JPH0961430A - クレアチニン測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 希釈されていない尿中のクレアチニン濃度を
精度よく測定できる安定な乾式の試験片を提供する。 【解決手段】 展開層を支持するための支持体上に３，
４−ジニトロ安息香酸を含む試薬層が設けられ、この試
薬層上に水酸化リチウム等の強アルカリ性物質を含む展
開層が設けられた試験片を用いて、非希釈尿等の試料中
のクレアチニンを測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液中のクレアチ
ニン測定用試験片及び測定法に関し、詳しくは、尿のよ
うな緩衝作用の強い体液中のクレアチニンであっても高
精度で測定することが可能な安定性の高い試験片を提供
するものである。

【０００２】

【従来の技術】クレアチニンは、クレアチン経路の最終
代謝物であり、クレアチンが脱水、環化した構造を有す
る。体内においては、大半はクレアチン又はクレアチン
リン酸として筋肉中に存在する。クレアチンは、ＡＴＰ
から高エネルギーリン酸を受けてクレアチンリン酸とな
り、エネルギー貯蔵物質として機能し、筋収縮などのエ
ネルギー消費時にはＡＤＰに高エネルギーリン酸を転移
してクレアチンに戻るか、非酵素的反応によってクレア
チニンとなる。その後、生成したクレアチニンは、腎臓
を介して尿中へ排泄される。

【０００３】従って、クレアチニンの尿中排泄量すなわ
ち尿中濃度は、筋肉疾患や腎機能障害の指標に用いられ
ている。また、腎機能障害がある場合等、血中のクレア
チニン濃度が疾患の指標となり得る。

【０００４】体液中のクレアチニンの検出方法として公
知の「ヤッフェ(Jaffe) 反応」は、強アルカリ性条件下
におけるクレアチニンとピクリン酸との縮合物による呈
色反応を利用したものであり、簡便かつ経済的な検出方
法として広く一般的に使用されている。またヤッフェ反
応は、ピクリン酸の代わりに３，５−ジニトロ安息香酸
を使用する、ベネディクト−ベーレ(Benedict-Bhere)の
方法が応用化されている。

【０００５】上記のヤッフェ反応は、主に溶液系として
使われているが、その一方でこの反応を簡便な乾式の試
験片へ応用した技術が開示されている（特開平１−１２
９１６４号、特開平１−１２９１６５号、特開平５−２
８１２３５号各公報）。しかしながら、尿を対象とした
場合、これらに記載の方法はいずれもある程度のクレア
チニンを測定できるものの、精度のよい方法とは言いが
たいものであった。

【０００６】というのは、尿は広いpH域を有し、しかも
緩衝作用が非常に強いため、強アルカリ性下が必須条件
であるヤッフェ反応あるいはベネディクト−ベーレの方
法において、アルカリ性物質を加えても尿の緩衝作用に
よって反応ｐＨの低下が引き起こされ、結果的にクレア
チニンの検出・測定に大きな誤差を与えてしまうからで
ある。

【０００７】よって、上記方法を利用した尿中クレアチ
ニンの測定において誤差を少なくするためには、強力な
アルカリ性物質（例えば水酸化ナトリウムや水酸化リチ
ウム等の水酸化物）を、尿の緩衝能を上回る程度に多量
に添加する必要がある。本発明者らの実験によれば、尿
の緩衝能を上回って強アルカリ性を確保・維持するに
は、尿以外の検体を用いる場合の約５倍量以上のアルカ
リ性物質を添加しなけらばならないことが判明してい
る。

【０００８】ところが、上記のようなクレアチニンの測
定に使用されるピクリン酸や３，５−ジニトロ安息香
酸、特にこれらの反応生成物は、尿の緩衝作用を上回る
程の量のアルカリ性物質を添加すると極めて不安定であ
り、生成物の呈色にも大きな影響を与える。

【０００９】反応系が液系である場合には、測定する直
前に大量のアルカリ性物質を添加することによって、ピ
クリン酸や３，５−ジニトロ安息香酸の安定性を保つこ
とはできるが、使用する全ての試薬類をあらかじめ仕込
んである乾式の試験片では、これらの安定性を保つこと
はできない。したがって、希釈されていない尿を対象と
して、クレアチニンを精度よく測定する試験片を作製す
ることは、非常に困難であった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、非希釈尿のような緩衝作用の強
い体液であっても、クレアチニンを精度よく測定できる
安定な試験片を提供することを課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に鋭意研究した結果、３，４−ジニトロ安息香酸が、尿
の緩衝作用を上回る程に増量したアルカリ性物質の存在
下でも安定して、クレアチニンとの縮合反応により呈色
することを見出し、本発明を完成させた。

【００１２】すなわち本発明は、展開層と、この展開層
の全部又は少なくとも一部に接する３，４−ジニトロ安
息香酸及び強アルカリ性物質とを含む、体液中のクレア
チニン測定用試験片である。

【００１３】また本発明は、上記試験片の好ましい態様
として、展開層を支持するための支持体をさらに有し、
この支持体上に３，４−ジニトロ安息香酸を含む試薬層
が設けられ、この試薬層上に強アルカリ性物質を含む展
開層が設けられた試験片を提供する。

【００１４】本発明はさらに、試料液中のクレアチニン
濃度を測定する方法であって、試料液中に、試料液のｐ
Ｈが１２〜１３となる量の強アルカリ性物質と、３，４
−ジニトロ安息香酸とを溶解させ、試料中に含まれるク
レアチニンと３，４−ジニトロ安息香酸との縮合反応に
よる呈色を測定することを特徴とするクレアチニンの測
定法を提供する。

【００１５】前記体液としては、尿、血清等が適用され
得るが、特に非希釈尿が好適に適用される。その際、前
記強アルカリ性物質は、試験片に非希釈尿を吸収させた
ときに反応ｐＨを１２〜１３に維持することができるこ
とが好ましい。この強アルカリ性物質として、具体的に
は水酸化リチウムが挙げられる。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
試験片は、展開層と、この展開層の全部又は少なくとも
一部に接する３，４−ジニトロ安息香酸及び強アルカリ
性物質とを有し、好ましくは支持体をさらに備える。

【００１７】前記展開層は、尿などの検体を吸収して液
相の反応系を作るためのものであり、素材としては濾
紙、織布、不織布、ガラス繊維、ニトロセルロース、親
水性高分子等、多孔性の素材が挙げられる。また、形状
としては、ストリップ（細片）状、棒状等が挙げられ
る。これらの内では、濾紙などのようなセルロース等の
天然由来の繊維素材は、強アルカリ条件下では加水分解
や劣化することがあるため、化学合成繊維生地等が好ま
しい。

【００１８】展開層の物理的な強度が弱い場合には、本
発明の試験片は、展開層を支持するための支持体を有し
ていてもよい。支持体は、展開層と一体となり得る形状
であってもよいし、展開層の一部のみを支持するもので
あってもよい。支持体の素材としては、乾式試験片を作
製する際に通常用いられるプラスチック樹脂、例えばポ
リエチレンテレフタレート（以下、「ＰＥＴ」と省略す
る）等が挙げられる。支持体に光透過性の素材を用いる
と、試験片を使用する際に、呈色を支持体側から観察、
測定することが可能となる。

【００１９】３，４−ジニトロ安息香酸及び強アルカリ
性物質は、上記のような展開層の全部又は少なくとも一
部に接する。ここで「接する」とは、３，４−ジニトロ
安息香酸及び強アルカリ性物質が展開層の表面上に接し
ていることのみを意味するものではなく、展開層の内部
で展開層を構成する素材に接していることも含む。ま
た、上記の物質は間接的に展開層に接していてもよく、
例えばマイクロカプセルに封入された状態で接していて
もよい。さらには、展開層上に３，４−ジニトロ安息香
酸及び強アルカリ性物質の一方の物質が層状に設けら
れ、他方の物質がその上に接するように担持されていて
もよい。

【００２０】本発明の試験片の好ましい態様としては、
３，４−ジニトロ安息香酸を含む層が表面上に形成され
た支持体と、強アルカリ性物質を含む層が表面上に形成
された展開層とが、３，４−ジニトロ安息香酸層と強ア
ルカリ性物質層が接するようにして圧着等の手法により
積層化させた試験片（図１参照）が挙げられる。このよ
うに多層化することで、３，４−ジニトロ安息香酸の安
定性を一層高めることができる。その際、支持体として
プラスチック素材等の非多孔性素材を用いるときは、
３，４−ジニトロ安息香酸を支持体上に固定するため
に、バインダーを用いて試薬層として支持体上に担持さ
せてもよい。また、強アルカリ性物質は、展開層中に含
浸させてもよい。尚、３，４−ジニトロ安息香酸と強ア
ルカリ性物質の試験片中の存在部位は、上記と逆であっ
てもよいが、反応環境を強アルカリにすることが必要で
あるので、展開層及び支持層のうち、先に検体試料が触
れる展開層側に水酸化物を含ませることが好ましい。ま
た、強アルカリ性物質は、強アルカリ性条件を強化する
ために、試薬層及び展開層の両方に含有させてもよい。

【００２１】強アルカリ性物質としては、試料に溶解さ
せたときに強アルカリ性の環境を誘導することができる
ものであればよく、特に、試験片に非希釈尿を吸収させ
たときに、試験片での反応ｐＨを１２〜１３に維持する
ことができることが好ましい。具体的には、水酸化アル
カリ金属であれば、大抵の物質が使用できる。試験片の
作製・保存中に、水酸化アルカリ金属の二酸化炭素を吸
着する性質により炭酸が生じるため、試験片のｐＨが低
下することが知られている。この観点から、使用する水
酸化アルカリ金属としては、炭酸を生じにくい水酸化リ
チウムが望ましい。水酸化リチウムを用いる場合には、
例えば展開層が厚さ１５０μｍ、面積が１００ｃｍ² の
場合、１９〜３１ｇ含有されていることが好ましい。

【００２２】本発明の試験片は、クレアチニンとの縮合
反応により呈色する物質として３，４−ジニトロ安息香
酸を用いる以外は、従来の試験片と同様にして製造する
ことができる。例えば、バインダーと３，４−ジニトロ
安息香酸とを溶媒中に溶解又は分散させることによって
粘性の高い塗工液を調製し、この塗工液を支持体表面に
一定の厚さに塗工した後乾燥させて、試薬層を形成させ
る。バインダーとしては、メチルセルロース等の非活性
かつ親水性のポリマーが挙げられる。上記のようにして
得られる支持体と、強アルカリ性物質溶液を含浸、乾燥
させた展開層とを、試薬層と展開層が接するようにして
圧着することによって、全体を積層化する。これらの操
作は、最終製品と同じ大きさの素材を用いて行ってもよ
いが、大きい素材を用いて積層化したものを適宜裁断し
てもよい。

【００２３】試薬を担持させた展開層又は展開層と支持
体とを積層化したものを、そのまま試験片として用いて
もよいが、これを細片化したものをＰＥＴ等からなる把
持部の先端に固定して用いてもよい。

【００２４】本発明の試験片を使用する際には、展開層
の上へ試料（非希釈尿等）を滴下して、試薬層の色変化
を、目視あるいは分光色差計、反射率測定装置（例えば
スポットケムＳＰ−４４１０（（株）京都第一科学の商
標）等の装置を用いて読み取る。装置を用いて定量分析
する場合には、試料液を試験片の展開層へ滴下した後、
クレアチニンと３，４−ジニトロ安息香酸の縮合物の吸
収波長（５５０ｎｍ）における反射率の変化速度を測定
し、あらかじめ既知濃度系列のクレアチニン溶液を滴下
して測定しておいた結果から作成した検量線を用いて、
前記変化速度から濃度を算出する。支持体に光透過性の
素材を用いたときは、呈色を支持体側から測定してもよ
い。

【００２５】本発明の試験片は、上記のような構成を有
しているので、試験片に試料液を吸収させたときに、試
料液中のｐＨを高く維持することができ、試料中に含ま
れるクレアチニンと３，４−ジニトロ安息香酸との縮合
反応による呈色を安定化させることができる。その結
果、高い測定精度を有し、簡便にクレアチニンを定量す
ることができる。

【００２６】

【発明の実施の形態】以下に、本発明をさらに具体的に
説明する。下記の塗工液成分を混合した後、支持体（１
２５μｍのＰＥＴ製白色フィルム）上に、濡れ厚さ１５
０μｍの厚さで塗工し、４０℃で１０分間乾燥させる。

【００２７】 （試薬層の塗工液成分） ３，４−ジニトロ安息香酸 （（株）東京化成） １．６９６ｇ 水酸化リチウム１水和物 （（株）ナカライテスク） ０．３３６ｇ メチルセルロース （（株）ナカライテスク） ０．２３ｇ 蒸留水 ５．０ｇ

【００２８】一方、下記の含浸液成分を混合し３７℃で
溶解させた後、化学合成繊維生地（ポリエステル編み物
「ザヴィーナ・ミニマックス」（株）鐘紡の商標）へ１
３０ｍｌ／m²吸収、含浸させた後、４０℃で１５分間乾
燥させる。

【００２９】 （展開層の含浸液成分） 水酸化リチウム （（株）東京化成） ２９．３７２ｇ 蒸留水 ２００．００ｇ

【００３０】次に、０．１％トリトンＸ−１００を含む
蒸留水で湿らせた展開層を、試薬層の上にのせて圧着さ
せることによりラミネートした後、この積層物を裁断機
で５mm×７mmになるように裁断する。裁断して得られた
パッドを、面積が５mm×７０mm，厚さが０．２５mmのス
ティック状の白色ＰＥＴ片の先端部分に貼り付け、最終
的な試験片を得る。

【００３１】このようにして得られる試験片の側面図を
図１に示す。

【００３２】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００３３】

【実施例１】上記実施の形態と同様にして試験片を製造
した。得られた試験片を用いて、尿中のクレアチニンを
測定した。ヒトプール尿へクレアチニンを１００〜５０
０ｍｇ／ｄｌとなるように添加したものを試料とし、ヤ
ッフェ反応を用いた市販の溶液系自動分析装置用試薬
（「クリニメイト」（株）第一化学の商標）と、本発明
による試験片の各々を用いて、クレアチニン定量値の相
関をとった。

【００３４】試験片の展開層へ滴下する試料の量は５μ
ｌとし、３７℃の環境下で、スポットケムＳＰ−４４１
０（（株）京都第一科学製）を使用して、クレアチニン
と３，４−ジニトロ安息香酸の縮合物の吸収波長（５５
０ｎｍ）における反射率を展開層側から測定した。得ら
れた反射率は、化１式に示すクベルカ−ムンク(Kubelka
-Munk)の式に従ってＫ／Ｓ値に換算し、その２０〜３０
秒間の増加量（ΔＫ／Ｓ）から１分間あたりの増加量を
求めた。

【００３５】

【化１】Ｋ／Ｓ値＝（１−Ｒ）²／２Ｒ Ｒ ：反射率（％）

【００３６】上記のようにして本発明の試験片を用いて
測定された各クレアチニン濃度と１分間あたりのΔＫ／
Ｓとの関係を図２に示す。これを検量線とした。検量線
は、上記測定範囲で良好な直線性を示した。

【００３７】また、市販の溶液系自動分析装置用試薬を
用いて測定された結果と、本発明による試験片を用いて
測定された結果との相関を、化２式に示す。

【００３８】

【化２】ｒ＝０．９９９ ｙ＝１．６６×１０^-3＋０．９９９ｘ （ｘ＝自動分析装置用試薬、ｙ＝本発明による試験片）

【００３９】随時尿中に含まれるクレアチニン排泄量
（濃度）は、個人差があるものの、一般的に３００ｍｇ
／ｄｌまでの範囲であり、本発明によって得られる検量
線は５００ｍｇ／ｄｌまでの直線性を示しており、尿中
クレアチニンの定量に十分な測定範囲を有している。

【００４０】

【実施例２】実尿を試料として、ヤッフェ反応を用いた
溶液系自動分析装置用試薬と、本発明による試験片を用
い、クレアチニンを定量した。これらの値の相関を化３
式に示す。このように、両者は、実尿に対しても良好な
相関関係を示した。

【００４１】

【化３】ｒ＝０．９８４ ｙ＝０．０３３＋０．９６７ｘ （ｎ＝５０、ｘ＝自動分析装置用試薬、ｙ＝本発明によ
る試験片）

【００４２】

【比較例１】比較対照として、３，４−ジニトロ安息香
酸の代わりに３，５−ジニトロ安息香酸を用い、３，５
−ジニトロ安息香酸の安定性を鑑みてアルカリ性物質量
が実施例１の試験片の１／５量である試験片を作製し、
実尿を試料として実施例２と同様に測定した。本発明の
試験片を用いた結果との相関を化４式に示す。

【００４３】

【化４】ｒ＝０．７５０ ｙ＝０．４６０＋０．５６２ｘ （ｎ＝５０、ｘ＝自動分析装置用試薬、ｙ＝本発明によ
る試験片）

【００４４】この結果から明らかなように、両者の相関
は低かった。これは、反応時のｐＨ（アルカリ性）が維
持されないような強い緩衝能を、尿が持つことが多いた
めに、比較例の試験片では正確な測定ができなかったた
めであると考えられる。

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、希釈されていない尿中
のクレアチニン濃度を精度よく測定できる安定な乾式の
試験片を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の試験片の１実施例を示す側面図。

【図２】 本発明による試験片によって得られたクレア
チニン測定用の検量線である。縦軸は１分間あたりのΔ
Ｋ／Ｓ値を、横軸はクレアチニン濃度（ｍｇ／ｄｌ）を
示す。

【符号の説明】

１．展開層（水酸化リチウムを含浸させた化学合成繊維
生地） ２．３，４−ジニトロ安息香酸を含む試薬層 ３．支持層（白色ＰＥＴフィルム）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古田 仁志 京都府京都市南区東九条西明田町57株式会 社京都第一科学内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 展開層と、この展開層の全部又は少なく
   とも一部に接する３，４−ジニトロ安息香酸及び強アル
   カリ性物質とを含む、体液中のクレアチニン測定用試験
   片。
2. 【請求項２】 展開層を支持するための支持体をさらに
   有し、この支持体上に３，４−ジニトロ安息香酸を含む
   試薬層が設けられ、この試薬層上に強アルカリ性物質を
   含む展開層が設けられた請求項１記載の試験片。
3. 【請求項３】 前記体液が非希釈尿である請求項１又は
   ２記載の試験片。
4. 【請求項４】 前記強アルカリ性物質が、試験片に非希
   釈尿を染み込ませたときに反応ｐＨを１２〜１３に維持
   することができる請求項１〜３のいずれか一項に記載の
   試験片。
5. 【請求項５】 前記強アルカリ性物質が水酸化リチウム
   である請求項１〜４のいずれか一項に記載の試験片。
6. 【請求項６】 試料液中のクレアチニン濃度を測定する
   方法であって、試料液中に、試料液のｐＨが１２〜１３
   となる量の強アルカリ性物質と、３，４−ジニトロ安息
   香酸とを溶解させ、試料中に含まれるクレアチニンと
   ３，４−ジニトロ安息香酸との縮合反応による呈色を測
   定することを特徴とするクレアチニンの測定法。