ溶
液中で１０％の浮遊液とし、４℃で１晩保持した。グル
タルアルデヒド固定された赤血球を２０倍量のＰＢＳで
４回洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＰＢＳ中でさらに４℃
で１晩保持した。最後に２０倍量のＴＢＳで洗浄し、１
０％浮遊液の状態で０．１％アジ化ナトリウムを添加
し、赤血球使用時まで保持した。
ウサギ、ヒトの赤血球を使用した。まず新鮮な赤血球を
トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ：１５０ｍＭのＮａＣｌを含
有する１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．４）で
数回洗浄した。この洗浄した各種動物の赤血球につい
て、佐々木らの方法（Sasaki, H., and Aketa, K. (198
1) Purification and distribution of a lectin in se
a urchin (AnthocidarisCrassispina) egg before and
after fertilization Exp. Cell, Res. vol.135, 15-1
9）にしたがってトリプシン処理し、さらにグルタルア
ルデヒド固定を行った。すなわち該赤血球を０．１％ト
リプシン（シグマ社製、タイプIII）−ＴＢＳ溶液中で
１０％の浮遊液とし、３７℃で１時間保持した。その後
２０倍量のＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、１５０ｍＭの塩化
ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４）で４回洗浄し、１％グルタルアルデヒド−ＰＢＳ溶
液中で１０％の浮遊液とし、４℃で１晩保持した。グル
タルアルデヒド固定された赤血球を２０倍量のＰＢＳで
４回洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＰＢＳ中でさらに４℃
で１晩保持した。最後に２０倍量のＴＢＳで洗浄し、１
０％浮遊液の状態で０．１％アジ化ナトリウムを添加
し、赤血球使用時まで保持した。
【００３８】赤血球凝集活性はマイクロタイターＶプレ
ートで測定した。すなわち各ウェルに、０．２％のツイ
ーン２０を含有するＴＢＳ中に連続して２倍ずつ希釈さ
れたレクチンを２５μｌと、ＴＢＳを５０μｌと、２％
の赤血球懸濁液を２５μｌとを混合し、２０℃で１時
間、保湿器で保持した。凝集活性は凝集を起こすレクチ
ン蛋白質の最大希釈倍率の逆数で表した。結果を表１に
示す。
ートで測定した。すなわち各ウェルに、０．２％のツイ
ーン２０を含有するＴＢＳ中に連続して２倍ずつ希釈さ
れたレクチンを２５μｌと、ＴＢＳを５０μｌと、２％
の赤血球懸濁液を２５μｌとを混合し、２０℃で１時
間、保湿器で保持した。凝集活性は凝集を起こすレクチ
ン蛋白質の最大希釈倍率の逆数で表した。結果を表１に
示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１からレクチン蛋白質は、ヒトのＡ型、
Ｂ型、Ｏ型及びヒツジの赤血球に対してはほとんど凝集
反応を示さず、ウサギの赤血球に対してのみ凝集反応を
示すことが確認される。
Ｂ型、Ｏ型及びヒツジの赤血球に対してはほとんど凝集
反応を示さず、ウサギの赤血球に対してのみ凝集反応を
示すことが確認される。
【００４１】リンパ球幼若化活性の測定：リンパ球の幼
若化活性はＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜１０週齢）の脾臓
リンパ球を用いて測定した。リンパ球を１０％の胎児の
子牛の血清（ベーリンガー社製）、ペニシリン及びスト
レプトマイシン（ギブコ ＢＲＬ社製）を含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０（日水社製）中で１×１０7個／ｍｌと
なるように調製し、この細胞懸濁液１００μｌを９６穴
のウェルにまき、５０μｌのレクチン溶液を添加した。
これを３７℃、二酸化炭素５％の環境下で４８時間培養
した。細胞の増殖は、３−（４、５−ジメチルチアゾリ
ル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイ
ド（ＭＴＴ、シグマ社製）の、ミトコンドリアコハク酸
デヒドロゲナーゼによるホルマザンへの変換、を検出し
測定した（Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric ass
ay for cellular growth and survival; application t
o proliferation and cytotoxicity assays. J. Immuno
l.Methods 65, 55-63 及び Denizot, F., and Lang,
R. (1986) Rapid colorimetric assay for cell growth
and survival modification to the tetrazoliumdye p
rocedure giving improved sensitivity and reliabili
ty. J. Immunol. Methods 89, 271-277）。４８時間培
養後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した３７．５μ
ｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。細胞
をさらに４時間培養し、ホルマザンの結晶を生成させ、
この結晶を５０μｌのイソプロパノールに溶解した。こ
のホルマザンの結晶溶液を分光光度計で５７０ｎｍで吸
光度を測定し（ただし対照は６３０ｎｍで測定した）、
リンパ球の増殖活性能（ＳＩ）を次式、ＳＩ＝Ａ2−Ａ0
／Ａ1−Ａ0により算出した（ただしＡ0は対照の吸光
度、Ａ1はレクチンを添加しなかった場合の吸光度、Ａ2
はレクチンを添加した場合の吸光度である）。結果を図
２に示す。図２の実線はレクチン蛋白質のＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ ７５での溶出パターンを２８０ｎｍでの吸光度で
示したものであり、○は溶出したレクチン蛋白質のチュ
ーブ番号９〜１２における幼若化活性を示したものであ
る。チューブ番号９において幼若化活性は１．１であ
り、チューブ番号１１において２．４と最大となり、チ
ューブ番号１２まで１より大きい。すなわちレクチン蛋
白質は、リンパ球に対する幼若化活性を有することが確
認される。
若化活性はＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜１０週齢）の脾臓
リンパ球を用いて測定した。リンパ球を１０％の胎児の
子牛の血清（ベーリンガー社製）、ペニシリン及びスト
レプトマイシン（ギブコ ＢＲＬ社製）を含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０（日水社製）中で１×１０7個／ｍｌと
なるように調製し、この細胞懸濁液１００μｌを９６穴
のウェルにまき、５０μｌのレクチン溶液を添加した。
これを３７℃、二酸化炭素５％の環境下で４８時間培養
した。細胞の増殖は、３−（４、５−ジメチルチアゾリ
ル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイ
ド（ＭＴＴ、シグマ社製）の、ミトコンドリアコハク酸
デヒドロゲナーゼによるホルマザンへの変換、を検出し
測定した（Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric ass
ay for cellular growth and survival; application t
o proliferation and cytotoxicity assays. J. Immuno
l.Methods 65, 55-63 及び Denizot, F., and Lang,
R. (1986) Rapid colorimetric assay for cell growth
and survival modification to the tetrazoliumdye p
rocedure giving improved sensitivity and reliabili
ty. J. Immunol. Methods 89, 271-277）。４８時間培
養後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した３７．５μ
ｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。細胞
をさらに４時間培養し、ホルマザンの結晶を生成させ、
この結晶を５０μｌのイソプロパノールに溶解した。こ
のホルマザンの結晶溶液を分光光度計で５７０ｎｍで吸
光度を測定し（ただし対照は６３０ｎｍで測定した）、
リンパ球の増殖活性能（ＳＩ）を次式、ＳＩ＝Ａ2−Ａ0
／Ａ1−Ａ0により算出した（ただしＡ0は対照の吸光
度、Ａ1はレクチンを添加しなかった場合の吸光度、Ａ2
はレクチンを添加した場合の吸光度である）。結果を図
２に示す。図２の実線はレクチン蛋白質のＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ ７５での溶出パターンを２８０ｎｍでの吸光度で
示したものであり、○は溶出したレクチン蛋白質のチュ
ーブ番号９〜１２における幼若化活性を示したものであ
る。チューブ番号９において幼若化活性は１．１であ
り、チューブ番号１１において２．４と最大となり、チ
ューブ番号１２まで１より大きい。すなわちレクチン蛋
白質は、リンパ球に対する幼若化活性を有することが確
認される。
【００４２】糖類に対する結合特異性：糖類に対する結
合特異性はレクチン蛋白質の赤血球凝集活性を阻害する
最小の糖濃度として表した。Ｄ−マンノース、メチル−
α−Ｄ−マンノピラノシド、マルトース、フルクトー
ス、マンニトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド（以上
ナカライテスク社製）、マンナン、マンノサミン、Ｄ−
グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコース、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラク
トサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以上シグマ社
製）、及びラクトース（和光純薬社製）の各種の糖類を
１種類ずつ段階的に希釈し、これらに赤血球凝集活性が
１６に調整されたレクチンを含有する溶液を添加し、赤
血球凝集活性の阻害性を確認した。結果を表２に示す。
合特異性はレクチン蛋白質の赤血球凝集活性を阻害する
最小の糖濃度として表した。Ｄ−マンノース、メチル−
α−Ｄ−マンノピラノシド、マルトース、フルクトー
ス、マンニトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド（以上
ナカライテスク社製）、マンナン、マンノサミン、Ｄ−
グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコース、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラク
トサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以上シグマ社
製）、及びラクトース（和光純薬社製）の各種の糖類を
１種類ずつ段階的に希釈し、これらに赤血球凝集活性が
１６に調整されたレクチンを含有する溶液を添加し、赤
血球凝集活性の阻害性を確認した。結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】表２より赤血球凝集活性を阻害する濃度の
低いものは、Ｄ−マンノース、及びＤ−マンノースの１
水素原子がメチル基で置換されたメチル−α−Ｄ−マン
ノピラノシドである。レクチン蛋白質は、マンノース及
びその置換体に対して特異的に結合することが確認され
る。
低いものは、Ｄ−マンノース、及びＤ−マンノースの１
水素原子がメチル基で置換されたメチル−α−Ｄ−マン
ノピラノシドである。レクチン蛋白質は、マンノース及
びその置換体に対して特異的に結合することが確認され
る。
【００４５】
【発明の効果】アロエの葉皮から単離したレクチン蛋白
質の全アミノ酸配列の決定により、アロエ由来のレクチ
ン蛋白質を他の動植物等由来のレクチン蛋白質と明確に
区別し、その生理活性を明確にすることが可能となっ
た。またかかるアミノ酸配列の修飾によって、または類
縁蛋白との一次構造の比較によって、所定の機能を発現
するための重要な領域を推定することも可能となる。ア
ロエの葉皮から単離したかかるレクチン活性物質は、種
々の生理活性を有する。すなわちウサギの赤血球に対し
てのみ凝集活性を示し、あるいはリンパ球に対して幼若
化活性を示し、あるいは糖類に対する特異的結合性がマ
ンノース及びその置換体に対してのみである。かかる生
理活性により、レクチン蛋白質の多方面への応用が可能
である。
質の全アミノ酸配列の決定により、アロエ由来のレクチ
ン蛋白質を他の動植物等由来のレクチン蛋白質と明確に
区別し、その生理活性を明確にすることが可能となっ
た。またかかるアミノ酸配列の修飾によって、または類
縁蛋白との一次構造の比較によって、所定の機能を発現
するための重要な領域を推定することも可能となる。ア
ロエの葉皮から単離したかかるレクチン活性物質は、種
々の生理活性を有する。すなわちウサギの赤血球に対し
てのみ凝集活性を示し、あるいはリンパ球に対して幼若
化活性を示し、あるいは糖類に対する特異的結合性がマ
ンノース及びその置換体に対してのみである。かかる生
理活性により、レクチン蛋白質の多方面への応用が可能
である。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：１０９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：アロエ（Aloe） 株名：キダチアロエ（Aloe arborescens Miller var. n
atalensis Berger） 組織の種類：葉皮 配列の特徴 特徴を表す記号：disulfide-bonds 存在位置：２９．．５２ 特徴を決定した方法：Ｅ、Ｓ 配列 Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Ser Glu Val Leu 1 5 10 His Glu Asn Gln Tyr Ile Ser Tyr Gly Pro 15 20 Tyr Glu Phe Ile Met Gln His Asp Cys Asn 25 30 Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Pro Thr 35 40 Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Leu Ala Leu 45 50 His Cys Arg Ala Thr Leu Gln Thr Asp Gly 55 60 Asn Leu IleまたはVal Val Gln Asn Ser Ala Asn 65 Arg Ile Ile Trp Gln Ser AsnまたはPhe Thr Gly 70 75 Thr Gly Thr Asn Gly Asp Tyr Leu Leu Val 80 85 Leu Gln Lys Asn Gly AsnまたはAsp Val Val Ile 90 95 Val Gly Pro Pro Ile Trp SerまたはAla Thr Gly 100 105 Thr Gly Arg
atalensis Berger） 組織の種類：葉皮 配列の特徴 特徴を表す記号：disulfide-bonds 存在位置：２９．．５２ 特徴を決定した方法：Ｅ、Ｓ 配列 Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Ser Glu Val Leu 1 5 10 His Glu Asn Gln Tyr Ile Ser Tyr Gly Pro 15 20 Tyr Glu Phe Ile Met Gln His Asp Cys Asn 25 30 Leu Val Leu Tyr Glu Ser Gly Asn Pro Thr 35 40 Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Leu Ala Leu 45 50 His Cys Arg Ala Thr Leu Gln Thr Asp Gly 55 60 Asn Leu IleまたはVal Val Gln Asn Ser Ala Asn 65 Arg Ile Ile Trp Gln Ser AsnまたはPhe Thr Gly 70 75 Thr Gly Thr Asn Gly Asp Tyr Leu Leu Val 80 85 Leu Gln Lys Asn Gly AsnまたはAsp Val Val Ile 90 95 Val Gly Pro Pro Ile Trp SerまたはAla Thr Gly 100 105 Thr Gly Arg
【図１】本発明に係るアロエから単離したレクチン蛋白
質を所定の方法で分画し、各分画のアミノ酸配列から決
定されたレクチン蛋白質の全アミノ酸配列を示したもの
である。各分画名の下に記載された配列がその分画のア
ミノ酸配列であり、レクチン蛋白質の全アミノ酸配列は
No.１及びNo.１ contの下に記載されたアミノ酸配列で
ある。左から右へ向かう方向がＮ末端からＣ末端へ向か
う方向である。記載した略号は以下の通りである。 A:
Ala, C:Cys, D:Asp, E:Glu, F:Phe, G:Gly, H:His, I:I
le, K:Lys, L:Leu, M:Met, N:Asn, P:Pro, Q:Gln, R:ar
g, S:ser,T:Thr, V:Val, W:Trp, Y:Tyr。 また「−−
−」はそのアミノ酸残基以降の配列を解読しなかったこ
とを示す。また、No.１ contにおいて２段に記載されて
いるアミノ酸は「または」の意、すなわち上段のアミノ
酸または下段のアミノ酸の意である。
質を所定の方法で分画し、各分画のアミノ酸配列から決
定されたレクチン蛋白質の全アミノ酸配列を示したもの
である。各分画名の下に記載された配列がその分画のア
ミノ酸配列であり、レクチン蛋白質の全アミノ酸配列は
No.１及びNo.１ contの下に記載されたアミノ酸配列で
ある。左から右へ向かう方向がＮ末端からＣ末端へ向か
う方向である。記載した略号は以下の通りである。 A:
Ala, C:Cys, D:Asp, E:Glu, F:Phe, G:Gly, H:His, I:I
le, K:Lys, L:Leu, M:Met, N:Asn, P:Pro, Q:Gln, R:ar
g, S:ser,T:Thr, V:Val, W:Trp, Y:Tyr。 また「−−
−」はそのアミノ酸残基以降の配列を解読しなかったこ
とを示す。また、No.１ contにおいて２段に記載されて
いるアミノ酸は「または」の意、すなわち上段のアミノ
酸または下段のアミノ酸の意である。
【図２】本発明の実施例に係るレクチン蛋白質の溶出パ
ターン及びレクチン蛋白質の幼若化活性を示したもので
ある。実線はアロエの葉皮に所定の処理を行い、得られ
たレクチン活性分画をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５でゲルろ
過した際の溶出パターンを２８０ｎｍでの吸光度で示し
たものである。○はリンパ球の幼若化活性能を示す。ま
た横軸はチューブ番号を示す。
ターン及びレクチン蛋白質の幼若化活性を示したもので
ある。実線はアロエの葉皮に所定の処理を行い、得られ
たレクチン活性分画をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５でゲルろ
過した際の溶出パターンを２８０ｎｍでの吸光度で示し
たものである。○はリンパ球の幼若化活性能を示す。ま
た横軸はチューブ番号を示す。
【図３】本発明の実施例に係るレクチン蛋白質の分子量
測定結果を示したものである。（１）は牛血清アルブミ
ン、（２）は卵白アルブミン、（３）はミオグロビン
を、○はレクチン蛋白質を示している。また、横軸は溶
出体積／排除体積を示す。
測定結果を示したものである。（１）は牛血清アルブミ
ン、（２）は卵白アルブミン、（３）はミオグロビン
を、○はレクチン蛋白質を示している。また、横軸は溶
出体積／排除体積を示す。
【図４】本発明の実施例に係る精製レクチン蛋白質を還
元し、さらにＳ−ピリジルエチル化し、逆相の高速液体
クロマトグラフィーにより溶出させたパターンを２８０
ｎｍでの吸光度で示したものである。１は分画Ｉを、２
は分画IIを示している。実線は溶出パターンを、破線は
アセトニトリルの直線濃度勾配を示している。
元し、さらにＳ−ピリジルエチル化し、逆相の高速液体
クロマトグラフィーにより溶出させたパターンを２８０
ｎｍでの吸光度で示したものである。１は分画Ｉを、２
は分画IIを示している。実線は溶出パターンを、破線は
アセトニトリルの直線濃度勾配を示している。
【図５】本発明の実施例に係る精製レクチン蛋白質をシ
アノーゲンブロマイドで限定分画し、トリプシン処理を
行い、逆相の高速液体クロマトグラフィーにより溶出さ
せた際の溶出パターンを２０６ｎｍでの吸光度で示した
ものである。実線は溶出パターンを、破線はアセトニト
リルの直線濃度勾配を示している。
アノーゲンブロマイドで限定分画し、トリプシン処理を
行い、逆相の高速液体クロマトグラフィーにより溶出さ
せた際の溶出パターンを２０６ｎｍでの吸光度で示した
ものである。実線は溶出パターンを、破線はアセトニト
リルの直線濃度勾配を示している。
【図６】本発明の実施例に係る分画IIをアクロモバクタ
ープロテアーゼＩで限定分解し、これを逆相の高速液体
クロマトグラフィーにより溶出させた際の溶出パターン
を２０６ｎｍでの吸光度で示したものである。実線は溶
出パターンを、破線はアセトニトリルの直線濃度勾配を
示している。
ープロテアーゼＩで限定分解し、これを逆相の高速液体
クロマトグラフィーにより溶出させた際の溶出パターン
を２０６ｎｍでの吸光度で示したものである。実線は溶
出パターンを、破線はアセトニトリルの直線濃度勾配を
示している。
Claims (7)
- 【請求項１】配列番号１で表わされるアミノ酸配列、で
特定される、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質。 - 【請求項２】アロエ葉皮から単離したレクチン活性蛋白
質。 - 【請求項３】請求項２記載の単離がアロエ葉皮部を均質
化し、溶剤により沈澱した沈澱物を溶解し、該溶解物を
クロマトグラフィーにより分画し、該分画により得られ
たレクチン活性物質を塩析し、沈澱物を溶解させてこれ
をクロマトグラフィーにかけ、レクチン活性分画を溶出
させ、該レクチン活性分画を透析後、クロマトグラフィ
ーにより分画、精製したものであることを特徴とするレ
クチン活性蛋白質。 - 【請求項４】ウサギの赤血球に対してのみ凝集活性を示
すことを特徴とする、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋
白質。 - 【請求項５】リンパ球に対して幼若化活性を有すること
を特徴とする、アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質。 - 【請求項６】糖類に対する特異的結合性が、マンノース
及びその置換体に対してのみであることを特徴とする、
アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質。 - 【請求項７】前記マンノースの置換体がメチル−α−Ｄ
−マンノピラノシドであることを特徴とする請求項６記
載のレクチン活性蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23615095A JP3752000B2 (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23615095A JP3752000B2 (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0959298A true JPH0959298A (ja) | 1997-03-04 |
| JP3752000B2 JP3752000B2 (ja) | 2006-03-08 |
Family
ID=16996507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23615095A Expired - Fee Related JP3752000B2 (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3752000B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7534770B2 (en) | 2004-03-31 | 2009-05-19 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Glycoside having 4-methylergost-7-en-3-ol skeleton and hyperglycemia improving agent |
| US7674784B2 (en) | 2004-09-29 | 2010-03-09 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Drug and food or drink for improving hyperglycemia |
| US7754704B2 (en) | 2004-03-31 | 2010-07-13 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for treating hyperglycemia |
-
1995
- 1995-08-21 JP JP23615095A patent/JP3752000B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7534770B2 (en) | 2004-03-31 | 2009-05-19 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Glycoside having 4-methylergost-7-en-3-ol skeleton and hyperglycemia improving agent |
| US7754704B2 (en) | 2004-03-31 | 2010-07-13 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for treating hyperglycemia |
| US8338403B2 (en) | 2004-03-31 | 2012-12-25 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Drug for improving hyperglycemia |
| US8486462B2 (en) | 2004-03-31 | 2013-07-16 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Glycoside having 4-methylergost-7-en-3-ol skeleton and hyperglycemia improving agent |
| US7674784B2 (en) | 2004-09-29 | 2010-03-09 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Drug and food or drink for improving hyperglycemia |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3752000B2 (ja) | 2006-03-08 |
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