JPH0970291A - 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】コリネホルム細菌の育種方法を新たに提供す
る。 【解決手段】コリネホルム細菌由来のインサーションシ
ークエンス内に薬剤耐性遺伝子及び所望の遺伝子を挿入
した人工トランスポゾンを造成し、該人工トランスポゾ
ンをコリネホルム細菌に導入することを含んでなる、該
コリネホルム細菌の染色体上に当該所望の遺伝子を増幅
する方法。 【効果】 本発明の方法によれば、アミノ酸や核酸の工
業生産に用いられるコリネホルム細菌において所望の遺
伝子を染色体上で増幅させることができ、該細菌を育種
改良することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コリネホルム細菌
で転移可能な人工トランスポゾンを用いてコリネホルム
細菌の染色体上に所望の遺伝子を増幅する方法及び該方
法により得られたコリネホルム細菌に関する。所望の遺
伝子がアミノ酸や核酸等の生合成に関与する遺伝子であ
れば、得られるコリネホルム細菌を用いてアミノ酸や核
酸等を生産することができる。染色体上で所望の遺伝子
を増幅する方法は、アミノ酸や核酸の工業生産に用いら
れるコリネホルム細菌を育種改良する上で重要である。

【０００２】

【従来の技術】コリネホルム細菌を育種改良し、アミノ
酸や核酸を効率良く生産するための研究はこれまで精力
的に行われてきた。育種を行うための手段としては、遺
伝子工学によるものも数多く報告されている。コリネホ
ルム細菌の育種を目的にした遺伝子操作技術は、プロト
プラストによるトランスフォーメーション法の確立（Ka
tsumata,R., Ozaki,A., Oka,T. and Furuya,A. :J.Bact
eriol., 159, 306-311(1984)、Santamaria,R.I., Gil,
J.A. and Martin,J.F. :J.Bacteriol., 161, 463-467
(1985)）、各種ベクターの開発（Miwa,K., Matsui,H.,
Terabe,M., Nakamori,S., Sano,K. and Momose,H. :Agr
ic.Biol.Chem., 48, 2901-2903 (1984)、Katsumata,R.,
Ozaki,A., Oka,T. and Furuya,A. :J.Bacteriol., 15
9, 306-311(1984)、Santamaria,R.I., Gil,J.A., Mesa
s,J.M. and Martin,J.F. :J.Gen.Microbiol., 130, 223
7-2246 (1984)、Yeh,P., Oreglia,J., Prevotos,F. and
Scicard,A.M. :Gene, 47, 301-306 (1986)、Patek,M.,
Nesvera,J. and Hochmannova,J. :Appl.Microbiol.Bio
technol., 31, 65-69 (1989)）、遺伝子発現制御法の開
発（Tsuchiya,M. and Morinaga,Y. :Bio/Technology,
6, 428-430 (1988)）及びコスミドの開発（Miwa,K., Ma
tsui,K., Terabe,M., Ito,K., Ishida,M., Takagi,H.,
Nakamori,S. and Sano,K. :Gene, 39, 281-286 (198
5)）など、プラスミドやファージを用いた系で発展して
きた。またコリネホルム細菌由来の遺伝子クローニング
（Matsui,K., Sano,K. and Ohtsubo,E. :Nucleic Acids
Res., 14, 10113-10114 (1986)、Follettie,M.T. and
Shinskey,A.J. :J.Bacteriol., 167,695-702 (1986)、M
ateos,L.M., Del,R.G., Aguilar,A. and Martin,J.F. :
Nucleic Acids Res., 15, 10598 (1987)、Mateos,L.M.,
Del,R.G., Auilar,A. and Martin,J.F. :Nucleic Acid
s Res., 15, 3922 (1987), Melumbres,M., Mateos,L.
M., Guerrero,C. and Martin,J.F. :Nucleic Acids Re
s., 16, 9859 (1988)、Matsui,K., Miwa,K. and Sano,
K. :Agric.Biol.Chem., 52,525-531 (1988)、Peoples,
O.P., Liebl,W., Bodis,M., Maeng,P.J., Follettie,M.
T., Archer,J. A. andShinskey,A.J. :Mol.Microbiol.,
2, 63-72 (1988)、Eikmanns,B.J., Follettie,M.T., G
riot,M.U., Martin,U. and Shinskey,A.J. :Mol.Gen.Ge
net.,218, 330-339 (1989)、O'Regan,M., Thierbach,
G., Bachmann,B., Vgilleval,D., Lepage,P., Viret,J.
F. and Lemoine,Y. :Gene, 77, 237-251 (1989)）及び
各種アミノ酸の収率増加（Sano,k., Miwa,K. and Nakam
ori,S. :Agric.Biol.Chem., 51, 597-599 (1987)）につ
いても報告されている。

【０００３】最近、コリネホルム細菌由来の転移因子が
相次いで報告されている（WO92/02627、WO93/18151、EP
0445385、特開平６−４６８６７号、Vertes,A.A., Inu
i,M.,Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.Mi
crobiol., 11, 739-746 (1994)、Bonamy,C., Labarre,
J., Reyer,O. and Leblon,G. :Mol.Microbiol., 14, 57
1-581 (1994)、Vertes,A.A., Asai,Y., Inui,M., Kobay
ashi, M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.Gen.Genet.,
245, 397-405 (1994)、Jagar,W.,Schafer,A.,Kalinows
ki,J. and Puhler,A. :FEMS Microbiology Letters, 12
6, 1-6 (1995)、特開平７− １０７９７６号）。

【０００４】転移因子とは、染色体上で転移し得るＤＮ
Ａ断片で、原核生物から真核生物までの広い範囲の生物
に存在することが知られている。真核生物ではトウモロ
コシ、ショウジョウバエや酵母等で、原核生物ではエシ
ェリヒア・コリ等で詳しい知見が得られている（Mobile
DNA. American Society for Microbiology, Washingto
n D.C. (1989)）。細菌の転移因子はインサーションシ
ークエンスとトランスポゾンの二種類に分類される。イ
ンサーションシークエンスは大きさが760〜2000bp程度
のＤＮＡ断片で、両端に8〜20bp程度のインバーテッド
リピートを有し、内部には転移に必要な酵素であるトラ
ンスポゼースをコードしている。一方、トランスポゾン
はインバーテッドリピートやトランスポゼースに加え
て、転移機能には直接関与しない薬剤耐性遺伝子等の遺
伝子を併せ持つ転移因子であり、２つのインサーション
シークエンスの間に薬剤耐性遺伝子が挟まれた形のもの
とインサーションシークエンス内に薬剤耐性遺伝子が挿
入された形のものとがある。インサーションシークエン
ス及びトランスポゾンの両方に共通する特徴として、こ
れらが導入された標的遺伝子部位で、約10bpの塩基配列
重複が見られることも知られている（Mobile Genetic E
lements. Academic Press, New York, p.159-221(198
3)）。

【０００５】現在知られている転移因子の中には、エシ
ェリヒア・コリのトランスポゾンＴｎ１０、Ｔｎ５やＭ
ｕファージなど、染色体遺伝子工学に非常に利用価値の
高いものがある。これらの利用例として、トランスポゾ
ンを染色体上の遺伝子の中に転移させることにより、
１）遺伝子破壊を生じてその染色体遺伝子の発現を抑え
る、２）トランスポゾン上にプロモーター配列を挿入し
ておくことによりその導入部位にある染色体遺伝子を発
現させる、３）異種あるいは同種の所望の遺伝子をトラ
ンスポゾン上に搭載しておき、転移を行わせることによ
って染色体に新たな遺伝子を導入する、等が考えられる
（Mobile DNA. American Society for Microbiology, W
ashington D.C., p.879-925 (1989)）。

【０００６】コリネホルム細菌においては最近、インサ
ーションシークエンスなる転移因子が見いだされたが、
薬剤耐性遺伝子等を持つトランスポゾン型のものは見い
だされていない。ただし、人工的にカナマイシン耐性遺
伝子を挿入したトランスポゾンを作製し（WO93/18151、
特開平７−１０７９７６号、Vertes,A.A., Asai,Y.,Inu
i,M., Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.G
en.Genet., 245, 397-405 (1994)）、染色体上に転移を
行わせることは可能となってきた。ここで造成された
人工トランスポゾンは、２つのインサーションシークエ
ンスの間に薬剤耐性遺伝子が挟まれた形のもの（WO93/1
8151）とインサーションシークエンス内に薬剤耐性遺伝
子が挿入された形のもの（特開平７−１０７９７６号、
Vertes,A.A., Asai,Y., Inui,M., Kobayashi,M., Kurus
u,Y. and Yukawa,H. :Mol.Gen.Genet., 245, 397-405
(1994)）とがあるが、このような人工トランスポゾン
は、多コピーでの転移が認められていないか、もしくは
コピー数の増加が満足のいくものではなく、アミノ酸や
核酸工業に利用価値のある遺伝子増幅のための技術には
未だ至っていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネホル
ム細菌由来のインサーションシークエンスをもとに、薬
剤耐性遺伝子と所望の有用な遺伝子を搭載した人工トラ
ンスポゾンを造成し、該人工トランスポゾンを用いてア
ミノ酸や核酸の工業生産に用いられるコリネホルム細菌
の染色体上に所望の遺伝子を増幅する方法を提供するこ
とを目的とする。また、本発明は、所望の有用な遺伝子
が染色体上に増幅されたコリネホルム細菌を提供するこ
とも目的とする。さらに、本発明は、所望の有用な遺伝
子が染色体上に増幅されたコリネホルム細菌を用いて、
アミノ酸、核酸等の物質を製造する方法を提供すること
を目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、エシェリヒア・コリ等で既知のトラ
ンスポゾンにおいて、インサーションシークエンスの特
徴を示す両端のインバーテッドリピート構造の間に転移
機能とは無関係な薬剤耐性遺伝子を持つ構造を取って転
移することに着目し、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ
中に存在するインサーションシークエンスの両端のイン
バーテッドリピートの間に、転移機能には関与しない薬
剤耐性遺伝子及び所望の遺伝子を挿入した構造を有する
トランスポゾン様配列を人工的に種々構築し、これらの
トランスポゾン様配列（人工トランスポゾン）が効率良
く転移を行うことを見いだし、さらに薬剤耐性遺伝子と
その選択濃度を適宜設定することにより、多コピーの人
工トランスポゾンが染色体に転移した遺伝子増幅体を効
率よく取得することができることを見いだし、本発明を
完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は以下のとおりである。 （発明１） インバーテッドリピートに、薬剤耐性遺伝
子及び所望の遺伝子が挟まれた構造を有し、コリネホル
ム細菌細胞内で転移可能な人工トランスポゾンを造成
し、該人工トランスポゾンをコリネホルム細菌細胞内に
導入して、該トランスポゾンを該コリネホルム細菌の染
色体上に転移させて、該染色体上に当該所望の遺伝子を
導入し増幅する方法。 （発明２） 人工トランスポゾンが、インバーテッドリ
ピートにさらにトランスポゼース遺伝子が挟まれた構造
を有するものである発明１記載の方法。 （発明３） インバーテッドリピート及びトランスポゼ
ース遺伝子が、コリネホルム細菌のインサーションシー
クエンス由来のものである発明１ないし２記載の方法。 （発明４） インサーションシークエンスが配列表配列
番号１、５及び９記載のいずれかで表される塩基配列を
有する発明３記載の方法。 （発明５） 薬剤耐性遺伝子がクロラムフェニコール耐
性遺伝子またはテトラサイクリン耐性遺伝子である発明
１ないし４記載の方法。 （発明６） 所望の遺伝子がアミノ酸生合成に関与する
遺伝子である発明１ないし５記載の方法。 （発明７） 所望の遺伝子がアスパルトキナーゼ遺伝子
および／またはジヒドロピコリン酸合成酵素遺伝子であ
る発明６記載の方法。 （発明８） 発明１ないし７のいずれかに記載の方法に
より染色体上に所望の遺伝子が導入されたコリネホルム
細菌。 （発明９） 発明６記載の方法により染色体上にアミノ
酸生合成に関与する遺伝子が導入されたコリネホルム細
菌を培地に培養し、培地中にアミノ酸を生成蓄積させ、
該アミノ酸を回収することを特徴とするアミノ酸の製造
法。 （発明１０）アミノ酸生合成に関与する遺伝子がアスパ
ルトキナーゼ遺伝子および／またはジヒドロピコリン酸
合成酵素遺伝子であり、アミノ酸がリジンである、発明
９記載の方法。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明にいうインバーテッドリピ
ートとは、コリネホルム細菌から単離される転移因子の
両端に存在するものが好ましい。コリネホルム細菌由来
の転移因子としては、例えば配列表配列番号１、５及び
９に記載されるインサーションシークエンスが知られて
いるが（ＷＯ９３／１８１５１）、配列番号１記載のイ
ンサーションシークエンスＩＳ７１４は５’側に配列番
号３記載の配列を、逆鎖５’側に配列番号４記載の配列
を有し、インバーテッドリピートを形成している。配列
番号５記載のインサーションシークエンスＩＳ７１９は
５’側に配列番号７記載の配列を、逆鎖５’側に配列番
号８記載の配列を有し、インバーテッドリピートを形成
している。配列番号３、４、７及び８のうちから選ばれ
る１種類の配列を５’側と逆鎖５’側に配置してインバ
ーテッドリピートを形成させることもできるし、配列番
号３、４、７及び８のうちから選ばれる２種類の配列を
それぞれ５’側と逆鎖５’側に配置してインバーテッド
リピートを形成させることもできる。 配列番号９記載
のインサーションシークエンスＩＳ９０３は５’側に配
列番号１１記載の配列を、逆鎖５’側に配列番号１２記
載の配列を有し、インバーテッドリピートを形成してい
る。配列番号１０及び１１のうちから選ばれる１種類の
配列を５’側と逆鎖５’側に配置してインバーテッドリ
ピートを形成させることもできるし、配列番号１０及び
１１の２種類の配列をそれぞれ５’側と逆鎖５’側に配
置してインバーテッドリピートを形成させることもでき
る。本発明のインバーテッドリピートは、配列番号１、
５及び９に記載される配列を有するものだけに限定され
ず、他の配列でも転移因子の中で機能するものも存在す
る。

【００１１】本発明にいう薬剤耐性遺伝子は、カナマイ
シン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子及び
テトラサイクリン耐性遺伝子の他、アンピシリンやメト
トレキセート耐性遺伝子等の種々の薬剤に耐性な遺伝子
が挙げられる。特に、薬剤耐性度と薬剤耐性遺伝子のコ
ピー数が相関関係にある薬剤耐性遺伝子が好ましい。

【００１２】増幅されるべき所望の遺伝子としては、各
種アミノ酸及び核酸の生合成に関与する遺伝子が挙げら
れる。例えば、グルタミン酸生合成のためのグルタミン
酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン生合成のためのグルタ
ミン合成酵素遺伝子、リジン生合成のためのアスパルト
キナーゼ遺伝子（以下、アスパルトキナーゼを「ＡＫ」
と、アスパルトキナーゼ遺伝子を「ｌｙｓＣ」と呼ぶこ
とがある）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（以
下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素を「ＤＤＰＳ」と、
ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子を「ｄａｐＡ」と
呼ぶことがある）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
遺伝子（以下、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼを
「ＤＤＰＲ」と、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺
伝子を「ｄａｐＢ」と呼ぶことがある）、ジアミノピメ
リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、ジアミノピメ
リン酸デカルボキシラーゼを「ＤＤＣ」と、ジアミノピ
メリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を「ｌｙｓＡ」と呼
ぶことがある）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを
「ＤＤＨ」と、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子を「ｄｄｈ」という）、スレオニン生合成のための
ホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンやバリン生
合成のためのアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイ
シン生合成のための２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素
遺伝子、プロリンやアルギニン生合成のためのグルタミ
ン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成のためのフォス
フォリボシル−ＡＴＰ ピロフォスフォリラーゼ遺伝
子、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニン等
の芳香族アミノ酸生合成のためのデオキシアラビノヘプ
ツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子や核酸、例
えばイノシン酸やグアニル酸生合成のためのホスホリボ
シルピロフォスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフ
ェラーゼ遺伝子、イノシングアノシンキナーゼ遺伝子、
イノシン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素遺伝子やグアニル酸
（ＧＭＰ）合成酵素遺伝子等がある。その他、インター
ロイキン２やインターロイキン６等の生理活性蛋白質等
をコードする遺伝子も挙げられる。

【００１３】本発明にいうコリネホルム細菌とは、Berg
ey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th E
d., p.599 (1974)に記載されているように、好気性のグ
ラム陽性桿菌であり、従来よりコリネバクテリウム属に
分類されている細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (198
1)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビ
バクテリウム属細菌やミクロバクテリウム属細菌を含む
ものであり、一般にＬ−グルタミン酸生産菌として知ら
れている下記のような微生物である。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス

【００１４】具体的に例示すると、下記のような野生株
及びこれらから誘導される各種変異株が挙げられる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）

【００１５】本発明の人工トランスポゾンとは、インバ
ーテッドリピートに、薬剤耐性遺伝子及び所望の遺伝子
が挟まれた構造を有するものであり、かつ、コリネホル
ム細菌細胞内で転移可能なものである。

【００１６】本発明のトランスポゼースとは、たとえば
配列表配列番号２及び６で示されるアミノ酸配列を有す
るものが考えられる。ただし、トランスポゼース活性を
有する限り、１または２以上のアミノ酸残基が欠失、挿
入、付加、置換又は転移されていてもかまわない。本発
明のトランスポゼース遺伝子とは、例えば配列表配列番
号１で示される塩基配列のうち１３０番目から１４３７
番目の配列があり、配列表配列番号５で示される塩基配
列のうち１３０番目から１４３７番目の配列がある。遺
伝子産物がトランスポゼース活性を有する限り、１また
は２以上の塩基が欠失、挿入、付加、置換又は転移され
ていてもかまわない。トランスポゼース遺伝子は人工ト
ランスポゾン内部にあってもかまわない。すなわち、イ
ンバーテッドリピートに挟まれて、かつ、薬剤耐性遺伝
子及び所望の遺伝子の機能を損なわないように配置され
る。トランスポゼース遺伝子は人工トランスポゾン外部
にあってもかまわない。人工トランスポゾンが搭載され
るベクターに同時に搭載されても良いし、該ベクターと
は別のもうひとつのベクターに搭載されていても良い。
コリネホルム細菌の染色体上に存在していても良い。

【００１７】本発明の人工トランスポゾンを構築するに
は、コリネホルム細菌由来の転移因子を出発材料にする
と構築操作が楽である。

【００１８】本発明で使用するインサーションシークエ
ンスは、上記のコリネホルム細菌の染色体上に存在し、
大きさが760〜2000bp程度で両端に8〜20bp程度のインバ
ーテッドリピートを有し、内部には転移に必要な酵素で
あるトランスポゼースをコードするものであれば特に制
限はない。このようなインサーションシークエンスを得
るには、WO93/18151に開示されている方法に従えばよ
い。すなわち、１）コリネホルム細菌にプラスミドｐＥ
Ｃ７０１を導入して形質転換を行い、２）ｐＥＣ７０１
により形質転換された株をカナマイシン耐性をマーカー
として選択し、３）プラスミドｐＥＣ７０１を持つコリ
ネホルム細菌をイソプロピル−β−チオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）入りの寒天プレートに塗布し生育した株を
選択し、４）選択した株の保持するプラスミドのクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発
現調節領域あるいは構造遺伝子領域の塩基配列を解析
し、５）該配列に挿入された配列を見いだすことにより
インサーションシークエンスを含むＤＮＡ断片を得るこ
とができる。また、１）コリネホルム細菌にプラスミド
ｐＥＣ９０１を導入して形質転換を行い、２）ｐＥＣ９
０１により形質転換された株をカナマイシン耐性をマー
カーとして選択し、３）ｐＥＣ９０１を持つコリネホル
ム細菌を３０℃で培養し、３０℃でもクロラムフェニコ
ール耐性を発現する株を選択し、４）選択した株の保持
するプラスミドのｃＩリプレッサーの塩基配列を解析
し、５）該配列に挿入された配列を見いだすことによっ
ても取得可能である。

【００１９】コリネホルム細菌のインサーションシーク
エンスの具体例としては、配列表配列番号１、５及び９
に示される３種のインサーションシークエンス、ＩＳ７
１４、ＩＳ７１９、ＩＳ９０３が挙げられる。ここで示
す塩基配列は必ずしも厳密なものではなく、インバーテ
ッドリピート配列を含め、その配列中の一部の塩基が別
の塩基に置換されたもの、一部の配列が欠失したもの、
新たな配列が挿入または付加したものであっても、イン
サーションシークエンスとしての機能を有する限り、人
工トランスポゾンの構築に使用することができる。

【００２０】これらのインサーションシークエンスをベ
ースとして種々の型の人工トランスポゾンが作製でき
る。これらの人工トランスポゾンの構造を図１に示す。
このうち、本発明で使用する人工トランスポゾンは、イ
ンサーションシークエンスの内部に薬剤耐性遺伝子及び
増幅されるべき所望の遺伝子が挿入された構造を有す
る。 配列番号１に示されるＩＳ７１４の場合、３７番
目から４２番目の位置に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位があ
り、この位置に塩基の挿入が起こってもインバーテッド
リピート及びトランスポゼースの機能を損なわないの
で、薬剤耐性遺伝子及び増幅されるべき所望の遺伝子を
導入する位置として適している。配列番号５に示される
ＩＳ７１９の場合、３７番目から４２番目の位置に制限
酵素ＮｈｅＩ切断部位があり、この位置に塩基の挿入が
起こってもインバーテッドリピート及びトランスポゼー
スの機能を損なわないので、薬剤耐性遺伝子及び増幅さ
れるべき所望の遺伝子を導入する位置として適してい
る。配列番号９に示されるＩＳ９０３の場合、３４番目
から４８番目の位置に制限酵素ＸｃｍＩ切断部位があ
り、この位置に塩基の挿入が起こってもインバーテッド
リピート及びトランスポゼースの機能を損なわないの
で、薬剤耐性遺伝子及び増幅されるべき所望の遺伝子を
導入する位置として適している。

【００２１】以下、ＩＳ７１４を例にして、カナマイシ
ン（ネオマイシン）、クロラムフェニコール及びテトラ
サイクリン等の薬剤に耐性な遺伝子を挿入した人工トラ
ンスポゾンの構築方法、さらにこの薬剤耐性遺伝子に加
えてアミノ酸や核酸の生産に有用な所望の遺伝子（例え
ばアスパルトキナーゼ遺伝子など）を挿入した人工トラ
ンスポゾンの構築方法について説明する。

【００２２】（１）カナマイシン耐性遺伝子を搭載した
人工トランスポゾンの構築 コリネホルム細菌の野生型株であるブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ
ＢＰ−７３４）由来のインサーションシークエンスであ
るＩＳ７１４の配列を持つプラスミドｐＥＣ７０１−Ｉ
Ｓ１４（WO93/18151参照）を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏ
ＲＩで切断することによって、ＩＳ７１４を含む１．６
ｋｂの断片を得る。一方、コリネホルム細菌由来の温度
感受性複製起点を有するプラスミドｐＨＳＣ４（特開平
５−７４９１号参照）の制限酵素ＳａｌＩ部位にＩＳ７
１４を含む断片を挿入し、プラスミドｐＨＩＳ７１４を
作製する。このｐＨＩＳ７１４のＳｍａＩ部位にさらに
もう一つ、先に得たＩＳ７１４を含む１．６ｋｂの断片
を挿入し、正逆方向に二つのＩＳ７１４断片を含むプラ
スミドｐＨＴＮ７１４１及びｐＨＴＮ７１４２を作製す
る（図２）。ついで、ｐＨＴＮ７１４１及びｐＨＴＮ７
１４２をそれぞれ制限酵素ＰｖｕIIで切断することによ
りＩＳ７１４の配列２つとｐＨＳＣ４のコリネホルム細
菌内における温度感受性複製起点の配列を含む断片を切
り出すことができる。一方、プラスミドベクターｐＨＳ
Ｇ２９８（宝酒造社製）にも制限酵素ＰｖｕII部位が２
カ所あり、制限酵素ＰｖｕIIで切断することにより、ネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（カナ
マイシン耐性遺伝子でもある）を含む２．３ｋｂの大き
さの断片を得ることができる。そこで、ｐＨＴＮ７１４
１ならびにｐＨＳＧ２９８を制限酵素ＰｖｕIIで切断
後、ライゲーションを行い、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＪ１２０３６を形質転換する。形
質転換体の中でカナマイシンに対して耐性を示す株から
プラスミドｐＨＴＮ７１４３を得る（図３）。

【００２３】同様の方法により、プラスミドｐＨＴＮ７
１４２とｐＨＳＧ２９８よりプラスミドｐＨＴＮ７１４
４を得る（図４）。ｐＨＴＮ７１４３及びｐＨＴＮ７１
４４は２つのＩＳ７１４の間にネオマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ遺伝子が挟まれた構造となってい
る。また、同様の方法により、プラスミドｐＨＩＳ７１
４とｐＨＳＧ２９８よりプラスミドｐＨＩＳ７１４Ｋ１
及びｐＨＩＳ７１４Ｋ２を対照区として作製する（図
５）。ｐＨＩＳ７１４Ｋ１とｐＨＩＳ７１４Ｋ２とはネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を含む
挿入断片の向きが正逆の関係にある。

【００２４】次に、人工トランスポゾンの小型化のため
に、１つのＩＳ７１４内にネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を挿入した人工トランスポゾンの
作製を行う。ＩＳ７１４中にはトランスポゼースの機能
を損なわない位置に制限酵素ＮｈｅＩ部位が存在する。
そこでプラスミドｐＨＩＳ７１４を制限酵素ＮｈｅＩで
切断し、その末端を平滑末端化する。一方、プラスミド
ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア バイオテク社製）からネオ
マイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子領域を制
限酵素ＰｓｔＩによって切り出し、その末端を平滑末端
とする。両者をライゲイションし、目的プラスミドｐＨ
ＴＮ７１４５を得る（図６）。

【００２５】（２）クロラムフェニコール耐性遺伝子を
搭載した人工トランスポゾンの構築 プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）を制
限酵素ＡｃｃIIで切断することによりクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約１．１
ｋｂの大きさの断片を得ることができる。次にこのＡｃ
ｃII断片をｐＵＣ１８（宝酒造社製）のＳｍａＩ部位に
挿入したものをクローン化する。目的のクローンを選択
し、プラスミドｐＵＣ１８−ＣＭを得る。さらにｐＵＣ
１８−ＣＭよりＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで切り出した
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を含む約１．１ｋｂの大きさの断片と先に構築したｐ
ＨＩＳ７１４Ｋ２のＩＳ７１４中の転移機能には関係し
ない位置に存在する制限酵素ＮｈｅＩ部位を平滑末端化
したものとをライゲーションし、エシェリヒア・コリを
形質転換し、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子断片が挿入されたクローンを選択する。
得られたクローンより目的プラスミドｐＨＴＮ７１５１
を得ることができる（図７）。

【００２６】（３）テトラサイクリン耐性遺伝子を搭載
した人工トランスポゾンの構築 プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切断することによりテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂの大きさの断
片を得ることができる。このＤＮＡ断片と先に構築した
ｐＨＩＳ７１４Ｋ２のＩＳ７１４中の転移機能には関係
しない位置に存在する制限酵素ＮｈｅＩ部位を平滑末端
化したものとをライゲーションし、エシェリヒア・コリ
を形質転換し、テトラサイクリン耐性遺伝子断片が挿入
されたクローンを選択する。得られたクローンより目的
プラスミドｐＨＴＮ７１５２を得ることができる（図
８）。

【００２７】（４）テトラサイクリン耐性遺伝子が搭載
された人工トランスポゾンへのリジン生合成遺伝子の一
つであるアスパルトキナーゼ遺伝子の挿入 図８で構築したｐＨＴＮ７１５２にはアスパルトキナー
ゼ遺伝子を挿入する良い制限酵素部位がないため、新た
に挿入部位を導入したｐＨＴＮ７１５６を以下のように
して構築する。プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒
造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切断するこ
とによりテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約１．４ｋ
ｂの大きさの断片を得ることができる。このＤＮＡ断片
とプラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社
製）を制限酵素ＳｍａＩで切断したものとをライゲーシ
ョンし、エシェリヒア・コリを形質転換し、テトラサイ
クリン耐性遺伝子断片が挿入されたクローンを選択す
る。得られたクローンよりプラスミドｐＨＹ３００−Ｔ
Ｃを得る。さらにｐＨＹ３００−ＴＣを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＸｂａＩで切断することによって得たテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含む断片と、先に構築したｐＨＩＳ
７１４Ｋ２のＩＳ７１４中の転移機能には関係しない位
置に存在する制限酵素ＮｈｅＩ部位を平滑末端化したも
のとをライゲーションし、エシェリヒア・コリを形質転
換し、テトラサイクリン耐性遺伝子断片が挿入されたク
ローンを選択する。得られたクローンより目的プラスミ
ドｐＨＴＮ７１５６を得る（図９）。

【００２８】次に、プラスミドｐＨＴＮ７１５６にリジ
ン生合成遺伝子の一つであるアスパルトキナーゼ遺伝子
を以下のようにして挿入する。コリネホルム細菌である
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのリジン生
産性変異株に由来し、リジンとスレオニンの協奏阻害に
対して脱感作型であるアスパルトキナーゼ遺伝子を含む
プラスミドｐ３９９ＡＫ９Ｂ（WO94/25605参照）を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、セルフライゲーションを行う
ことにより、コリネホルム細菌内で機能する複製起点を
除いたｐＨＳＧ３９９ＡＫを構築する。このｐＨＳＧ３
９９ＡＫを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断して、
約１．７Ｋｂのアスパルトキナーゼ遺伝子断片を得、こ
れをテトラサイクリン耐性遺伝子が搭載された人工トラ
ンスポゾンを持つプラスミドｐＨＴＮ７１５６の制限酵
素ＢｇｌII部位を平滑化したところに挿入し、プラスミ
ドｐＨＴＮ７１５６−Ｃを構築する（図９）。

【００２９】（５）トランスポゼースをトランスポゾン
から切り離したユニットからなるテトラサイクリン耐性
遺伝子を搭載した人工トランスポゾンの構築 プラスミドｐＨＩＳ７１４より、制限酵素ＮｈｅＩ及び
ＸｂａＩによって切り出されるＩＳ７１４のトランスポ
ゼース遺伝子を含む断片を取得し、プラスミドベクター
ｐＵＣ１９のＸｂａＩサイトにクローニングして、プラ
スミドＴｎｐＬ／ｐＵＣ１９を構築する。 次に、Ｔｎ
ｐＬ／ｐＵＣ１９を制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで切断
することによって、ＩＳ７１４の終止コドンと３’側イ
ンバーテッドリピート（ＩＲ）を含む配列を除去し、代
わりに終止コドンのみを再生させるようにデザインされ
た合成二本鎖ＤＮＡを挿入する。この操作によりＩＲが
隣接していないトランスポゼース遺伝子を取得する。次
にこのＯＲＦＬ／ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩとＸｂ
ａＩで切断し、トランスポゼース遺伝子を含む約１．５
ｋｂの断片を取得する。このトランスポゼース遺伝子断
片をプラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＳｍａＩ
からＸｂａＩの間を除去したところに挿入した後に、さ
らに制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで切り出す。プラス
ミドベクターｐＨＳＧ３９８を制限酵素ＰｖｕIIによっ
て部分分解し、マルチクローニングサイトを含む断片を
除いたところに、前述のｐＨＹ３００ＰＬＫより切り出
したトランスポゼース遺伝子断片を平滑末端化した後、
ライゲーションし、プラスミドｐＯＲＦ１を構築する
（図１０）。

【００３０】一方、プラスミドｐＨＩＳ７１４より制限
酵素ＮｈｅＩ及びＸｂａＩによって切り出されるＩＳ７
１４のトランスポゼース遺伝子を含む断片を取得した後
に平滑末端化し、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＰｓ
ｔＩサイトを平滑末端化したところにクローニングし
て、プラスミドＴｎｐ（Ｐｓｔ）／ｐＵＣ１９を構築す
る。このＴｎｐ（Ｐｓｔ）／ｐＵＣ１９上でトランスポ
ゼース遺伝子中の一部の塩基置換をＵ．Ｓ．Ｅ． Ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ファルマシア バイオテ
ク社製）を用いて行う。置換した塩基は配列番号１に示
されるＩＳ７１４の２８８番目の塩基にあたるＧであ
り、これをＣに変更する。塩基置換の行われたプラスミ
ドをＴｎｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９と命名する。Ｔｎ
ｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９の構造は図１１に示されて
いる。＊は導入された変異を示している。

【００３１】転移因子の転移はさまざまな形で調節を受
けている。例えば、以下のものがある（Mobile DNA.Ame
rican Society for Microbiology, Washington D.C.(19
89)）。 １）転移因子内にトランスポゼースに加えてトランスポ
ゼースのインヒビターやリプレッサーが並んでコードさ
れている（例えばＴｎ３）。 ２）インフレームでＯＲＦが２つ存在し、そのうち３’
側のＯＲＦがインヒビターをコードする。２つのＯＲＦ
間で低頻度に翻訳のフレームシフトが起こり、これによ
って２つのＯＲＦが連続して翻訳されトランスポゼース
が生成する（例えばＩＳ１）。 ３）トランスポゼースがコードされているＯＲＦの内部
に、別の開始コドン（ＡＴＧ，ＧＴＧ）が存在し、そこ
より翻訳が開始しインヒビターが産生される（例えばＴ
ｎ５（ＩＳ５０））。

【００３２】ところでＩＳ７１４には、そのほぼ全長に
わたって１つのＯＲＦが存在しており、そのほかに長い
ＯＲＦは見いだされない。このことから、ＩＳ７１４は
Ｔｎ５のように、トランスポゼースをコードするＯＲＦ
を有し、一方その内部に存在する別の開始コドンよりイ
ンヒビターが翻訳される可能性がある。プロモーター様
配列の検索を行ったところ、ＩＳ７１４の配列上では２
８６番目から２８８番目の塩基にあたるＧＴＧの配列が
インヒビターの開始コドンに当たる可能性があることが
判明した。つまり、Ｔｎｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９上
に導入された変異は、インヒビターの翻訳を開始させな
いためのものである。

【００３３】ｐＯＲＦ１上でトランスポゼース前半部分
遺伝子上にある制限酵素サイトＳｍａＩとＮａｅＩの間
を除去したところに、Ｔｎｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９
を制限酵素ＳｍａＩとＮａｅＩで切断することによって
得られるトランスポゼース前半部分遺伝子断片をライゲ
ーションし、ｐＯＲＦ２を構築する。ｐＯＲＦ２のＳｍ
ａＩサイトからＸｂａＩサイトの間を除去して平滑末端
化したところに、ｐＢＳＦ２−ＳＤ７（ＷＯ９２／１４
８３２）から制限酵素ＮａｅＩとＨｉｎｄIIIを用いて
切り出したトリプトファンオペロンアテニュエーターを
含む遺伝子断片を、平滑末端化した後に挿入する。ここ
で構築したプラスミドをｐＯＲＦ３と命名する。ｐＯＲ
Ｆ３を制限酵素ＳａｌＩとＢｐｕ１１０２Ｉで切断し
て、トランスポゼース前半部分遺伝子断片を除いたとこ
ろに、Ｔｎｐ（Ｐｓｔ）／ｐＵＣ１９を制限酵素Ｓａｌ
ＩとＢｐｕ１１０２Ｉで切断して得られたトランスポゼ
ース前半部分遺伝子断片をライゲーションし、ｐＯＲＦ
４を構築する（図１１）。

【００３４】ＴｎｐＬ／ｐＵＣ１９をＳａｃＩで切断し
た後に、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼで３０℃、２０分間分
解し、トランスポゼース遺伝子の開始コドン近傍を上流
側から削除する。その後、そのトランスポゼース遺伝子
をＳｐｈＩサイトを利用して切り出し、ｐＨＳＧ３９８
をＳｍａＩとＳｐｈＩで切断したところに挿入する。こ
のようにして構築できたプラスミドをｄｅｌＴｎｐ５／
３９８と命名する。ｄｅｌＴｎｐ５／３９８を制限酵素
ＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIで切断して取得したトランスポ
ゼース前半部分遺伝子断片を平滑末端化した後に、プラ
スミドベクターｐＫＫ２３３−２（ファルマシア バイ
オテク社製）をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで切断して平滑
末端化したところにライゲーションし、ｐＴｒｃ−ＯＲ
Ｆを構築する。ｐＴｒｃ−ＯＲＦをＳｓｐＩとＢｐｕ１
１０２Ｉで切断することによって得られるＴｒｃプロモ
ーターとトランスポゼース前半部分遺伝子を含む断片
を、ｐＯＲＦ３をＸｂａＩで切断して平滑末端化した後
に、更にＢｐｕ１１０２Ｉで切断してそのトランスポゼ
ース前半部分遺伝子断片を除去したところに挿入してｐ
ＯＲＦ７を構築する（図１２）。

【００３５】また、ｄｅｌＴｎｐ５／３９８を制限酵素
ＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIで切断して取得したトランスポ
ゼース前半部分遺伝子断片を、プラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８のＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIの間にクローニングす
る。そのプラスミド（ｄｅｌＴｎｐ５／１８）のＢｓｍ
ＩとＮａｅＩの間を除去して、Ｔｎｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐ
ＵＣ１９を制限酵素ＢｓｍＩとＮａｅＩで切断すること
によって得られるトランスポゼース前半部分遺伝子断片
をライゲーションし、ｄｅｌＴｎｐ５Ｍ／１８を構築す
る。ｄｅｌＴｎｐ５Ｍ／１８をＫｐｎＩとＨｉｎｄIII
で切断することによって得られるトランスポゼース前半
部分遺伝子断片を、ｐＫＫ２３３−２をＮｃｏＩとＨｉ
ｎｄIIIで切断して平滑末端化したところにライゲーシ
ョンし、ｐＴｒｃ−ＴｎｐＭを構築する。ｐＴｒｃ−Ｏ
ＲＦからｐＯＲＦ７を構築する方法と同様の方法を用い
て、ｐＴｒｃ−ＴｎｐＭとｐＯＲＦ３よりｐＯＲＦ８を
構築する（図１３）。

【００３６】これまでのプラスミドｐＯＲＦ３、ｐＯＲ
Ｆ４、ｐＯＲＦ７、ｐＯＲＦ８を材料にコリネ型細菌へ
の導入用の各プラスミドの構築を行う。以下にｐＯＲＦ
３からｐＯＲＦ４１を構築する手順を示す。まず、ｐＨ
ＩＳ７１４をＮｈｅＩとＳａｃIIで切断し、トランスポ
ゼース遺伝子の大部分を除去したところに、クローニン
グサイト造成のためにデザインした二本鎖合成ＤＮＡを
挿入し、ｐＨＴＮ７１６０を構築する。ｐＨＴＮ７１６
０を制限酵素ＫｐｎＩで切断し平滑末端化した後に、更
にＢｇｌＩで切断することによってＩＳ７１４の両側の
ＩＲとコリネ型細菌内で機能する温度感受性複製起点を
含む遺伝子断片を取得する。また、ｐＯＲＦ３を制限酵
素ＥａｒＩで切断し平滑末端化した後に、更にＢｇｌＩ
で切断する。そこに上記ｐＨＴＮ７１６０由来断片を挿
入し、ｐＯＲＦ４１−ｐｒｅを構築する。次に、ｐＯＲ
Ｆ４１−ｐｒｅをＩＳ７１４の両端のＩＲに挟まれる位
置に存在するＥｃｏＲ■サイトで切断したところに、プ
ラスミドベクターｐＢＲ３２２より制限酵素ＥｃｏＲＩ
とＡｖａＩを利用して切り出したテトラサイクリン耐性
遺伝子を平滑末端化したものを挿入し、ｐＯＲＦ４１を
構築する（図１４）。

【００３７】同様の方法を利用して、ｐＯＲＦ４からは
ｐＯＲＦ３１−ｐｒｅを経由してｐＯＲＦ３１を、ｐＯ
ＲＦ７からはｐＯＲＦ７１−ｐｒｅを経由してｐＯＲＦ
７１を、ｐＯＲＦ８からはｐＯＲＦ８１−ｐｒｅを経由
してｐＯＲＦ８１を構築する。 また、ｐＯＲＦ３をＸ
ｂａＩとＥａｒＩで切断した後に平滑末端化し、セルフ
ライゲーションさせｐＯＲＦＣ０を構築する（図１
５）。ｐＯＲＦ３よりｐＯＲＦ４１を構築する場合と同
様の方法でｐＯＲＦＣ０よりｐＯＲＦＣ２−ｐｒｅを経
由してｐＯＲＦＣ２を構築する。

【００３８】これらの最終構築プラスミド上にはトラン
スポゼースの構造遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、大腸菌内で機能する複製起点、コリネ型細菌内で
機能する温度感受性複製起点、及びＩＳ７１４由来の両
端のインバーテッドリピート（ＩＲ）に挟まれたテトラ
サイクリン耐性遺伝子が存在する。ただし、ｐＯＲＦＣ
２に関してはトランスポゼースの構造遺伝子は存在しな
い。

【００３９】ＩＳ７１４の両端のＩＲとテトラサイクリ
ン耐性遺伝子のユニットをトランスポゾンユニットＴｎ
７１６２と命名する。ＩＳ７１４自身、あるいは先に記
述したＴｎ７１５２等は転移可能な領域の遺伝子内にト
ランスポゼースの構造遺伝子を有しているのに対して、
Ｔｎ７１６２は転移可能な領域内にトランスポゼースの
構造遺伝子を有していないのが特徴である。この場合に
はＴｎ７１６２が搭載されている同じベクター上のユニ
ット外に存在するトランスポゼース遺伝子より発現され
るトランスポゼースによって転移が起こると考えられる
（図１６）。あるいは、染色体上に存在するトランスポ
ゼース遺伝子より発現されるトランスポゼースによって
転移が起こると考えられる。

【００４０】次にトランスポゾンユニットを搭載せず
に、トランスポゼース遺伝子のみが搭載されたコリネ型
細菌への導入用プラスミドの構築を行う。プラスミドｐ
ＨＩＳ７１４Ｋ１をＥｃｏＯ１０９ＩとＭｒｏＩで切断
することによって、ＩＳ７１４を除去した後、セルフラ
イゲーションを行い、ｐＨＩＳ７１４Ｋｄｅｌを構築す
る。一方、ｐＯＲＦ３を制限酵素ＥａｒＩで切断し平滑
末端化した後に、更にＢｇｌＩで切断する。そこにｐＨ
ＩＳ７１４Ｋｄｅｌを制限酵素ＫｐｎＩで切断し平滑末
端化した後に、更にＢｇｌＩで切断することによって得
られるコリネ型細菌内で機能する温度感受性複製起点を
含む断片をライゲーションして、ｐＯＲＦ４０を構築す
る（図１７）。同様の操作を行って、ｐＯＲＦ４からは
ｐＯＲＦ３０を、ｐＯＲＦ７からはｐＯＲＦ７０を、ｐ
ＯＲＦ８からはｐＯＲＦ８０を、ｐＯＲＦＣ０からはｐ
ＯＲＦＣ１を構築する。

【００４１】上記のＩＳ７１４以外に、配列表配列番号
５及び９にそれぞれ示される塩基配列を有するＩＳ７１
９及びＩＳ９０３その他のコリネホルム細菌由来のイン
サーションシークエンスについても、インサーションシ
ークエンス内部のトランスポゼース遺伝子の発現調節領
域及び構造遺伝子領域外に存在する適当な制限酵素部位
に、クロラムフェニコール耐性遺伝子やテトラサイクリ
ン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子及びアスパルトキナー
ゼ遺伝子等の所望の遺伝子を挿入することにより、人工
トランスポゾンを構築することができる。トランスポゼ
ース遺伝子の発現調節領域及び構造遺伝子領域外に適当
な制限酵素部位がない場合には、トランスポゼース機能
を損なわない領域において、ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション法（ＰＣＲ法）または合成ＤＮＡオリゴヌ
クレオチド（アダプター）により部位特異的変異または
遺伝子挿入を行うことによって、塩基配列を改変し適当
な制限酵素部位を予め作製すればよい。

【００４２】かくして構築した人工トランスポゾンは、
適切なベクター、例えばプラスミドに搭載して宿主であ
るコリネホルム細菌に導入される。人工トランスポゾン
を搭載するプラスミドとしては、特に制限はないが、通
常コリネホルム細菌由来のプラスミドを用いればよい。
具体的には、ｐＨＭ１５１９（Agric.Biol.Chem., 48,
2901-2903 (1984)）、ｐＡＭ３３０（Agric.Biol.Che
m.,48, 2901-2903 (1984)）、及びこれらを改良した薬
剤耐性遺伝子を有するプラスミド等である。さらに、導
入された人工トランスポゾンを効率よく染色体上で増幅
させるには、上記（１）に記載したような温度感受性複
製起点を有するプラスミドを用いることが好ましい（特
開平５−７４９１号参照）。人工トランスポゾンを搭載
したプラスミドをコリネホルム細菌に導入する方法とし
ては、通常よく用いられるプロトプラスト法（Gene, 3
9, 281-286 (1985)）、エレクトロポーレーション法（B
io/Technology, 7, 1067-1070(1989)）等の方法を用い
ればよい。

【００４３】人工トランスポゾンを温度感受性プラスミ
ドに搭載してコリネホルム細菌へ導入する場合、構築し
たプラスミドでコリネホルム細菌を形質転換し、プラス
ミドの複製が可能な２５℃で培養することにより、一細
胞当り数十〜数百コピーの人工トランスポゾン搭載プラ
スミドを増幅させて染色体への導入を行い、その後３４
℃で培養することにより余分なプラスミドを除去すれば
よく、この方法により効率よく染色体上での遺伝子の増
幅が起こる。温度感受性プラスミドを用いずに正常なプ
ラスミドを用いることもできるが、染色体への導入後に
余分なプラスミドを除去することが困難となる場合が多
い。その他、人工トランスポゾンのみのＤＮＡ断片やコ
リネホルム細菌中で複製できないプラスミドベクター
（例えばエシェリヒア・コリで複製するプラスミドベク
ター等）を用いてコリネホルム細菌の染色体に導入する
方法もある（特開平７−１０７９７６号、Vertes,A.A.,
Asai,Y., Inui,M., Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yuk
awa,H. :Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)）が、こ
の方法は形質転換後に宿主菌体内、宿主染色体外でＤＮ
Ａ断片を増幅できず、宿主染色体への転移効率が極めて
悪い。

【００４４】染色体に所望の遺伝子が導入された株やさ
らに該遺伝子が染色体上で増幅された株を選択する方法
としては、所望の遺伝子と共に導入された薬剤耐性遺伝
子の薬剤耐性度を利用する方法が用いられる。利用され
る薬剤耐性遺伝子は、カナマイシン、クロラムフェニコ
ール及びテトラサイクリン耐性遺伝子の他、アンピシリ
ンやメトトレキセート耐性遺伝子等の種々の薬剤に耐性
な遺伝子が挙げられるが、特に薬剤耐性度と薬剤耐性遺
伝子のコピー数が相関関係にある薬剤耐性遺伝子が最も
好ましい。すなわち、より高濃度の薬剤の存在下に生育
可能なクローンから所望の遺伝子が染色体上で増幅され
た株を取得することができる。

【００４５】構築したテトラサイクリン耐性遺伝子等の
薬剤耐性遺伝子と脱感作型アスパルトキナーゼ遺伝子等
の所望の遺伝子を含む人工トランスポゾンを搭載したプ
ラスミド（例えばｐＨＴＮ７１５６−Ｃ）を用いてコリ
ネホルム細菌を形質転換し、人工トランスポゾンの宿主
染色体への転移を行った後、転移により生じた染色体上
の転移コピー数の評価を以下の方法により行うことがで
きる。形質転換体をテトラサイクリン（Ｔｃ）等の選択
薬剤の適切な濃度（Ｔｃの場合１〜２０μg/ml）を含む
上記ＣＭ２Ｇ（酵母エキス１０g/l、トリプトン１０g/
l、グルコース５g/l及びＮａＣｌ５g/l）液体培地中に
２５℃で一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適宜希釈し
て、薬剤の適切な範囲の濃度を含む上記ＣＭ２Ｇ寒天培
地に１００μｌずつ塗布する。これらを３４℃で培養
し、出現したコロニーをそれぞれランダムに数クローン
ずつ選び、染色体ＤＮＡを調製し、ＰｖｕＩＩを始めと
した適当な種々の制限酵素で完全に消化し、アガロース
ゲル電気泳動を行い、ニトロセルロースあるいはナイロ
ン、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）等のフィ
ルターにブロッテイングする。このフィルターを^３２Ｐ
−ラベルしたテトラサイクリン耐性遺伝子断片をプロー
ブとしてサザンハイブリダイゼーションし、プローブと
ハイブリダイズするバンドの数を検定する。

【００４６】かくして得られた染色体上において所望の
遺伝子が増幅した形質転換体は、通常用いられている方
法や条件に従って培養すればよい。培養のための培地と
しては、炭素源、窒素源、無機イオン等を含有する通常
の培地である。また、必要に応じ、ビタミン、アミノ酸
等の有機微量栄養素を添加することが望ましい。炭素源
としては、グルコースやシュクロース等の炭水化物、酢
酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類、その他が
適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無
機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、
カリウムイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使
用される。培養は、好気条件下にｐＨ５．０から８．
５、温度を１５℃から３７℃の適当な範囲に制御しつ
つ、１ないし７日間程度培養を行う。人工トランスポゾ
ンを用いて遺伝子が増幅された結果、目的有用物質の生
産効率が上昇しており、培養物中には、菌体内または菌
体外に目的物質が著量生成蓄積される。培養物中からの
目的物質の採取は、公知の方法により行うことができ
る。

【００４７】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。

【００４８】［実施例１］ＩＳ７１４を用いたカナマイシン耐性遺伝子を含む人工
トランスポゾンの構築 コリネホルム細菌由来のインサーションシークエンスで
あるＩＳ７１４の配列を持つプラスミドｐＥＣ７０１−
ＩＳ１４を制限酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで切断するこ
とによってＩＳ７１４を含む１．６ｋｂの断片を得た。
なお、プラスミドｐＥＣ７０１−ＩＳ１４を保持するブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２６
８４は、平成４年３月１０日付で受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１２８６３のもとに通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所(郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東
１丁目１番３号）に寄託され、平成５年３月９日付でブ
ダペスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４２３２が付与されている。一方、複製機能
が温度感受性になった変異型プラスミドｐＨＳＣ４の複
製に関与しない位置に存在する制限酵素ＳａｌＩ部位に
ＩＳ７１４を含む断片を両者ともクレノーフラグメント
処理で平滑末端化した後、ライゲーションによって挿入
し、プラスミドｐＨＩＳ７１４を作製した（図２）。な
お、プラスミドｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒア・コ
リ ＡＪ１２５７１は、平成２年１０月１１日付で受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６３のもとに通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本
国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され、平成
３年８月２６日付でブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３５２４が付与されて
いる。このｐＨＩＳ７１４のＳｍａＩ部位にさらにもう
一つ、先に得たＩＳ７１４を含む１．６ｋｂの断片をク
レノーフラグメント処理で平滑末端化した後、ライゲー
ションによって挿入し、プラスミドｐＨＴＮ７１４１及
びｐＨＴＮ７１４２を作製した（図２）。制限酵素切断
による解析の結果、このプラスミドｐＨＴＮ７１４１は
２カ所に挿入したＩＳ７１４を含む断片は同方向であ
り、プラスミドｐＨＴＮ７１４２は逆方向であった。

【００４９】ｐＨＴＮ７１４１及びｐＨＴＮ７１４２を
それぞれ制限酵素ＰｖｕIIで切断することにより、ＩＳ
７１４の配列２つとｐＨＳＣ４のコリネホルム細菌内に
おける温度感受性複製起点の配列を含む断片を切り出す
ことができる。一方、プラスミドベクターｐＨＳＧ２９
８（宝酒造社製）にも制限酵素ＰｖｕII部位が２カ所あ
り、制限酵素ＰｖｕIIで切断することによりネオマイシ
ンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（カナマイシン
耐性遺伝子）を含む２．３ｋｂの大きさの断片を得るこ
とができる。そこで、ｐＨＴＮ７１４１ならびにｐＨＳ
Ｇ２９８を制限酵素ＰｖｕIIで切断した後にライゲーシ
ョンを行い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＪ１２０３６を形質転換した。形質転換体の中で、
カナマイシン（Ｋｍ）２５μg/mlに対して耐性を示す株
からプラスミドｐＨＴＮ７１４３を得た（図３）。プラ
スミドｐＨＴＮ７１４３を保持するブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＪ１２８２６は、平成５年３
月９日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東１丁目１
番３号）にブダペスト条約に基づき寄託され、受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３１が付与されている。同様の方
法でｐＨＴＮ７１４２とｐＨＳＧ２９８よりプラスミド
ｐＨＴＮ７１４４を得た（図４）。ｐＨＴＮ７１４３及
びｐＨＴＮ７１４４は、ＩＳ７１４の２つのＩＳ７１４
の間にネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝
子が挟まれた構造からなる。さらに同様の方法により、
プラスミドｐＨＩＳ７１４とｐＨＳＧ２９８よりプラス
ミドｐＨＩＳ７１４Ｋ１及びｐＨＩＳ７１４Ｋ２を対照
区として作製した（図５）。ここでｐＨＩＳ７１４Ｋ１
とｐＨＩＳ７１４Ｋ２とはネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含む挿入断片が正逆の関係にあ
る。

【００５０】次に人工トランスポゾンの小型化を目指し
て、１つのＩＳ７１４内にネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を挿入した人工トランスポゾンの
作製を行った。ＩＳ７１４中にはトランスポゼースの機
能を損なわない位置に制限酵素ＮｈｅＩ部位が存在す
る。そこでプラスミドｐＨＩＳ７１４を制限酵素Ｎｈｅ
Ｉで切断し、その末端を平滑末端化した。一方、プラス
ミドｐＵＣ４Ｋ（ファルマシアバイオテク社製）からネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子領域を
制限酵素ＰｓｔＩによって切り出し、その末端を平滑末
端とした。両者をライゲーションし、得られたプラスミ
ドをｐＨＴＮ７１４５と命名した（図６）。プラスミド
ｐＨＴＮ７１４５を保持するエシェリヒア・コリ ＡＪ
１３１２８は、平成７年６月２９日付で通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨
城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５０１１が付与されている。同株は、平
成８年５月１４日付でブダペスト条約に基づく寄託に移
管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５３７が付与され
ている。

【００５１】人工トランスポゾンの転移機能の評価 このようにして作製した人工トランスポゾンの転移機能
を以下のようにして評価した。クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子を持つプラスミドｐＡ
Ｊ４３をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ１２０３６に保持させた株を人工トランスポゾンを
搭載したプラスミドｐＨＴＮ７１４５で形質転換し、共
存状態とした。なお、ｐＡＪ４３を保持するエシェリヒ
ア・コリ ＡＪ１１８８２は、昭和５７年４月２８日付
で受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−６５１７のもとに通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され、
昭和５７年５月２２日付でブダペスト条約に基づく寄託
に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６が付与さ
れている。上記のようにして得たｐＨＴＮ７１４５とｐ
ＡＪ４３を同時に保持するブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムをＫｍ２５μg/ml、クロラムフェニコー
ル（Ｃｍ）５μg/mlを含むＣＭ２Ｇ培地（酵母エキス１
０g/l、トリプトン１０g/l、グルコース５g/l及びＮａ
Ｃｌ５g/l）で２５℃で一晩振とう培養後、培養液を適
宜希釈してＫｍ２５μg/ml、Ｃｍ５μg/mlを含むＣＭ２
Ｇ寒天培地に塗布し、３４℃で培養した。出現したコロ
ニーのうち１００株についてプラスミドを抽出し、その
大きさを電気泳動によって調べたところ、そのうちの３
株でｐＨＴＮ７１４５、ｐＡＪ４３の両プラスミドと分
子量が異なり、ｐＡＪ４３と人工トランスポゾンの分子
量の和の大きさになっているプラスミドが存在してい
た。これらのプラスミドを制限酵素切断によって解析し
たところ、ｐＡＪ４３にｐＨＴＮ７１４５上の配列が挿
入されたものであることが分った。このうちの１株につ
いて、挿入を受けたｐＡＪ４３上の挿入断片とｐＡＪ４
３との連結部分の近傍の塩基配列をダイデオキシ法によ
って決定したところ、人工トランスポゾンの両末端の配
列が存在すること、ならびに挿入を受けたｐＡＪ４３の
ターゲット配列ＧＧＴＴＴＡＴＴ（配列番号１２）が重
複していることが確認された。これらの結果から、１つ
のＩＳ７１４内に転移機能に関与しない遺伝子（ここで
はネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）
を挿入した形のトランスポゾン構造をとらせた場合に、
その構造が保存されたままいわゆるトランスポゾンの如
くに転移することが示された。

【００５２】人工トランスポゾンの転移頻度の評価 対照プラスミドをｐＨＩＳ７１４Ｋ１とし、人工トラン
スポゾンを搭載したｐＨＴＮ７１４３、ｐＨＴＮ７１４
４及びｐＨＴＮ７１４５を用いて、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３６を形質転換
し、人工トランスポゾンの宿主染色体への転移の頻度を
評価した。それぞれの形質転換体をＫｍ２５μg/mlを含
む上記ＣＭ２Ｇ液体培地中に、２５℃で一晩培養後、
０．９％ＮａＣｌ液で適宜希釈してＫｍ２５μg/mlを含
むＣＭ２Ｇ寒天培地に１００μｌずつ塗布した。３４℃
及び２５℃で培養し、各温度におけるＫｍ耐性株の出現
頻度をコロニー数により計測し、３４℃でのコロニー数
を２５℃でのコロニー数で割った値を転移頻度とした。
その結果を表１に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】この結果より、対照区のＩＳ７１４（ｐＨ
ＩＳ７１４Ｋ１上に搭載）に比し、人工トランスポゾン
Ｔｎ７１４３（ｐＨＴＮ７１４３上に搭載）やＴｎ７１
４４（ｐＨＴＮ７１４４上に搭載）は、その宿主染色体
への転移頻度がせいぜい１〜２倍であったが、人工トラ
ンスポゾンＴｎ７１４５（ｐＨＴＮ７１４５上に搭載）
型は約１１倍と極めて効率的な人工トランスポゾンであ
ることが示された。

【００５５】［実施例２］ＩＳ７１４を用いたクロラムフェニコール耐性遺伝子を
含む人工トランスポゾンの構築 プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）を制
限酵素ＡｃｃIIで切断することによりクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約１．１
ｋｂの大きさの断片を得た。このＡｃｃII断片をｐＵＣ
１８（宝酒造社製）のＳｍａＩ部位に挿入、クローン化
した。すなわち、Ｃｍ２５μg/mlとアンピシリン（Ａ
ｐ）１００μg/mlを含むＬ培地（トリプトン１０g/l、
酵母エキス５g/l及びＮａＣｌ５g/l）に生育 したエシ
ェリヒア・コリ形質転換体より、目的のクローンを選択
し、そのプラスミドをｐＵＣ１８−ＣＭと命名した。さ
らにｐＵＣ１８−ＣＭよりＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで
切り出したクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含む約１．１ｋｂの大きさの断片を平滑
末端化し、このＤＮＡ断片と実施例１において構築した
ｐＨＩＳ７１４Ｋ２のＩＳ７１４中の転移機能には関係
しない位置に存在する制限酵素ＮｈｅＩ部位をクレノー
フラグメント処理で平滑末端化したものとをライゲーシ
ョンし、エシェリヒア・コリを形質転換し、Ｃｍ２５μ
g/mlとＫｍ５０μg/mlを含むＬ培地に生育するコロニー
を得、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子断片が挿入されたクローンを選択した。本クロ
ーンが保持するプラスミドをｐＨＴＮ７１５１と命名し
た（図７）。プラスミドｐＨＴＮ７１５１を保持するエ
シェリヒア・コリ ＡＪ１３１２９は、平成７年６月２
９日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵
便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託され受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１２が付
与されている。同株は、平成８年５月１４日付でブダペ
スト条約に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５５３８が付与されている。

【００５６】人工トランスポゾンの転移によって生じる
染色体上のコピー数の評価 ｐＨＴＮ７１５１を用いて、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＪ１２０３６を形質転換し、人工
トランスポゾンの宿主染色体への転移によって生じる染
色体上のコピー数を以下の方法により評価した。得られ
た形質転換体をＣｍ３μg/mlを含む上記ＣＭ２Ｇ液体培
地中に、２５℃で一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適
宜希釈してＣｍ３μg/mlを含むＣＭ２Ｇ寒天培地に１０
０μｌずつ塗布し、３４℃で培養し、出現したコロニー
の中からカナマイシン感受性のクローンを選んだ。この
クローンをＣｍ３μg/mlを含む上記ＣＭ２Ｇ液体培地中
に、３０℃で一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適宜希
釈してＣｍ６μg/mlを含む上記ＣＭ２Ｇ寒天培地に１０
０μｌずつ塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニー
の中からランダムに数クローンを選んだ。各クローンか
ら染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素ＰｖｕIIで完全に消
化し、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリビニリデン
ジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターにブロッテイング
した。このフィルターを³²Ｐ−ラベルしたクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片をプロ
ーブとしてサザンハイブリダイゼーションし、プローブ
とハイブリダイズするバンドの数を検定した。その結
果、ランダムに選んだ４クローン中３クローンにおい
て、クロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ人工トラン
スポゾンが宿主染色体上に２コピー転移していることが
確認された。

【００５７】［実施例３］ＩＳ７１４を用いたテトラサイクリン耐性遺伝子を含む
人工トランスポゾンの構築 プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を制限
酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切断することによりテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂの大きさの断
片を得た。次にこのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩ切断断片をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端化し、このＤＮＡ
断片と実施例１において構築したｐＨＩＳ７１４Ｋ２の
ＩＳ７１４中の転移機能には関係しない位置に存在する
制限酵素ＮｈｅＩ部位をクレノーフラグメント処理で平
滑末端化したものとをライゲーションし、エシェリヒア
・コリを形質転換し、Ｔｃ２５μg/mlを含むＬ培地に生
育するコロニーを得、テトラサイクリン耐性遺伝子断片
が挿入されたクローンを選択した。本クローンが保持す
るプラスミドをｐＨＴＮ７１５２と命名した（図８）。
プラスミドｐＨＴＮ７１５２を保持するエシェリヒア・
コリ ＡＪ１３１３０は、平成７年６月２９日付で通産
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１３が付与されている。
同株は、平成８年５月１４日付でブダペスト条約に基づ
く寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５３９
が付与されている。

【００５８】人工トランスポゾンの転移によって生じる
染色体上のコピー数の評価 ｐＨＴＮ７１５２を用いて、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＪ１２０３６を形質転換し、人工
トランスポゾンの宿主染色体への転移によって生じる染
色体上のコピー数を以下のようにして評価した。形質転
換体をＴｃ１．５μg/mlを含む上記ＣＭ２Ｇ液体培地中
に、２５℃で一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適宜希
釈してＴｃを１．５μg/mlから５μg/mlの範囲で含む上
記ＣＭ２Ｇ寒天培地に１００μｌずつ塗布し、３４℃で
培養し、出現したコロニーをそれぞれランダムに数クロ
ーンずつ選んだ。各クローンから染色体ＤＮＡを調製
し、制限酵素ＰｖｕIIで完全に消化し、アガロースゲル
電気泳動を行い、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤ
Ｆ）フィルターにブロッテイングした。このフィルター
を³²Ｐ−ラベルしたテトラサイクリン耐性遺伝子断片を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションし、プロ
ーブとハイブリダイズするバンドの数を検定した。その
結果、表２に示すように、テトラサイクリン耐性遺伝子
をもつ人工トランスポゾンは高頻度で２〜３コピーのも
のが検出された。これより、テトラサイクリン耐性遺伝
子を選択薬剤耐性遺伝子として用いることにより、高頻
度で目的とする多コピー型の形質転換体を得ることがで
きることが示された。

【００５９】

【表２】

【００６０】Ｔｃ４μg/mlに耐性を示し、染色体上に３
コピーの人工トランスポゾンが検出されたブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＡＪ１３１８８は、平成
８年５月１４日付で通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号）にブダペスト条約に基づいて寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５３６が付与されている。

【００６１】［実施例４］ＩＳ７１４を用いたテトラサイクリン耐性遺伝子及びア
スパルトキナーゼ遺伝子を含む人 工トランスポゾンの構
築 テトラサイクリン耐性遺伝子が搭載された人工トランス
ポゾンにリジン生合成遺伝子の一つであるアスパルトキ
ナーゼ遺伝子を以下のようにして挿入した。プラスミド
ベクターｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＡｖａＩで切断することにより、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂの大きさのＤＮＡ断片
を得た。このＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩ切断断片をＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で平滑末端化し、得られたＤＮＡ断
片とプラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社
製）を制限酵素ＳｍａＩで切断したものとをライゲーシ
ョンし、得られた組換えＤＮＡでエシェリヒア・コリを
形質転換し、Ｔｃ２５μg/mlを含むＬ培地に生育するコ
ロニーを得、テトラサイクリン耐性遺伝子断片が挿入さ
れた組換えＤＮＡが導入された株を選択した。同株が有
するプラスミドをｐＨＹ３００−ＴＣと命名した。さら
にｐＨＹ３００−ＴＣを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ
で切断することによって得たｐＢＲ３２２由来のテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む断片をクレノーフラグメン
ト処理で平滑末端化し、このＤＮＡ断片と先に構築した
ｐＨＩＳ７１４Ｋ２のＩＳ７１４中の制限酵素ＮｈｅＩ
部位をクレノーフラグメント処理で平滑末端化したもの
とをライゲーションし、エシェリヒア・コリを形質転換
し、Ｔｃ２５μg/mlを含むＬ培地に生育するコロニーを
得、テトラサイクリン耐性遺伝子断片が挿入されたクロ
ーンを選択した。本クローンが保持するプラスミドをｐ
ＨＴＮ７１５６と命名した（図９）。

【００６２】一方、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのリジン生産性変異株に由来し、リジンとスレ
オニンの協奏阻害に対して脱感作型であるアスパルトキ
ナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐ３９９ＡＫ９Ｂを保持
するエシェリヒア・コリ ＡＪ１２６９１（WO94/2560
5）は、平成４年４月１０日付で通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２１９８が付与されている。同株は、平成７
年２月１０日付でブダペスト条約に基づく寄託に移管さ
れ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９９９が付与されてい
る。このｐ３９９ＡＫ９Ｂを制限酵素ＢａｍＨＩで切断
し、セルフライゲーションを行い、コリネホルム細菌内
で機能する複製起点を除いたｐＨＳＧ３９９ＡＫを構築
した。このｐＨＳＧ３９９ＡＫを制限酵素ＥｃｏＲＩと
ＳｐｈＩで切断して、約１．７ｋｂのアスパルトキナー
ゼ遺伝子断片を得、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
で平滑末端化した後、テトラサイクリン耐性遺伝子が搭
載された人工トランスポゾンを持つプラスミドｐＨＴＮ
７１５６の制限酵素ＢｇｌII部位をクレノーフラグメン
ト処理で平滑末端化したところに挿入し、プラスミドｐ
ＨＴＮ７１５６−Ｃを構築した（図９）。プラスミドｐ
ＨＴＮ７１５６−Ｃでエシェリヒア・コリを形質転換し
たエシェリヒア・コリＡＪ１３１３１は、平成７年６月
２９日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１４
が付与されている。同株は、平成８年５月１４日付でブ
ダペスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５５４０が付与されている。

【００６３】人工トランスポゾンの転移によって生じる
染色体上のコピー数の評価 ｐＨＴＮ７１５６−Ｃを用いて、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６あるいはブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ３４４５を形
質転換し、人工トランスポゾンの宿主染色体への転移に
よって生じる染色体上のトランスポゾンのコピー数を評
価した。ＡＪ１２０３６株は野生型のアスパルトキナー
ゼ遺伝子をその染色体上に有することに対し、ＡＪ３４
４５株はＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性を
示し、リジンとスレオニンの協奏阻害に対して脱感作型
であるアスパルトキナーゼ遺伝子を有する。

【００６４】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＪ１２０３６株は、昭和５９年３月２６日付で通産
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託さ
れ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７５５９が付与されてい
る。同株は、昭和６０年３月１３日付でブダペスト条約
に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
３４が付与されている。ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム ＡＪ３４４５株は、昭和４８年３月２日
付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号３０５ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４４が付与され
ている。同株は、平成８年５月１７日付でブダペスト条
約に基づく寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
５５４１が付与されている。

【００６５】まず、形質転換体をＴｃ０．７μｇ／ｍｌ
を含むＣＭ２Ｇ培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、トリプト
ン１０ｇ／ｌ、グルコース５ｇ／ｌ及びＮａＣｌ５ｇ／
ｌ）中に、２５゜Ｃで一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液
で適宜希釈してＴｃを１．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍ
ｌの範囲で含む上記ＣＭ２Ｇ寒天培地に１００μｌずつ
塗布する。それらを３４゜Ｃで培養し、出現したコロニ
ーをそれぞれランダムに数クローンずつ選び、Ｋｍ２５
μｇ／ｍｌを含むＣＭ２Ｇ寒天培地にレプリカし、Ｋｍ
感受性株を選択した。選択されたＫｍ感受性株の染色体
ＤＮＡを調製し、制限酵素ＢｇｌIIで完全に消化し、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、ポリビニリデンジフルオ
リド（ＰＶＤＦ）フィルターにブロッテイングした。こ
のフィルターを³²−Ｐラベルしたアスパルトキナーゼ遺
伝子断片（遺伝子後半部分のＨｉｎｄIIIサイトからＥ
ｃｏＲＩサイトまでの４４０ｂｐ）をプローブとしてサ
ザンハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリダ
イズするバンドの数を検定した。その結果、ＡＪ１２０
３６を宿主とした場合は解析した１０株中４株で、また
ＡＪ３４４５を宿主とした場合には解析した２２株中８
株で、それぞれトランスポゾンＴｎ７１５６−Ｃが２コ
ピー転移していることが検出された。これより、テトラ
サイクリン耐性遺伝子を選択薬剤耐性遺伝子として用い
ることによって、高頻度で有用遺伝子を染色体上に多コ
ピー導入できることが示された。

【００６６】人工トランスポゾンを用いてアスパルトキ
ナーゼ遺伝子を転移させた株のリジン生産 性の評価 次に、上記人工トランスポゾン転移株におけるリジン生
産性の評価を行った。人工トランスポゾン転移株をＴｃ
０．７μｇ／ｍｌを含むＣＭ２Ｇ寒天培地の全面に塗布
し３４℃で１晩培養した後、そのうちの６分の１量の菌
体をリジン生産培地（グルコース １００ｇ／ｌ、硫酸
アンモニウム ５５ｇ／ｌ、豆濃 ５０ｍｌ／ｌ、燐酸
二水素カリウム １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム １ｇ／
ｌ、ビタミンＢ１ ２ｍｇ／ｌ、ビオチン ０．５ｍｇ
／ｌ、ニコチン酸アミド ５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄 ２ｍｇ
／ｌ、硫酸マンガン ２ｍｇ／ｌ、水酸化カリウムでｐ
Ｈ７．５に調整、１１５℃にて１５分間オートクレーブ
の後、炭酸カルシウム５０ｇ／ｌを添加）２０ｍｌに植
菌し、坂口フラスコにて３０℃、７２時間培養した培養
液のリジン含量を分析し、人工トランスポゾン転移株の
リジン生産性を評価した。その結果、表３、４に示すよ
うにＡＪ１２０３６を親株にした場合とＡＪ３４４５を
親株にした場合の双方でＴｎ７１５６−Ｃの転移によっ
て、トランスポゾン未転移株と比較してリジンの生産性
の上昇が認められた。また、トランスポゾンの転移コピ
ー数（１コピーと２コピー）に応じて、リジン生産性が
より高かった。これより、テトラサイクリン耐性遺伝子
を選択薬剤耐性遺伝子として活用して多コピーの有用遺
伝子を導入することによって、菌株のアミノ酸生産性を
向上させることが可能であることが示された。

【００６７】

【表３】

【００６８】

【表４】

【００６９】［実施例５］シャトルベクターｐＶＫ７の構築 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに存在する
クリプティックプラスミドとして、ｐＡＭ３３０があ
る。ｐＡＭ３３０は特公平１−１１２８０号公報、USP
4,788,762に記載されており、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株から調製され
る。ｐＡＭ３３０はコリネホルム細菌中で増殖可能なシ
ャトルベクターの複製起点として利用可能である。エシ
ェリヒア・コリ用の汎用ベクターであるｐＨＳＧ２９９
（宝酒造社製）とｐＡＭ３３０を結合した新規シャトル
ベクターを構築した。ｐＡＭ３３０を制限酵素Ｈｉｎｄ
IIIにて一ヶ所切断し、切断面をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼにて平滑末端化した。また、ｐＨＳＧ２９９を制限酵
素ＡｖａIIにて一ヶ所切断し、切断面をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼにより平滑末端化した。得られた断片をライゲ
ーションし、ｐＡＭ３３０とｐＨＳＧ２９９が連結した
プラスミドを取得した。ｐＶＫ７の構築の過程を図１８
に示す。ｐＶＫ７はエシェリヒア・コリ及びコリネホル
ム細菌中で複製可能で、宿主にカナマイシン耐性能を付
与する。また、クローニングサイトとしては、ｐＨＳＧ
２９９由来のマルチクローニングサイトのうち、一ヶ所
切断するクローニングサイトとしてＰｓｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩを持
つ。

【００７０】シャトルベクターｐＶＣ７の構築 ｐＶＫ７と同様に、エシェリヒア・コリ用汎用ベクター
であるｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）とｐＡＭ３３０を
結合し、新規シャトルベクターｐＶＣ７を構築した。ｐ
ＡＭ３３０を制限酵素ＨｉｎｄIIIにて一ヶ所切断し、
切断面をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化した。
また、ｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＢｓａＩにて一ヶ所切
断し同じくＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。
得られた断片をライゲーションし、ｐＡＭ３３０とｐＨ
ＳＧ３９９が連結したプラスミドを取得した。取得した
プラスミドのうち、ｐＶＣ７の構築の過程を図１９に示
す。ｐＶＣ７はエシェリヒア・コリ及びコリネホルム細
菌中で複製可能で、宿主にカナマイシン耐性能を付与す
る。また、クローニングサイトとしては、ｐＨＳＧ３９
９由来のマルチプルクローニングサイトのうち、一ヶ所
切断するクローニングサイトとしてＰｓｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＨｉｎｄIIIを持つ。

【００７１】ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを含有する
プラスミドの作製 （１）ｌｙｓＡの取得及びそれを含有するプラスミドの
作製 野生型のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９株を染色体ＤＮＡの供与体として用い
た。ＡＴＣＣ１３８６９株より常法に従い、染色体ＤＮ
Ａを調製した。染色体ＤＮＡよりＰＣＲにより、ａｒｇ
Ｓ、ｌｙｓＡ及びこれらを含むオペロンのプロモーター
を含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたＤＮＡプラ
イマーとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムに
おいて既知となっている配列（Molecular Microbiology
4(11),1819-1830(1990)、Molecular and General Geneti
cs 212,112-119(1988)参照）を基にしてアルギニル−ｔ
ＲＮＡシンターゼ及びＤＤＣをコードする約３．６ｋｂ
の領域を増幅すべく、配列表の配列番号１３及び１４に
記載の塩基配列を有する各々２３ｍｅｒの合成ＤＮＡを
用いた。ＤＮＡの合成及びＰＣＲ反応は、常法に従って
行った。すなわち、ＤＮＡの合成はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３８
０Ｂを使用し、ホスホアミタイト法を用いて（Tetrahed
ron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成し
た。ＰＣＲ反応は、宝酒造社製ＤＮＡサーマルサイクラ
ーＰＪ２０００型を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを
用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅
を行なった。増幅されたＤＮＡの配列を配列番号１５に
示す。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子断片のクローン
化用のベクタ一にはｐＨＳＧ３９９を用いた。ｐＨＳＧ
３９９を制限酵素ＳｍａＩにて切断し、増幅されたｌｙ
ｓＡを含むＤＮＡ断片と連結した。この様にして取得し
たＡＴＣＣ１３８６９由来のｌｙｓＡを有するプラスミ
ドをｐ３９９ＬＹＳＡと命名した。更に、ｐ３９９ＬＹ
ＳＡをＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断することにより、ｌ
ｙｓＡを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、ｐ
ＨＳＧ２９９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断したものと
連結した。得られたプラスミドをｐ２９９ＬＹＳＡと命
名した。ｐ２９９ＬＹＳＡ構築の過程を図２０に示す。
ｐ３９９ＬＹＳＡをＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断するこ
とによってｌｙｓＡ断片を得、この断片をＫｐｎＩとＢ
ａｍＨＩにて切断したｐＶＫ７と連結した。この作製し
たプラスミドをｐＬＹＳＡｍと命名した（図２１）。

【００７２】（２）ｄａｐＡの取得及びそれを含有する
プラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ＡＴ
ＣＣ１３８６９株を染色体ＤＮＡの供与体として用い
た。ＡＴＣＣ１３８６９株より常法に従い、染色体ＤＮ
Ａを調製した。染色体ＤＮＡよりＰＣＲによりｄａｐＡ
を含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたＤＮＡプラ
イマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既
知となっている配列（Nucleic Acids Research 18(21),
6421(1990)、EMBL accession No.X53993参照）を基にし
てＤＤＰＳをコードする約１．５ｋｂの領域を増幅すべ
く、配列表の配列番号１６及び１７に記載の塩基配列を
有する各々２３ｍｅｒのＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合
成及びＰＣＲ反応は、常法に従って行った。増幅された
ＤＮＡの配列を配列番号１８に示す。増幅された１４１
１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはｐＣ
Ｒ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；Bio/Technolo
gy 9,657-663(1991)参照）を用い、増幅したｄａｐＡ断
片と連結した。ＤＮＡの連結は、ＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行な
った。この様にしてｐＣＲ１０００にブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたｄａｐ
Ａ断片１４１１ｂｐの挿入されたプラスミドを作製し
た。この様にして取得したＡＴＣＣ１３８６９由来のｄ
ａｐＡを有するプラスミドをｐＣＲＤＡＰＡと命名した
（図２２）。エシェリヒア・コリにｐＣＲＤＡＰＡを導
入して得られた形質転換株ＡＪ１３１０６株は、平成７
年５月２６日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一
丁目１番３号）にＦＥＲＭＢＰ‐５１１３の受託番号
で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。ｄａ
ｐＡを有するプラスミドｐＣＲＤＡＰＡをＫｐｎＩおよ
びＥｃｏＲＩにて切断し、ｄａｐＡを含むＤＮＡ断片を
得、ベクタープラスミドｐＨＳＧ３９９をＫｐｎＩおよ
びＥｃｏＲＩにて切断したものと連結した。得られたプ
ラスミドをｐ３９９ＤＰＳと命名した（図２３）。

【００７３】（３）野生型及び変異型ｌｙｓＣの取得及
びそれらを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９株、及びＡＴＣＣ１３８６９株より変異処理に
より得られたＬ−リジン生産性変異株ＡＪ３４４５を染
色体ＤＮＡの供与体として用いた。ＡＪ３４４５株は、
変異によりｌｙｓＣがリジン及びスレオニンによる協奏
阻害が実質的に解除されている（Journal of Biochemis
try 68,701-710(1970)）。染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法
（polymerase chain reaction;White,T,J.et al;Trends
Genet.5,185(1989)参照）によりｌｙｓＣを含むＤＮＡ
断片を増幅した。増幅に用いたＤＮＡプライマーはコリ
ネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となってい
る配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-120
4,Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にして
ｌｙｓＣをコードする約１６４３ｂｐの領域を増幅すべ
く、配列番号１９及び配列番号２０に示す塩基配列を有
する２３ｍｅｒ及び２１ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを合成し
た。ＤＮＡの合成は常法に従って合成した。ＰＣＲ反応
は常法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅されたＤＮ
Ａの配列を配列番号２１に示す。増幅された１６４３ｂ
ｐの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認し
た後、ゲルより切り出した断片を常法により精製し、制
限酵素ＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩにて切断した。遺伝子断
片のクローン化用ベクターにはｐＨＳＧ３９９を用い
た。ｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＳｍａＩ及び制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩにて切断し、増幅されたｌｙｓＣ断片と連結し
た。ＤＮＡの連結はＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用い、指定された方法にて行なった。この様
にしてｐＨＳＧ３９９にブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム染色体より増幅されたｌｙｓＣ断片が連結
されたプラスミドを作製した。野生株であるＡＴＣＣ１
３８６９株由来のｌｙｓＣを有するプラスミドをｐ３９
９ＡＫＹ、Ｌ−リジン生産菌であるＡＪ３４４５由来の
ｌｙｓＣを有するプラスミドをｐ３９９ＡＫ９と命名し
た（図２４）。

【００７４】（４）ｄａｐＢの取得及びそれを含有する
プラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ＡＴ
ＣＣ１３８６９株を染色体ＤＮＡの供与体として用い
た。ＡＴＣＣ１３８６９株より常法に従い、染色体ＤＮ
Ａを調製した。染色体ＤＮＡよりＰＣＲによりｄａｐＢ
を含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたＤＮＡプラ
イマーはブレビバクテリウム・ラクトファ2743-2749(19
93)参照）を基にしてＤＤＰＲをコードする約２．０ｋ
ｂの領域を増幅すべく、配列表の配列番号２２及び２３
に記載の塩基配列を有する各々２３ｍｅｒのＤＮＡ断片
を合成した。ＤＮＡの合成及びＰＣＲ反応は、常法に従
って行った。増幅されたＤＮＡの配列を配列番号２４に
示す。増幅された２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン
化用ベクターにはｐＣＲ‐Ｓｃｒｉｐｔ（ｌｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社製）を用い、増幅したｄａｐＢ断片と連結し
た。この様にしてｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたｄ
ａｐＢ断片２００１ｂｐの挿入されたプラスミドを作製
した。この様にして取得したＡＴＣＣ１３８６９由来の
ｄａｐＢを有するプラスミドをｐＣＲＤＡＰＢと命名し
た（図２５）。エシェリヒアコリにｐＣＲＤＡＰＢを導
入して得られた形質転換株ＡＪ１３１０７株は、平成７
年５月２６日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一
丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−５１１４の受託番号
で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

【００７５】（５）ｌｙｓＣ、ｄａｐＡ及びｄａｐＢを
含有するプラスミドの作製 ｐ３９９ＤＰＳをＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩにて切断し、平
滑末端化した後、ｄａｐＡ遺伝子断片を得た。この断片
を、ｐ３９９ＡＫ９をＳａｌＩにて切断し平滑末端化し
たものとライゲーションし、変異型ｌｙｓＣとｄａｐＡ
が共存したプラスミドｐ３９９ＣＡを構築した。ｄａｐ
Ｂを有するプラスミドｐＣＲＤＡＰＢをＥｃｏＲＩにて
切断、平滑末端化した後、ＳａｃＩにて切断し、ｄａｐ
Ｂを含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ｄａｐＡ及び
変異型ｌｙｓＣを有するプラスミドｐ３９９ＣＡをＳｐ
ｅＩにて切断、平滑末端化した後、ＳａｃＩにて切断
し、先に得た２．０ｋｂのｄａｐＢ断片とライゲーショ
ンし、変異型ｌｙｓＣ、ｄａｐＡ及びｄａｐＢを含むプ
ラスミドを得た。このプラスミドをｐ３９９ＣＡＢと命
名した（図２６）。次にｐ３９９ＣＡＢをＳａｃＩＩに
て切断し、平滑末端化した後、ｄａｐＡとｄａｐＢ断片
を得た。この断片をｐＬＹＳＡｍをＢａｍＨＩにて切断
し平滑末端化したものと連結した。この様にしてコリネ
型細菌中で自律増殖可能でかつｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌ
ｙｓＡを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミ
ドをｐＡＢＬｍと命名した。ｐＡＢＬｍ構築の過程を図
２１に示す。

【００７６】ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを含むプラ
スミドのブレビバクテリウム・ラクトファ ーメンタムＴ
ｎ７１５６−Ｃｉｎｔ−Ｙ２への導入 作製されたｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを含むプラス
ミドｐＡＢＬｍをブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＴｎ７１５６−Ｃｉｎｔ−Ｙ２に導入した。プラ
スミド導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平２
−２０７７９１号公報）によった。形質転換体の選択
は、プラスミドが持つ薬剤耐性マーカー、カナマイシン
耐性遺伝子と染色体上に増幅されているテトラサイクリ
ン耐性遺伝子によった。よって、２５μg/mlのカナマイ
シン（Ｋｍ）と１．５μg/mlのテトラサイクリン（Ｔ
ｃ）を含む完全培地にて形質転換体の選択を行った。形
質転換体をＴｎ７１５６−Ｃｉｎｔ−Ｙ２／pABLmと命
名した。

【００７７】ｌｙｓＣ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡ
を含むプラスミドのブレビバクテリウム・ ラクトファー
メンタム野生型株への導入 （１）ｐ３９９ＣＡＢにＢｒｅｖｉ．−ｏｒｉを導入し
た。Ｂｒｅｖｉ．−ｏｒｉを有するプラスミドｐＨＫ４
を制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、切断面を平滑末端化
した。平滑末端化はＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ
（宝酒造社製）を用い、指定された方法にて行なった。
平滑末端化後、リン酸化済みＫｐｎＩリンカー（宝酒造
社製）を連結し、ｐＨＫ４よりＢｒｅｖｉ．‐ｏｒｉ部
分のＤＮＡ断片をＫｐｎＩのみによる切断によって切り
出される様改変した。このプラスミドをＫｐｎＩにより
切断し、生じたＢｒｅｖｉ．‐ｏｒｉＤＮＡ断片を同じ
くＫｐｎｌにて切断したｐ３９９ＣＡＢに連結し、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型ｌｙｓＣ、ｄａ
ｐＡおよびｄａｐＢを併せ持つプラスミドを作製し、ｐ
ＣＡＢと命名した。ｐＣＡＢの構築の過程を図２６に示
す。ｐＨＫ４は、ｐＨＣ４をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで
切断し、Ｂｒｅｖｉ．−ｏｒｉ断片を抽出し、同じくＫ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩにて切断したｐＨＳＧ２９８に連
結することによって構築される（特開平５−７４９１号
公報参照）。ｐＨＫ４は、宿主にカナマイシン耐性を付
与する。尚、ｐＨＫ４を保持するエシェリヒア・コリＡ
Ｊ１３１３６は、平成７年８月１日に、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国
茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ‐５１８６としてブタペスト条約に基づき寄託さ
れている。

【００７８】（２）ｌｙｓＡを有するプラスミドｐ２９
９ＬＹＳＡをＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、平滑
末端化した後、ｌｙｓＡ遺伝子断片を得た。この断片
を、ｐＣＡＢをＨｐａＩにて切断したものとライゲーシ
ョンし、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型ｌ
ｙｓＣ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、及びｌｙｓＡを併せ持つ
プラスミドを作製し、ｐＣＡＢＬと命名した。 ｐＣＡ
ＢＬ構築の過程を図２７に示す。尚、ｐＣＡＥＬ中で、
１ｙｓＡ遺伝子断片はｄａｐＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片
内のＨｐａｌ部位に挿入されているが、このＨｐａＩ部
位は、ｄａｐＢ遺伝子のプロモーターよりも上流（配列
番号２４中塩基番号６１１〜６１６）に位置しており、
ｄａｐＢ遺伝子は分断されていない。作製されたｌｙｓ
Ｃ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを含むプラスミドｐ
ＣＡＢＬをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
野生株ＡＪ１２０３６に導入し、５μg/mlのクロラムフ
ェニコール（Ｃｍ）を含む完全培地にて形質転換体の選
択を行った。形質転換体をＡＪ１２０３６／pCABLと命
名した。

【００７９】構築した菌株の培養評価 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ＡＪ
１２０３６形質転換体ＡＪ１２０３６／pCABL及びＴｎ
７１５６−Ｃｉｎｔ−Ｙ２／pABLmをＬ−リジン生産培
地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−
リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。 （Ｌ−リジン生産培地）炭酸カルシウム以外の下記成分
（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１
１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カル
シウムを５０ｇ加える。 グルコース 100g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55g ＫＨ2ＰＯ4 1g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1g ビオチン 500μg チアミン 2000μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01g ニコチンアミド 5mg タンパク質加水分解物（豆濃） 30ml 炭酸カルシウム 50g 上記組成の培地に親株及び形質転換体を植菌し、31.5℃
にて往復振盪培養を行った。培養７２時間後のＬ−リジ
ン生成量、生育（O_D562）、培養終了時における安定性
を表５に示す。生育は１０１倍希釈した後、５６２ｎｍ
にてＯＤを測定することにより定量した。また、安定性
については、培養終了時における培養液を希釈後完全培
地上にて生育させ、生育したコロニーを薬剤を含むプレ
ート上での生育の割合で示した。

【００８０】

【表５】

【００８１】以上に示す様に、染色体上においてｌｙｓ
Ｃを増強させた株を用いても、プラスミド上にてｌｙｓ
Ｃを増強した場合と同様、リジン生産性は向上した。ま
た、安定性はＡＪ１２０３６／pCABLが９０％であるの
に対し、Ｔｎ７１５６−Ｃｉｎｔ−Ｙ２／pABLmは１０
０％であった。

【００８２】［実施例６］ｐＨＴＮ７１５０の構築 カナマイシン耐性遺伝子が搭載された人工トランスポゾ
ンＴｎ７１４５にはジヒドロジピコリン酸シンターゼを
コードする遺伝子を挿入する良いサイトがないため、新
たに挿入部位が導入されたｐＨＴＮ７１５０を以下のよ
うにして構築した。プラスミドベクターｐＵＣ４Ｋ（フ
ァルマシアバイオテク社製）から制限酵素ＰｓｔＩを用
いてカナマイシン耐性遺伝子を切り出し、それを平滑末
端化した後にｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）のＳｍ
ａＩサイトにクローニングし、ｐＨＹ３００−ＫＭを構
築した。次に、ｐＨＹ３００−ＫＭより制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＸｂａＩを用いてカナマイシン耐性遺伝子を含む
断片を切り出して平滑末端化し、この断片を先に構築し
たｐＨＩＳ７１４上のＩＳ７１４中の制限酵素ＮｈｅＩ
サイトを平滑末端化したところに挿入し、プラスミドｐ
ＨＴＮ７１５０を構築した。ｐＨＴＮ７１５０上に搭載
した人工トランスポゾンＴｎ７１５０はカナマイシン耐
性遺伝子をそのマーカー遺伝子として有しており、Ｂｇ
ｌＩＩサイトが遺伝子導入サイトとして利用可能である
（図３０）。

【００８３】ｐＨＴＮ７１５０とブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム由来のｄａｐＡ遺伝 子の連結 カナマイシン耐性遺伝子が搭載された人工トランスポゾ
ンｐＨＴＮ７１５０にリジン生合成系の遺伝子であるジ
ヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤＤＰＳ）をコードする
遺伝子を以下のようにして挿入した。ｄａｐＡを搭載し
たプラスミドｐ３９９ＤＰＳをＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑末端化し、燐酸化済み
ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造社製）を連結しｄａｐＡ遺
伝子をＢａｍＨＩのみの切断で切り出せるよう改変し
た。このプラスミドをｐ３９９ＤＰＳ２と命名した。こ
のプラスミドをＢａｍＨＩ切断により生じた１．４ｋｂ
のｄａｐＡ断片をＢａｍＨＩと同様の接着末端を生じる
ＢｇｌＩＩで切断したｐＨＴＮ７１５０に連結したプラ
スミドを構築した。このプラスミドをｐＨＴＮ７１５０
Ａと命名した。ｐＨＴＮ７１５０Ａの構築過程を図２８
に示す。

【００８４】人工トランスポゾンＴｎ７１５０Ａのブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム染 色体上への転
移 ｐＨＴＮ７１５０Ａを用いて、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ１２０３６株へｄａｐＡを搭載
した人工トランスポゾン（Ｔｎ７１５０Ａ）が転移した
株を以下のようにして取得した。ｐＨＴＮ７１５０Ａで
ＡＪ１２０３６株を形質転換し、取得した形質転換体を
２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＣＭ２Ｓ
液体培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、トリプトン１０ｇ／
ｌ、シュークロース５ｇ／ｌ、及びＮａＣｌ５ｇ／ｌ）
中に２５℃で一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適宜希
釈して２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２
Ｓ寒天培地に塗布し、３４℃で培養した。出現したコロ
ニーについてクロラムフェニコール感受性株を選択し、
これらの株の中からランダムに数株ずつ選び染色体ＤＮ
Ａを調製し、ｄａｐＡ断片をプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼーションを行い、人工トランスポゾンの転移
を確認した。以上のようにして取得した人工トランスポ
ゾンが転移した株をＡＪ１２０３６：：Ａと命名した。

【００８５】ｐＣＢＬｍｃの構築と菌株作製 ｐＡＭ３３０とｐＨＳＧ３９９のシャトルベクターであ
るｐＶＣ７を用い、変異型ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ、ｌｙｓ
Ａを有するプラスミドを以下のようにして構築した。ｄ
ａｐＢを搭載したｐＣＲＤＡＰＢをＳａｃＩ処理後、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端化し、燐酸化
済みＰｓｔＩリンカー（宝酒造社製）を連結したプラス
ミドを構築した。取得したプラスミドをｐＣＲＤＡＰＢ
２と命名した。このプラスミドをＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ
で切断し生じた２．０ｋｂのｄａｐＢ断片を同じくＢａ
ｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断したｐＶＣ７へ挿入した。この
プラスミドをｐＢｍｃと命名した。ｌｙｓＣを搭載した
ｐ３９９ＡＫ９をＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩで切断し、生
じた１．６ｋｂのｌｙｓＣ断片を同じくＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したｐＢｍｃに連結し、ｄａｐＢ，ｌｙ
ｓＣを搭載したプラスミドを構築した。このプラスミド
をｐＢＣｍｃと命名した。ｌｙｓＡを搭載したｐ３９９
ＬＹＳＡをＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ処理により平滑末端化し、燐酸化済みＫｐｎＩリンカ
ーを連結し、ＫｐｎＩによりｌｙｓＡが切り出せるよう
改変したプラスミドを構築した。このプラスミドをｐ３
９９ＬＹＳＡ２と命名した。ｐ３９９ＬＹＳＡ２をＫｐ
ｎＩで切断し生じた３．６ｋｂのｌｙｓＡ断片をｐＢＣ
ｍｃをＥｃｏＲＩで切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
により平滑末端化し、燐酸化済みＫｐｎＩリンカーを挿
入した断片に連結した。取得したプラスミドをｐＣＢＬ
ｍｃと命名した。このプラスミドはエシェリヒア・コリ
とコリネ型細菌中で自立複製可能で、かつ宿主にクロラ
ムフェニコール耐性を付与し、変異型ｌｙｓＣとｄａｐ
ＢとｌｙｓＡを併せ保持しているプラスミドである。ｐ
ＣＢＬｍｃの構築過程を図２９に示す。上記のようにし
て構築されたｐＣＢＬｍを染色体上に人工トランスポゾ
ンＴｎ７１５０Ａが転移したＡＪ１２０３６：：Ａ株に
導入した。プラスミド導入の方法は、電気パルス法（杉
本ら特開平２ー２０７７９１号公報）によった。形質転
換体の選択は５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃ
ｍ）と２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含む上
記ＣＭ２Ｓ培地にて行った。構築した菌株をＡＪ１２０
３６：：Ａ／ｐＣＢＬｍｃと命名した。

【００８６】構築した菌株の培養評価 親株と、取得した形質転換体ＡＪ１２０３６／ｐＣＡＢ
Ｌ及びＡＪ１２０３６：：Ａ／ｐＣＢＬｍｃをＬ−リジ
ン生産培地にて培養し、そのリジン生産能を評価した。
その結果を表６に示す。

【００８７】

【表６】

【００８８】以上に示す様に、染色体上においてｄａｐ
Ａを増強させた株を用いても、プラスミド上にてｌｙｓ
Ｃを増強した場合と同様、リジン生産性は向上した。ま
た、安定性はＡＪ１２０３６／ｐＣＡＢＬが９０％であ
るのに対し、ＡＪ１２０３６：：Ａ／ｐＣＢＬｍｃは１
００％であった。

【００８９】［実施例７］トランスポゾンユニット内にトランスポゼースを含まな
い人工トランスポゾンの構築

【００９０】大腸菌由来Ｔｒｃプロモーター等によるト
ランスポゼース発現プラスミド構築 プラスミドｐＨＩＳ７１４を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｂ
ａＩによって切断し、ＩＳ７１４の５’側インバーテッ
ドリピート（ＩＲ）を除いたトランスポゼースをコード
する遺伝子を含む断片を取得し、このＤＮＡ断片をプラ
スミドベクターｐＵＣ１９のＸｂａＩサイトに導入した
プラスミドＴｎｐＬ／ｐＵＣ１９を構築した。さらにＴ
ｎｐＬ／ｐＵＣ１９を制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで切
断することによって、ＩＳ７１４の終止コドンと３’側
インバーテッドリピート（ＩＲ）を含む配列を除去し、
そこに以下に示す配列の合成二本鎖ＤＮＡをライゲーシ
ョンし、挿入した。 5´-CCGGACAGCTCACCCACAAAATCAATGCACTCTAAAAAGGTACCT - 3´配列番号２５ 3´- TGTCGAGTGGGTGTTTTAGTTACGTGAGATTTTTCCATGGAGATC- 5´配列番号２６ このことにより、ＴｎｐＬ／ｐＵＣ１９上のトランスポ
ゼース３’側に存在していたＩＲを除去したプラスミド
ＯＲＦＬ／ｐＵＣ１９を構築した。次にこのＯＲＦＬ／
ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断し、ト
ランスポゼースを含む約１．５ｋｂの遺伝子断片を取得
した。このトランスポゼース遺伝子断片をプラスミドベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）のＳｍａＩか
らＸｂａＩの間を除去したところに挿入した後に、制限
酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで切り出した。このＥｃｏＲ
Ｉ−ＫｐｎＩのトランスポゼース遺伝子断片をＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化したものを、プラスミドベ
クターｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）を制限酵素Ｐｖｕ
IIによって部分分解し、マルチクローニングサイトを含
む約０．３ｋｂの断片を除いたところにライゲーション
し、プラスミドｐＯＲＦ１を構築した（図１０）。

【００９１】一方、先に取得したプラスミドｐＨＩＳ７
１４のＮｈｅＩ−ＸｂａＩ切断断片を平滑末端化し、プ
ラスミドベクターｐＵＣ１９のＰｓｔＩサイトを平滑末
端化したところに導入したプラスミドＴｎｐ（Ｐｓｔ）
／ｐＵＣ１９を構築した。このＴｎｐ（Ｐｓｔ）／ｐＵ
Ｃ１９上で、トランスポゼース遺伝子中の一部の塩基置
換をＵ．Ｓ．Ｅ． Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ
（ファルマシア バイオテク社製）を用いて行った。置
換した塩基はＩＳ７１４の配列上では２８８番目の塩基
にあたるＧであり、これをＣに変更した。これはＧＴＧ
のＧＴＣへの変更であり、アミノ酸レベルでの変化では
ない。塩基置換の行われたプラスミドはＴｎｐ（Ｐｓ
ｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９と命名した。ｐＯＲＦ１上でトラン
スポゼース前半部分遺伝子中に存在する制限酵素サイト
ＳｍａＩとＮａｅＩの間を除去したところに、Ｔｎｐ
（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩとＮａｅ
Ｉで切断することによって得られるトランスポゼース前
半部分遺伝子断片（ＧＴＧ→ＧＴＣの変異が含まれる）
をライゲーションし、ｐＯＲＦ２を構築した。ｐＯＲＦ
２のＳｍａＩサイトからＸｂａＩサイトの間を除去して
平滑末端化したところに、ｐＢＳＦ２−ＳＤ７から制限
酵素ＮａｅＩとＨｉｎｄIIIを用いて切り出したトリプ
トファンオペロンアテニュエーターを含むＤＮＡ断片
を、平滑末端化した後に挿入した。ここで構築したプラ
スミドをｐＯＲＦ３と命名した。プラスミドｐＢＳＦ２
−ＳＤ７（ＷＯ９２／１４８３２）はエシェリヒア・コ
リHB101に導入されて、得られた形質転換体はエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２４４８と命名された。同株は、平成
元年６月１日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１
番３号）に寄託され受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１０７５８
が付与された。また、平成４年２月１９日付でブタペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ‐３７５３が付与されている。

【００９２】ｐＯＲＦ３を制限酵素ＳａｌＩとＢｐｕ１
１０２Ｉで切断してトランスポゼース前半部分遺伝子断
片を除いたところにＴｎｐ（Ｐｓｔ）／ｐＵＣ１９を制
限酵素ＳａｌＩとＢｐｕ１１０２Ｉで切断して得られた
トランスポゼース前半部分遺伝子断片をライゲーション
し、ｐＯＲＦ４を構築した（図１１）。また、ＴｎｐＬ
／ｐＵＣ１９をＳａｃＩで切断した後に、ＢＡＬ３１ヌ
クレアーゼで３０℃、２０分間分解し、トランスポゼー
ス遺伝子の開始コドン近傍を上流側から削除する。その
後、削除を行った末端を平滑末端化した後に、トランス
ポゼース遺伝子断片をＳｐｈＩサイトを利用して切り出
し、ｐＨＳＧ３９８をＳｍａＩとＳｐｈＩで切断したと
ころに挿入した。このようにして構築できたプラスミド
をｄｅｌＴｎｐ５／３９８と命名した。ｄｅｌＴｎｐ５
／３９８を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIで切断して
取得したトランスポゼース前半部分遺伝子断片を平滑末
端化した後に、プラスミドベクターｐＫＫ２３３−２
（ファルマシア バイオテク社製）をＮｃｏＩとＨｉｎ
ｄIIIで切断して平滑末端化したところにライゲーショ
ンし、ｐＴｒｃ−ＯＲＦを構築した。ｐＴｒｃ−ＯＲＦ
をＳｓｐＩとＢｐｕ１１０２Ｉで切断することによって
得られるＴｒｃプロモーターとトランスポゼース前半部
分遺伝子を含む断片を、ｐＯＲＦ３をＸｂａＩで切断し
て平滑末端化した後に、更にＢｐｕ１１０２Ｉで切断し
てそのトランスポゼース前半部分遺伝子断片を除去した
ところに挿入して、ｐＯＲＦ７を構築した（図１２）。

【００９３】また、ｄｅｌＴｎｐ５／３９８を制限酵素
ＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIで切断して取得したトランスポ
ゼース前半部分遺伝子断片を、プラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８のＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIの間にクローニングし
た。そのプラスミドのＢｓｍＩとＮａｅＩの間を除去し
て、これとＴｎｐ（Ｐｓｔ）Ｍ／ｐＵＣ１９を制限酵素
ＢｓｍＩとＮａｅＩで切断することによって得られるト
ランスポゼース前半部分遺伝子断片（Ｇ→Ｃへの置換
型）とをライゲーションし、ｄｅｌＴｎｐ５Ｍ／１８を
構築した。ｄｅｌＴｎｐ５Ｍ／１８をＫｐｎＩとＨｉｎ
ｄIIIで切断することによって得られたトランスポゼー
ス前半部分遺伝子断片を平滑末端化したものを、ｐＫＫ
２３３−２をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで切断して平滑末
端化したところにライゲーションし、ｐＴｒｃ−Ｔｎｐ
Ｍを構築した。ｐＴｒｃ−ＴｎｐよりｐＯＲＦ７を構築
した方法と同様の方法を用いて、ｐＴｒｃ−ＴｎｐＭと
ｐＯＲＦ３よりｐＯＲＦ８を構築した（図１３）。

【００９４】人工トランスポゾンユニットとユニット外
にトランスポゼース発現系を搭載したコリ ネ型細菌導入
用プラスミドの構築 前項のプラスミドｐＯＲＦ３、ｐＯＲＦ４、ｐＯＲＦ
７、ｐＯＲＦ８を材料に各プラスミドの構築を行った。
以下にｐＯＲＦ３からｐＯＲＦ４１を構築する手順を示
す。まず、ｐＨＩＳ７１４をＮｈｅＩとＳａｃIIで切断
し、トランスポゼース遺伝子の大部分を除去したところ
に、以下の配列の二本鎖合成ＤＮＡを挿入し、ｐＨＴＮ
７１６０を構築した。 5' - CTAGCTCGAGATATCAGATCTACTAGTCGACCGC - 3' 配列番号２７ 3' - GAGCTCTATAGTCTAGATGATCAGCTGG - 5' 配列番号２８ ｐＨＴＮ７１６０を制限酵素ＫｐｎＩで切断し平滑末端
化した後に、更にＢｇｌＩで切断することによってＩＳ
７１４の両側のインバーテッドリピート（ＩＲ）とコリ
ネ型細菌内で機能する温度感受性複製起点を含む断片を
取得した。また、ｐＯＲＦ３を制限酵素ＥａｒＩで切断
し平滑末端化した後に、更にＢｇｌＩで切断する。そこ
に上記ｐＨＴＮ７１６０由来断片を挿入し、ｐＯＲＦ４
１−ｐｒｅを構築した。次に、ｐＯＲＦ４１−ｐｒｅを
ＥｃｏＲ■で切断したところに、ｐＢＲ３２２由来のＴ
ｃ耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩの平滑末端化
断片を挿入し、ｐＯＲＦ４１を構築した（図１４）。同
様の方法を繰り返して、ｐＯＲＦ４からはｐＯＲＦ３１
−ｐｒｅを経由してｐＯＲＦ３１を、ｐＯＲＦ７からは
ｐＯＲＦ７１−ｐｒｅを経由してｐＯＲＦ７１を、ｐＯ
ＲＦ８からはｐＯＲＦ８１−ｐｒｅを経由してｐＯＲＦ
８１を構築した。プラスミドｐＯＲＦ８１はエシェリヒ
ア・コリＡＪ１３２０８に保持されている。同株は、平
成８年６月３日付で通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目
１番３号）にブタペスト条約に基づいて国際寄託され、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐５５５７が付与されている。

【００９５】また、ｐＯＲＦ３をＸｂａＩとＥａｒＩで
切断した後に平滑末端化し、セルフライゲーションさ
せ、トランスポゼース遺伝子を含まないｐＯＲＦＣ０を
構築した（図１５）。ｐＯＲＦ３よりｐＯＲＦ４１を構
築したときと同様の方法でｐＯＲＦＣ０よりｐＯＲＦＣ
２−ｐｒｅを経由してトランスポゾンユニット（トラン
スポゼース遺伝子を含まない）のみからなるｐＯＲＦＣ
２を構築した。これらの最終的に構築されたプラスミド
上にはトランスポゼースの構造遺伝子、Ｃｍ耐性遺伝
子、大腸菌内で機能する複製起点、コリネ型細菌内で機
能する温度感受性複製起点、及びＩＳ７１４由来のＩＲ
に挟まれたＴｃ耐性遺伝子が存在する。ただし、ｐＯＲ
ＦＣ２に関してはトランスポゼースの構造遺伝子は存在
しない。ＩＳ７１４の両端のＩＲとＴｃ耐性遺伝子のユ
ニットをトランスポゾンユニットＴｎ７１６２と命名し
た。

【００９６】トランスポゾンユニットの転移によって生
じる染色体上のＴｃ耐性遺伝子を有するト ランスポゾン
ユニットのコピー数の評価 構築したプラスミドの内、ｐＯＲＦ３１、ｐＯＲＦ４
１、ｐＯＲＦ８１、ｐＯＲＦＣ２を用いて転移実験を行
った。転移すると考えられるユニットはトランスポゾン
ユニットＴｎ７１６２である。上記プラスミドを用い
て、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１
２０３６を形質転換し、トランスポゾンユニットＴｎ７
１６２の宿主染色体への転移によって生じる染色体上の
Ｔｎ７１６２のコピー数を評価した。その方法は形質転
換体をＣｍ５μｇ／ｍｌを含む上記ＣＭ２Ｇ液体培地中
に、２５゜Ｃで一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液で適宜
希釈してＴｃを１．５μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌの範
囲で含む上記ＣＭ２Ｇ寒天培地に１００μｌずつ塗布し
た。それらを３４゜Ｃで培養し、出現したコロニーの中
からＣｍ感受性のクローンを選んだ。それらを３４゜Ｃ
で培養し、出現したコロニーの中からランダムに数クロ
ーンを選び、染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素ＰｖｕII
で完全に消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、ニト
ロセルロース（あるいはナイロン、ＰＶＤＦ）フィルタ
ーにブロッテイングした。 このフィルターを３２−Ｐ
ラベルあるいはＥＣＬダイレクトラベリングシステム
（アマシャム社製）にてラベルしたＴｃ耐性遺伝子断片
をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションし、プ
ローブとハイブリダイズするバンドの数を検定した。そ
の結果、表７に示したように、Ｔｃ耐性マーカー遺伝子
をもつトランスポゾンユニットＴｎ７１６２は、ある頻
度で高コピー転移していることが検出された。 この結
果は発現型トランスポゼース遺伝子がプラスミド上のト
ランソポゾンユニット外に存在（ｐＯＲＦ３１，４１，
８１の場合）しても、あるいは染色体上に本来存在する
トランスポゼース（ｐＯＲＦＣ２の場合）によっても機
能していることを示している。

【００９７】

【表７】

【００９８】［実施例８］トランスポゼース発現系のみを搭載したコリネ型細菌用
プラスミドの構築と染色体上のト ランスポゾンユニット
の転移

【００９９】トランスポゼース発現系のみを搭載したコ
リネ型細菌用プラスミドの構築 プラスミドｐＨＩＳ７１４Ｋ１をＥｃｏＯ１０９ＩとＭ
ｒｏＩで切断することによって、ＩＳ７１４を除去した
後、セルフライゲーションを行い、ｐＨＩＳ７１４Ｋｄ
ｅｌを構築した。一方、ｐＯＲＦ３を制限酵素ＥａｒＩ
で切断し平滑末端化した後に、更にＢｇｌＩで切断し
た。そこにｐＨＩＳ７１４Ｋｄｅｌを制限酵素ＫｐｎＩ
で切断し平滑末端化した後に、更にＢｇｌＩで切断する
ことによって得られたコリネ型細菌内で機能する温度感
受性複製起点を含む断片をライゲーションして、ｐＯＲ
Ｆ４０を構築した（図１７）。同様の方法を利用して、
ｐＯＲＦ４からはｐＯＲＦ３０を、ｐＯＲＦ７からはｐ
ＯＲＦ７０を、ｐＯＲＦ８からはｐＯＲＦ８０を、ｐＯ
ＲＦＣ０からはｐＯＲＦＣ１を構築した。

【０１００】トランスポゾンユニットの転移によって生
じる染色体上のＴｃ耐性遺伝子を有するト ランスポゾン
ユニットのコピー数の評価 構築したプラスミドの内、ｐＯＲＦ８０、ｐＯＲＦＣ１
を用いて転移実験を行った。転移すると考えられるユニ
ットはトランスポゾンユニットＴｎ７１６２である。実
施例７にブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡ
Ｊ１２０３６をトランスポゾンユニットＴｎ７１６２を
搭載するプラスミドで形質転換して、トランスポゾンユ
ニットＴｎ７１６２が宿主染色体へ多コピー転移するこ
とを示した。ここで得られた１コピー染色体転移株を宿
主として、さらに上記プラスミドｐＯＲＦ８０及びｐＯ
ＲＦＣ１を導入してトランスポゼース活性を高めた場合
に、染色体上のＴｎ７１６２がさらに転移あるいは複製
するかを、染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーショ
ン解析を行って、そのコピー数を評価した。その方法は
形質転換体をＣｍ５μｇ／ｍｌを含む上記ＣＭ２Ｇ液体
培地中に、２５゜Ｃで一晩培養後、０．９％ＮａＣｌ液
で適宜希釈してＴｃを６μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ
の範囲で含む上記ＣＭ２Ｇ寒天培地に１００μｌずつ塗
布した。それらを３４゜Ｃで培養し、出現したコロニー
の中からＣｍ感受性のクローンを選んだ。これらのＣｍ
感受性のクローンの中からランダムに数クローンを選
び、染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素ＰｖｕIIで完全に
消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、ニトロセルロ
ース（あるいはナイロン、ＰＶＤＦ）フィルターにブロ
ッテイングした。 このフィルターを³2Ｐラベルあるい
はＥＣＬダイレクトラベリングシステム（アマシャム社
製）にてラベルしたＴｃ耐性遺伝子断片をプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションし、プローブとハイブ
リダイズするバンドの数を検定した。その結果、Ｔｃ耐
性マーカー遺伝子をもつトランスポゾンユニットＴｎ７
１６２は、ある頻度で多コピー転移、複製していること
が見出された。

【０１０１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1453 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：1..1453 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を表す記号： 存在位置：130..1440 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1..15 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1339..1453 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：-35 region 存在位置：71..76 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：-10 region 存在位置：92..97 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCCCTTCCG GTTTTGGGGT ACATCACAGA ACCTGGGCTA GCGGTGTAGA CCCGAAAATA 60 AACGAGCCTT TTGTCAGGGT TAAGGTTTAG GTATCTAAGC TAACCAAACA CCAACAAAAG 120 GCTCTACCC ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC ATC TGC 168 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys 1 5 10 CGC ACT GCG GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT GCA GGT 216 Arg Thr Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly 15 20 25 GAT TAC ACC CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAT ACC TCC ACC TGC 264 Asp Tyr Thr Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys 30 35 40 45 CCA GAA TGC TTC CAA CCT GGG GTG TTT CGT CAT CAC ACC CAC CGG ATG 312 Pro Glu Cys Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met 50 55 60 CTC ATT GAT TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT ATC CGT 360 Leu Ile Asp Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg 65 70 75 CTA CCT CGC TAC CGC TGC ACC AAC CCG ACA TGT AAG CAA AAG TAT TTC 408 Leu Pro Arg Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe 80 85 90 CAA GCA GAA CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC CAC CGG 456 Gln Ala Glu Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg 95 100 105 GTC ACC CGC TGG ATT TTG CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG AGT GTT 504 Val Thr Arg Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val 110 115 120 125 CAC GCA ACT GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC TGC CAA 552 His Ala Thr Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln 130 135 140 CTA GCC CTC GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT CAC CAT 600 Leu Ala Leu Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His 145 150 155 CTT GAT GGA GTG TAT GTC ATT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG TCA CAT 648 Leu Asp Gly Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His 160 165 170 AAT AGG GCT AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC GAT ATG 696 Asn Arg Ala Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met 175 180 185 ACC GGG CAT CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA GAT GTC 744 Thr Gly His Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val 190 195 200 205 GTC CCA GGT CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCC TGG CTT GGC TCC CGC 792 Val Pro Gly Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg 210 215 220 GGT GAA CAG TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT GGA TTC 840 Gly Glu Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe 225 230 235 CAA GGC TAC GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT CGT CGC 888 Gln Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg 240 245 250 GTG ATG GAT CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG CTC ACC 936 Val Met Asp Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr 255 260 265 GCC TGC CGG CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT GGT TTA 984 Ala Cys Arg Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu 270 275 280 285 AGC CAG GAT CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG ACC TTG TTG ACC ACG CAC 1032 Ser Gln Asp Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His 290 295 300 AAG TGG TTG AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG TGG GCG 1080 Lys Trp Leu Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala 305 310 315 TAT GAC AAA GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG TAT CAG 1128 Tyr Asp Lys Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln 320 325 330 GCG ATT ATT GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG AAG AAG 1176 Ala Ile Ile Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys 335 340 345 AAA ATG CGG ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG CCG AAT 1224 Lys Met Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn 350 355 360 365 AAG GAA CTC GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTT AAA CGA CTT GGT GAT 1272 Lys Glu Leu Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp 370 375 380 GTG TTG GCG TAT TTC GAC GTA GGA GTC TCC AAC GGA CCA GTC GAA GCC 1320 Val Leu Ala Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala 385 390 395 ATC AAT GGA CGC CTA GAA CAC CTC CGC GGA ATC GCG CTT GGA TTC CGC 1368 Ile Asn Gly Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg 400 405 410 AAC CTC ACC CAC TAC ATC CTT CGA TGC CTC ATC CAC TCC GGA CAG CTC 1416 Asn Leu Thr His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu 415 420 425 ACC CAC AAA ATC AAT GCA CTC TAA AAACGGAAGA GCC 1453 Thr His Lys Ile Asn Ala Leu 430 435

【０１０２】配列番号：２ 配列の長さ：436 amino acids 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys Arg Thr Ala 1 5 10 15 Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly Asp Tyr Thr 20 25 30 Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys Pro Glu Cys 35 40 45 Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met Leu Ile Asp 50 55 60 Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg Leu Pro Arg 65 70 75 80 Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe Gln Ala Glu 85 90 95 Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg Val Thr Arg 100 105 110 Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val His Ala Thr 115 120 125 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln Leu Ala Leu 130 135 140 Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His Leu Asp Gly 145 150 155 160 Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His Asn Arg Ala 165 170 175 Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met Thr Gly His 180 185 190 Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val Val Pro Gly 195 200 205 Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg Gly Glu Gln 210 215 220 Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe Gln Gly Tyr 225 230 235 240 Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg Val Met Asp 245 250 255 Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr Ala Cys Arg 260 265 270 Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu Ser Gln Asp 275 280 285 Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His Lys Trp Leu 290 295 300 Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala Tyr Asp Lys 305 310 315 320 Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln Ala Ile Ile 325 330 335 Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys Lys Met Arg 340 345 350 Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn Lys Glu Leu 355 360 365 Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp Val Leu Ala 370 375 380 Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala Ile Asn Gly 385 390 395 400 Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg Asn Leu Thr 405 410 415 His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu Thr His Lys 420 425 430 Ile Asn Ala Leu 435

【０１０３】配列番号：３ 配列の長さ：15 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： NO 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 ＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧ ＧＴＴＴＴ
１５

【０１０４】配列番号：４ 配列の長さ：１５ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： YES 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 GGCTCTTCCG TTTTT 15

【０１０５】配列番号：５ 配列の長さ：1453 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：1..1453 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を表す記号： 存在位置：130..1440 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1..15 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1339..1453 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：-35 region 存在位置：71..76 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：-10 region 存在位置：92..97 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCCCTTCCG GTTTTGGGGT ACATCACAGA ACCTGGGCTA GCGGTGTAGA CCCGAAAATA 60 AACGAGCCTT TTGTCAGGGT TAAGGTTTAG GTATCTAAGC TAACCAAACA CCAACAAAAG 120 GCTCTACCC ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC ATC TGC 168 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys 1 5 10 CGC ACT GCG GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT GCA GGT 216 Arg Thr Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly 15 20 25 GAT TAC ACC CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAT ACC TCC ACC TGC 264 Asp Tyr Thr Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys 30 35 40 45 CCA GAA TGC TTC CAA CCT GGG GTG TTT CGT CAT CAC ACC CAC CGG ATG 312 Pro Glu Cys Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met 50 55 60 CTC ATT GAT TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT ATC CGT 360 Leu Ile Asp Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg 65 70 75 CTA CCT CGC TAC CGC TGC ACC AAC CCG ACA TGT AAG CAA AAG TAT TTC 408 Leu Pro Arg Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe 80 85 90 CAA GCA GAA CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC CAC CGG 456 Gln Ala Glu Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg 95 100 105 GTC ACC CGC TGG ATT TTG CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG AGT GTT 504 Val Thr Arg Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val 110 115 120 125 CAC GCA ACT GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC TGC CAA 552 His Ala Thr Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln 130 135 140 CTA GCC CTC GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT CAC CAT 600 Leu Ala Leu Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His 145 150 155 CTT GAT GGA GTG TAT GTC ATT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG TCA CAT 648 Leu Asp Gly Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His 160 165 170 AAT AGG GCT AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC GAT ATG 696 Asn Arg Ala Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met 175 180 185 ACC GGG CAT CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA GAT GTC 744 Thr Gly His Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val 190 195 200 205 GTC CCA GGT CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCC TGG CTT GGC TCC CGC 792 Val Pro Gly Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg 210 215 220 GGT GAA CAG TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT GGA TTC 840 Gly Glu Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe 225 230 235 CAA GGC TAC GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT CGT CGC 888 Gln Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg 240 245 250 GTG ATG GAT CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG CTC ACC 936 Val Met Asp Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr 255 260 265 GCC TGC CGG CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT GGT TTA 984 Ala Cys Arg Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu 270 275 280 285 AGC CAG GAT CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG ACC TTG TTG ACC ACG CAC 1032 Ser Gln Asp Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His 290 295 300 AAG TGG TTG AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG TGG GCG 1080 Lys Trp Leu Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala 305 310 315 TAT GAC AAA GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG TAT CAG 1128 Tyr Asp Lys Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln 320 325 330 GCG ATT ATT GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG AAG AAG 1176 Ala Ile Ile Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys 335 340 345 AAA ATG CGG ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG CCG AAT 1224 Lys Met Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn 350 355 360 365 AAG GAA CTC GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTT AAA CGA CTT GGT GAT 1272 Lys Glu Leu Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp 370 375 380 GTG TTG GCG TAT TTC GAT GTT GGT GTC TCC AAC GGT CCG GTC GAA GCG 1320 Val Leu Ala Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala 385 390 395 ATC AAC GGA CGG TTG GAG CAT TTG CGT GGG ATT GCT CTA GGT TTC CGT 1368 Ile Asn Gly Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg 400 405 410 AAT TTG AAC CAC TAC ATT CTG CGG TGC CTT ATC CAT TCA GGG CAG TTG 1416 Asn Leu Asn His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu 415 420 425 GTC CAT AAG ATC AAT GCA CTC TAA AACAGGAAGA GCC 1453 Val His Lys Ile Asn Ala Leu 430 435

【０１０６】配列番号：６ 配列の長さ：436 amino acids 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys Arg Thr Ala 1 5 10 15 Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly Asp Tyr Thr 20 25 30 Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys Pro Glu Cys 35 40 45 Phe Gln Pro Gly Val Phe Arg His His Thr His Arg Met Leu Ile Asp 50 55 60 Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg Leu Pro Arg 65 70 75 80 Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe Gln Ala Glu 85 90 95 Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg Val Thr Arg 100 105 110 Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val His Ala Thr 115 120 125 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln Leu Ala Leu 130 135 140 Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His Leu Asp Gly 145 150 155 160 Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His Asn Arg Ala 165 170 175 Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met Thr Gly His 180 185 190 Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val Val Pro Gly 195 200 205 Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg Gly Glu Gln 210 215 220 Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe Gln Gly Tyr 225 230 235 240 Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg Val Met Asp 245 250 255 Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr Ala Cys Arg 260 265 270 Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu Ser Gln Asp 275 280 285 Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Thr Leu Leu Thr Thr His Lys Trp Leu 290 295 300 Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala Tyr Asp Lys 305 310 315 320 Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln Ala Ile Ile 325 330 335 Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys Lys Met Arg 340 345 350 Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn Lys Glu Leu 355 360 365 Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp Val Leu Ala 370 375 380 Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala Ile Asn Gly 385 390 395 400 Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg Asn Leu Asn 405 410 415 His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu Val His Lys 420 425 430 Ile Asn Ala Leu 435

【０１０７】配列番号：７ 配列の長さ：15 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： NO 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 GGCCCTTCCG GTTTT 15

【０１０８】配列番号：８ 配列の長さ：15 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： YES 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 GGCTCTTCCG GTTTT 15

【０１０９】配列番号：９ 配列の長さ：1279 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：1..1279 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1..14 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1266..1279 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGGACTGACC CCTGTTTGGT GGACACCTTG AAACCAGCAT GATGCTGGAA AGGTAATCTG 60 CCACCATGCC ACGCAAGACC TATACAGAGG AGTTCAAGCG CGATGCCGTC GCCTTGTACG 120 AGAACTCCCC AGAGGCTTCG ATCCAGACCA TCGCCACCGA TCTCGGGGTC AACCGCGCCA 180 CGTTGGCGAA CTGGGTGAAA AAATACGGCA CCGCAGGCTC CCAACGAAAC ACCCTCGCCA 240 GCCTCTGTGA ACGAGGCTGA GCAGATCCGG AAACTGGAAC GGGAAAACGC TCGCTTGAGA 300 GAAGAGCGCG ATATCCTGCG GAAAGCTGCA AAATATTTCG CGGAAGAGAC GAATTGGTGA 360 TCCGCTTCCG GTTCGTTGAT GACGCCTCCA AGACCTACTC GGTCAAGCGG ATATGTGACG 420 TCCTCAAACT CAACAGGTCT TCCTACTATA AATGGAAAAG TACCTGCTCA GCACGCAGGA 480 AACGCCTCAT GTCGACGCGA TCCTCGGGGC TCGAGTCAAG GCTGTCTTCA CCACCGAAAA 540 TGGTTGTTAT GGGGCCAAGC GGATCACCGC TGAACTCAAA GACCAGGTGG ATCATGACCC 600 CGTAAATCAC AAGCGGGTCG CTCGGGTGAT GCGCTCGTTG AAGCTGTTTG GCTACACAAA 660 TAAACGCAAG GTCACCACCA CTGTGTCGGA TAAAACCAAG ACAGTGTTTC CTGACCTTGT 720 CGGCCGGAAG TTCACCGCTA ATAAGCCAAA TCAGGTGTAC GTCGGGACAT CACGTACCTG 780 CCGATTGCTG ATGGGTCGAA TATGTACCTG GCTACGGTCA TTGACTGCTA TTCCCGCAGG 840 TTGGTGGGCT TTTCTATCGC ACATCACATG CGTACCTCCC TGGTGCAGAC GCGCTGCTGA 900 TGGCTAAGGG CCAGCGCGAA GCTGACGGGG GCGATCTTTC ACTCGGATCA CGGAAGTGTT 960 TACACTTCTC ACGCATTCCA GACACCTGTA AAGACCTGGG ATAAGGCAGT CGATGGGATC 1020 AATCGGCACC AGTGCGACAA TGCCTCGCGG AGTCCTTCAA CGCAGCACTG AAGCGGAAGT 1080 CCTCCAGGAT TCCAAGACAT TCATGAACCA GTTGCGCTGT CGCCGGGACG TCTTCCGCTG 1140 GTGTACCCGC TACAACATGG TGCGCCGGCA TTCCTGGTGT AAATATCTCG CCCTGCGGTG 1200 TTTGAGAAGC GCTGTCCTGC TATCCTGAAA TCTGCTTCCT GATCAAATCC TCCGTGTCTA 1260 CTATCCGGGG GTCGGGCCC 1279

【０１１０】配列番号：１０ 配列の長さ：14 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： NO 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 GGGACTGACC CCTG 14

【０１１１】配列番号：１１ 配列の長さ：14 base pairs 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス： YES 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム （Brevibacteriu
m lactofermentum） 株名：AJ12036 配列 GGGCCCGACC CCCG 14

【０１１２】配列番号：１２ 配列の長さ：8 bases 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGTTTATT 8

【０１１３】配列番号：１３ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: NO 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23

【０１１４】配列番号：１４ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: YES 配列 CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23

【０１１５】配列番号：１５ 配列の長さ: 3579 base pairs 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: Genomic DNA 起源: 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム (Brevibacteriu
m lactofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 533..2182 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 2188..3522 配列 GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60 TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120 GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180 GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240 GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300 AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360 CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420 CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480 AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535 Met 1 ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583 Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val 5 10 15 TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631 Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val 20 25 30 GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679 Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile 35 40 45 GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727 Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala 50 55 60 65 ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775 Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala 70 75 80 GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823 Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala 85 90 95 CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871 Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly 100 105 110 AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919 Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser 115 120 125 GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967 Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala 130 135 140 145 GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015 Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val 150 155 160 ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063 Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe 165 170 175 GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111 Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp 180 185 190 GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159 Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu 195 200 205 AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207 Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu 210 215 220 225 TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255 Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser 230 235 240 CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303 Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser 245 250 255 CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351 Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp 260 265 270 AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399 Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr 275 280 285 GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447 Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp 290 295 300 305 GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495 Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser 310 315 320 CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543 Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly 325 330 335 TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591 Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro 340 345 350 GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639 Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp 355 360 365 GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687 Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu 370 375 380 385 GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735 Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu 390 395 400 ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783 Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp 405 410 415 GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831 Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His 420 425 430 GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879 Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr 435 440 445 GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927 Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp 450 455 460 465 CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975 Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala 470 475 480 GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023 Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala 485 490 495 GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071 Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val 500 505 510 GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119 Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala 515 520 525 GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167 Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser 530 535 540 545 GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214 Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu 550 1 5 CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly 10 15 20 25 GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310 Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr 30 35 40 GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358 Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys 45 50 55 CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406 Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala 60 65 70 TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454 Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu 75 80 85 GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu 90 95 100 105 GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys 110 115 120 GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val 125 130 135 GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646 Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala 140 145 150 GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694 Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile 155 160 165 GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742 Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys 170 175 180 185 TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790 Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala 190 195 200 GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838 Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val 205 210 215 GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886 Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg 220 225 230 GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934 Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu 235 240 245 CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982 Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala 250 255 260 265 GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030 Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala 270 275 280 GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078 Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu 285 290 295 GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126 Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr 300 305 310 GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174 Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg 315 320 325 CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222 Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala 330 335 340 345 CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270 Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu 350 355 360 GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318 Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly 365 370 375 GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366 Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly 380 385 390 GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser 395 400 405 TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462 Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala 410 415 420 425 GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu 430 435 440 TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562 Ser Leu Glu Ala 445 GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579

【０１１６】配列番号：１６ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス： ＮＯ 配列 ＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴ ＣＧＣＡＡＡＴＧＧＣ ＡＡＣ
２３

【０１１７】配列番号：１７ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: YES 配列 GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23

【０１１８】配列番号：１８ 配列の長さ: 1411 base pairs 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: Genomic DNA 起源: 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム (Brevibacteriu
m lactofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 311..1213 配列 CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60 TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120 ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC 180 GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT 240 GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC 349 Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His 1 5 10 TTC GGC ACC GTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA 397 Phe Gly Thr Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly 15 20 25 GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT 445 Asp Ile Asp Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp 30 35 40 45 AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA 493 Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro 50 55 60 ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG 541 Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu 65 70 75 GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC 589 Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn 80 85 90 ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA 637 Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala 95 100 105 GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG 685 Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu 110 115 120 125 GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA 733 Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro 130 135 140 ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT 781 Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser 145 150 155 GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829 Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys 160 165 170 GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877 Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr 175 180 185 GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925 Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu 190 195 200 205 GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973 Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro 210 215 220 ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021 Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val 225 230 235 CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069 Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln 240 245 250 GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117 Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln 255 260 265 GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG 1165 Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu 270 275 280 285 CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213 Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300 TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273 AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333 CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393 TCAAGGATCC CAACATTC 1411

【０１１９】配列番号：１９ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス: NO 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23

【０１２０】配列番号：２０ 配列の長さ: 21 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス: YES 配列 ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

【０１２１】配列番号：２１ 配列の長さ: 1643 base pairs 配列の型: 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: Genomic DNA 起源: 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム (Brevibacteriu
m lactofermentum) 株名： ATCC 13869 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

【０１２２】配列番号：２２ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: NO 配列 GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23

【０１２３】配列番号：２３ 配列の長さ: 23 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: YES 配列 CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23

【０１２４】配列番号：２４ 配列の長さ： ２００１ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型： 核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: Genomic DNA 起源: 生物名： フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム (Brevibacteriu
m lactofermentum) 株名： ATCC 13869 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 730..1473 配列 GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT 60 GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG 120 ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180 TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240 AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300 GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360 ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG 420 AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA 480 AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT 540 AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT 600 GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT 660 TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA 720 AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1 5 10 GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG 816 Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu 15 20 25 CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC 864 Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp 30 35 40 45 AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG 912 Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met 50 55 60 GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA 960 Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly 65 70 75 ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT 1008 Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu 80 85 90 GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC 1056 Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile 95 100 105 TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC 1104 Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe 110 115 120 125 GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA 1152 Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala 130 135 140 CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC 1200 Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg 145 150 155 AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT 1248 Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu 160 165 170 GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC 1296 Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val 175 180 185 CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG 1344 Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln 190 195 200 205 GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT 1392 Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe 210 215 220 GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC 1440 Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly 225 230 235 CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC 1493 Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 240 245 GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT 1553 GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT 1613 TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA 1673 GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733 CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793 GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT 1853 GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG 1913 TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC 1973 GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG 2001

【０１２５】配列番号：２５ 配列の長さ: 45 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNAアンチセンス : NO 配列 CCGGACAGCT CACCCACAAA ATCAATGCAC TCTAAAAAGG TACCT 45

【０１２６】配列番号：２６ 配列の長さ: 45 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: YES 配列 CTAGAGGTAC CTTTTTAGAG TGCATTGATT TTGTGGGTGA GCTGT 45

【０１２７】配列番号：２７ 配列の長さ: 34 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: NO 配列 CTAGCTCGAG ATATCAGATC TACTAGTCGA CCGC 34

【０１２８】配列番号：２８ 配列の長さ: 28 bases 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成DNA アンチセンス: YES 配列 GGTCGACTAG TAGATCTGAT ATCTCGAG 28

【図面の簡単な説明】

【図１】 各種人工トランスポゾンの構造を示す図であ
る。Ｋｍｒはネオマイシンフォスフォトランスフェラー
ゼ遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子）、Ｔｎｐはトラン
スポゼース遺伝子、黒く塗りつぶした部分はインバーテ
ッドリピート配列を示す。

【図２】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１４１とｐＨＴＮ７１４２の構築図である。

【図３】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１４３の構築図である。

【図４】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１４４の構築図である。

【図５】 プラスミドｐＨＩＳ７１４Ｋ１とｐＨＩＳ７
１４Ｋ２の構築図である。

【図６】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１４５の構築図である。

【図７】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１５１の構築図である。

【図８】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１５２の構築図である。

【図９】 人工トランスポゾンを搭載したプラスミドｐ
ＨＴＮ７１５６−Ｃの構築図である。

【図１０】 プラスミドｐＯＲＦ１の構築図である。

【図１１】 プラスミドｐＯＲＦ３とｐＯＲＦ４の構築
図である。

【図１２】 プラスミドｐＯＲＦ７の構築図である。

【図１３】 プラスミドｐＯＲＦ８の構築図である。

【図１４】 トランスポゾンユニットを搭載したプラス
ミドｐＯＲＦ４１の構築図である。

【図１５】 プラスミドｐＯＲＦＣ０の構築図である

【図１６】 インサーションシーケンス、人工トランス
ポゾン及びトランスポゾンユニットの構造の相違を示す
略図である。ＴＣｒはテトラサイクリン耐性遺伝子、Ｔ
ｎｐはトランスポゼース遺伝子、黒く塗りつぶした部分
はインバーテッドリピート配列（ＩＲ）を示す。また、
各構造の略図の下に点線で示した部分は転移領域を示
す。

【図１７】 プラスミドｐＯＲＦ４０の構築図である。

【図１８】 プラスミドｐＶＫ７の構築図である。

【図１９】 プラスミドｐＶＣ７の構築図である。

【図２０】 プラスミドｐ３９９ＬＹＳＡ及びプラスミ
ドｐ２９９ＬＹＳＡの構築図である。

【図２１】 プラスミドｐＡＢＬｍの構築図である。

【図２２】 プラスミドｐＣＲＤＡＰＡの構築図であ
る。

【図２３】 プラスミドｐ３９９ＤＰＳの構築図であ
る。

【図２４】 プラスミドｐ３９９ＡＫ９の構築図であ
る。

【図２５】 プラスミドｐＣＲＤＡＰＢの構築図であ
る。

【図２６】 プラスミドｐ３９９ＣＡＢ及びプラスミド
ｐＣＡＢの構築図である。

【図２７】 プラスミドｐＣＡＢＬの構築図である。

【図２８】 プラスミドｐＨＴＮ７１５０Ａの構築図で
ある。

【図２９】 プラスミドｐＣＢＬｍｃの構築図である。

【図３０】 プラスミドｐＨＴＮ７１５０の構築図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 平野 聖子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 早川 敦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 泉井 正子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 杉本 雅一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インバーテッドリピートに、薬剤耐性遺
   伝子及び所望の遺伝子が挟まれた構造を有し、コリネホ
   ルム細菌細胞内で転移可能な人工トランスポゾンを造成
   し、該人工トランスポゾンをコリネホルム細菌細胞内に
   導入して、該トランスポゾンを該コリネホルム細菌の染
   色体上に転移させて、該染色体上に当該所望の遺伝子を
   導入し増幅する方法。
2. 【請求項２】 人工トランスポゾンが、インバーテッド
   リピートにさらにトランスポゼース遺伝子が挟まれた構
   造を有するものである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 インバーテッドリピート及びトランスポ
   ゼース遺伝子が、コリネホルム細菌のインサーションシ
   ークエンス由来のものである請求項１ないし２記載の方
   法。
4. 【請求項４】 インサーションシークエンスが配列表配
   列番号１、５及び９記載のいずれかで表される塩基配列
   を有する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 薬剤耐性遺伝子がクロラムフェニコール
   耐性遺伝子またはテトラサイクリン耐性遺伝子である請
   求項１ないし４記載の方法。
6. 【請求項６】 所望の遺伝子がアミノ酸生合成に関与す
   る遺伝子である請求項１ないし５記載の方法。
7. 【請求項７】 所望の遺伝子がアスパルトキナーゼ遺伝
   子および／またはジヒドロピコリン酸合成酵素遺伝子で
   ある請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれかに記載の方
   法により染色体上に所望の遺伝子が導入されたコリネホ
   ルム細菌。
9. 【請求項９】 請求項６記載の方法により染色体上にア
   ミノ酸生合成に関与する遺伝子が導入されたコリネホル
   ム細菌を培地に培養し、培地中にアミノ酸を生成蓄積さ
   せ、該アミノ酸を回収することを特徴とするアミノ酸の
   製造法。
10. 【請求項１０】アミノ酸生合成に関与する遺伝子がアス
    パルトキナーゼ遺伝子および／またはジヒドロピコリン
    酸合成酵素遺伝子であり、アミノ酸がリジンである、請
    求項９記載の方法。