JPH0970289A - ヒトｃｒｆ２レセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

ヒトｃｒｆ２レセプター蛋白質、その製造法および用途

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JPH0970289A
JPH0970289A JP7237081A JP23708195A JPH0970289A JP H0970289 A JPH0970289 A JP H0970289A JP 7237081 A JP7237081 A JP 7237081A JP 23708195 A JP23708195 A JP 23708195A JP H0970289 A JPH0970289 A JP H0970289A
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receptor protein
dna
crf
receptor
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JP7237081A
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Kuniji Hinuma
州司 日沼
Yasuaki Ito
康明 伊藤
Masashi Fukuzumi
昌司 福住
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片のスクリーニングに有用なＤＮＡプライマー
の提供、さらにヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、その製
造法および用途の提供。 【解決手段】公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
第３膜貫通領域または第７膜貫通領域のアミノ酸配列を
コードする塩基配列に共通する塩基配列に相補的なＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを増幅しスクリーニングにより得られるＤ
ＮＡにコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ま
たはその部分ペプチド、さらに、新規なヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質、をコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、該ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の製造方法、及び
スクリーニング用キットで得られるヒトＣＲＦ2レセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニスト、及び該レセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬組成
物、該レセプター蛋白質またはその部分ペプチドに対す
る抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリメラーゼ・チ
ェーン・リアクション用のＤＮＡプライマーとして有用
な新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを用いるＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡの増幅方法、該ＤＮＡを
用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡのスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得
られるＤＮＡおよびスクリーニング方法で得られたＤＮ
ＡにコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質また
はその部分ペプチドに関する。さらに、本発明は、新規
なＣＲＦ2レセプター蛋白質、該蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ、該ＣＲＦ2レセプター蛋白質の
製造方法、および該蛋白質ならびにＤＮＡの用途に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体
の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質
および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を
担っている。それぞれの分子に対して特異的なレセプタ
ー蛋白質が存在し、それによって個々の生理活性物質の
作用の特異性、すなわち標的細胞・臓器、薬理作用、作
用強度、作用時間等を決定している。したがって、Ｇ蛋
白質共役型レセプター遺伝子あるいはｃＤＮＡをクロー
ニングすることができれば、Ｇ蛋白質共役型レセプター
の構造、機能、生理作用等の解明に役立つばかりでな
く、レセプターに作用する物質を探索することにより、
医薬品を開発するためにも役に立つと考えられている。
これまでいくつかのＧ蛋白質共役型レセプター遺伝子あ
るいはｃＤＮＡがクローニングされているが、また未知
のＧ蛋白質共役型レセプター遺伝子が数多く存在すると
考えられている。
【０００３】これまでに知られているＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の特徴として、一次構造上に疎水性アミ
ノ酸残基のクラスターが７個配置し、それぞれの部分で
細胞膜を貫通していることがあげられる。この構造は公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質すべてに共通であ
り、また、この膜貫通領域およびその近傍のアミノ酸配
列はしばしばレセプター間で高度に保存されていること
が知られている。未知の蛋白質がこのような構造を有す
る場合、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の範疇に入る
ことを強く示唆する。また、一部のアミノ酸残基の配置
には共通性があり、これらを特徴としてさらにＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質であることが強く示唆される。
公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の比較から得た
共通のアミノ酸配列をもとに合成ＤＮＡプライマーを合
成し、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（以
下、ＰＣＲ法と略称する場合がある）によって新規レセ
プター遺伝子の単離を行う方法がLibert F.らによって
報告されている（Science 244: 569-572; 1989）。この
報文において、Libert F.らは第３膜貫通領域および第
６膜貫通領域の部分に相当する一組の合成ＤＮＡプライ
マーを用いている。しかし、一般にＰＣＲ法に用いるプ
ライマーのデザインによって、増幅されるＤＮＡの分子
種が規定される。また、アミノ酸配列の類似性をもとに
すれば、コドンの使用が異なった場合、プライマーの結
合に影響を及ぼし、その結果、増幅効率の低下が引き起
こされる。そのため、該ＤＮＡプライマーを用いて各種
の新規レセプター蛋白質のＤＮＡが得られてはいるが、
すべてのレセプター蛋白質のＤＮＡを増幅できるわけで
はない。
【０００４】また、７４種のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の第１膜貫通領域〜第７膜貫通領域に共通するア
ミノ酸配列がWilliam C. Probstらによって報告されて
いる（DNA AND CELL BIOLOGY, Vol/11, No.1, 1992, pp
1-20）。しかし、これらアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ法によっ
て、新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡをスクリーニングする方法については示唆され
ていない。したがって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質またはそれをコードするＤＮＡの共通の配列を利用し
て、新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のより全長
に近い領域をコードするＤＮＡを選択的に、かつ効率よ
くスクリーニングするためのＰＣＲ用ＤＮＡプライマー
の開発が望まれていた。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質は生体の機能を調節する物質を研究し、医薬品として
開発を進める対象として非常に重要である。Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を用い、レセプター結合実験およ
び細胞内情報伝達系を指標としたアゴニスト・アンタゴ
ニストの評価実験等を行うことによって、新規医薬候補
化合物の発見・開発を効率的に進めることができる。特
に、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の存在を明ら
かにすれば、それに対する特異的な作用物質の存在が示
唆される。新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを効率的にスクリーニングし単離すること
ができれば、全コード領域を有するＤＮＡの単離、発現
系の構築、作用するリガンドのスクリーニングを効率的
に進めることが可能となる。
【０００５】Corticotropin-Releasing Factor（以下、
ＣＲＦと略称する）は、はじめ１９８１年にヒツジ視床
下部から単離されたアミノ酸４１個から成るペプチド
で、下垂体からＡＣＴＨ／β-endorphin 分泌を促進す
る活性を有する。その作用機構は、ＣＲＦが下垂体前葉
のＡＣＴＨ産生細胞（Corticotroph）などのＣＲＦ標的
細胞の細胞膜表面に存在するＣＲＦレセプターに結合
後、guanine nucleotide regulatory protein （Ｇ蛋白
質）を介して adenylate cyclase-cyclic ＡＭＰ-prote
in kinase 系を活性化することによることが明らかにさ
れている〔Vale, W.et al.、サイエンス（Science）213
巻、1394頁、1981年〕。臨床的にも、合成ＣＲＦが下垂
体機能低下症や Cushing 症候群の診断に広く応用され
ている。一方、ＣＲＦレセプターは下垂体のみならず、
大脳皮質灰白質、大脳基底核、視床下部室傍核、中央隆
起外層、脳幹大脳神経核、オリーブ核、小脳神経核、小
脳皮質、嗅索、前障、扁桃、脊髄角など中枢神経系内に
広く分布している〔Vale, W.、コルチコトロピン・リリ
ージング・ファクター（Corticotropin Releasing Fact
or）、172巻、1-21頁、1993年〕。この分布はＣＲＦニ
ューロン終末の分布とほとんど一致しており、ＣＲＦが
これらの部分で neurotransmitter あるいは neuromodu
later として作用しているものと考えられている。その
他、ＣＲＦレセプターは、副腎髄質、交感神経節、前立
腺、脾臓、肝臓、腎臓、睾丸、赤血球膜、脾マクロファ
ージにも存在し、ストレス時には、下垂体ＡＣＴＨ／β
-endorphin 分泌促進作用のみならず、これらのレセプ
ターを介して、行動、自律神経あるいは免疫系の反応な
どすべてのストレス適応反応に関与しているものと推測
されている。
【０００６】中枢神経系に存在するＣＲＦレセプターの
性状については、よく研究されていて例えばヒトＣＲＦ
レセプターｃＤＮＡはクローニングされており、動物細
胞（ＣＯＳ ７細胞〔Natalio Vita et al.、フェブス・
レターズ（FEBS Letters）、335巻、1-5頁、1993年〕、
ＣＯＳ ６Ｍ細胞〔Ruoping Chen et al.、プロシージン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、
90巻、8967-8971頁、1993年〕）での発現も報告されて
いる。しかし、本ＣＲＦレセプター（以下、ＣＲＦ1レ
セプターと記す）の体内での分布は、必ずしもＣＲＦが
作用する場所と一致していないことが判明していた。例
えば、視床下部、脳幹、小腸、胃、精巣、心臓、骨格筋
などには、ＣＲＦが作用することが示唆されていたが、
ＣＲＦ1レセプターは、ごくわずかしか存在しないか、
全く存在しないことが示されていた〔Owens, M. J., Ne
meroff, C. B.、ファーマコロジカル・レビュー(Pharma
col. Rev.) 43巻、425頁、1991年〕、〔Grunt, M. et a
l.、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー(A
m. J. Physiol.) 264巻、H1124頁、1993年〕、〔Wei,
E. T., Gao, G. C.、レギュラトリー・ペプチド(Regul.
Pept.) 33巻、93頁、1991年〕、〔Lenz, H.J. et a
l.、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー
(Am. J. Physiol.) 249巻、R85頁、1985年〕。これらの
ことから、ＣＲＦ1レセプター以外にもＣＲＦをリガン
ドとするレセプターが存在する可能性が考えられてい
た。
【０００７】最近、相次いで、ＣＲＦ1レセプターとは
異なるＣＲＦレセプター（以下、ＣＲＦ2レセプターと
記す）が、ラットおよびマウスからクローニングされた
〔Lovenberg, T. W. et al.、プロシージング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー
エスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 92巻、836頁、
1995年〕、〔Kishimoto, T. et al. 、プロシージング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)92巻、
1108頁、1995年〕、〔Perrin, M. et al. 、プロシージ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 9
2巻、2969頁、1995年〕。これによると、ラットＣＲＦ2
レセプターｃＤＮＡは４１１個のアミノ酸をコードして
おり、ＣＲＦ1レセプターとは約７０％の相同性を有す
る７回膜貫通型のＧ蛋白質共役型レセプターである。ま
たマウスＣＲＦ2レセプターは、４３１個のアミノ酸か
らなることが判明した（上記のマウスＣＲＦ2レセプタ
ーに関する論文中では、本明細書のＣＲＦ2レセプター
をheart/muscle(ＨＭ)−ＣＲＦレセプターまたはＣＲＦ
−レセプターＢの用語で記載されている）。一方、ラッ
トとマウスで明らかにされたＣＲＦ2レセプターがヒト
でも存在するかどうかについてはまだ分かっていなかっ
た。
【０００８】ＣＲＦは多くの末梢組織（例えば胎盤、副
腎髄質、膵臓、肺、胃、十二指腸、肝臓）に存在してお
り、またＣＲＦおよびＣＲＦ類似ペプチドのソイベジン
やウロテンシンＩの投与により、末梢組織の全身性の反
応が引き起こされることが示されている〔Lenz, H. J.
et al.、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジ
ー(Am. J. Physiol.) 249巻、R85頁、1985年〕。上記の
ラットおよびマウスのＣＲＦ2レセプターの研究から、
中枢神経系の局所および末梢組織に分布しているＣＲＦ
レセプターは、ＣＲＦ2レセプターであることが強く示
唆されている。以上のことから、ＣＲＦ2レセプターに
対するアゴニストあるいはアンタゴニストは、中枢神経
系や末梢組織に作用する有用な薬物になり得ると期待さ
れる。ヒトの中枢神経系や末梢組織などに作用するよう
な医薬としてのＣＲＦ2レセプターに対するアゴニスト
あるいはアンタゴニストをスクリーニングしようとする
場合は、１次スクリーニングとしてはヒトのＣＲＦ2レ
セプターを発現している組織あるいは細胞を使ってその
レセプターに結合する物質をスクリーニングすることが
考えられるが、ヒトのＣＲＦ2レセプターが未確認でそ
のようなヒトの組織を入手することは事実上ほとんど不
可能である。また、ヒトＣＲＦ2レセプターを発現して
いるような培養細胞も知られていない。一方、ラットや
マウスのＣＲＦ2レセプターを発現している組織あるい
は細胞を使ってスクリーニングすることは可能である
が、この場合には動物種間でのレセプターの特性の違
い、いわゆるレセプターの種特異性が問題となってく
る。以上に加えて、ヒトのＣＲＦ2レセプターのｃＤＮ
Ａが取得されていなかったため、ヒトＣＲＦ2レセプタ
ーのシグナル伝達について調べる手段が全くなかった。
【０００９】このような問題を解決する手段として、ヒ
トＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡをクローニングすること
ができれば、それを使って適当な手段によりヒトＣＲＦ
2レセプターを昆虫細胞や動物細胞等に発現させること
ができるので、ヒトのＣＲＦ2レセプターアゴニストあ
るいはアンタゴニストの探索および研究を大きく前進さ
せることができるものと考えられるが、ヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質のｃＤＮＡについての知見は全くなかっ
た。すなわち、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を使用し
てＣＲＦ2レセプターのアゴニスト／アンタゴニストを
スクリーニングすることができれば、実験動物を用いる
ことの欠点（例えば、種が異なることにより、ヒトに対
して効果を発揮できない化合物が得られる可能性がある
ことなど）を克服することができ、ヒトに対して有効な
医薬の開発が効率よく行えるようになると期待される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＣＲ用の
ＤＮＡプライマーとして有用な新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを
用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡの増幅方法、該ＤＮＡを用いるＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡのスクリーニング方
法、該スクリーニング方法で得られるＤＮＡおよびスク
リーニング方法で得られたＤＮＡにコードされるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドを提
供するものである。さらに、本発明は、ヒトの中枢神経
系や末梢組織などに作用するヒトのＣＲＦ2レセプター
アゴニストあるいはアンタゴニストのスクリーニングな
どに有用な新規ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、該蛋白
質をコードするＤＮＡおよび該蛋白質の製造法およびそ
の用途を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを
採取することができれば、その中に新規レセプター蛋白
質をコードするＤＮＡが含まれていた場合にそれを遺伝
子組み換え技術によって発現させ、今後の研究、医薬品
開発に多大な効果を奏することができると考え、鋭意研
究を重ねた結果、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の第３膜貫通領域または第７膜貫通領域をコードする
塩基配列の類似性に基づいて新規なＤＮＡプライマーを
合成することに成功した。そして、これらのＤＮＡプラ
イマーを用いてＰＣＲを行うことによって予想外にもＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断
片）を効率よく増幅することに成功した。すなわち、本
発明者らは、該ＤＮＡプライマーを用いて各種ＤＮＡの
増幅、解析を行うことによって新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができるこ
とを見いだした。
【００１２】より具体的には、本発明者らは、公知のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質の第３膜貫通領域および
第７膜貫通領域付近に共通するアミノ酸配列を選び、第
３膜貫通領域に共通するアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａプライマー（配列番号：１）、および第７膜貫通領域
付近に共通するアミノ酸配列をコードする塩基配列に相
補的なＤＮＡプライマー（配列番号：２）を設計した。
これらのＤＮＡプライマーは、これまでに報告されてい
る類似のＤＮＡプライマーとは塩基配列が異なってお
り、新規なＤＮＡプライマーである。特に、ＰＣＲにお
いて伸長反応が効率的に行うことができるように、プラ
イマーの３’末端部分に多くのレセプター蛋白質におい
て共通している塩基配列を使用している。その他の部分
においても塩基配列の類似性を活かし、なるべく多くの
レセプター蛋白質のＤＮＡと塩基配列が一致するように
混合塩基部分を設定した。そして、本発明者らは、上記
したＤＮＡプライマーを用いてヒト胃由来のｃＤＮＡを
ＰＣＲにより増幅することに成功し、その解析を進め
た。その結果、本発明者らは、新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするヒト由来のｃＤＮＡを単離
し、その部分的な構造を決定することに成功した。そし
て、このｃＤＮＡは、ラットおよびマウスのＣＲＦ2レ
セプター蛋白質とＤＮＡおよびアミノ酸配列の高い相同
性が認められたことから、ヒトの胃で発現機能している
新規なＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードしているＤＮ
Ａであることを見いだした。これらの知見から、このＤ
ＮＡを用いれば、完全長の翻訳枠を持つｃＤＮＡを入手
することができ、該レセプター蛋白質を製造することも
できる。さらに、該ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡを適当な手段で発現させることによっ
て得られる該レセプター蛋白質を用いれば、レセプター
結合実験または細胞内セカンドメッセンジャーの測定等
を指標に、生体内あるいは天然・非天然の化合物から該
レセプター蛋白質に対するリガンドをスクリーニングす
ることができ、さらには、リガンドとレセプター蛋白質
との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行うこと
もできる。
【００１３】より具体的には、本発明者らは、〔図３〕
に示すヒト胃由来の新規なｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法によ
って増幅し、プラスミドベクターにサブクローニングし
た（ｐｈｓ−ＡＨ１）。その部分配列の解析から、該ｃ
ＤＮＡが新規レセプター蛋白質をコードしていることが
明らかになった。この配列をアミノ酸配列に翻訳したと
ころ〔図３〕、第３、第４、第５、第６および第７膜貫
通領域が疎水性プロット上で確認された〔図４〕。ま
た、増幅されたｃＤＮＡのサイズも、公知のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の第３膜貫通領域と第７膜貫通領
域の間の塩基数と比較して同程度の約０.５ｋｂであっ
た。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質はそのアミノ酸配
列にある程度の共通性を示し、一つの蛋白質ファミリー
を形成している。そこで、本件の新規レセプター蛋白質
ＤＮＡ（ｐｈｓ−ＡＨ１に含まれるｃＤＮＡ）によって
コードされるアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行
ったところ、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質で
あるラットＣＲＦ2レセプター蛋白質（Ｕ１６２３
５）、マウスＣＲＦレセプターＢ蛋白質（Ｕ１７８５
８）とそれぞれ９６.６％および９３.９％の相同性が認
められ〔図５〕、本件の新規レセプター蛋白質ＤＮＡ
が、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードしているこ
とが判明した。さらにこれを基にＰＣＲ法を用いてヒト
ＣＲＦ2レセプター蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ
断片を取得し、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の全アミ
ノ酸配列を明らかにした〔図６および図７〕。
【００１４】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
または配列番号：２で表わされる塩基配列と実質的に同
一の塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ、（２）
ＤＮＡがＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡのポリメラーゼ・チェーン・リアクションに用い
られるＤＮＡプライマーである第（１）項記載のＤＮ
Ａ、（３）鋳型となるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡと第（１）項記載のＤＮＡを混合し
てポリメラーゼ・チェーン・リアクションを行なうこと
を特徴とする該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを増幅する方法、（４）第（１）項記載の
ＤＮＡをＤＮＡプライマーとしてポリメラーゼ・チェー
ン・リアクションに用いることを特徴とするＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡライブラリーからＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法、（５）
第（４）項記載のスクリーニング方法で得られるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ、（６）
第（５）項記載のＤＮＡにコードされるＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩、
【００１５】（７）配列番号：３で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特
徴とするヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩、
（８）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩、（９）第
（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（１０）第
（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有
するＤＮＡ、（１１）配列番号：４で表される塩基配列
を有する第（１０）項記載のＤＮＡ、（１２）配列番
号：１５で表される塩基配列を有する第（１０）項記載
のＤＮＡ、（１３）第（１０）項記載のＤＮＡを含有す
ることを特徴とするベクター、（１４）第（１３）項記
載のベクターを保持する形質転換体、（１５）第（１
４）項記載の形質転換体を培養し、形質転換体の細胞膜
にヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を生成せしめることを
特徴とする第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩の製造方法、（１
６）第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質もしくはその塩または第（９）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩を用いることを特徴とす
るＣＲＦ2レセプターを活性化するアゴニストもしくは
その塩またはＣＲＦ2レセプターとＣＲＦとの結合を拮
抗阻害するアンタゴニストもしくはその塩のスクリーニ
ング方法、（１７）（ｉ）第（７）項あるいは第（８）
項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩
または第（９）項記載の部分ペプチドもしくはその塩
に、リガンドを接触させた場合と（ii）第（７）項ある
いは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質も
しくはその塩または第（９）項記載の部分ペプチドもし
くはその塩に、リガンドおよび試験化合物を接触させた
場合との比較を行なうことを特徴とする、リガンドと第
（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩をス
クリーニングする方法、（１８）第（７）項あるいは第
（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくは
その塩または第（９）項記載の部分ペプチドもしくはそ
の塩を含有することを特徴とする、リガンドと第（７）
項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット、（１９）第（１６）項もしくは第（１
７）項記載のスクリーニング方法または第（１８）項記
載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒトＣＲ
Ｆ2レセプターアゴニストまたはその塩、（２０）第
（１６）項もしくは第（１７）項記載のスクリーニング
方法または第（１８）項記載のスクリーニング用キット
を用いて得られるヒトＣＲＦ2レセプターアンタゴニス
トまたはその塩、（２１）第（１９）項記載のヒトＣＲ
Ｆ2レセプターアゴニストまたはその塩を含有すること
を特徴とする痴呆症、肥満症の予防・治療剤、ストレス
に対する適応促進剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフィン，
β−リポトロピンもしくはα−ＭＳＦの分泌促進剤、血
圧降下剤、気分や行動の調節剤、胃腸機能の調節剤、自
律神経系の調節剤、または下垂体，心血管系，消化管も
しくは中枢神経の機能検査薬、（２２）第（２０）項記
載のヒトＣＲＦ2レセプターアンタゴニストまたはその
塩を含有することを特徴とするストレスからくる鬱病・
不安・頭痛、炎症性疾患、免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツ
ハイマー病、胃腸障害、食欲不振、出血性ストレス、薬
物・アルコールの禁断症状、薬物依存症、生殖障害、ク
ッシング病または低血圧症の予防・治療剤、および（２
３）第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質もしくはその塩または第（９）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体を提供す
る。
【００１６】より具体的には、（２４）ＤＮＡが、配列
番号：１または配列番号：２で表される塩基配列、配列
番号：１または配列番号：２で表される塩基配列中の１
又は２個以上のヌクレオチドが欠失した塩基配列、配列
番号：１または配列番号：２で表される塩基配列に１ま
たは２個以上のヌクレオチドが付加した塩基配列、ある
いは配列番号：１または配列番号：２で表される塩基配
列中の１または２個以上のヌクレオチドが他のヌクレオ
チドで置換された塩基配列を有するＤＮＡである第
（１）項記載のＤＮＡ、（２５）蛋白質が、配列番号：
３で表されるアミノ酸配列、配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号：３で表されるアミノ酸配列に
１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
あるいは配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列を含有する蛋白質である第（７）項記載のヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩、（２６）蛋
白質が、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列、配列
番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以
上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１４
で表されるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸
が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：１４で表
されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白
質である第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質またはその塩、
【００１７】（２７）標識したリガンドを第（７）項あ
るいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質
もしくはその塩または第（９）項記載の部分ペプチドも
しくはその塩に接触させた場合と、標識したリガンドお
よび試験化合物を第（７）項あるいは第（８）項記載の
ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩または第
（９）項記載の部分ペプチドまたはその塩に接触させた
場合における、標識したリガンドの第（７）項あるいは
第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしく
はその塩または第（９）項記載の部分ペプチドもしくは
その塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴と
するリガンドと第（７）項あるいは第（８）項記載のヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（２８）標識した
リガンドを第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場
合と、標識したリガンドおよび試験化合物を第（７）項
あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質を含有する細胞に接触させた場合における、標識した
リガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とするリガンドと第（７）項あるいは第（８）
項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２
９）標識したリガンドを第（７）項あるいは第（８）項
記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞の
膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試
験化合物を第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（３０）標識したリガ
ンドを第（１４）項記載の形質転換体を培養することに
よって該形質転換体の細胞膜に発現したヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質に接触させた場合と、標識したリガンド
および試験化合物を第（１４）項記載の形質転換体を培
養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（３１）第（７）項あ
るいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質
を活性化する化合物を第（７）項あるいは第（８）項記
載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞に接
触させた場合と、第（７）項あるいは第（８）項記載の
ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を活性化する化合物およ
び試験化合物を第（７）項あるいは第（８）項記載のヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させ
た場合における、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を介し
た細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、（３２）第（７）項ある
いは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
活性化する化合物を第（１４）項記載の形質転換体を培
養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質に接触させた場合と、第
（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を第
（１４）項記載の形質転換体を培養することによって該
形質転換体の細胞膜に発現したヒトＣＲＦ2レセプター
蛋白質に接触させた場合における、ヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、比較するこ
とを特徴とするリガンドと第（７）項あるいは第（８）
項記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００１８】（３３）第（１７）項、第（２７）項〜第
（３２）項記載のスクリーニング方法で得られる化合物
またはその塩、（３４）第（３３）項記載の化合物また
はその塩を含有することを特徴とする医薬組成物、（３
５）第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴
とする第（１８）項記載のスクリーニング用キット、
（３６）第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有す
ることを特徴とする第（１８）項記載のスクリーニング
用キット、（３７）第（１８）項、第（３５）項または
第（３６）項記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる化合物またはその塩、（３８）第（３７）項記載
の化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬
組成物、および（３９）第（２３）項記載の抗体と、第
（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質もしくはその塩または第（９）項記載の部分
ペプチドもしくはその塩とを接触させることを特徴とす
る第（７）項あるいは第（８）項記載のヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質もしくはその塩または第（９）項記載の
部分ペプチドもしくはその塩の定量法を提供する。
【発明の実施の形態】
【００１９】本発明のＤＮＡは、配列番号：１または配
列番号：２で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配
列を有するＤＮＡである。すなわち、配列番号：１で表
わされる塩基配列は、 ５'−ＣＡＴＴＡＹＴＫＧＡＴＳＧＹＧＲＣＣＡＡＣＴ
ＷＣＷＮＣＴＧＧ−３' 〔ＹはＴまたはＣを示し、ＫはＧまたはＴを示し、Ｓは
ＣまたはＧを示し、ＲはＡまたはＧを示し、ＷはＡまた
はＴを示し、ＮはＩを示す。〕である〔図１〕。配列番
号：２で表わされる塩基配列は、 ５'−ＧＴＡＧＡＲＲＡＹＡＧＣＣＡＣＭＡＭＲＡＲＮ
ＣＣＣＴＧＲＡＡ−３' 〔ＲはＡまたはＧを示し、ＹはＴまたはＣを示し、Ｍは
ＡまたはＣを示し、ＮはＩを示す。〕であり、これは ５'−ＴＴＹＣＡＧＧＧＮＹＴＹＫＴＫＧＴＧＧＣＴＲ
ＴＹＹＴＣＴＡＣ−３' 〔ＹはＴまたはＣを示し、ＮはＩを示し、ＫはＧまたは
Ｔを示し、ＲはＡまたはＧを示す。〕で表わされる塩基
配列〔図２〕に相補的な塩基配列である。
【００２０】本発明のＤＮＡとしては、配列番号：１ま
たは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡな
どの他に、配列番号：１または配列番号：２で表される
塩基配列と約７０〜９９.９％の相同性を有する塩基配
列を有し、配列番号：１または配列番号：２で表される
塩基配列を有するＤＮＡと実質的に同質の機能を有する
ＤＮＡなどが挙げられる。実質的に同質の機能として
は、例えばＤＮＡプライマーの結合機能、増幅効率など
が挙げられる。実質的に同質とは、ＤＮＡプライマーの
結合機能やプライマー活性が性質的に同質であることを
示す。より具体的には、本発明のＤＮＡとしては、配列
番号：１または配列番号：２で表される塩基配列を有す
るＤＮＡなどが挙げられる。また、本発明のＤＮＡとし
ては、配列番号：１または配列番号：２で表される塩基
配列中の１または２個以上のヌクレオチドが欠失した塩
基配列、配列番号：１または配列番号：２で表される塩
基配列に１または２個以上のヌクレオチドが付加した塩
基配列、配列番号：１または配列番号：２で表される塩
基配列中の１または２個以上のヌクレオチドが他のヌク
レオチドで置換された塩基配列を有するＤＮＡなども挙
げられる。さらに具体的には、本発明のＤＮＡとして
は、配列番号：１または配列番号：２で表される塩基配
列を有するＤＮＡなどの他に、配列番号：１または配列
番号：２で表される塩基配列中の１または２個以上（好
ましくは、２個以上９個以下、より好ましくは２個以上
６個以下）のヌクレオチドが欠失したもの、配列番号：
１または配列番号：２で表される塩基配列に１または２
個以上（好ましくは、２個以上９個以下、より好ましく
はＤＮＡ２個以上６個以下）のヌクレオチドが付加した
もの、配列番号：１または配列番号：２で表される塩基
配列に１または２個以上（好ましくは、２個以上９個以
下、より好ましくはＤＮＡ２個以上６個以下）のヌクレ
オチドが他のヌクレオチドで置換されたものなどが挙げ
られる。
【００２１】配列番号：１および配列番号：２で表され
る塩基配列は、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質、すなわち、ヒトカルシトニンレセプター（Ｘ８２４
６６）、ヒトパラチロイドホルモンレセプター（Ｘ６８
５９６）、ヒトグルカゴンレセプター（Ｕ０３４６
９）、ヒトグルカゴン−ライクポリペプチド−１レセプ
ター（Ｕ０１１５６）、ラットセクレチンレセプター
（Ｘ５９１３２）、ヒトグロースホルモン放出ホルモン
レセプター（Ｌ０１４０６）、ヒトピチュイタリーアデ
ニレートサイクレース−アクティベートポリペプチドレ
セプター（Ｄ１７５１６）、ラットピチュイタリーアデ
ニレートサイクレース−アクティベートポリペプチドレ
セプター（Ｚ２３２７９）、ヒトバソアクティブインテ
スティナルペプチドレセプター（Ｘ７５２９９）、ヒト
ビップ２レセプター（Ｌ３６５６６）、ヒトコルチコト
ロピン放出ファクターレセプター（Ｌ２３３３２）、お
よびラットコルチコトロピン放出ファクター２レセプタ
ー（Ｕ１６２５３）などの第３および第７膜貫通領域付
近のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列に共通
して存在する塩基配列である〔図１および図２〕。上記
の（ ）内の略語は、GenBank/EMBL Data Bankにデータ
として登録される際の整理番号であり、通常Accession
Numberと呼ばれているものである。
【００２２】本発明のＤＮＡは、それ自体公知のＤＮＡ
合成法あるいはそれに準じる方法に従って、製造するこ
とができる。たとえば、固相合成法、液相合成法のいず
れによってもよい。公知の合成法としてはたとえば、以
下の〜に記載された方法が挙げられる。 池原森男他、核酸有機化学、化学同人（1979年） G. H. BlackburnおよびM. J. Gait, Nucleic Acids i
n Chemistry and Biology, IRL Press, Oxford (1989
年） 大塚栄子および井上英夫、日本臨床、47巻、87頁 (19
89年） また、市販のＤＮＡ自動合成機を用いることもできる。
本発明のＤＮＡのうち、配列番号：１で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡは前述の公知のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質の第３膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡの塩基配列に共通して存在する塩基配列
であり、また配列番号：２で表わされる塩基配列を有す
るＤＮＡは第７膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡの塩基配列に共通して存在する塩基配列に相
補的な塩基配列であるので、該公知のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡ）またはＲＮＡに相補的に結合することができ
る。さらに、これらの公知のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードするＤＮＡ・ＲＮＡに限らず、本発明の
ＤＮＡの塩基配列に類似した塩基配列を有する他の公知
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
またはＲＮＡや未知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにも相補的に結合する
ことができる。したがって、本発明のＤＮＡはＰＣＲ用
のＤＮＡプライマーとして用いることができる。例え
ば、鋳型となる微量のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡ（断片）と本発明のＤＮＡプライマ
ーを混合してＰＣＲを行なうことによって、該レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）を増幅することが
できる。具体的には、配列番号：１で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法を行なう
と、該ＤＮＡプライマーは鋳型となるＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）あるいはＲ
ＮＡの第３膜貫通領域に相当する塩基配列に結合し、
５’側から３’側へＤＮＡを伸長していく。一方、配列
番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行なうと、該ＤＮＡプライマーは
鋳型となるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡ（断片）あるいはＲＮＡの第７膜貫通領域に相
当する塩基配列に結合し、３’側から５’側へＤＮＡを
伸長していく。すなわち、本発明の配列番号：１で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡプライマーおよび配列番
号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプライマー
を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の第３膜貫通領域から第７膜貫通領域部分をコードす
るＤＮＡ（断片）を増幅することができる。
【００２３】この増幅方法は、公知のＰＣＲ法に従って
実施することができる。例えば、Saiki R.K. et al. Sc
ience,239:487-491(1988)に記載の方法に従って実施す
ることができる。ＰＣＲ法の温度、時間、バッファー、
サイクル数、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、2'-deoxy
-7-deaza-guanosine triphosphateやInosineの添加など
は対象ＤＮＡの種類などに応じて適宜選択することがで
きる。またＲＮＡを鋳型として用いる場合は、Saiki R.
K. et al. Science,239:487-491(1988)に記載の方法な
どに従って行なう。さらに、本発明のＤＮＡは、Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の第３膜貫通領域または第７
膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩
基配列に相補的に結合することができるので、ある種の
ＤＮＡライブラリーからＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質をコードするＤＮＡ（断片）をスクリーニングするた
めのプローブとしても有用である。本発明のＤＮＡをプ
ローブとして用いてＤＮＡライブラリーからＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）をス
クリーニングするには、それ自体公知の方法あるいはそ
れに準じる方法に従って行なうことができる。特に、本
発明のＤＮＡをＰＣＲ法のＤＮＡプライマーとして使用
すれば、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ（断片）の増幅とスクリーニングとを一挙に行な
うことができる。すなわち、本発明のＤＮＡをＰＣＲ用
のＤＮＡプライマーとして使用すれば、該ＤＮＡプライ
マーはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の第３膜貫通領
域から第７膜貫通領域のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ（断片）あるいはＲＮＡに結合し、該ＤＮＡを増幅し
ていくことができるので、本発明のＤＮＡプライマーは
ＤＮＡライブラリーの中からＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の第３膜貫通領域から第７膜貫通領域のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ（断片）のみを選択的に増幅す
ることができる。そして、増幅されたＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の第３膜貫通領域から第７膜貫通領域部
分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（断片）をプロー
ブとして用い、それ自体公知の方法に従って、ＤＮＡラ
イブラリーからＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全
にコードするＤＮＡをスクリーニングすることができ
る。
【００２４】すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡをＰ
ＣＲ用ＤＮＡプライマーとして用いることを特徴とする
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）を含有す
るＤＮＡライブラリーあるいは組織・細胞由来のＲＮＡ
からＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａ（断片）をスクリーニングする方法を提供する。具体
的には、本発明は、本発明のＤＮＡをＰＣＲ用のＤＮＡ
プライマーとして用い、該ＤＮＡプライマーと鋳型とな
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ
（断片）を含有するＤＮＡライブラリーとを混合しＰＣ
Ｒ法を行ない、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の第３
膜貫通領域から第７膜貫通領域部分をコードするＤＮＡ
を増幅し選択し（すなわち、スクリーニングし）、これ
をプローブとして自体公知の方法を用いて、ＤＮＡライ
ブラリーから完全な長さを持つＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングする方法を
提供する。クローニングされたＤＮＡの解析はＤＮＡシ
ークエンサーを用いて行なうことができる。本発明のＤ
ＮＡを用いるＰＣＲ法による増幅およびスクリーニング
の対象となるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡ（断片）またはＲＮＡとしては、公知のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断
片）またはＲＮＡであってもよいし、新規なＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）また
はＲＮＡであってもよい。例えば、脊椎動物（例えば、
マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、サ
ル、ヒトなど）のあらゆる組織（例えば、下垂体、脳、
膵臓、肺、副腎など）、昆虫もしくはその他の無脊椎動
物（例えば、ショウジョウバエ、カイコ、ヨトウガな
ど）、植物（例えば、イネ、コムギ、トマトなど）およ
びそれらに由来する培養細胞株由来のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）またはＲＮ
Ａなどが挙げられる。具体的には、例えばカルシトニ
ン、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、グ
ルカゴン−ライクポリペプチド−１、セクレチン、グロ
ースホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＰＡＣＡＰ、
ＶＩＰ、ＶＩＰ２、ＣＲＦなどのＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）またはＲＮＡな
どが挙げられる。本発明のＤＮＡを用いたＰＣＲ法によ
る増幅の鋳型とするＤＮＡ（断片）としては、上記の組
織・細胞由来のものであればいかなるものであってもよ
い。より具体的には、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライ
ブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来
のｃＤＮＡライブラリーのいずれでもよい。ライブラリ
ーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分を調整したもの
を用いて直接にＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することも
できる。鋳型となるＤＮＡは、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を完全にコードするＤＮＡであってもよいし、
そのＤＮＡ断片であってもよい。本明細書では、これら
をまとめてＤＮＡ（断片）と表記する場合がある。
【００２５】ＤＮＡのクローニングの手段としては、該
ＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを
用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または該ＤＮＡの
一部あるいは全領域を有するＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ
を用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによ
って選別する。ハイブリダイゼーションの方法は、例え
ば Molecular Cloning 2nd ed.; J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 に記載の方法な
どに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用
する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行な
う。したがって、本発明のＤＮＡを用いるスクリーニン
グ方法で得られるＤＮＡ（断片）は、ＤＮＡライブラリ
ーなどに含まれているＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡ（断片）である。すなわち、具体的
には、カルシトニン、ＰＴＨ、グルカゴン、グルカゴン
−ライクポリペプチド−１、セクレチン、ＧＨＲＨ、Ｐ
ＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＶＩＰ２、ＣＲＦなどのＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）であ
る。該スクリーニング方法で得られたＤＮＡ（断片）を
プローブとして用いることによって、適当なＤＮＡライ
ブラリーからそれ自体公知のＤＮＡのスクリーニング方
法に従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全に
コードするＤＮＡを単離することができる。
【００２６】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全に
コードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望に
より制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして
使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側に
は翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ
を有していてよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止
コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加す
ることもできる。また、該ＤＮＡをプローブとしてノザ
ンプローティングを行なって、該レセプター蛋白質が発
現している組織・細胞などを決定することができる。ま
た、全コード領域を有するＤＮＡを適当なプロモーター
と連結して動物細胞に導入することによりレセプター蛋
白質を発現させることができる。本発明のスクリーニン
グ方法で得られるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡにコードされるＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質は、具体的には、カルシトニン、ＰＴＨ、グル
カゴン、グルカゴン−ライクポリペプチド−１、セクレ
チン、ＧＨＲＨ、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＶＩＰ２、ＣＲ
ＦなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質である。該Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質は、温血動物の組織また
は細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造す
ることもできるし、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養すること
によっても製造することができる。
【００２７】該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
ペプチドとしては、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位など
が用いられる。具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水
性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分ペプ
チドである。また、疎水性（Hydtophobic）部位を一部
に含むペプチドも同様に用いることができる。さらに、
個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複
数のドメインを同時に含む部分ペプチドでもよい。Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドは、自体公
知のペプチドの合成法に従って、あるいはＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分
ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生
成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することによ
り目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合
方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の〜に
記載された方法が挙げられる。 Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および M.A. Ondetti、
ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscie
nce Publishers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適用な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。さら
に、該部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによっても製造することができ
る。該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分
ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される
酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機
酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２８】本発明のＤＮＡを用いた前述のスクリーニ
ング方法で得られるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡ（断片）および該ＤＮＡにコードされ
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または部分ペプチド
は、例えば、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドの決定や該レセプター蛋白質とリガンドとの
結合を阻害する化合物のスクリーニングなどに使用する
ことができる。この場合、まずＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡ（断片）の発現系を構築す
る。宿主として用いるものは動物細胞、昆虫細胞、酵
母、枯草菌、大腸菌などいずれでも良く、用いるプロモ
ーターとしては遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適
切なプロモーターであればいかなるものであっても良
い。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
構築した発現細胞をそのまま、あるいはそれらより公知
の方法に従って膜画分を調製し、結合実験に供すること
ができる。用いるリガンドは、市販の放射性同位元素等
による標識化合物、また培養上清、組織抽出物等を直接
クロラミンＴ法やラクトペルオキシダーゼ法によって標
識化したものでもよい。結合・遊離のリガンドの分離
は、基質に接着している細胞を用いた場合はそのまま洗
浄によって行い、浮遊細胞あるいは膜画分の場合は遠心
分離あるいはろ過によって行っても良い。容器等への非
特異結合は、投入した標識リガンドに対して１００倍程
度の濃い非標識リガンドの添加によって推定できる。
【００２９】このような結合実験によって得られたリガ
ンドについて、アゴニスト・アンタゴニストの判別を行
なうことができる。具体的には、該レセプター蛋白質を
発現している細胞とリガンドであることが予想される天
然物・化合物をインキュベートし、その後培養上清を回
収あるいは細胞を抽出する。これらに含まれる成分の変
化を、例えば市販の測定キット（ｃＡＭＰ、ジアシルグ
リセロール、ｃＧＭＰ、プロテインキナーゼＡなど）で
測定する。また公知の方法に従い、Ｆｕｒａ−２、〔3
Ｈ〕アラキドン酸、〔3Ｈ〕イノシトールリン酸代謝物
の遊離等を測定することもできる。このようにスクリー
ニングして得た化合物、天然物は該レセプター蛋白質に
対するアゴニストあるいはアンタゴニストであり、該レ
セプターが分布する組織・細胞に作用することが予測さ
れる。そのため、ノーザンブロッティング等によって明
らかにした分布を参考にすることによって、よりその薬
効を効率的に探索することが可能である。また、例えば
中枢神経組織、循環系、腎臓、膵臓等において、新しい
薬効を持つ化合物が望まれる。組織より選択的にＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを増幅す
ることによって、これらを用いてより効率的に医薬の開
発を進めることができる。
【００３０】以下に、本発明のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡのスクリーニング方法で得
られるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡ（断片）および該ＤＮＡを発現させて得られるＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたは
それらの塩（以下、塩を含めてＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその部分ペプチドと略称する）の有用性
について、以下に詳細に説明する。 （１）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガン
ドの決定方法 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドは、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガ
ンドを探索しまたは決定するための試薬として有用であ
る。すなわち、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または
その部分ペプチドと、試験化合物とを接触させることを
特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドの決定方法を提供する。試験化合物としては、公
知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシ、
カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロト
ニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、
プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソ
アクティブ インテスティナル アンド リレイテッド
ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリ
ン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニン
ジーンリレーティッドペプチド）、アドレノメジュリ
ン、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタノ
イド、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、α
およびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、、ＧＲＯ
β、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、Ｉ
Ｐ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−
３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴ
ＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒス
タミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティッ
クポリペプタイド、ガラニン、カルシトニン、パラチロ
イドホルモン、グルカゴン、セクレチン、ＧＨＲＨ、Ｐ
ＡＣＡＰ、ＣＲＦなど）の他に、例えば温血動物（例え
ば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト
など）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測
定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ること
ができる。
【００３１】具体的には、該リガンド決定方法は、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドを
用いるか、または組み替え型レセプター蛋白質の発現系
を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系
を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化などを
促進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例
えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化
合物、発酵生産物など）またはその塩を決定する方法で
ある。該リガンド決定方法においては、Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質または部分ペプチドと試験化合物とを
接触させた場合の、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質または該部分ペプチドに対する試験化合物の結合
量、細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００３２】より具体的には、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質またはその部分ペプチドもしくはその塩に接触させ
た場合における、標識した試験化合物の該蛋白質もしく
はその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩に対す
る結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた
場合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜
画分に対する結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方
法、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に接触させた場合における、標識した試験
化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結
合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドの決定方法、 試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化などを促進する活性または
抑制する活性など）を測定することを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方
法、および 試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供す
る。
【００３３】リガンド決定方法の具体的な説明を以下に
する。まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質またはその部分ペプチドを含有するものであれば
何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発
現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、
前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行う
ことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相
補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるも
のではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いて
もよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく
発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とする
バキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclea
r polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモ
ーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒト
ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプ
ロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現し
たレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行
うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. B
iol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の
方法に従って行うことができる。
【００３４】したがって、リガンド決定方法において、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従っ
て精製したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドであって
もよいし、該蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、ま
た該蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。リ
ガンド決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルア
ルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化
方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞として
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細
胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。膜画分とし
ては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られ
る細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕
方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細
胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン
（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フ
レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから
噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の
分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの
遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細
胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短
時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高
速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０
分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜
画分中には、発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含
まれる。該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する
細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の量
は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好まし
く、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発
現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活
性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可
能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定
できるようになる。
【００３５】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識
した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画
分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白
質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等
の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識
した試験化合物としては、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、
〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したアンギオテンシン、
ボンベシ、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミ
ン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オ
ピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブ インテスティナルアンド リレ
イテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン
（Ｄ５ドーパミンなど）、モチリン、アミリン、ブラジ
キニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッド
ペプチド）、アドレノメジュリン、ロイコトリエン、パ
ンクレアスタチン、プロスタノイド、トロンボキサン、
アデノシン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine
（ＩＬ−８、ＧＲＯα、、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ
−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、
ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩ
Ｐ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセ
リン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテン
シン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガ
ラニン、カルシトニン、パラチロイドホルモン、グルカ
ゴン、セクレチン、ＧＨＲＨ、ＰＡＣＡＰ、ＣＲＦなど
が好適である。
【００３６】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバ
ッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
によるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭ
ＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識し
た試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
あるいはγ−カウンターで計測する。全結合（Ｂ）から
ＮＳＢを引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越
える試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に対するリガンドとして選択することができる。
【００３７】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化など
を促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法
または市販の測定用キットを用いて測定することができ
る。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養す
る。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な
培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに
交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベ
ートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生
成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺
激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）
の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な
場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイ
を行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性
については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量
を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検
出することができる。
【００３８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドの決定方法に用いるキットとしては、Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチド、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、または
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画
分などを含有するものなどが挙げられる。リガンド決定
用キットの例としては、次のものが挙げられる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識試験化合物 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難
溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミ
ド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。
【００３９】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合することができ
るリガンドとしては、例えば脳、下垂体などに特異的に
存在する物質などが挙げられ、具体的にはアンギオテン
シン、ボンベシ、カナビノイド、コレシストキニン、グ
ルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチド
Ｙ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシ
ン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アン
ド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドー
パミン（Ｄ５ドーパミンなど）、モチリン、アミリン、
ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーテ
ィッドペプチド）、アドレノメジュリン、ロイコトリエ
ン、パンクレアスタチン、プロスタノイド、トロンボキ
サン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ−chemok
ine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、Ｎ
ＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−
２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、
ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、カルシトニン、パラチロイドホルモン、
グルカゴン、セクレチン、ＧＨＲＨ、ＰＡＣＡＰ、ＣＲ
Ｆなどが挙げられる。
【００４０】（２）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠
乏症の予防・治療剤 上記（１）の方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドが明らかになれば、該リガンド
が有する作用に応じて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質をコードするＤＮＡをＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質欠乏症の予防・治療剤として低毒性で安全に使用する
ことができる。例えば、生体内においてＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質が減少しているためにリガンドの生理
作用が期待できない患者がいる場合に、（イ）Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に
投与し発現させることによって、あるいは（ロ）脳細胞
などにＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡを挿入し発現させた後に、該脳細胞を該患者に移植
することなどによって、該患者の脳細胞におけるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の量を増加させ、リガンドの
作用を充分に発揮させることができる。したがって、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、
安全で低毒性なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症
の予防・治療剤などとして用いることができる。
【００４１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを上記治療剤として使用する場合は、該ＤＮ
Ａを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイル
スベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手
段に従って実施することができる。例えば、必要に応じ
て糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしく
はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、ま
たは懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、本発明のＤＮＡを生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、ア
ラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような
賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの
ような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油
などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させ
るなどの通常の製剤実施にしたがって処方することがで
きる。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖や
その他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトー
ル、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあ
げられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たと
えばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレ
ングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性
界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、Ｈ
ＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴ
マ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香
酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよ
い。
【００４２】また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整され
た注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に対して投与
することができる。該ＤＮＡの投与量は、症状などによ
り差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（６０
ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１
００ｍｇ、好ましくは１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合
は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では
通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは０．１〜２０ｍｇ
程度、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４３】（３）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの定量法 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドは、リガンドに対して結合性を有しているので、生体
内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができ
る。この定量法は、例えば競合法と組み合わせることに
よって用いることができる。すなわち、被検体をＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドと接
触させることによって被検体中のリガンド濃度を測定す
ることができる。具体的には、例えば、以下のまたは
などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って
用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）
【００４４】（４）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と
リガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニング方法 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドを用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現
系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ
系を用いることによって、リガンドとＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との結合を阻害する化合物（例えば、ペ
プチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発
酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすること
ができる。このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセ
プターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化，ｃ−
ｆｏｓの活性化などを促進する活性または抑制する活性
など）を有する化合物（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプ
ターアゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物
（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）
などが含まれる。すなわち、（ｉ）Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質もしくはその塩または部分ペプチドもし
くはその塩およびリガンドを接触させた場合と（ii）
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩また
は部分ペプチドもしくはその塩、リガンドおよび試
験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴
とするリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。該スクリーニング方法においては、
（ｉ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または部分ペ
プチドおよびリガンドを接触させた場合と（ii）Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質または部分ペプチド、
リガンドおよび試験化合物を接触させた場合におけ
る、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該
部分ペプチドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性
などを測定して、比較することを特徴とする。
【００４５】より具体的には、 標識したリガンドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質またはその部分ペプチドに接触させた場合と、標識し
たリガンドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその部分ペプチドに接触させた場合にお
ける、標識リガンドの該蛋白質またはその部分ペプチド
もしくはその塩に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、 標識リガンドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合
と、標識したリガンドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画
分に接触させた場合における、標識リガンドの該細胞ま
たは該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とするリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、 標識リガンドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養すること
によって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試
験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
接触させた場合における、標識リガンドの該Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較す
ることを特徴とするリガンドとＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング方法、 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化合物
（例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドなど）を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ターを活性化する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合
における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激
活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化など
を促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比
較することを特徴とするリガンドとＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、および Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物（例え
ば、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
など）を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化
する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培
養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質
共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化などを促進する活性または
抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合
を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を
提供する。
【００４６】このスクリーニング方法の具体的な説明を
以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に用い
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドを含有
するものであれば何れのものであってもよいが、温血動
物の臓器の膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来
の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニング
に用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現
させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適している。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、前述
の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮＡを
哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行うこと
ができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相補Ｄ
ＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるもので
はない。例えば遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよ
い。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現
させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキ
ュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear po
lyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモータ
ー、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒー
トショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモ
ーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレ
セプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うこ
とができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法
に従って行うことができる。したがって、スクリーニン
グ方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質また
はその部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体
公知の方法に従って精製したＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
ペプチドであってもよいし、該蛋白質を含有する細胞を
用いてもよく、また該蛋白質を含有する細胞の膜画分を
用いてもよい。
【００４７】スクリーニング方法において、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該
細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化し
てもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行
うことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大
腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら
れる。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公
知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことを
いう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホ
モジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレン
ダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音
波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞
を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げ
られる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配
遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いら
れる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０
００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心
し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００
ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を
膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質な
どの膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子
であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適
である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガン
ド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニ
ング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで
大量の試料を測定できるようになる。
【００４８】リガンドとＧ蛋白質共役型レセプターとの
結合を阻害する化合物をスクリーニングする前記の〜
を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプタ
ー画分と、標識したリガンドが必要である。Ｇ蛋白質共
役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型
レセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組
換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。
ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性など
を示す。標識したリガンドとしては、標識したリガン
ド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられ
る。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕な
どで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行うに
は、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細
胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッ
ファーに懸濁することによりレセプター標品を調製す
る。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６
〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーな
どのリガンドＸとレセプターとの結合を阻害しないバッ
ファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を
低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０
TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレー
トなどの界面活性剤をバッファーに加えることもでき
る。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンド
の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６
４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテア
ーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０m
lの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５
０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時
に１０-4Ｍ〜１０-10 Ｍの試験化合物を共存させる。非
特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の
リガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃
から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２
４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物
質がない場合のカウント(Ｂ0）からＮＳＢを引いたカウ
ント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合
量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物
を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで
きる。
【００４９】リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物スクリーニングする前記の
〜の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化などを促進する活性または抑制する
活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用
いて測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェ
ルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあ
たっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さ
ない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加
して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるい
は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に
従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。細胞刺激
活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞が必要で
ある。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞
としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
有する細胞株（例えば、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６な
ど）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
発現細胞株などが望ましい。試験化合物としては、例え
ばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な
化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。
【００５０】リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質また
はその部分ペプチド、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有するものである。ス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識リガンド 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したリガンド 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。
【００５１】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
【００５２】
【数１】
【００５３】ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量 スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用
いて得られる化合物またはその塩は、リガンドとＧ蛋白
質共役型レセプターとの結合を阻害する化合物であり、
具体的にはＧ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激
活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＧ蛋白質共
役型レセプターアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有
しない化合物（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアン
タゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タ
ンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であって
もよいし、公知の化合物であってもよい。
【００５４】該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニスト
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該リ
ガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物として有
用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニ
ストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガ
ンドが有する生理活性を抑制することができるので、該
リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬組成物とし
て有用である。スクリーニング方法またはスクリーニン
グ用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述
の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実
施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施し
た錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル
剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の
薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤
などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該
化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
容量が得られるようにするものである。
【００５５】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。注射用の水性液としては生
理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例
えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナト
リウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たと
えばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコー
ル（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に
対して投与することができる。該化合物またはその塩の
投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは１．０〜５０
ｍｇ、より好ましくは１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえ
ば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは０．１〜１０ｍ
ｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他
の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与す
ることができる。
【００５６】（５）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する
抗体または抗血清の製造 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩に対する抗体または抗血清
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドもしくはその塩を抗原として用い、自体
公知の抗体の製造法に従って製造することができる。例
えば、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造
することができる。
【００５７】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩（以下、Ｇ蛋白質共役型レセ
プターと略称する場合がある）は、温血動物に対して投
与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用
いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際して
は、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗
体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に
脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化Ｇ
蛋白質共役型レセプターと抗血清とを反応させたのち、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げ
られるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞
としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、Ａ
Ｐ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗
Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイブリドーマのス
クリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえば
Ｇ蛋白質共役型レセプター抗原を直接あるいは担体とと
もに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素など
で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられ
る細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が
用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合し
た抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体を検
出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡ
を吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、
放射性物質や酵素などで標識したＧ蛋白質共役型レセプ
ターを加え、固相に結合した抗Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ーモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられ
る。抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の
選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行
なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行
なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリド
ーマが生育できるものならばどのような培地を用いても
良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の
牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％
の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））
あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１
０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培
養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃であ
る。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間
〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なわ
れる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血
清中の抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体価の測定と同様
にして測定できる。
【００５８】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離
精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免
疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈
殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、
ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗
原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ
などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離
させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以
上の（１）および（２）の方法に従って製造させる本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体は、Ｇ蛋白質共役型
レセプターを特異的に認識することができるので、被検
液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量、特にサンドイ
ッチ免疫測定法による定量などに使用することができ
る。すなわち、本発明は、例えば、
【００５９】（ｉ）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
に反応する抗体と、被検液および標識化Ｇ蛋白質共役型
レセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化Ｇ蛋白質共役型レセプターの割合を測定することを
特徴とする被検液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量
法、（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識
化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量法に
おいて、一方の抗体がＧ蛋白質共役型レセプターのＮ端
部を認識する抗体で、他方の抗体がＧ蛋白質共役型レセ
プターのＣ端部に反応する抗体であることを特徴とする
被検液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量法を提供す
る。本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを認識するモノ
クローナル抗体（以下、抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗
体と称する場合がある）を用いてＧ蛋白質共役型レセプ
ターの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行
なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのも
のを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆ
ａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の
抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものでは
なく、被測定液中の抗原量（例えばＧ蛋白質共役型レセ
プター量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複
合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これ
を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線
より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いて
もよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメト
リック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、
感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いる
のが特に好ましい。
【００６０】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上
記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレス
カミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発
光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さら
に、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−ア
ビジン系を用いることもできる。抗原あるいは抗体の不
溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋
白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられ
る化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガ
ロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖
類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の
合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。サンドイッ
チ法においては不溶化した抗Ｇ蛋白質共役型レセプター
抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗
Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体を反応させ（２次反応）
たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することに
より被検液中のＧ蛋白質共役型レセプター量を定量する
ことができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行って
も、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行な
ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれ
らに準じることができる。また、サンドイッチ法による
免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に
用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測
定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合
物を用いてもよい。
【００６１】本発明のサンドイッチ法によるＧ蛋白質共
役型レセプターの測定法においては、１次反応と２次反
応に用いられる抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はＧ蛋
白質共役型レセプターの結合する部位が相異なる抗体が
好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に
用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、Ｇ蛋白質共役型レセプターのＣ端部を認識する場
合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以
外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター抗体をサンドイッチ法以外
の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法
あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競
合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して
競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と
抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分
離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗
原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体
を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗
体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１
抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体
は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用い
る固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、
被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に
対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、ある
いは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。これら個々の
免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっ
ては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。そ
れぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通
常の技術的配慮を加えてＧ蛋白質共役型レセプターの測
定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳
細については、総説、成書などを参照することができる
〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談
社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノア
ッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石
川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、
昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」
（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods
in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(P
art A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Pa
rt B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Pa
rt C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Pa
rtD:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunoc
hemical Techniques(PartE:Monoclonal Antibodies and
General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Imm
unochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology
and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプ
レス社発行)など参照〕。以上のように、本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター抗体を用いることによって、Ｇ蛋
白質共役型レセプターを感度良く定量することができ
る。
【００６２】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質と
しては、配列番号：３または配列番号：１４で表される
アミノ酸配列を有する蛋白質などの他に、配列番号：３
または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と約９７
〜９９.９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配
列番号：３または配列番号：１４で表されるアミノ酸配
列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質
などが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例え
ばリガンド結合活性、シグナル情報伝達などが挙げられ
る。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的
に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活
性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの
量的要素は異なっていてもよい。より具体的には、本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質としては、配列番
号：３または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を
有するヒト胃由来のＣＲＦ2レセプター蛋白質などが挙
げられる。また、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質としては、配列番号：３または配列番号：１４で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠
失したアミノ酸配列、配列番号：３または配列番号：１
４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ
酸が付加したアミノ酸配列を含有する蛋白質なども挙げ
られる。さらに具体的には、本発明のヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質としては、配列番号：３または配列番号：
１４で表されるアミノ酸配列を有するヒト胃由来のＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質などの他に、配列番号：３または
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１または２
個以上（好ましくは、２個以上３０個以下、より好まし
くは２個以上１０個以下）のアミノ酸が欠失したもの、
配列番号：３または配列番号：１４で表されるアミノ酸
配列に１または２個以上（好ましくは、２個以上３０個
以下、より好ましくは２個以上１０個以下）のアミノ酸
が付加したもの、配列番号：３または配列番号：１４で
表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０
個以下）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものな
どが挙げられる。さらに、本発明のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホル
ミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護
されているもの、GluのＮ末端側が生体内で切断され、
該Gluがピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋
白質なども含まれる。
【００６３】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の
塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が
好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい
は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸）との塩などが用いられる。本発明のヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質またはその塩は、後述するヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形
質転換体を培養することによっても製造することができ
る。また、後述のペプチド合成法に準じて製造すること
もできる。本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部
分ペプチドとしては、例えば、本発明のヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している
部位などが用いられる。具体的には、〔図４〕または
〔図８〕で示される本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性
（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含む
ペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を
一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々
のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数の
ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明
のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩と
しては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま
しい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。
【００６４】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の
部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合
成法に従って、あるいは本発明のヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって
製造することができる。ペプチドの合成法としては、例
えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドも
しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護
基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペ
プチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護
基の脱離としてはたとえば、以下の〜に記載された
方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。
【００６５】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：３また
は配列番号：１４のアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコ
ードする塩基配列を含有するものであればいかなるもの
であってもよい。また、ヒトゲノムＤＮＡ、ヒトゲノム
ＤＮＡライブラリー、ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、
ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮ
Ａのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクター
はバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファー
ジミドなどいずれであってもよい。また、組織・細胞よ
りｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tr
anscription Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-
ＰＣＲ法と略称する。）によって増幅することもでき
る。ＲＴ−ＰＣＲは、より具体的には、ＤＮＡプライマ
ーとしては、配列番号：４または配列番号：１５で表わ
される塩基配列（センス配列またはアンチセンス配列）
を有する合成ＤＮＡなどが用いられる。
【００６６】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分塩基配列を有
する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増
幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを
ヒトヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の一部あるいは全領
域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識
したものとのハイブリダイゼーションによって選別す
る。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecul
ar Cloning ２nd（ed.；J. Sambrook et al., Cold Spr
ing Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従
って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場
合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。クロ
ーン化されたヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限
酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用する
ことができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コ
ドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終
止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の発現ベクタ
ーは、例えば、（イ）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター
蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を
切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中
のプロモーターの下流に連結することにより製造するこ
とができる。
【００６７】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，
ｐＵＣ１１９）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ
１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝
子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターで
あればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、trp プロモーター、la
c プロモーター、recＡプロモーター、λＰＬプロモー
ター、lpp プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ター、penＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイ
トメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターな
どがそれぞれ利用できる。なお、発現にエンハンサーの
利用も効果的である。また、必要に応じて、宿主に合っ
たシグナル配列を、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質のＮ
端末側に付加することもできる。宿主がエシェリヒア属
菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル
配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属
菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブ
チリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、メイテイングファクターα・シグナル配列、インベ
ルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−イン
ターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列
などがそれぞれ利用できる。
【００６８】このようにして構築されたヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造する。宿主としては、たと
えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動
物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌、バチルス
属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Re
search），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journa
l ofMolecular Biology），１２０巻，５１７(１９７
８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン（G
ene），２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ
２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−
１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコの
幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Natur
e），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞として
は、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Vero細胞，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細
胞），ＣＨＯ Ｋ−１細胞，ヒトＦＬ細胞，２９３細
胞，Ｌ細胞，ミエローマ細胞，Ｃ１２７細胞，Ｂａｌｂ
／ｃ３Ｔ３細胞，Ｓｐ−２／０細胞などが用いられる。
【００６９】エシェリヒア属菌を形質転換するには、た
とえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。バチル
ス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ G
eneral Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)など
に記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，
１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノ
ロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記
載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換する
には、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４
５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。以上
の宿主細胞の中でも、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター
蛋白質ＤＮＡを含有する発現プラスミドの宿主細胞とし
ては、特に、動物細胞などが好ましく、例えば２９３細
胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞、ミエローマ細
胞、Ｃ１２７細胞、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｓｐ-２
／Ｏ細胞などが挙げられ、なかでもＣＨＯ細胞または２
９３細胞などが好ましく、特にＣＨＯ細胞〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメント・オブ・メディソン（J. Ex
p. Med.）、１０８巻、９４５（１９５８）〕などが好
適である。さらに、ＣＨＯ細胞のなかでも、ｄｈｆｒ遺
伝子が欠損しているＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略称する場合がある）〔プロシージングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ）、７７巻、４２１６−４２２０（１９８
０）〕、ＣＨＯ Ｋ−１細胞〔プロシージングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ
・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
ＵＳＡ）、６０巻、１２７５（１９６８）〕などが好ま
しい。発現プラスミド中に選択マーカーとしてｄｈｆｒ
遺伝子が挿入されている場合は、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）
細胞などが好適である。発現プラスミドの動物細胞への
導入方法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウ
ム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J. ヴィロロ
ジー(Virology)52, 456-467 (1973)〕、電気穿孔法〔Ne
umann, E. et al. エンボ・ジャーナル(EMBO J.) 1, 84
1-845 (1982)〕等が用いられる。以上のようにしてヒト
ＣＲＦ2レセプター蛋白質ＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。また、ヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質ＤＮＡを含有する発現プラスミド
で形質転換された形質転換体は、ヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質を製造することができる。
【００７０】ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を高発現で
きる細胞は、前述の発現プラスミドが染色体に組込まれ
た細胞をクローン選択によって選択することによって得
ることができる。具体的には、まず、上記の選択マーカ
ーを指標として形質転換体を選択する。さらに、このよ
うに選択マーカーを用いて得られた形質転換体に対し
て、繰り返しクローン選択を行うことによりヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質の高発現能を安定に有する細胞株を
得ることができる。またｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカー
として用いた場合、メソトレキセート（ＭＴＸ）の濃度
を漸次上げて培養して耐性細胞を選択することにより、
導入遺伝子を細胞内で増幅することにより、さらに高発
現の細胞株を得ることもできる。本発明のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質および本発明のヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質を含有する細胞は、本発明のヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質ＤＮＡを含有するベクター（特に、発現プ
ラスミド）を含有する形質転換体を、ヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下
で培養することによっても製造することができる。宿主
細胞がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、
生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５
〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地
としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培
地〔ミラー（Miller)，ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Jour
nal of Experiments in Molecular Genetics),４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York
１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーター
を効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主
細胞がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を
加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養
は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要に
より通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母であ
る形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバ
ークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K.
L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４
５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳ
Ｄ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。宿主細胞が昆虫である
形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Inse
ct Medium〔Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,
788(1962)〕に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を
適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６.
２〜６.４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７
℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培
地としては、たとえば約０.５〜２０％の胎児牛血清を
含むＥＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Jounal of the Amer
ican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding of the Society for the Biological Med
icine），７３巻，１(１９５０)〕，α−ＭＥＭ培地な
どが用いられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およ
びｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いる場合、チミジン
をほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培
地を用いるのが好ましい。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７２時
間行い、必要に応じて培地の交換、通気、撹拌などを加
える。このようにして、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを含有するベクター（特に、発現プ
ラスミド）を保持する形質転換体からヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質を含有する細胞を製造することができる。
【００７１】上記したヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞の培養物からヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質またはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば
下記の方法により行なうことができる。まず、ヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出
するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細
胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾ
チームおよび／または凍結融解などによって菌体あるい
は細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜
用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのた
んぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以
下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が
含まれていてもよい。これらの公知の分離、精製法とし
ては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、
透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の
差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなど
の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグ
ラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速
液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。かくして得られるヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の
方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換するこ
とができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あ
るいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に
変換することができる。なお、組換え体が産生するヒト
ＣＲＦ2レセプター蛋白質を、精製前または精製後に適
当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾
を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもで
きる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キ
モトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ
インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かく
して生成するヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の活性は標
識したＣＲＦなどとの結合実験および特異抗体を用いた
エンザイムイムノアッセイなどにより測定することがで
きる。
【００７２】本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞の細胞膜画分は、上記のヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質を含有する細胞を破砕した後、それ自体公
知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことを
いう。細胞の破砕方法としては、例えば、Potter−Elve
hjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリン
グブレンダーやポリトロン（Kinematica社）による破
砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しな
がら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕な
どが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や
密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主とし
て用いられる。例えば細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ
〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）
遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００
００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈
澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質
などの膜成分が多く含まれる。本発明のヒトＣＲＦ2レ
セプター蛋白質を含有する細胞やその細胞膜画分中のヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3
〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子で
あるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当
たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度
なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、
同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、ヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質の部分ペプチドおよびヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および抗血清の
入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、
同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医
薬品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似した
リガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデ
ザインの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲ
プライマーの作製、遺伝子治療などに用いることがで
きる。特に、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の
発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、温
血動物（特に、ヒト）に特異的なＣＲＦ2レセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするこ
とができ、該アゴニストまたはアンタゴニストをＣＲＦ
に起因する各種疾病の予防・治療剤などとして使用する
ことができる。
【００７３】以下に、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター
蛋白質、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質部分ペプチド、
ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの用
途について、具体的に説明する。 （１）ＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストのスクリーニング方法 ＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング方法においては、ヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質としてヒトの心臓や筋肉を用いることも考えら
れる。しかし、ヒト由来の組織は入手が極めて困難であ
るため、スクリーニングに用いるものとしては適当では
なく、実際には、細胞（特に、ＣＨＯ細胞などの動物細
胞や昆虫細胞）に大量発現させた組換え型ヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質が適している。さらには、ヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質を持続的に安定発現している細胞株
を用いるのが最も好ましい。したがって、本発明のヒト
ＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩、本発明のヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはそ
の塩、または本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞またはその細胞膜画分は、ＣＲＦ2レセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
用試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明
のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩、本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペプチドもし
くはその塩、または本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質を含有する細胞またはその細胞膜画分を用いること
を特徴とするＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアン
タゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【００７４】より具体的には、本発明は、 （Ｉ）（ｉ）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＣＲＦを接触さ
せた場合と（ii）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＣＲＦおよ
び試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを
特徴とするＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法、および （II）（ｉ）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞またはその細胞膜画分に、ＣＲＦを接触さ
せた場合と（ii）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ＣＲＦおよ
び試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを
特徴とするＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法を提供する。 具体的には、本発明のスクリーニング方法（Ｉ）および
（II）においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例
えば該ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、その部分ペプチ
ドもしくはそれらの塩、またはヒトＣＲＦ2レセプター
蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に対する
ＣＲＦの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較す
ることを特徴とするものである。
【００７５】より具体的には、本発明は、 （Ｉａ）（ｉ）標識したＣＲＦを、本発明のヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩に接触させた場合と、（ii）標識したＣＲＦおよび試
験化合物を、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合に
おける、標識したＣＲＦの該レセプター蛋白質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、
比較することを特徴とするヒトＣＲＦ2レセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法 （IIａ）（ｉ）標識したＣＲＦを、本発明のヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合と、（ii）標識したＣＲＦおよび試
験化合物を、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合に
おける、標識したＣＲＦの該細胞またはその細胞膜画分
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするヒ
トＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
のスクリーニング方法、および （IIｂ）（ｉ）ＣＲＦを、本発明のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触
させた場合と、（ii）ＣＲＦおよび試験化合物を、本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞また
はその細胞膜画分に接触させた場合における、ヒトＣＲ
Ｆ2レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、Ｋ+チャ
ンネルの開放、Ｎ型Ｃａ2+チャンネルの閉鎖、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変
動、細胞内ｃＡＭＰ生成の促進または抑制、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活
性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖など
を促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比
較することを特徴とするヒトＣＲＦ2レセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供
する。
【００７６】上記の（Ｉａ）または（IIａ）のスクリー
ニング方法において、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質に
結合して、ＣＲＦとヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物がヒトＣＲＦ2レセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして選択できる。さらに、
上記（IIｂ）のスクリーニング方法において、ヒトＣＲ
Ｆ2レセプターに結合し、該レセプターを介して細胞刺
激活性（例えば、Ｋ+チャンネルの開放、Ｎ型Ｃａ2+チ
ャンネルの閉鎖、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成の促進または抑制、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホル
モン分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する
活性または抑制する活性など）を有する化合物をヒトＣ
ＲＦ2レセプターアゴニストとして選択することができ
る。一方、上記の（Ｉａ）または（IIａ）のスクリーニ
ング方法において、ＣＲＦとヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質との結合を阻害する活性が認められた試験化合物の
中で、該細胞刺激活性を有しない化合物をヒトＣＲＦ2
レセプターアンタゴニストとして選択することができ
る。本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードす
るｃＤＮＡおよびヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有
する細胞が得られる以前は、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質を高発現できる細胞がなかったため、ヒトＣＲＦ2
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率よく
スクリーニングすることができなかった。
【００７７】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。リガンドとして使用するＣＲＦとして
は、市販のものなどを用いることができる。また、ＣＲ
Ｆの代わりに、公知のＣＲＦレセプターアゴニストやア
ンタゴニストなどを使用することもできる。例えば、ソ
イベジンやウロテンシンＩなどを使用することができ
る。標識したＣＲＦとしては、例えば、〔3Ｈ〕、〔125
Ｉ〕、〔14Ｃ〕などで標識したＣＲＦなどを用いること
ができ、さらには、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕など
で標識した公知のＣＲＦアゴニストやアンタゴニストな
どを用いることもできる。例えば、〔125Ｉ〕で標識さ
れたヒツジＣＲＦ（NEN Research Products社、ＮＥＸ
−２１７）やヒトＣＲＦ（NEN Research Products社、
ＮＥＸ−２１６）などが好適である。試験化合物として
は、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動
物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化
合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００７８】具体的には、上記の（Ｉａ）または（II
ａ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有する細胞また
はその細胞膜画分、あるいはヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質またはその部分ペプチドを、スクリーニングに適し
た反応バッファーに懸濁することによりレセプター標品
を調製する。反応バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望
ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス
−塩酸バッファーなどの、ＣＲＦとレセプターとの結合
を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。ま
た、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔ
ｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、
デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加え
ることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプタ
ーやリガンドの分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペ
プチン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（ペプ
チド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。さらに、蛋白質成分とし
て、約０.０１〜５％（好ましくは、０.１〜１％）のＢ
ＳＡ、約０.０１〜５％（好ましくは、０.０５〜０.５
％）のゼラチンなどを加えることもできる。従来、ＣＲ
Ｆは４１個のアミノ酸からなる比較的分子量の大きいペ
プチドであるため、リガンド結合実験の際の反応容器や
ピペットなどに吸着しやすく、正確で感度の高い測定は
容易ではなかった。そこで、本発明の上記（Ｉａ）およ
び（IIａ）のスクリーニング方法において、ＣＲＦの特
異的結合量を測定するための反応条件としては、本発明
のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ド、あるいは本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
含有する細胞またはその細胞膜画分にＣＲＦを接触させ
る際の反応バッファーの組成、反応時間、反応温度など
をそれぞれ適切に設定することが望ましい。
【００７９】反応バッファーの組成中に非特異的結合を
低減させる目的で、界面活性剤や蛋白質を添加すること
が効果的で、特に界面活性剤としては、例えば約０.０
１〜０.０５％のＣＨＡＰＳ、約０.０５％のジギトニン
を添加することが望ましい。また、蛋白質成分として
は、例えば、約０.２％のＢＳＡまたは約０.３％のゼラ
チンを添加することが望ましい。また、反応温度と反応
時間としては、それぞれ約２５℃、約２時間であること
が望ましい。一方、上記スクリーニング方法にヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を用いる場
合、培養器に付着させたまま、つまりＣＨＯ細胞を生育
させた状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラホル
ムアルデヒドで固定化した細胞を用いて、ＣＲＦとＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質を結合させることができる。この
場合、該反応バッファーとしては、例えば培地やハンク
ス液などが用いられる。そして、０.０１ｍｌ〜１０ｍ
ｌの該レセプター溶液に、一定量（例えば、２２００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００００
００ｃｐｍ）の標識したＣＲＦ（例えば、〔125Ｉ〕Ｃ
ＲＦ）を添加し、同時に１０-4Ｍ〜１０-10Ｍの試験化
合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るた
めに大過剰の未標識のＣＲＦを加えた反応チューブも用
意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３
７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時
間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の
洗浄用バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存
する放射活性（例えば、〔125Ｉ〕の量）を液体シンチ
レーションカウンターまたはγ−カウンターで測定す
る。濾過には、マニホールドやセルハーベスターを用い
ることができるが、セルハーベスターを用いることが大
量の試験化合物を処理するためには望ましい。拮抗する
物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量
（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００
％とした時、試験化合物を入れた時の特異的結合量（Ｂ
−ＮＳＢ）が、例えばカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）の５０
％以下になる試験化合物をアゴニストまたはアンタゴニ
スト候補化合物として選択することができる。
【００８０】また、上記（IIｂ）のスクリーニング方法
を実施するためには、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低
下、ホルモンの放出、細胞の遊走活性などを促進する活
性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の
測定用キットを用いて測定することができる。具体的に
は、まず、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有するＣ
ＨＯ細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリ
ーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある
いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、
試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした
後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産
物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の
指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰやアラキドン酸な
ど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困
難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッ
セイを行なってもよい。
【００８１】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細
胞またはその細胞膜画分、あるいは本発明のヒトＣＲＦ
2レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を
含有するものである。本発明のスクリーニング用キット
の例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質標品 ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識ＣＲＦ 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したＣＲＦ 溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて５ｎＭに希釈する。 ＣＲＦ標準液 ＣＲＦを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃
で保存する。
【００８２】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養したヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を、測定用緩衝
液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液
を各穴に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、５ｎＭ標識ＣＲＦを５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の
かわりに１０-4ＭのＣＲＦを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識ＣＲＦを０.５ｍｌの０.２Ｎ
ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレ
ーターＡ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数２〕で求める。なお、
〔125Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレータ
ーと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定
できる。
【００８３】
【数２】
【００８４】ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られる化合物またはその塩は、ＣＲＦと
本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害
する化合物であり、具体的には、ヒトＣＲＦ2レセプタ
ーを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩
（いわゆる、ヒトＣＲＦ2レセプターアゴニスト）、あ
るいは該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩
（いわゆる、ヒトＣＲＦ2レセプターアンタゴニスト）
である。
【００８５】ヒトＣＲＦ2レセプターアゴニストは、Ｃ
ＲＦが有する生理活性の全部または一部を有しているの
で、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物とし
て有用である。例えば、痴呆症、肥満症の予防・治療剤
として有用である他、例えば、ストレスに対する適応促
進剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフィン，β−リポトロピ
ンもしくはα−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気分
や行動の調節剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調節
剤、下垂体，心血管系，消化管もしくは中枢神経の機能
検査薬などとして有用である。一方、ヒトＣＲＦ2レセ
プターアンタゴニストは、ＣＲＦが有する生理活性の全
部または一部を抑制することができるので、該生理活性
を抑制する安全で低毒性な医薬組成物として有用であ
る。例えば、ストレスからくる鬱病・不安・頭痛、炎症
性疾患、免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸
障害、食欲不振、出血性ストレス、薬物・アルコール等
の禁断症状、薬物依存症、生殖障害、クッシング病、低
血圧症の予防・治療剤などとして有用である。さらに、
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られた該ヒトＣＲＦ2レセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニストの構造式を化学修飾あるいは
置換したもの、また、該化合物の構造式を基にデザイン
化した化合物なども、本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られたヒトＣＲＦ
2レセプターアゴニストまたはアンタゴニストに含まれ
る。該ヒトＣＲＦ2レセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストの塩としては、とりわけ生理学的に許容される
酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば無
機塩（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００８６】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って低毒性で安全に使用することができ
る。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその
塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒ
クル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認め
られた製薬実施に要求される単位用量形態で混和するこ
とによって製造することができる。これら製剤における
有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ
うにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和する
ことができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーン
スターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、
結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼ
ラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸
マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッ
カリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油また
はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位
形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさ
らに油脂のような液状担体を含有することができる。注
射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の
活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油
などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にし
たがって処方することができる。
【００８７】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム
など）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばア
ルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（た
とえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補
助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど
と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩
衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩
化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤
（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェ
ノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整
された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。こ
のようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、
例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒ
ト）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
である。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異
なるが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。
【００８８】（２）ＣＲＦ2レセプター蛋白質欠乏症の
予防・治療剤 本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコードするＤ
ＮＡは、ＣＲＦ2レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療
剤として使用することができる。例えば、生体内におい
て本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質が減少してい
るためにＣＲＦの生理作用が期待できない患者がいる場
合に、（イ）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを該患者に投与し、生体内で該ヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質を発現させることによって、あ
るいは（ロ）細胞に本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを挿入し、該ヒトＣＲＦ2レセ
プター蛋白質を発現させた後に、該細胞を該患者に移植
することなどによって、該患者のヒトＣＲＦ2レセプタ
ー蛋白質の量を増加させ、ＣＲＦの作用を充分に発揮さ
せることができる。したがって、本発明のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性
なＣＲＦ2レセプター蛋白質欠乏症（例えば、高血圧、
自律神経失調症またはストレスなど）の予防・治療剤な
どとして用いることができる。本発明のＤＮＡを上記の
予防・治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あ
るいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って
実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施
した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
本発明のＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量
が得られるようにするものである。
【００８９】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。注射用の水性液としては生
理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例
えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナト
リウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たと
えばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコー
ル（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特
にヒト）に対して投与することができる。該ＤＮＡの投
与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１.０〜
５０ｍｇ、より好ましくは約１.０〜２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる
が、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０.１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０.１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。また、本発明のＤ
ＮＡを細胞に挿入し、該ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質
を発現させ、該細胞を患者に移植する方法は、それ自体
公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いることがで
きる。
【００９０】（３）ＣＲＦの定量法 本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩は、ＣＲ
Ｆに対して結合性を有しているので、生体内におけるＣ
ＲＦ濃度を感度良く定量する際の試薬として用いること
ができる。すなわち、本発明は、本発明のヒトＣＲＦ2
レセプター蛋白質もしくはその塩、または本発明の部分
ペプチドまたはその塩と、被検体とを接触させることを
特徴とする被検体中のＣＲＦ濃度の定量法を提供する。
本発明の定量法は、例えば競合法と組み合わせることに
よって用いることができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行） さらに、本発明のＣＲＦの定量法は、ＣＲＦ濃度の増減
に起因する疾病（例えば、ストレス、炎症、アルツハイ
マー病、胃腸障害など）の診断方法としても使用でき
る。
【００９１】（４）本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質もしくはその塩または本発明のヒトＣＲＦ2レセプ
ター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体
または抗血清の製造 本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペ
プチドもしくはその塩に対する抗体（例えば、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本
発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペプ
チドもしくはその塩を抗原として用い、自体公知の抗体
または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製
造することができる。
【００９２】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の部分ペ
プチドもしくはその塩（以下、ヒトＣＲＦ2レセプター
と略称する場合がある）は、温血動物に対して投与によ
り抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈
剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高め
るため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイン
トアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週
毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる
温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モル
モット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあ
げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられ
る。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗
原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の
認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓ま
たはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血
清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ヒトＣＲＦ
2レセプターと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合
操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの
方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い
実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、
好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはた
とえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１など
があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用い
られる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との
好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ
（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０
〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好まし
くは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートするこ
とにより効率よく細胞融合を実施できる。抗ヒトＣＲＦ
2レセプター抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
には種々の方法が使用できるが、たとえばヒトＣＲＦ2
レセプター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた
固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上
清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免
疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウス
の場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）ま
たはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ヒトＣＲＦ
2レセプターモノクローナル抗体を検出する方法、抗免
疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相
にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素
などで標識したヒトＣＲＦ2レセプターを加え、固相に
結合した抗ヒトＣＲＦ2レセプターモノクローナル抗体
を検出する方法などがあげられる。抗ヒトＣＲＦ2レセ
プターモノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別および育種
用培地としては、ハイビリドーマが生育できるものなら
ばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０
％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩ
Ｔ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ
培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））
などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４
０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５
日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養
は、通常５％炭酸ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ
培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ヒトＣＲＦ2
レセプター抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００９３】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗ヒトＣＲＦ2レセプターモノクローナル抗体の分離精
製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫
グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、Ｄ
ＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原
結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧな
どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離さ
せて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以上
の（１）および（２）の方法に従って製造させる本発明
のヒトＣＲＦ2レセプター抗体は、ヒトＣＲＦ2レセプタ
ーを特異的に認識することができるので、被検液中のヒ
トＣＲＦ2レセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測
定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のヒトＣＲＦ2レ
セプターに反応する抗体と、被検液および標識化ヒトＣ
ＲＦ2レセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合
した標識化ヒトＣＲＦ2レセプターの割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中のヒトＣＲＦ2レセプターの定
量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および標
識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中のヒトＣＲＦ2レセプターの定量法にお
いて、一方の抗体がヒトＣＲＦ2レセプターのＮ端部を
認識する抗体で、他方の抗体がヒトＣＲＦ2レセプター
のＣ端部に反応する抗体であることを特徴とする被検液
中のヒトＣＲＦ2レセプターの定量法を提供する。本発
明のヒトＣＲＦ2レセプターを認識するモノクローナル
抗体（以下、抗ヒトＣＲＦ2レセプター抗体と称する場
合がある）を用いてヒトＣＲＦ2レセプターの測定を行
なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともでき
る。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよ
く、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいは
Ｆａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定
法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中
の抗原量（例えばヒトＣＲＦ2レセプター量）に対応し
た抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的ま
たは物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含
む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法
であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネ
フロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサン
ドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点
で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし
い。
【００９４】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上
記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレス
カミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発
光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さら
に、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−ア
ビジン系を用いることもできる。抗原あるいは抗体の不
溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋
白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられ
る化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガ
ロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖
類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の
合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。サンドイッ
チ法においては不溶化した抗ヒトＣＲＦ2レセプター抗
体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗ヒ
トＣＲＦ2レセプター抗体を反応させ（２次反応）たの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより
被検液中のヒトＣＲＦ2レセプター量を定量することが
できる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。
【００９５】本発明のサンドイッチ法によるヒトＣＲＦ
2レセプターの測定法においては、１次反応と２次反応
に用いられる抗ヒトＣＲＦ2レセプター抗体はヒトＣＲ
Ｆ2レセプターの結合する部位が相異なる抗体が好まし
く用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いら
れる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ヒ
トＣＲＦ2レセプターのＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。本発明のヒトＣＲ
Ｆ2レセプター抗体をサンドイッチ法以外の測定システ
ム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフ
ロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被
検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応
させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合し
た標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆい
ずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量す
る。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／
Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第
２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固
相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のも
のを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法と
が用いられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗
原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反
応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液
中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相
化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたの
ち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識
量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロ
メトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の
結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の
抗原量僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合に
もレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな
どが好適に用いられる。
【００９６】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてヒト
ＣＲＦ2レセプターの測定系を構築すればよい。これら
の一般的な技術手段の詳細については、総説、成書など
を参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオ
イムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江
寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、
昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」
（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら
編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２
年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunoc
hemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunoc
hemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunoc
hemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunoc
hemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明のヒトＣＲＦ2レセプター抗体を
用いることによって、ヒトＣＲＦ2レセプターを感度良
く定量することができる。
【００９７】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基
【００９８】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合成
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに使用した合
成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質の全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５〕本発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋
白質の全長をコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。 後述の実施例４で得られた形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈｓ−ＡＨ１
は、平成７年６月１５日から通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１３６として寄託されており、また平成７年６
月１２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ
１５８２７として寄託されている。また、後述の実施例
６で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escheric
hia coli) ＪＭ１０９／ｐＣＲＦ２−１０は、平成７年
９月５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２６
として寄託されており、また平成７年８月２９日から財
団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５８６８とし
て寄託されている。
【００９９】
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。
【実施例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒトカルシトニンレセプター（Ｘ８２４６６）、
ヒトパラチロイドホルモンレセプター（Ｘ６８５９
６）、ヒトグルカゴンレセプター（Ｕ０３４６９）、ヒ
トグルカゴン−ライクポリペプチド−１レセプター（Ｕ
０１１５６）、ラットセクレチンレセプター（Ｘ５９１
３２）、ヒトグロースホルモン放出ホルモンレセプター
（Ｌ０１４０６）、ヒトピチュイタリーアデニレートサ
イクレース−アクティベートポリペプチドレセプター
（Ｄ１７５１６）、ラットピチュイタリーアデニレート
サイクレース−アクティベートポリペプチドレセプター
（Ｚ２３２７９）、ヒトバソアクティブインテスティナ
ルペプチドレセプター（Ｘ７５２９９）、ヒトビップ２
レセプター（Ｌ３６５６６）、ヒトコルチコトロピン放
出ファクターレセプター（Ｌ２３３３２）、およびラッ
トコルチコトロピン放出ファクター２レセプター（Ｕ１
６２５３）の第３および第７膜貫通領域付近のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ比較
し、それぞれの領域で類似性の高い部分を見いだした
〔図１および図２〕。上記の（ ）内の略語はDNASIS G
ene/Proteinシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、
日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いてGenBank/
EMBL Data Bankを検索した際に示される整理番号であ
り、通常Accession numberと呼ばれるものである。特
に、多くのレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一
致する塩基部分を基準とし、その他の部分においてもな
るべく多くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高め
るために混合塩基の導入を計画した。この配列をもと
に、共通する塩基配列に相補的である配列番号：１また
は配列番号：２で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮ
Ａ２本を作製した。 ５'−ＣＡＴＴＡＹＴＫＧＡＴＳＧＹＧＲＣＣＡＡＣＴ
ＷＣＷＮＣＴＧＧ−３' 〔ＹはＴまたはＣを示し、ＫはＧまたはＴを示し、Ｓは
ＣまたはＧを示し、ＲはＡまたはＧを示し、ＷはＡまた
はＴを示し、ＮはＩを示す。〕（配列番号：１） ５'−ＧＴＡＧＡＲＲＡＹＡＧＣＣＡＣＭＡＭＲＡＲＮ
ＣＣＣＴＧＲＡＡ−３' 〔ＲはＡまたはＧを示し、ＹはＴまたはＣを示し、Ｍは
ＡまたはＣを示し、ＮはＩを示す。〕（配列番号：２） Ｙ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、ＷおよびＭは、合成時に複数の塩基に
混合して合成する。
【０１００】
【実施例２】ヒト胃由来poly(Ａ)+ＲＮＡ画分からのｃ
ＤＮＡの合成 ヒト胃poly(Ａ)+ＲＮＡ画分（クロンテック社、カタロ
グ番号6548-1）５μｇにプライマーとしてランダムＤＮ
Ａヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白血
病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッ
ファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物は
エタノール沈殿を行なった後、３０μｌのＴＥに溶解し
た。
【０１０１】
【実施例３】ヒト胃由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によ
る受容体ｃＤＮＡの増幅 実施例２でヒト胃より調製したｃＤＮＡ １μｌを鋳型
として使用し、実施例１で合成したＤＮＡプライマーを
用いてＰＣＲによる増幅を行なった。反応液の組成は、
合成ＤＮＡプライマー（配列：５'プライマー配列およ
び３'プライマー配列）各１００ｐＭ、０.２５mM ｄＮ
ＴＰｓ（Deoxyribonucleoside triphosphate)、Ｔａｑ
ＤＮＡ polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッフ
ァー１０μｌで、総反応溶液量は１００μｌとした。増
幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・
エルマー社）を用い、９６℃・３０秒、４５℃・１分、
６０℃・３分のサイクルを２５回繰り返した。増幅産物
の確認は１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジ
ウムブロミド染色によって行なった。
【０１０２】
【実施例４】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
によるヒトＣＲＦ2レセプター候補クローンの選択 実施例３で行なったＰＣＲ後の反応産物は１.５％のア
ガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリ
で切り出した後、エレクトロエリューション、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。Ｔ
Ａクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従
い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲTMIIへ
サブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９ compe
tent cell（宝酒造株式会社）に導入して形質転換した
のち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ン、ＩＰＴＧ(isopropylthio-β-D-galactoside)および
Ｘ−ｇａｌ(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto
side)を含むＬＢ寒天培地中で選択し、白色を呈するク
ローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離し、形質転換
体を１００クローン得た。個々のクローンをアンピシリ
ンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装
置ＰＩ−１００（クラボウ）を用いてプラスミドＤＮＡ
を調製した。調製したＤＮＡの一部を用いてＥｃｏＲＩ
による切断を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の大き
さを確認した。残りのＤＮＡの一部をさらにＲＮａｓｅ
処理、フェノール・クロロフォルム抽出し、エタノール
沈殿によって濃縮した。塩基配列の決定のための反応は
DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ
社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解
読した。得られた塩基配列を基に、ＤＮＡＳＩＳ（日立
システムエンジニアリング社）を用いてホモロジー検索
を行なった結果、形質転換体エシェリヒア コリ（Esch
erichiacoli) ＪＭ１０９／ｐｈｓ−ＡＨ１の保有する
プラスミドに挿入されたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードすることが分かった。該
ｃＤＮＡ断片の塩基配列を〔図３〕に示した。さらに確
認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニア
リング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した
後〔図３〕、疎水性プロット〔図４〕を行なった結果、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質であることを示す疎水
性ドメインが存在することが確認された。また、アミノ
酸配列に基づくホモロジー検索を行なった結果、ラット
ＣＲＦ２レセプター蛋白質（Ｕ１６２３５）と９６.６
％、マウスＣＲＦ2（ＣＲＦ−ＲＢ）レセプター蛋白質
（Ｕ１７８５８）と９３.９％、ヒトＣＲＦレセプター
蛋白質（Ｌ２３３３２）とは８４.５％のホモロジーを
有していた。これは、本発明のｃＤＮＡ断片が、これま
で報告されていないヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質をコ
ードしていることを示すものである。上記の（ ）内の
略語はGenBankにデータとして登録される際の整理番号
であり、通常Accession numberと呼ばれるものである。
【０１０３】
【実施例５】ＰＣＲ法によるヒトＣＲＦ2レセプターｃ
ＤＮＡの５'側および３'側配列の増幅 ヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡ画分（クロンテック社、カタロ
グ番号６５４８−１）を材料にしてヒトＣＲＦ2レセプ
ターｃＤＮＡの５'側および３'側配列を増幅させるＰＣ
Ｒを行った。はじめに Marathon cDNA amplification
キット（クロンテック社、カタログ番号 K1802-1）を用
いて、実施例４で取得したヒトＣＲＦ2レセプターｃＤ
ＮＡ断片の５'側配列を持つｃＤＮＡを増幅させるため
のＰＣＲを行った。プライマーとして実施例４で取得し
たヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片の配列（配列番
号：４）に相補的である配列番号：５または配列番号：
６で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作製し
た。 Ｎ０ ５'−ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＣＡ−３’ （配列番号：５） Ｎ１ ５’−ＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＧＣ−３’ （配列番号：６） 次にヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡ画分 １μｇを用いて Mara
thon cDNA amplification キットの方法に従って、鋳型
に用いるための二本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いてこれ
を材料にして１回目のＰＣＲを行った。反応液の組成
は、二本鎖ｃＤＮＡ ５μｌ、合成ＤＮＡプライマー
（Ｎ０およびキットに付属しているＡＰ１）各２００ｎ
Ｍ、２００μＭ ｄＮＴＰ、ExTaq ＤＮＡ polymerase
（宝酒造）０.５μｌ、および１０×ExTaq用反応バッフ
ァー ５μｌで、総反応液量は水を加えて５０μｌとし
た。増幅のための反応はサーマルサイクラー（パーキン
・エルマー社）を用い、９４℃・３０秒、６０℃・３０
秒、６８℃・３分のサイクルを３０回繰り返した。次に
該反応液０.１μｌを鋳型にして２回目のＰＣＲを行っ
た。反応液の組成は、合成プライマー（Ｎ１およびキッ
トに付属しているＡＰ２）各２００ｎＭ、２００μＭ
ｄＮＴＰ、ExTaq ＤＮＡ polymerase ０.５μｌ、１０
×ExTaq用反応バッファー ５μｌで、総反応液量は水を
加えて５０μｌとした。反応条件は９４℃・３０秒、６
８℃・３分を２５回繰り返した。増幅産物の確認は１.
２％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミド
染色によって行った。特異的に増幅されてきた約３５０
ｂｐの長さのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで
ゲルから回収した。これを実施例４に記載の方法でプラ
スミドベクターｐＣＲIIへクローニング後、塩基配列を
決定した。その結果、回収したＤＮＡ断片は、ヒトＣＲ
Ｆ2レセプターｃＤＮＡ断片のプライマーＮ１の位置か
ら５'側に向かって約３５０ｂｐを含んでいることが判
明した。以上の操作で得られたヒトＣＲＦ2レセプター
ｃＤＮＡの塩基配列の情報を基に、さらに５'および３'
側のＤＮＡ断片の増幅を行った。５'側ＤＮＡ断片の増
幅用には５'-AmpliFINDER RACE Kit（クローンテック
社、カタログ番号 Ｋ１８００−１）を用いて以下のよ
うに行った。５’側を増幅させるためのプライマーとし
て新たに配列番号：７または配列番号：８で表される塩
基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作製した。 Ｎ１１ ５'−ＡＴＧＡＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡ ＣＣ−３’ （配列番号：７） Ｎ１２ ５'−ＧＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＴ ＣＴ−３’ （配列番号：８） 次にヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡ画分 ２μｇを用いて５'-A
mpliFINDER RACE Kitの方法に従ってｃＤＮＡ合成およ
びＰＣＲを行った。ｃＤＮＡ合成の際のプライマーとし
てＮ１１を用いた。また１回目のＰＣＲには、プライマ
ーとしてＮ１２およびキットに付属しているアンカープ
ライマーを使用し、２回目のＰＣＲには先に合成したＮ
０およびアンカープライマーを使用した。ＰＣＲ反応の
組成は、合成プライマー各２００ｎＭ、２００μＭ ｄ
ＮＴＰ、ExTaq ＤＮＡ polymerase０.５μｌ、１０×Ex
Taq用反応バッファー ５μｌで、総反応液量は水を加え
て５０μｌとした。１回目のＰＣＲは、９４℃・４５
秒、５５℃・４５秒、６８℃・３分を３０回繰り返し
た。また２回目のＰＣＲは、９４℃・４５秒、６０℃・
４５秒、６８℃・３分を２５回繰り返した。増幅産物を
１.５％アガロースゲル電気泳動で確認した結果、約７
００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されていたので、該ＤＮＡ
断片をエレクトロエリューションでゲルから回収し、実
施例４に記載の方法でプラスミドベクターｐＣＲIIへク
ローニングし、塩基配列を決定した。その結果、回収し
たＤＮＡ断片は、ヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片
のプライマーＮ０の位置から、５'側方向約７００ｂｐ
を含んでいることが判明した。３'側ＤＮＡ断片の増幅
用には３' RACE System（GIBCO BRL：カタログ番号 837
3SA）を用いて以下のように行った。３'側を増幅させる
ためのプライマーとして新たに配列番号：９、配列番
号：１０、または配列番号：１１で表される塩基配列を
有する合成ＤＮＡ３本を作製した。 Ｃ１ ５'−ＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴ−３’ （配列番号：９） Ｃ１１ ５'−ＡＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＴ
ＧＧ−３’ （配列番号：１０） Ｃ１２ ５’−ＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧ ＣＧ−３’ （配列番号：１１） 次にヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡ画分 １μｇを用いて３' R
ACE Systemの方法に従ってｃＤＮＡを合成した後、１回
目のＰＣＲをＣ１１およびキットに付属のアンカープラ
イマーを用いて行った。反応液の組成および反応条件
は、前述の５'側ＤＮＡ断片の増幅と同様の方法で行っ
た。次に２回目のＰＣＲをプライマーにＣ１２およびア
ンカープライマーを用いて同様に行い、３回目のＰＣＲ
をプライマーにＣ１およびアンカープライマーを用いて
同様に行った。増幅産物を１.５％アガロースゲル電気
泳動で確認した結果、約１２００ｂｐのＤＮＡ断片が増
幅されていたので、該ＤＮＡ断片を上記の方法で塩基配
列を解析した。その結果、回収したＤＮＡ断片は、ヒト
ＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片のプライマーＣ１の位
置から３'方向約１２００ｂｐを含んでいることが判明
した。以上の操作で配列番号：１５で表されるヒトＣＲ
Ｆ2レセプターｃＤＮＡの全コード領域を取得した。こ
れにより、ヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡの全コード
領域の塩基配列が判明し、配列番号：１４で表されるヒ
トＣＲＦ2レセプター蛋白質の全アミノ酸配列がはじめ
て明らかになった〔図６および図７〕。
【０１０４】
【実施例６】ＰＣＲ法によるヒトＣＲＦ2レセプターｃ
ＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の増幅 実施例２で調製したヒト胃ｃＤＮＡを鋳型としてヒトＣ
ＲＦ2レセプター蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ断
片の増幅を行った。まず、実施例５で判明したヒトＣＲ
Ｆ2レセプターｃＤＮＡの配列を基に、配列番号：１２
または配列番号：１３で表される塩基配列を有する合成
ＤＮＡ２本を作製した。 Ｃ２−Ｆ ５'−ＧＴＣＧＡＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＧＣＧＡＴＧ ＧＡ−３’ （配列番号：１２） Ｃ２−Ｒ ５'−ＧＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧ ＧＧＴＣＡ−３’ （配列番号：１３） Ｃ２−Ｆは、ヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡのスター
トコドンを含む−１８〜＋５（スタートコドンＡＴＧの
Ａを＋１とする）に対応するセンス配列で、Ｃ２−Ｒ
は、ヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡのストップコドン
を含む＋１２５８〜＋１２８３に対応するアンチセンス
配列である。また、両方のプライマーには５'末端に制
限酵素部位（ＳａｌＩ）を付加した。ＰＣＲ反応液の組
成は、ヒト胃ｃＤＮＡ １μｌ、合成ＤＮＡプライマー
（Ｃ２−ＦおよびＣ２−Ｒ）各２００ｎＭ、２００μＭ
ｄＮＴＰ、ExTaq ＤＮＡ polymerase ０.５μｌ、およ
び１０×ExTaq用反応バッファー ５μｌで、総反応液量
は水を加えて５０μｌとした。反応条件は、９５℃・３
０秒、７０℃・４分を３５回繰り返した。反応液を１％
アガロースゲル電気泳動で確認した結果、目的とする大
きさ（約１.３ｋｂ）のＤＮＡ断片が特異的に増幅され
ていた。該ＤＮＡ断片をエレクトロエリューションでゲ
ルから回収し、前記の方法でプラスミドベクターｐＣＲ
IIへクローニング後、自動塩基配列解析装置３７０Ａ
（アプライドバイオシステム社）で挿入ＤＮＡ断片の塩
基配列を解析した。その結果、該ＤＮＡ断片は、実施例
５で判明したヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡの全コー
ド領域を含有するＤＮＡ断片であることが確認された。
ここで得られた複数のクローンの中でｐＣＲＦ２−１０
を以後の実験に使用することとした。ｐＣＲＦ２−１０
はヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡの全コード領域が制
限酵素ＳａｌＩまたはＥｃｏＲＩで切り出すことができ
るため、ヒトＣＲＦ2レセプター発現プラスミドの構
築、ＤＮＡプローブの調製等に好適である。
【０１０５】
【発明の効果】本発明の配列番号：１または配列番号：
２で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有す
ることを特徴とするＤＮＡを用いることによって、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを効率
よく増幅することができる。これによって、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを効率よくス
クリーニングし、クローニングを行うことができる。本
発明のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質は、公知のヒトＣ
ＲＦレセプター蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ
酸配列を有する新規な蛋白質である。本発明のヒトＣＲ
Ｆ2レセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよび該ＤＮ
ＡにコードされるヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質、その
部分ペプチドまたはヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を含
有する細胞もしくはその細胞膜画分は、ヒトＣＲＦ2レ
セプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率よくス
クリーニングすることができる。上記のスクリーニング
方法によれば、アゴニストまたはアンタゴニストを有利
に選択することができるので、医薬品を早期に開発する
ことができる。アゴニストは、例えば痴呆症、肥満症の
予防・治療剤、ストレスに対する適応促進剤、ＡＣＴ
Ｈ，β−エンドルフィン，β−リポトロピンもしくはα
−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気分や行動の調節
剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調節剤、さらには
下垂体，心血管系，消化管もしくは中枢神経の機能検査
薬などとして有用である。一方、アンタゴニストは、例
えば、ストレスからくる鬱病・不安・頭痛、炎症性疾
患、免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸障
害、食欲不振、出血性ストレス、さらには薬物・アルコ
ールの禁断症状、薬物依存症、生殖障害、クッシング病
または低血圧症の予防・治療剤などとして有用である。
【０１０６】
【配列表】
【配列番号：１】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 CATTAYTKGA TSGYGRCCAA CTWCWNCTGG 30
【０１０７】
【配列番号：２】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 GTAGARRAYA GCCACMAMRA RNCCCTGRAA 30
【０１０８】
【配列番号：３】 配列の長さ：１４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr 1 5 10 15 Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys Cys Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys 20 25 30 Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr 35 40 45 Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Pro Gly Asp Leu Val Asp 50 55 60 Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser 85 90 95 Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu 100 105 110 Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn 115 120 125 Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser Gln Ile Met Phe Ile Tyr Phe Asn Ser 130 135 140 Phe Leu Gln Ser 145
【０１０９】
【配列番号：４】 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGTTTGTGG AAGGCTGCTA CCTGCACACG GCCATTGTCA TGACCTACTC CACTGAGCGC 60 CTGCGCAAGT GCCTCTTCCT CTTCATCGGA TGGTGCATCC CCTTCCCCAT CATCGTCGCC 120 TGGGCCATCG GCAAGCTCTA CTATGAGAAT GAACAGTGCT GGTTTGGCAA GGAGCCTGGC 180 GACCTGGTGG ACTACATCTA CCAAGGCCCC ATCATTCTCG TGCTCCTGAT CAATTTCGTA 240 TTTCTGTTCA ACATCGTCAG GATCCTAATG ACAAAGTTAC GCGCGTCCAC CACATCCGAG 300 ACAATCCAGT ACAGGAAGGC AGTGAAGGCC ACCCTGGTGC TCCTGCCCCT CCTGGGCATC 360 ACCTACATGC TCTTCTTCGT CAATCCCGGG GAGGACGACC TGTCACAGAT CATGTTCATC 420 TATTTCAACT CCTTCCTGCA GTCG 444
【０１１０】
【配列番号：５】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡ ＡＧＡＧＧＣＡＣＴＴ ＧＣＧ
ＣＡ ２５
【０１１１】
【配列番号：６】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡ ＧＧＴＣＡＴＧＡＣＡ ＡＴＧ
ＧＣ ２５
【０１１２】
【配列番号：７】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGATGGGGC CTTGGTAGAT GTAGTCCACC 30
【０１１３】
【配列番号：８】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＣＣＴＴＧＣＣ ＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣ ＴＧＴ
ＴＣＡＴＴＣＴ ３０
【０１１４】
【配列番号：９】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣ ＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴ ＣＡＴ
ＧＴ ２５
【０１１５】
【配列番号：１０】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTCGCTGTC TGCGGAATGT GATTCACTGG 30
【０１１６】
【配列番号：１１】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣ ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴ ＴＴＡ
ＴＣＣＴＧＣＧ ３０
【０１１７】
【配列番号：１２】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＣＧＡＣＡＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡ ＣＧＣ
ＧＡＴＧＧＡ ２９
【０１１８】
【配列番号：１３】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCGACTGTG CAGGTGGGCG ACCGAGGGGT CA 32
【０１１９】
【配列番号：１４】 配列の長さ：４１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Asp Ala Ala Leu Leu His Ser Leu Leu Glu Ala Asn Cys Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Glu Glu Leu Leu Leu Asp Gly Trp Gly Pro Pro Leu Asp 20 25 30 Pro Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly 35 40 45 Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys 50 55 60 Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser 85 90 95 Gln Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp Leu His 100 105 110 Tyr Arg Ile Ala Leu Val Val Asn Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Val 115 120 125 Ala Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg Ser Ile 130 135 140 Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile 145 150 155 160 Leu Arg Asn Val Met Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His Glu Val 165 170 175 His Glu Ser Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile Phe Asn 180 185 190 Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr 195 200 205 Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys 210 215 220 Cys Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val 225 230 235 240 Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe 245 250 255 Gly Lys Glu Pro Gly Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile 260 265 270 Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg 275 280 285 Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln 290 295 300 Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly 305 310 315 320 Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser 325 330 335 Gln Ile Met Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly 340 345 350 Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser 355 360 365 Ala Val Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Leu Arg 370 375 380 Val Pro Met Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile 385 390 395 400 Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val 405 410
【０１２０】
【配列番号：１５】 配列の長さ：１２７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACGCGGCTGC GGGACGCGAT GGACGCGGCA CTGCTCCACA GCCTGCTGGA GGCCAACTGC 60 AGCCTGGCGC TGGCTGAAGA GCTGCTCTTG GACGGCTGGG GGCCACCCCT GGACCCCGAG 120 GGTCCCTACT CCTACTGCAA CACGACCTTG GACCAGATCG GAACGTGCTG GCCCCGCAGC 180 GCTGCCGGAG CCCTCGTGGA GAGGCCGTGC CCCGAGTACT TCAACGGCGT CAAGTACAAC 240 ACGACCCGGA ATGCCTATCG AGAATGCTTG GAGAATGGGA CGTGGGCCTC AAAGATCAAC 300 TACTCACAGT GTGAGCCCAT TTTGGATGAC AAGCAGAGGA AGTATGACCT GCACTACCGC 360 ATCGCCCTTG TCGTCAACTA CCTGGGCCAC TGCGTATCTG TGGCAGCCCT GGTGGCCGCC 420 TTCCTGCTTT TCCTGGCCCT GCGGAGCATT CGCTGTCTGC GGAATGTGAT TCACTGGAAC 480 CTCATCACCA CCTTTATCCT GCGAAATGTC ATGTGGTTCC TGCTGCAGCT CGTTGACCAT 540 GAAGTGCACG AGAGCAATGA GGTCTGGTGC CGCTGCATCA CCACCATCTT CAACTACTTC 600 GTGGTGACCA ACTTCTTCTG GATGTTTGTG GAAGGCTGCT ACCTGCACAC GGCCATTGTC 660 ATGACCTACT CCACTGAGCG CCTGCGCAAG TGCCTCTTCC TCTTCATCGG ATGGTGCATC 720 CCCTTCCCCA TCATCGTCGC CTGGGCCATC GGCAAGCTCT ACTATGAGAA TGAACAGTGC 780 TGGTTTGGCA AGGAGCCTGG CGACCTGGTG GACTACATCT ACCAAGGCCC CATCATTCTC 840 GTGCTCCTGA TCAATTTCGT ATTTCTGTTC AACATCGTCA GGATCCTAAT GACAAAGTTA 900 CGCGCGTCCA CCACATCCGA GACAATCCAG TACAGGAAGG CAGTGAAGGC CACCCTGGTG 960 CTCCTGCCCC TCCTGGGCAT CACCTACATG CTCTTCTTCG TCAATCCCGG GGAGGACGAC 1020 CTGTCACAGA TCATGTTCAT CTATTTCAAC TCCTTCCTGC AGTCGTTCCA GGGTTTCTTC 1080 GTGTCTGTCT TCTACTGCTT CTTCAATGGA GAGGTGCGCT CAGCCGTGAG GAAGAGGTGG 1140 CACCGCTGGC AGGACCATCA CTCCCTTCGA GTCCCCATGG CCCGGGCCAT GTCCATCCCT 1200 ACATCACCCA CACGGATCAG CTTCCACAGC ATCAAGCAGA CGGCCGCTGT GTGACCCCTC 1260 GGTCGCCCAC CTGCACA 1277
【０１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号：１で表される塩基配列を有する５’
側の合成ＤＮＡプライマー（ＴＭ３−Ｃ）の配列と、他
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａあるいは遺伝子の塩基配列との共通性を示した図であ
る。
【図２】配列番号：２で表される塩基配列を有する３’
側の合成ＤＮＡプライマー（ＴＭ７−Ｄ）に相補的な塩
基配列と、他のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡあるいは遺伝子の塩基配列との共通性を
示した図である。
【図３】本発明のヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片
の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示
す。塩基配列の５’端および３’端に示した下線部分
は、ＰＣＲ増幅に用いた合成プライマーに相当する。
【図４】図３に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードさ
れる蛋白質の疎水性プロットを示す。この図からＴＭ３
〜ＴＭ７で示す疎水性ドメインの存在が明らかである。
【図５】図３に示したヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ
断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐｈｓ
−ＡＨ１）を、公知のラットＣＲＦ2レセプター蛋白質
（ＲＮＵ１６２５３）と比較した図を示す。黒く塗った
部分は一致しているアミノ酸残基を示す。下線部分は、
ＰＣＲで使用したプライマー部分を示す。
【図６】本発明のヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片
の塩基配列（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とした時
の−１８〜＋６３０）およびそれにコードされるアミノ
酸配列を示す。
【図７】本発明のヒトＣＲＦ2レセプターｃＤＮＡ断片
の塩基配列（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とした時
の＋６３１〜＋１２５９）およびそれにコードされるア
ミノ酸配列を示す。
【図８】図６および図７に示したアミノ酸配列をもとに
作成した、ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質の疎水性プロ
ットを示す。この図から、ＴＭ１〜ＴＭ７で示す疎水性
ドメインの存在が明らかである。
【図９】図６および図７に示したアミノ酸配列を、公知
のラットＣＲＦ2レセプター蛋白質（ＲＮＵ１６２５
３）と比較した図を示す。黒く塗った部分はアミノ酸残
基が両者で一致していることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ ＡＢＵ ＡＢＵ ＡＤＤ ＡＤＤ 38/04 ＡＡＴ 37/43 ＡＡＴ ＡＣＪ ＡＣＪ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号：１または配列番号：２で表わさ
    れる塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有することを
    特徴とするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】ＤＮＡがＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
    をコードするＤＮＡのポリメラーゼ・チェーン・リアク
    ションに用いられるＤＮＡプライマーである請求項１記
    載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】鋳型となるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
    質をコードするＤＮＡと請求項１記載のＤＮＡを混合し
    てポリメラーゼ・チェーン・リアクションを行なうこと
    を特徴とする該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
    ドするＤＮＡを増幅する方法。
  4. 【請求項４】請求項１記載のＤＮＡをＤＮＡプライマー
    としてポリメラーゼ・チェーン・リアクションに用いる
    ことを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
    ードするＤＮＡを含有するＤＮＡライブラリーからＧ蛋
    白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをスク
    リーニングする方法。
  5. 【請求項５】請求項４記載のスクリーニング方法で得ら
    れるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
    Ａ。
  6. 【請求項６】請求項５記載のＤＮＡにコードされるＧ蛋
    白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたは
    それらの塩。
  7. 【請求項７】配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とす
    るヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩。
  8. 【請求項８】配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列
    と実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴と
    するヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩。
  9. 【請求項９】請求項７あるいは請求項８記載のヒトＣＲ
    Ｆ2レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
  10. 【請求項１０】請求項７あるいは請求項８記載のヒトＣ
    ＲＦ2レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有する
    ＤＮＡを含有するＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】配列番号：４で表される塩基配列を有す
    る請求項１０記載のＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】配列番号：１５で表される塩基配列を有
    する請求項１０記載のＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】請求項１０記載のＤＮＡを含有すること
    を特徴とするベクター。
  14. 【請求項１４】請求項１３記載のベクターを保持する形
    質転換体。
  15. 【請求項１５】請求項１４記載の形質転換体を培養し、
    形質転換体の細胞膜にヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質を
    生成せしめることを特徴とする請求項７あるいは請求項
    ８記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質またはその塩の
    製造方法。
  16. 【請求項１６】請求項７あるいは請求項８記載のヒトＣ
    ＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩または請求項９
    記載の部分ペプチドもしくはその塩を用いることを特徴
    とするＣＲＦ2レセプターを活性化するアゴニストもし
    くはその塩またはＣＲＦ2レセプターとＣＲＦとの結合
    を拮抗阻害するアンタゴニストもしくはその塩のスクリ
    ーニング方法。
  17. 【請求項１７】（ｉ）請求項７あるいは請求項８記載の
    ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩または請
    求項９記載の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンド
    を接触させた場合と（ii）請求項７あるいは請求項８記
    載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩また
    は請求項９記載の部分ペプチドもしくはその塩に、リガ
    ンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行な
    うことを特徴とする、リガンドと請求項７あるいは請求
    項８記載のヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  18. 【請求項１８】請求項７あるいは請求項８記載のヒトＣ
    ＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩または請求項９
    記載の部分ペプチドもしくはその塩を含有することを特
    徴とする、リガンドと請求項７あるいは請求項８記載の
    ヒトＣＲＦ2レセプター蛋白質との結合を阻害する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
  19. 【請求項１９】請求項１６もしくは請求項１７記載のス
    クリーニング方法または請求項１８記載のスクリーニン
    グ用キットを用いて得られるヒトＣＲＦ2レセプターア
    ゴニストまたはその塩。
  20. 【請求項２０】請求項１６もしくは請求項１７記載のス
    クリーニング方法または請求項１８記載のスクリーニン
    グ用キットを用いて得られるヒトＣＲＦ2レセプターア
    ンタゴニストまたはその塩。
  21. 【請求項２１】請求項１９記載のヒトＣＲＦ2レセプタ
    ーアゴニストまたはその塩を含有することを特徴とする
    痴呆症、肥満症の予防・治療剤、ストレスに対する適応
    促進剤、ＡＣＴＨ，β−エンドルフィン，β−リポトロ
    ピンもしくはα−ＭＳＦの分泌促進剤、血圧降下剤、気
    分や行動の調節剤、胃腸機能の調節剤、自律神経系の調
    節剤、または下垂体，心血管系，消化管もしくは中枢神
    経の機能検査薬。
  22. 【請求項２２】請求項２０記載のヒトＣＲＦ2レセプタ
    ーアンタゴニストまたはその塩を含有することを特徴と
    するストレスからくる鬱病・不安・頭痛、炎症性疾患、
    免疫抑制、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、胃腸障害、食
    欲不振、出血性ストレス、薬物・アルコールの禁断症
    状、薬物依存症、生殖障害、クッシング病または低血圧
    症の予防・治療剤。
  23. 【請求項２３】請求項７あるいは請求項８記載のヒトＣ
    ＲＦ2レセプター蛋白質もしくはその塩または請求項９
    記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999000497A1 (fr) * 1997-06-30 1999-01-07 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Proteines susceptibles de se lier au facteur liberateur de corticotrophine
WO2000020455A1 (fr) * 1998-10-01 2000-04-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g d'origine humaine, et son adn
WO2000020580A1 (fr) * 1998-10-08 2000-04-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine recepteur couplee a la proteine g et adn associe
WO2001014883A1 (en) * 1999-08-24 2001-03-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Screening method
WO2002083174A1 (fr) * 2001-04-10 2002-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede d'administration d'une substance dans le ventricule gauche

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