JPH0959299A - 融合ＭｕｔＳタンパク質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ネイティブなＭｕｔＳタンパク質よりもミス
マッチ二本鎖ＤＮＡとの反応性が高い新規なタンパク質
及びその製造方法を提供すること。 【構成】 ＭｕｔＳタンパク質のＮ末端にラムダファー
ジのＮタンパク質のＮ末端側断片が結合された融合Ｍｕ
ｔＳタンパク質を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、融合ＭｕｔＳタンパク
質及びその製造方法に関する。本発明の融合ＭｕｔＳタ
ンパク質は、ＤＮＡの点突然変異の検出、すなわち、二
本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の検出に有用である。

【０００２】

【従来の技術】近年分子生物学が急速な発展を遂げるに
従い、様々な疾患が遺伝子の異常に起因することが明ら
かになってきた。それらは、例えば転座、大規模な欠失
等のような染色体レベルでの異常から、点突然変異や、
数塩基対の欠失によるフレームシフト等、分子レベルの
異常まで、多くの種類が挙げられる。その中でも特に分
子レベルの異常は頻度も高く、顕微鏡下での解析が困難
であるため、効果的な検出法が広く望まれている。

【０００３】現在点突然変異を検出する方法がいくつか
考えられている。それらのうちで最も広く用いられてい
るものは、関谷らによる「一本鎖ＤＮＡ高次構造多型
（single-strand conformation polymorphism; SSCP)解
析法」であるが、これは検出できるＤＮＡの長さが３０
０ｂｐ以下であり、結果として現れるパターンも一定で
はない、等の欠点を持つ。

【０００４】一方、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位に特
異的に結合するＭｕｔＳタンパク質が知られている（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, pp.5057-5061, Ju
ly 1986 ）。本願発明者らは、先に、このＭｕｔＳタン
パク質を用いてＤＮＡの点突然変異を検出する方法を発
明し、特許出願した（特願平７−１１２４６７号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記検出方法におい
て、もしＭｕｔＳタンパク質とミスマッチＤＮＡとの反
応性がネイティブなＭｕｔＳタンパク質よりも高いタン
パク質が存在すれば、ネイティブなＭｕｔＳタンパク質
を用いる場合に比べて検出の感度を高めることができる
し、また、より少量のタンパク質で同程度の検出感度を
得ることができるので好ましい。

【０００６】従って、本発明の目的は、ネイティブなＭ
ｕｔＳタンパク質よりもミスマッチ二本鎖ＤＮＡとの反
応性が高い新規なタンパク質及びその製造方法を提供す
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ネイティブなＭｕｔＳタンパク質のＮ末端に
ラムダファージのＮタンパク質のＮ末端側断片が結合さ
れた融合ＭｕｔＳタンパク質のミスマッチＤＮＡとの反
応性が、ネイティブなＭｕｔＳタンパク質とミスマッチ
ＤＮＡとの反応性よりも高いことを見出し本発明を完成
した。

【０００８】すなわち、本発明は、ＭｕｔＳタンパク質
のＮ末端にラムダファージのＮタンパク質のＮ末端側断
片が結合された融合ＭｕｔＳタンパク質を提供する。ま
た、本発明は、誘導時以外は検出可能な程度にその下流
の構造遺伝子を発現させないプロモーターと、該プロモ
ーターの下流に請求項１ないし４のいずれかに記載の融
合ＭｕｔＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を少なく
とも含むベクターを宿主細胞中で発現させ、該融合Ｍｕ
ｔＳタンパク質を回収することを含む、融合ＭｕｔＳタ
ンパク質の製造方法を提供する。

【０００９】以下、本発明をさらに詳細に説明する。

【００１０】上述のように、本発明の融合ＭｕｔＳタン
パク質は、ＭｕｔＳタンパク質のＮ末端にラムダファー
ジのＮタンパク質のＮ末端側断片が結合されたものであ
る。ここで、ラムダファージのＮタンパク質のＮ末端側
断片として、例えば下記実施例で作製したもののよう
に、Ｎタンパク質のＮ末端から１番目〜３３番目のアミ
ノ酸から成る断片を挙げることができるが、これよりも
多少短くても長くても、ネイティブなＭｕｔＳタンパク
質よりもミスマッチＤＮＡとの反応性が高ければよい。
なお、ここで言う、「ネイティブなＭｕｔＳタンパク
質」には、下記比較例１で得られたような、天然の遺伝
子又はｃＤＮＡを利用した遺伝子工学的手法により作製
されたＭｕｔＳタンパク質も含まれる。

【００１１】ＭｕｔＳタンパク質のＮ末端とラムダファ
ージＮタンパク質のＮ末端側断片とは直接結合されてい
てもよいが、間に他のオリゴペプチドが介在していても
よい。下記実施例で作製された融合タンパク質では、こ
のようなオリゴペプチドとしてAsn Ser Lys Val Gly Se
r から成るアミノ酸配列が含まれている。ラムダファー
ジのＮタンパク質のＮ末端から１〜３３番目のアミノ酸
配列と、その下流に上記オリゴペプチド配列と、さらに
その下流にＭｕｔＳタンパク質を含む、下記実施例で作
製された融合タンパク質のアミノ酸配列が配列表の配列
番号１に示されている。

【００１２】なお、一般に、生理活性を有するタンパク
質を構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が置換さ
れ若しくは欠失され又は他の少数のアミノ酸が該タンパ
ク質に付加若しくは挿入された場合であっても、その生
理活性がほとんど影響を受けない場合があることは当業
者にとって周知であり、また、少数のアミノ酸の置換、
欠失、挿入及び付加は、周知の部位特異的変異により容
易に行うことができる。従って、配列番号１で示される
アミノ酸配列の少数のアミノ酸を置換し若しくは欠失し
又は他の少数のアミノ酸を挿入若しくは付加したもので
あって、ネイティブのＭｕｔＳタンパク質よりもミスマ
ッチＤＮＡとの反応性の高いものは本発明に含まれる。
なお、ここで言う、「少数のアミノ酸」とは部位特異的
変異により置換、欠失、挿入又は付加できる程度の数の
アミノ酸を意味する。

【００１３】本発明の融合タンパク質は、プロモーター
の下流に上記本発明の融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を含む組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、
該宿主細胞中で融合タンパク質を生産させ、生産された
融合タンパク質を回収することにより得ることができ
る。これは通常の遺伝子工学的手法ではあるが、本発明
では、特定の要件を満足するプロモーターを用いる必要
がある。すなわち、誘導時以外は検出可能な程度にその
下流の構造遺伝子を発現させないプロモーターを用いる
必要がある。このことは、本願発明者が、下記比較例に
示すように種々のプロモーターを用いて行った失敗を積
み重ねることにより見出した新知見である。現在遺伝子
工学的手法に用いられているプロモーターのほとんどの
ものは、所望の遺伝子を発現させたい時に誘導をかける
が、多くのプロモーターは誘導をかけない場合であって
も下流の構造遺伝子が少しは発現する。このようなプロ
モーターを用いた場合には、発現された融合タンパク質
が不溶化したり、無活性なものに分解されたり、あるい
は融合タンパク質を産生する形質転換体が得られない。
これはおそらく、ＭｕｔＳタンパク質が多少毒性を有す
るので、宿主細胞が自己防衛のため、該タンパク質を不
溶化して封じ込めたり、分解して活性を持たないものに
変化させたり、あるいは細胞そのものが死滅してしまっ
たりするからであろうと考えられる。一方、誘導時のみ
その下流の構造遺伝子を発現させるプロモーターであれ
ば、この弊害はかなり軽減され、下記実施例に示すよう
に大量発現が可能になる。このようなプロモーターの例
としてはラムダファージ由来のＰ_L プロモーター及びＴ
₇ プロモーターを挙げることができる。

【００１４】上記のプロモーターを用いると言う点を除
けば、本発明の融合タンパク質は通常の遺伝子工学的手
法により製造することができる。なお、下記実施例に示
すように、Ｐ_L プロモーターとＮタンパク質遺伝子を含
む発現ベクターが市販されているので、このような市販
のベクターのＮタンパク質遺伝子内にＭｕｔＳタンパク
質遺伝子を挿入することにより、所望の組換えベクター
を得ることができる。なお、ＭｕｔＳタンパク質遺伝子
は、その塩基配列がわかっているので、大腸菌のゲノム
ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより容易に調製することが
できる。なお、具体的な操作方法は下記実施例に詳述さ
れている。

【００１５】本発明の融合タンパク質は、ミスマッチ部
位を有する二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するので、ＤＮ
Ａの点突然変異の検出に用いることができる。例えば、
試料ＤＮＡと対照ＤＮＡとをアニールしてこれらのハイ
ブリッド二本鎖ＤＮＡを形成させ、これと融合タンパク
質を反応させた後、ゲル電気泳動にかけて二本鎖ＤＮＡ
と融合タンパク質の結合体のバンドを形成させ、このバ
ンドを検出することにより、試料ＤＮＡ中に点突然変異
が存在するか否かを知ることができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例に基づきさ
らに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例
に限定されるものではない。

【００１７】比較例１ ＭｕｔＳタンパク質の生産 (1) ＭｕｔＳタンパク質生産菌の構築（図２） 大腸菌ＤＨ５α株（Hanahan,D., J. Mol. Biol. 166:55
7 (1983)）よりゲノムＤＮＡを常法により回収した。こ
の大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、Ｍｕ
ｔＳタンパク質遺伝子を含む２．６ｋｂｐの断片を複製
した。ＰＣＲに用いた２種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列はそれぞれ 5'GGATCCATGAGTGCAATAGAAAAT3' 5'GAATTCTTATTACACCAGGC3' であった。ＰＣＲは市販のキットを用い、添附のマニュ
アルに従って行った。上記プライマーは、それぞれBamH
I 部位及びEco RI部位を有するので、このようにして得
られたＤＮＡ断片は、５’側にBam HI部位、３’側にEc
o RI部位を有する。

【００１８】市販のプラスミドベクターであるpGEX-2T
（ファルマシア社製）をBam HI及びEco RIで消化し、上
記のようにして得たＭｕｔＳタンパク質遺伝子断片をpG
EX-2T のマルチクローニング部位に挿入した。得られた
組換えベクターをBam HIとPvu IIで消化し、両端にPvu
II部位、Bam HI部位、中央にXho I 部位、該Xho I 部位
と下流のBam HI部位の間にリボソーム結合部位（以下、
ＲＢＳ）を有する、図２に示す二本鎖オリゴヌクレオチ
ド断片をこれに挿入した。これをPvu IIとEcoRIで消化
し、ＭｕｔＳタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片の両端
を平滑末端化した。

【００１９】一方、市販のベクターであるｐＰＬ−λ
（ファルマシア社製）をHpa I で消化し、先に得られた
ＭｕｔＳタンパク質を含むＤＮＡ断片とライゲートし、
組換えベクターｐＰＬλ（mutS) を得た。大腸菌N4830-
1 株（ファルマシア社）を常法である塩化カルシウム法
により、ｐＰＬλ（mutS) で形質転換し、薬剤マーカー
（アンピシリン耐性）に従って形質転換株を選択し、さ
らに、調製したプラスミド（ｐＰＬλ(mutS)）を制限酵
素で確認することによりＭｕｔＳタンパク質高生産菌N4
830-1/pPL-λ(mutS)を選択した。

【００２０】(2) ＭｕｔＳタンパク質の部分精製 N4830-1/pPL λ(mutS)の培養液を遠心し、沈殿した細胞
ペーストを公知の方法（PREPARATION OF EXTRACTS FROM
PROKARYOTES, Methods in Enzymology, Vol.182, pp.1
49-150)によりリゾチームで処理して細胞を溶解した。
得られた細胞溶解物を１時間氷冷した後、３７℃で４分
間加温した。次いで23,000 gで１時間遠心し、上清に固
体の硫酸アンモニウムを最終濃度１８％（ｗ／ｖ）又は
３０％飽和となるよう添加した。沈殿画分を２０ｍＭ T
ris-HCl(pH7.5)に懸濁し、部分精製ＭｕｔＳタンパク質
試料とした（タンパク濃度10 mg/ml) 。なお、上記沈殿
画分は約３ｇの大腸菌から４３ｍｇ得られた。得られた
ＭｕｔＳタンパク質試料の一部を常法に基づきＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけ、クマシーブリリアントブルー（ＣＢ
Ｂ）でバンドを染色した。結果を図３に示す。図３に示
されるように、N4830-1/pPL λ(mutS)による大量発現物
は、分子量的に確かにＭｕｔＳタンパク質と思われ、ま
た、上記方法により９０％以上に部分精製された。

【００２１】(3) 部分精製ＭｕｔＳタンパク質の活性確
認 上記のようにして部分精製されたＭｕｔＳタンパク質
が、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位に特異的に結合する
活性を有しているか否かをゲルシフト法により調べた。
この操作は次のように行った。

【００２２】ＭｕｔＳタンパク質の基質となる二本鎖Ｄ
ＮＡを調製するため、下記の塩基配列を有する２種類の
一本鎖オリゴヌクレオチド（Ｉ）及び（II）を市販のＤ
ＮＡ合成機により合成した。 5'-GCA TAC GGA AGT TAA AGT GCG GAT CAT CTC TAG CCA-3' （Ｉ） 5'-TGG CTA GAG ATG ATC CGC NCT TTA ACT TCC GTA TGC-3' （II） これらのオリゴヌクレオチドは（Ｉ）の下線を引いたＴ
と（II）の下線を引いたＮの対合部分を除き、完全に相
補的である。（Ｉ）と（II）をアニールすると、（Ｉ）
の下線を引いたＴと（II）の下線を引いたＮとが対合す
るが、ＮがＡの場合（IIc)には（Ｉ）と（IIc)は完全に
相補的であり、誤対合は生じない。これを対照とした。
一方、ＮをＧとしたもの（IIm)及びＮが欠失したもの(I
Id）も調製し、これらをサンプルとして試験に供した。
（IIm)を用いた場合には、この部分のみに誤対合が生じ
る（点変異）。（IId)を用いると、（Ｉ）中の対応する
Ｔがループ状にはみ出した形で（Ｉ）と（IId)がハイブ
リダイズする（欠失）。なお、これらのオリゴヌクレオ
チドは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとＴ４ヌクレオチドキナー
ゼを用いて末端標識した。オリゴヌクレオチド（Ｉ）と
（IIm)、（IId)又は（IIc)を分析用緩衝液（２０ｍＭ T
ris-HCl pH 7.6, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 0.01 mM ED
TA) 中で７０℃で１０分間加熱し、室温まで冷却し、室
温で３０分間放置することによりアニーリングし、各々
二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。

【００２３】上記ＭｕｔＳタンパク質試料（タンパク量
４０pmol（約４μｇ））と、４μｌのｘ５分析用緩衝液
（100 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM MgCl₂、 2.5 mM CaCl
₂、 5mM DTT、 0.5 mM EDTA）、上記３６ｂｐのＤＮＡ試
料12 pmol (300 ng)、ｄ₂ Ｗを混合して全量を２０μｌ
とし、３０℃で２０分間インキュベートした。また、同
様に調製した試料を、DNase I （濃度、２５、５０、１
５０、３００ｎｇ／μｌ）を加えることにより、Ｍｕｔ
Ｓタンパク質により被覆されていないオリゴヌクレオチ
ドを分解した。100 mM EDTA を加えて反応を停止させ
た。これらの試料を、ネイティブＰＡＧＥにかけた。ネ
イティブＰＡＧＥは、各試料を３μｌの６ｘＬＢ緩衝液
（ローディング緩衝液）と共に２０％ポリアクリルアミ
ドゲル（1xTBE)にかけ、２０Ｖ／ｃｍの電圧密度で３〜
５時間電気泳動を行うことにより行った。次いで常法に
よりゲルをエチジウムブロミドで染色することによって
バンドを検出した。また、比較のため、３６ｂｐの一本
鎖ＤＮＡを用いたものについても同様に試験した（この
結果は、図４中のレーン「ｓ」に示す）。さらに、比較
のため、ｐＰＬ−λベクターのみを導入した細胞の抽出
液をＭｕｔＳと同様にして調製したものも同様に試験し
た（この結果は、図４中、右側の「ｐＰＬλ」と記した
３本のレーン「ｍ」、「ｄ」、「ｃ」に示す）。

【００２４】結果を図４に示す。図４から、(IIm) 又は
(IId) を用いた場合には、(IIc) を用いた場合とは異な
る位置にバンドが見られ、(IIc) を用いた場合にはこの
位置にはバンドが見られない。また、ＭｕｔＳタンパク
質遺伝子を含まない、ｐＰＬλベクターのみを含む細胞
から調製した試料を用いた場合も、同様にこの位置には
バンドが見られない。従って、ＭｕｔＳタンパク質は点
変異又は欠失を有する二本鎖オリゴヌクレオチドとのみ
結合したことがわかる。また、DNase I で処理した試料
についての結果を図５に示す。図５に示されるように、
対照である（IIc)を用いた場合には、DNase I の濃度に
従ってバンド自体が消滅していたが、（IIm)を用いた場
合には、DNase I の濃度を挙げるとバンドは低分子量側
へシフトした。このことから、ＭｕｔＳタンパク質はミ
スマッチを有する二本鎖ＤＮＡに結合してＤＮＡの一部
を被覆し、この被覆された部分がDNAase Iによる分解か
ら保護されたのに対し、完全に相補的な対照の二本鎖Ｄ
ＮＡではＭｕｔＳタンパク質と結合せず、DNase I によ
ってＤＮＡが完全に分解されてしまったことがわかる。
以上のことから、上記の方法により得られた部分精製Ｍ
ｕｔＳタンパク質は、ＭｕｔＳタンパク質としての活性
を有していることが確認された。

【００２５】(4) ＭｕｔＳタンパク質の精製 N4830-1/pPL λ(mutS)培養液１リットルを遠心し、上記
(2) と同様にして細胞溶解した。溶解物を遠心し、固体
の硫酸アンモニウムを終濃度１８％（ｗ／ｖ）に加えて
遠心し、沈殿を２０ｍＭ Tris-HCl (pH 7.5)に溶解し
た。この時のタンパク量（Bio Rad 社製クマシー試薬に
より、ＢＳＡを標準として測定）は１３７６．６μｇで
あった。次いで、これを緩衝液Ａ（20 mM KPO₄, 1 mM E
DTA, 1 mMPMSF, 10 mM 2ME, 0.1 M KCl, pH 7.5) に対
して透析し、ヘパリン−セファロースカラム（１ｘ１３
ｃｍ、ファルマシア社製）にかけた。カラムを緩衝液Ａ
で洗浄し、ＫＣｌの０．１→１Ｍ直線勾配で溶出した。
これを常法によりネイティブＰＡＧＥにかけ、９７ｋＤ
のバンドを回収した。この時のタンパク量は１７６．５
μｇであった。次いでこれをヒドロキシアパタイトカラ
ム（1.5 x 8.5 cm) にかけ、緩衝液（20 mM KPO₄, 0.1
mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM 2ME, 0.2 M KCl)でカラム
を洗浄した後、リン酸カリウムの０．０２→０．２Ｍ直
線勾配で溶出し、ネイティブＰＡＧＥにかけ、９７ｋＤ
のバンドを回収した。この時のタンパク量は７８．３μ
ｇであった。

【００２６】(5) ＭｕｔＳタンパク質の活性測定 ＭｕｔＳタンパク質は、下記反応式［Ｉ］に示すように
反応する。

【００２７】

【化１】

【００２８】上記反応式［Ｉ］の平衡定数Ｋｄは、下記
式［II］で表される。

【００２９】

【化２】

【００３０】上記のオリゴヌクレオチド（Ｉ）及び（I
I）を用い（Ｇ−Ｔミスマッチ）、ゲルシフトアッセイ
により、上記部分精製ＭｕｔＳタンパク質のＫｄ値を求
めた。この操作は具体的に次のように行った。比較例１
(3) で得た、³²Ｐ標識した二本鎖ＤＮＡ０．１ｐｍｏｌ
と、上記部分精製ＭｕｔＳタンパク質０．１μｇ〜５μ
ｇ（約１〜５０ｐｍｏｌ）と、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍ
Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）と１ｍＭのポリフェ
ニルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）とを１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中に含む溶
液（１５μｌ）を４℃で３０分間インキュベートし、次
いで６％ＰＡＧＥ（非変性）にかけ、バンドをオートラ
ジオグラフィーで検出した。上記式［II］において［Ｄ
ＮＡ］＝［ＭｕｔＳ−ＤＮＡ］のとき、Ｋｄ≒［Ｍｕｔ
Ｓ］となり、おおよそのＫｄ値が推定できる（この推定
方法は常用されており、Methods in Enzymology 208, 1
03-117 (Academic Press Inc.)に記載されている）こと
から、このバンドのパターンの中でＭｕｔＳ−ＤＮＡの
「バンドの強さ」とゲルの下部に泳動していた「遊離Ｄ
ＮＡのバンドの強さ」が等しくなっているレーンのＭｕ
ｔＳ濃度を求め、Ｋｄ値を推定した。その結果、Ｋｄ値
は約３．３ｘ１０^-6であった。

【００３１】実施例１ (1) 融合ＭｕｔＳタンパク質の調製（図１） ｐＰＬ−λ（ファルマシア社製）ベクターをSma I で消
化し、次いでそのままライゲートすることにより２つの
Sma I 部位に挟まれた領域（Bam HI部位を含む）を削除
した。次いで、このベクターをHpa I で切断し、図１に
示す配列を有する合成オリゴＤＮＡリンカーとアニール
し、ライゲートした。この合成オリゴＤＮＡリンカーは
Asn Ser Lys Val Gly Ser のアミノ酸配列をコードする
領域を含み、中央にBam HI部位を有し、パリンドローム
になっている。次いで、得られたベクターをBam HIで消
化し、一方、比較例１(1) で作製したpPL-λ(mutS)をBa
mHIで消化し、これらをアニールしてライゲートした。
得られたベクター（ＭｕｔＳタンパク質の上流にAsn Se
r Lys Val Gly Ser から成るオリゴペプチド、さらにそ
の上流にラムダファージのＮタンパクのＮ末端から第３
３番目のアミノ酸までから成るペプチドが結合された融
合ＭｕｔＳタンパク質（Ｆ９と命名）を発現する）で比
較例１(1) と同様にして大腸菌N4830-1 株（ファルマシ
ア社製）を形質転換し、形質転換株N4830-1/pPL-λ(F9)
を得た。

【００３２】(2) Ｆ９の部分精製物の調製 比較例１(2) と同様な操作によりＦ９の部分精製物（た
だし、タンパク濃度は５〜１０mg/ml)を得た。

【００３３】(3) Ｆ９部分精製物の活性 比較例１(5) と同様にして、Ｆ９部分精製物の活性を測
定したところ、Ｋｄ値は約１．３ｘ１０^-7であった。こ
のことから、本発明の融合タンパク質の活性は、比較例
１で作製したネイティブのＭｕｔＳタンパク質に比べ、
ミスマッチＤＮＡとの結合能が２５倍高いことがわか
る。

【００３４】比較例２ 市販の発現ベクターであるｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシ
ア社製）のマルチクローニング部位のＢａｍＨＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ部位に、比較例１と同様に調製したＭｕｔＳタン
パク質遺伝子を挿入した。ｐＧＥＸ−２Ｔベクターは、
ｔａｃプロモーター及びその下流にグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）の構造遺伝子（発現産物
の分子量は約２６ｋＤ）を持ち、組み込まれた遺伝子産
物はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タ
ンパク質として生産される。なお、宿主としては大腸菌
ＤＨ５αを用い、ＩＰＴＧで発現誘導した。

【００３５】このＧＴＳ−ＭｕｔＳ融合タンパク質を発
現させた大腸菌ＤＨ５αを比較例１と同様にして溶解す
ると、この融合タンパク質はほとんどが不溶画分に見出
された。この不溶性タンパク質は６Ｍグアニジン塩酸で
可溶化したが、透析によってグアニジン塩酸濃度を低下
させると再び不溶化し、活性の有無を検討することはで
きなかった。

【００３６】比較例３ 市販の発現ベクターであるｐＥＸ（クローンテック社
製）のマルチクローニング部位のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ
部位に、比較例１と同様に調製したＭｕｔＳタンパク質
遺伝子を挿入した。なお、ｐＥＸは、ラムダＰ_R プロモ
ーターを温度感受性のｃＩリプレッサーで制御するもの
であり、ラムダcro-β−ガラクトシダーゼ遺伝子（産物
の分子量は約１２０ｋＤ）を有する。発現は熱誘導によ
って行い、挿入遺伝子産物はラムダcro-β−ガラクトシ
ダーゼとの融合タンパク質として得られる。宿主として
は、大腸菌Ｎ４８３０−１を用いた。

【００３７】この融合タンパク質を発現させた大腸菌Ｎ
４８３０−１を比較例１と同様にして溶解すると、比較
例２と同様、不溶画分に分画され活性の測定を行うこと
はできなかった。また、抗β−ガラクトシダーゼ抗体を
用いてウェスタン解析を行ったところ、この融合タンパ
ク質は大腸菌内でかなり分解されていることがわかっ
た。また、少量ながら、既に誘導前から発現しているこ
とも示された。

【００３８】比較例４ 市販の発現ベクターであるｐＳＥ３８０（インビトロジ
ェン社製）のマルチクローニング部位中のＢａｍＨＩ部
位に比較例１と同様に調製したＭｕｔＳタンパク質遺伝
子を挿入し、かつ、その上流のＮｃｏＩ部位と該Ｂａｍ
ＨＩ部位との間にMet Gly Ser Ser Arg Gln Gly Ser の
アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿
入した。なお、ｐＳＥ３８０は、プロモーターとしてｔ
ａｃプロモーターを有し、ＩＰＴＧで誘導をかける。宿
主としての大腸菌ＤＨ５αを上記の組換えベクターで形
質転換した。その結果、得られた３１個のコロニー全て
において、目的とする挿入とは逆方向にＭｕｔＳタンパ
ク質遺伝子が入った構造の組換えベクターが見出され
た。そこで強制的に正しい方向に遺伝子を挿入すること
を目的として、マルチクローニング部位のＢａｍＨＩ部
位とＳｐｅＩ部位との間にＭｕｔＳタンパク質遺伝子を
挿入し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。ところが、今
度は全く形質転換株が得られなかった。この実験を数回
繰り返し行ったが、全て同じ結果が得られた。この結果
は、誘導をかける前にごく僅かに発現されるＭｕｔＳタ
ンパク質の毒性のために、望ましい方向でＭｕｔＳタン
パク質遺伝子が入った大腸菌は淘汰されてしまうことを
示唆している。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、ミスマッチＤＮＡとの結
合性がネイティブのＭｕｔＳタンパク質よりも高い新規
な融合タンパク質及びその製造方法が提供された。本発
明の融合タンパク質を用いることにより、ＤＮＡの点突
然変異を高感度に検出することができる。

【００４０】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 892 配列の型 :アミノ酸 配列 Met Asp Ala Gln Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala Glu Lys Gln Ala 1 5 10 15 Gln Trp Lys Ala Ala Asn Pro Leu Leu Val Gly Val Ser Ala Lys Pro 20 25 30 Val Asn Ser Lys Val Gly Ser Met Ser Ala Ile Glu Asn Phe Asp Ala 35 40 45 His Thr Pro Met Met Gln Gln Tyr Leu Arg Leu Lys Ala Gln His Pro 50 55 60 Glu Ile Leu Leu Phe Tyr Arg Met Gly Asp Phe Tyr Glu Leu Phe Tyr 65 70 75 80 Asp Asp Ala Lys Arg Ala Ser Gln Leu Leu Asp Ile Ser Leu Thr Lys 85 90 95 Arg Gly Ala Ser Ala Gly Glu Pro Ile Pro Met Ala Gly Ile Pro Tyr 100 105 110 His Ala Val Glu Asn Tyr Leu Ala Lys Leu Val Asn Gln Gly Glu Ser 115 120 125 Val Ala Ile Cys Glu Gln Ile Gly Asp Pro Ala Thr Ser Lys Gly Pro 130 135 140 Val Glu Arg Lys Val Val Arg Ile Val Thr Pro Gly Thr Ile Ser Asp 145 150 155 160 Glu Ala Leu Leu Gln Glu Arg Gln Asp Asn Leu Leu Ala Ala Ile Trp 165 170 175 Gln Asp Ser Lys Gly Phe Gly Tyr Ala Thr Leu Asp Ile Ser Ser Gly 180 185 190 Arg Phe Arg Leu Ser Glu Pro Ala Asp Arg Glu Thr Met Ala Ala Glu 195 200 205 Leu Gln Arg Thr Asn Pro Ala Glu Leu Leu Tyr Ala Glu Asp Phe Ala 210 215 220 Glu Met Ser Leu Ile Glu Gly Arg Arg Gly Leu Arg Arg Arg Pro Leu 225 230 235 240 Trp Glu Phe Glu Ile Asp Thr Ala Arg Gln Gln Leu Asn Leu Gln Phe 245 250 255 Gly Thr Arg Asp Leu Val Gly Phe Gly Val Glu Asn Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Leu Cys Ala Ala Gly Cys Leu Leu Gln Tyr Ala Lys Asp Thr Gln Arg 275 280 285 Thr Thr Leu Pro His Ile Arg Ser Ile Thr Met Glu Arg Glu Gln Asp 290 295 300 Ser Ile Ile Met Asp Ala Ala Thr Arg Arg Asn Leu Glu Ile Thr Gln 305 310 315 320 Asn Leu Ala Gly Gly Ala Glu Asn Thr Leu Ala Ser Val Leu Asp Cys 325 330 335 Thr Val Thr Pro Met Gly Ser Arg Met Leu Lys Arg Trp Leu His Met 340 345 350 Pro Val Arg Asp Thr Arg Val Leu Leu Glu Arg Gln Gln Thr Ile Gly 355 360 365 Ala Leu Gln Asp Phe Thr Ala Gly Leu Gln Pro Val Leu Arg Gln Val 370 375 380 Gly Asp Leu Glu Arg Ile Leu Ala Arg Leu Ala Leu Arg Thr Ala Arg 385 390 395 400 Pro Arg Asp Leu Ala Arg Met Arg His Ala Phe Gln Gln Leu Pro Glu 405 410 415 Leu Arg Ala Gln Leu Glu Thr Val Asp Ser Ala Pro Val Gln Ala Leu 420 425 430 Arg Glu Lys Met Gly Glu Phe Ala Glu Leu Arg Asp Leu Leu Glu Arg 435 440 445 Ala Ile Ile Asp Thr Pro Pro Val Leu Val Arg Asp Gly Gly Val Ile 450 455 460 Ala Ser Gly Tyr Asn Glu Glu Leu Asp Glu Trp Arg Ala Leu Ala Asp 465 470 475 480 Gly Ala Thr Asp Tyr Leu Glu Arg Leu Glu Val Arg Glu Arg Glu Arg 485 490 495 Thr Gly Leu Asp Thr Leu Lys Val Gly Phe Asn Ala Val His Gly Tyr 500 505 510 Tyr Ile Gln Ile Ser Arg Gly Gln Ser His Leu Ala Pro Ile Asn Tyr 515 520 525 Met Arg Arg Gln Thr Leu Lys Asn Ala Glu Arg Tyr Ile Ile Pro Glu 530 535 540 Leu Lys Glu Tyr Glu Asp Lys Val Leu Thr Ser Lys Gly Lys Ala Leu 545 550 555 560 Ala Leu Glu Lys Gln Leu Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Pro 565 570 575 His Leu Glu Ala Leu Gln Gln Ser Ala Ser Ala Leu Ala Glu Leu Asp 580 585 590 Val Leu Val Asn Leu Ala Glu Arg Ala Tyr Thr Leu Asn Tyr Thr Cys 595 600 605 Pro Thr Phe Ile Asp Lys Pro Gly Ile Arg Ile Thr Glu Gly Arg His 610 615 620 Pro Val Val Glu Gln Val Leu Asn Glu Pro Phe Ile Ala Asn Pro Leu 625 630 635 640 Asn Leu Ser Pro Gln Arg Arg Met Leu Ile Ile Thr Gly Pro Asn Met 645 650 655 Gly Gly Lys Ser Thr Tyr Met Arg Gln Thr Ala Leu Ile Ala Leu Met 660 665 670 Ala Tyr Ile Gly Ser Tyr Val Pro Ala Gln Lys Val Glu Ile Gly Pro 675 680 685 Ile Asp Arg Ile Phe Thr Arg Val Gly Ala Ala Asp Asp Leu Ala Ser 690 695 700 Gly Arg Ser Thr Phe Met Val Glu Met Thr Glu Thr Ala Asn Ile Leu 705 710 715 720 His Asn Ala Thr Glu Tyr Ser Leu Val Leu Met Asp Glu Ile Gly Arg 725 730 735 Gly Thr Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ser Leu Ala Trp Ala Cys Ala Glu 740 745 750 Asn Leu Ala Asn Lys Ile Lys Ala Leu Thr Leu Phe Ala Thr His Tyr 755 760 765 Phe Glu Leu Thr Gln Leu Pro Glu Lys Met Glu Gly Val Ala Asn Val 770 775 780 His Leu Asp Ala Leu Glu His Gly Asp Thr Ile Ala Phe Met His Ser 785 790 795 800 Val Gln Asp Gly Ala Ala Ser Lys Ser Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ala 805 810 815 Leu Ala Gly Val Pro Lys Glu Val Ile Lys Arg Ala Arg Gln Lys Leu 820 825 830 Arg Glu Leu Glu Ser Ile Ser Pro Asn Ala Ala Ala Thr Gln Val Asp 835 840 845 Gly Thr Gln Met Ser Leu Leu Ser Val Pro Glu Glu Thr Ser Pro Ala 850 855 860 Val Glu Ala Leu Glu Asn Leu Asp Pro Asp Ser Leu Thr Pro Arg Gln 865 870 875 880 Ala Leu Glu Trp Ile Tyr Arg Leu Lys Ser Leu Val 885 890

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の融合ＭｕｔＳタンパク質をコードする
ベクターを構築する方法を示す図である。

【図２】ＭｕｔＳタンパク質をコードするベクターを構
築する方法を示す図である。

【図３】部分精製したＭｕｔＳタンパク質のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示す模式図である。

【図４】部分精製したＭｕｔＳタンパク質がＭｕｔＳタ
ンパク質活性を有するか否かを調べたネイティブＰＡＧ
Ｅの結果を示す模式図である。

【図５】部分精製したＭｕｔＳタンパク質と各種二本鎖
オリゴヌクレオチドとの反応物を種々の濃度のDNase I
で処理したものをネイティブＰＡＧＥにかけた結果を示
す模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＭｕｔＳタンパク質のＮ末端にラムダフ
   ァージのＮタンパク質のＮ末端側断片が結合された融合
   ＭｕｔＳタンパク質。
2. 【請求項２】 前記ラムダファージのＮタンパク質のＮ
   末端側断片は、該Ｎタンパク質のＮ末端から１番目〜３
   ３番目のアミノ酸から成る断片である請求項１記載の融
   合ＭｕｔＳタンパク質。
3. 【請求項３】 ＭｕｔＳタンパク質のＮ末端と前記ラム
   ダファージのＮタンパク質のＮ末端側断片との間にオリ
   ゴペプチドをさらに含む請求項１又は２記載の融合Ｍｕ
   ｔＳタンパク質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   を有する融合ＭｕｔＳタンパク質。
5. 【請求項５】 誘導時以外は検出可能な程度にその下流
   の構造遺伝子を発現させないプロモーターと、該プロモ
   ーターの下流に請求項１ないし４のいずれかに記載の融
   合ＭｕｔＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を少なく
   とも含むベクターを宿主細胞中で発現させ、該融合Ｍｕ
   ｔＳタンパク質を回収することを含む、融合ＭｕｔＳタ
   ンパク質の製造方法。
6. 【請求項６】 前記プロモーターはＰ_L プロモーター又
   はＴ₇ プロモーターである請求項５記載の方法。