JPH0971598A

JPH0971598A - Ｗｆ１６６１６物質、その製法及び用途

Info

Publication number: JPH0971598A
Application number: JP8179827A
Authority: JP
Inventors: Terumi Okudaira; 照美奥平; Yasuhisa Tsurumi; 泰久鶴海; Hiroshi Hatanaka; 洋畑中; Toru Kino; 亨木野; Masaharu Hashimoto; 正治橋本
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1997-03-18

Abstract

(57)【要約】【解決手段】下記化１に示される化学構造式を有する
ＷＦ１６６１６物質又はその医薬として許容される塩。【化１】【効果】抗微生物作用、特にすぐれた抗真菌作用を有
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＷＦ１６６１６物
質、その製法及び用途に関するものである。ＷＦ１６６
１６物質は、微生物、特に不完全菌の培養物から分離採
取された従来未知の新規物質であり、すぐれた生理活性
を示し、ヒトや動物用の抗微生物剤、特に抗真菌剤、抗
ニューモシスチス・カリニ肺炎薬等の微生物、カビ、そ
の他真菌又は原虫に起因する各種疾患の予防、治療剤と
して有効である。

【０００２】

【従来の技術】従来より各種の抗菌性物質が開発されて
きたが、有効性、抗菌スペクトル、安全性、製造コスト
等の面からみて満足し得るものは少なく、新規物質の開
発が当業界において強く要望されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、新規にして卓越した生理活性物質を開発する目的で
なされたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明者らは各方面から検討の結果、微生物の発酵生
産物に着目し、各種微生物のスクリーニングを鋭意実施
した。その結果、長野県高遠町で採取した土壌試料より
新たに分離したＮo.１６６１６株の培養物からの分離抽
出物がすぐれた抗菌性、特に抗真菌性を有するという新
知見を得、そして更にこの物質についてその理化学的性
質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質である
ことを確認してこの物質を新たにＷＦ１６６１６物質と
命名し、そして更に研究の結果、この工業的製法を確立
し、本発明を完成するに至った。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明に係るＷＦ１６６１６物質
は、後記する理化学的性質ならびにその他の研究から、
その化学構造式は、下記化２に示されるとおりのもので
あることが判明した。

【０００６】

【化２】

【０００７】本発明に係るＷＦ１６６１６物質は、例え
ばＮo.１６６１６株によって生産される。Ｎo.１６６１
６株は、長野県上伊那郡高遠町で採取した土壌試料から
分離した糸状菌である。この微生物は各種培地上で抑制
的に生育し、黄味白色のコロニーをつくる。また、多く
の培地上で１６６１６株は、輪生したフィアライドと粘
性のある分生子塊を伴った分生子柄、アナモルフを形成
した。フィアライドは、膨らんだ基部と細く伸びた頚部
で構成される。これらの形態的特徴から、生産菌は不完
全糸状菌の一属Tolypocladium W. Gams（Gams, W.：Per
soonia, 6：185-191, 1971）に所属する事が明らかであ
る。以下にその菌学的性質を示す。

【０００８】種々の寒天培地上の培養的性質を、下記、
表１、表２に要約した。ポテトデキストロース寒天上の
培養では抑制的に生育し、２５℃で２週間培養後に直径
１．５−２．０cmに拡がる。このコロニーの表面は、フ
ェルト状から綿毛状で、やや隆起し、コロニーの中心部
と周縁部は白色から黄味白色で、その中間或は灰味茶色
であった。裏面はオリーブ味茶色と黄味白色であった。
分生子構造は豊富に観察された。コーンミール寒天上の
集落も抑制的に生育し、同一条件下で直径１．５−２．
０cmに拡がる。集落表面は平坦で、薄く、フェルト状、
中心部がオリーブ味灰色で周縁部は黄味白色であった。
裏面も表面と同じ色調であった。分生子は豊富に形成さ
れた。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】上記した培養的性質において、アスタリス
ク記号を付した麦芽抽出寒天、ツァペック寒天、ＭＹ２
０寒天の組成は、ＪＣＭカタログ（Nakase, T., 5th e
d., 503p., Japan Collection of Microorganisms and
Life Science Research Information Section of the I
nstitute of Physical and Chemical Research, Saitam
a, 1992）に従った。これらの特徴は、接種して２５℃
で１４日間培養後に観察した。色調の記載はMethuen Ha
ndbook of Colour(Kornerup, A. and J. H. Wanscher,
3rd ed., 525pp., Methuen, London, 1978）に基づいて
行った。

【００１２】形態的特徴は、三浦培地（Miura, K. and
M. Kudo : Trans. Mycol. Soc. Japan, 11: 116-118, 1
970）上の培養に基づいて決定した。分生子柄は明瞭ま
たはやや不明瞭に分化し、単生、無色から茶色、滑面
で、培地表面から直接立ち上がるか、気菌糸から短い分
枝として分化する。分生子柄は分枝しないか僅かに分枝
し、フィアライドを単生又は輪生する。フィアライドは
無色、滑面で、楕円形に膨らんだ基部と細く伸びた円筒
形の頚部からなるフラスコ形である。基部の大きさは５
−８（−１０）×２−３μｍ、頚部は２．５−５（−
６）×１−１．５μｍである。連続して形成される分生
子は粘塊を作るが、時には鎖状にもなる。無色、滑面、
１細胞、球形から亜球形で３−４×２．５−３μｍの大
きさである。栄養菌糸は、滑面、隔壁を持ち、分枝し、
暗い茶色から薄い茶色で分枝する。菌糸細胞は、円筒
形、幅１．０−３．０μｍである。厚膜胞子は観察され
ないが、時に単一のフィアロ型分生子がフィアライドの
先端に形成される事がある。Ｎo.１６６１６株は３〜３
０℃で生育可能で生育最適温度は１６〜２２℃である。
これらのデータはポテトデキストロース寒天（ニッス
イ）上で決定した。

【００１３】これらの菌学的性質を検討した結果、Toly
pocladium属菌の分類体系（Bissett, J. : Can. J. Bo
t., 61 : 1311-1329, 1983）に従えば、Ｎo.１６６１６
株はTolypocladium parasiticum Barron 1980に類似し
ている。この菌種はBarronによって最初に水辺の土中に
生息するワムシの寄生菌として記載されたが、純粋培養
条件でも生育が可能である。Ｎo.１６６１６株とT. par
asiticumは厚膜胞子の形成に関してのみ異なっていて、
T. parasiticumが培地上でもワムシ上でも厚膜胞子を形
成するのに対して、Ｎo.１６６１６株は時々厚膜胞子に
似た単独のフィアロ型分生子をフィアライドの先端に形
成するだけであった。その他の特徴に関してはＮo.１６
６１６株とT. parasiticumとは一致していた。従ってＮ
o.１６６１６株はT. parasiticumの１菌株と同定され
た。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−５５５３（受託日平成７年５月
２５日）として寄託されている。

【００１４】ＷＦ１６６１６物質の生産は、単に説明を
目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物の
使用に限定されるものではないことを理解するべきであ
る。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照
射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる人
工変異株並びに自然変異株を含めてＷＦ１６６１６物質
を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するものであ
る。

【００１５】本発明に係るＷＦ１６６１６物質は、糸状
菌に属する該物質生産菌（例えばＮo.１６６１６株）を
資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、
好気条件下で培養することにより（例えば、振とう培
養、通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。

【００１６】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。

【００１７】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
ができる。

【００１８】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。

【００１９】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい；炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

【００２０】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要に応じて、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。

【００２１】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
ＷＦ１６６１６物質の生産工程において菌の生産遅延を
防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接
種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移してそこ
で生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用
する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者と
もに同一であってもよいし必要あれば両者を変えてもよ
い。

【００２２】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。

【００２３】培養温度は、ＷＦ１６６１６物質生産菌が
本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は９
〜３９℃、好ましくは２３〜３０℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜２週間である。

【００２４】発酵終了後、培養物から目的とするＷＦ１
６６１６物質を回収する。すなわち、菌体（又は菌体を
含有する培養物）は、直接水及び／又は有機溶媒による
抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波等既知の手
段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶媒で抽出し
た後、常法にしたがって回収、精製する。培養液の場合
は、直接、常法にしたがって回収、精製すればよい。

【００２５】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

【００２６】ＷＦ１６６１６物質の回収、精製は上記の
ような既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のよ
うにしてもよい。培養物をアセトンで抽出し、さらにイ
オン交換樹脂処理、シリカゲル処理した後、クロマトグ
ラフィーで精製する。必要あれば更に精製工程をくり返
して行い、最終的に乾燥粉末を得ることができる。

【００２７】このようにして得られたＷＦ１６６１６物
質の理化学的性質は、下記の表３、表４、表５に示すと
おりである。

【００２８】

【表３】

【００２９】

【表４】

【００３０】

【表５】

【００３１】本発明に係るＷＦ１６６１６物質は、後記
するところからも明らかなように、すぐれた生理活性、
特に抗真菌作用又は抗原虫作用を有していることが確認
され、且つ低毒性で安全性も高いことも確認され、抗真
菌剤又は抗原虫剤として非常に有効である。

【００３２】したがって本発明に係る物質は、医薬の有
効成分として使用することができ、このような医薬も本
発明に包含されるものである。本発明に係る薬剤組成物
は、ＷＦ１６６１６物質及び／又はその塩を有効成分と
してこれに常用される無機又は有機の担体を加えて、固
体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか、外用剤
等の非経口投与剤に製剤化する。

【００３３】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。
本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。

【００３４】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＷＦ
１６６１６物質または／およびその塩）を０．０１〜１
０００mg／kg、好ましくは０．１〜１００mg／kg投与
し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００mg／k
g、好ましくは０．１〜１００mg／kg投与し、経口投与
の場合は０．５〜２０００mg／kg、好ましくは１〜１０
００mg／kgの範囲内で投与する。

【００３５】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。

【００３６】

【実施例１：ＷＦ１６６１６物質の発酵生産】

【００３７】（１）培養グリセロール（２％）、シュークロース（２％）、綿実
粉（２％）、乾燥酵母（１％）、ポリペプトン（１
％）、ＫＨ₂ＰＯ₄（０．１％）、Ｔｗｅｅｎ８０
（０．１％）の組成からなる水性種培地を、５００ｍｌ
容エルレンマイヤーフラスコ３本にそれぞれ１６０mlず
つ加え、１２０℃で３０分間滅菌した。上記した滅菌済
み培地に、ＹｐＳｓ寒天培地において２５℃で２週間培
養して充分に成長したＮo.１６６１６株の斜面培養物を
１白金耳ずつ接種し、ロータリーシェーカーを用いて
（２２０rpm、５．１cmストローク）、２５℃で１週間
振とう培養した。

【００３８】コーンスターチ（２％）、グルコース（１
％）、綿実粉（１％）、大豆粉（０．５％）、乾燥酵母
（０．５％）の組成からなる水性生産用培地を３０Ｌ容
ステンレス製のジャーファーメンターに入れ、１２０℃
で３０分間滅菌した。先に得た種培養物を上記した滅菌
済み生産用培地２０Ｌに接種し、２０Ｌ／分で通気し、
２００rpmで攪拌しながら、２５°で６日間発酵を継続
した。

【００３９】（２）分離精製培養終了後、培養物（１５Ｌ）に等量のアセトンを加
え、２時間室温にて抽出を行った。混合物にけい藻土を
加え、ろ過した。得られたろ液を減圧下アセトンを除去
して濃縮した。濃Ｈ₂ＳＯ₄を加えてｐＨを３．９５に調
整した後、高分子吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０（三
菱化学株式会社製、０．７５Ｌ）に吸着せしめた。カラ
ムを、水、５０％水性メタノールで洗浄した後、メタノ
ール及びアセトンで溶出した。

【００４０】溶出液（３．７５Ｌ）を減圧下で蒸発乾固
せしめた。得られた乾燥物を少量のメタノールに溶解
し、これにシリカゲル（Kiesel gel 60、E. Merck社
製、１００ml）を加えてスラリー化した。メタノールを
除去し、その結果残留した乾燥粉末を上記と同じシリカ
ゲルのカラム（２００ml）にアプライした。カラムを、
酢酸エチル、アセトン及びアセトン−メタノール混液で
展開した。アセトン−メタノール混液（１０：１及び
１：１）で溶出された活性フラクション（２００ml）
を、減圧下で濃縮乾固した。

【００４１】得られた残渣を５０％水性メタノール（２
００ml）に溶かし、ＹＭＣ−ｇｅｌ（ＯＤＳ−ＡＭ，１
２０−Ｓ５０、ＹＭＣ社製、３５０ml）クロマトグラフ
ィーに付した。カラムを、５０％及び６０％水性メタノ
ールで洗い、そして７０％水性メタノールで溶出した。
活性物質を含むフラクション（５００ml）を合し、減圧
濃縮して水性メタノール溶液１６０mlを得た。

【００４２】この溶液を、分取ＨＰＬＣ、ＹＭＣ充填カ
ラム（ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，Ｓ−５，
２５０×２０mm i.d.）に付し、そして、０．５％ＮＨ₄
Ｈ₂ＰＯ₄含有４５％水性アセトニトリルを用い、流速１
６ml／minで展開した。活性フラクション（１００ml）
を集め、水で２倍に希釈した。この溶液を、ＹＭＣ充填
カラム（ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，Ｓ−
５，２５０×２０mm i.d.）に付した。カラムを５０％
水性メタノールで洗い、次いで６０％水性メタノールを
用いて上記と同じ流速で溶出した。溶出液（１００ml）
を減圧濃縮した後凍結乾燥して、ＷＦ１６６１６物質の
塩（ナトリウム塩、カリウム塩もしくはアンモニウム
塩、又はこれらの混合物と思われる）の白色粉末（４
６．６mg）を得た。

【００４３】

【実施例２：ＷＦ１６６１６物質の生物学的性質】

【００４４】（１）抗真菌活性本物質の抗真菌活性は、９６−穴のマイクロタイタープ
レートを用いたマイクロブロス希釈分析法により、０．
５％グルコース含有イーストナイトロジェンベース（Ｙ
ＮＢＤ）培地中で測定した。本物質をメタノール中に溶
解し、マイクロタイタープレート内でＹＮＢＤ培地を用
いて順次２倍希釈した。

【００４５】各ウェル当り、１００μｌ中１×１０⁴cfu
/wellとなるように、試験微生物を接種した。該プレー
トを、Candida albicans及びAspergillus fumigatusに
ついては、３７℃で２２時間インキュベートし、Crypto
coccus neoformansについては、３０℃で４８時間イン
キュベートし、次いで、顕微鏡観察によってＭＩＣを測
定した。得られた結果を下記表６に示したが、その結果
から明らかなように本物質の卓越した抗真菌活性が確認
された。

【００４６】

【表６】

【００４７】（２）毒性試験生後５週令のＩＣＲ系雌マウス５匹にＷＦ１６６１６物
質を５mg／kgの投与量で毎日１回、３日間連続腹腔内注
射したが死亡例はなく、体重増加も無投与マウス群と全
く同じであり、ＷＦ１６６１６物質の安全性の高さが確
認された。

【００４８】

【実施例３：注射剤の製造】（１）実施例１で製造したＷＦ１６６１６物質５ｇ（２）食塩９ｇ（３）炭酸水素ナトリウム１ｇ

【００４９】（１）〜（３）の全成分を蒸留水１００ml
に溶解した後、アンプルに１mlずつ分注して、注射剤１
００本を製造した。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、ＷＦ１６６１６物質を提供す
るものであるが、この物質は従来未知の新規物質であっ
て、すぐれた生理活性を有し、抗微生物剤、特に抗真菌
剤、抗ニュウモシスチス・カリニ肺炎薬等として各種の
医薬品に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＷＦ１６６１６物質の塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩、もしくはアンモニウム塩、又はこれらの混合物
と思われる）の¹Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示すチャー
トである。

【図２】ＷＦ１６６１６物質の塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩、もしくはアンモニウム塩、又はこれらの混合物
と思われる）の¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示すチャー
トである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者橋本正治茨城県つくば市大字大角豆1194−１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記化１に示される化学構造式を有する
ＷＦ１６６１６物質又はその医薬として許容される塩。【化１】
【請求項２】トリポクラジウム(Tolypocladium）属に
属するＷＦ１６６１６物質生産菌を培養してＷＦ１６６
１６物質を生産せしめ、これを採取することを特徴とす
るＷＦ１６６１６物質の製造方法。
【請求項３】ＷＦ１６６１６物質生産菌がトリポクラ
ジウム・パラシチカム(Tolypocladium parasiticum）で
あることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】ＷＦ１６６１６物質又は医薬として許容
されるその塩、及び、医薬として許容され且つ実質的に
無毒の担体又は賦形剤を含むものであることを特徴とす
る医薬製剤。
【請求項５】抗真菌剤として使用されるものである請
求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】抗ニューモシスチス・カリニ肺炎薬とし
て使用されるものである請求項４に記載の医薬製剤。