JPH0975090A

JPH0975090A - 細胞付着部材

Info

Publication number: JPH0975090A
Application number: JP7262271A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Oohara; 高秋大原; Takeshi Okasaki; 武士岡▲さき▼; Toru Sumiya; 徹角谷
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 1997-03-25

Abstract

(57)【要約】【課題】ＣＤ２陽性細胞、好ましくは白血球、より好
ましくはＴ細胞、ならびにそれらのＤＮＡおよびＲＮＡ
を吸着、分離および回収することにより、自己免疫疾
患、輸血後の副作用防止、Ｔ細胞ワクチン療法および遺
伝子診断を可能にする、新規な細胞接着タンパク質の誘
導体を担体に固定化した細胞付着部材を提供する。【解決手段】ＣＤ２陽性細胞、好ましくは白血球、よ
り好ましくはＴ細胞、ならびにそれらのＤＮＡおよびＲ
ＮＡの吸着分離を行ないうる、Ｄ２領域およびＴＭ領域
をもたず細胞質内領域を部分的にもつカルボキシル末端
に唯一のシステイン残基を有するＬＦＡ−３誘導体タン
パク質を担体に固定化した細胞付着部材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な、細胞付着
タンパク質の誘導体を担体に固定化した細胞付着部材お
よびそれを用いてＣＤ２陽性細胞を付着分離する方法に
関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子工学を用い
た生産による、該誘導体を担体に固定した細胞付着部
材、該細胞付着部材を用いてＣＤ２陽性細胞、とくに白
血球を付着分離する方法、白血球を除去しうる該細胞付
着部材、Ｔ細胞を分離回収しうる細胞付着部材および白
血球からのＤＮＡあるいはＲＮＡの分離を可能とする該
細胞付着部材に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の白血球を分離する技術には、遠心
分離を用いた血球分離装置を用いる方法やコットンおよ
びポリエステル繊維のフィルターがある。Ｔ細胞を分離
する技術には、Ｔ細胞の表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４
あるいはＣＤ８に対する抗体を担体に固定化したビーズ
を充填したカラムやプレートがある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の遠心分離を用い
た血球分離装置を用いる方法は、たとえば血球分離装置
としてＩＢＭ２９９７を用いたばあい、体外循環した血
液を遠心して比重の違いから血球成分の分離層が形成さ
れる。ここで操作ダイアルを調節して、赤血球や血小板
は排出せずに体内に戻すことになるが、装置が複雑なた
めに本操作はかなり習熟しないと必要な成分まで除去さ
れてしまうことになるという問題点を有している。コッ
トンおよびポリエステル繊維のフィルターにより白血球
を付着分離するばあいは、施行にあたり、抗凝固剤とし
て、メシル酸ナファモスタットまたはクエン酸を使用
し、ヘパリンは使用できないという問題点と、原理的に
非特異的付着であるという問題点および血小板の付着量
が多いという問題点がある。

【０００４】Ｔ細胞の表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４あ
るいはＣＤ８に対する抗体を担体に固定化したビーズを
充填したカラムやプレートは、末梢血から直接Ｔ細胞を
分離できないか、あるいは、非常に回収率が低いという
問題点がある。

【０００５】本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意
検討を重ねた結果、今までに知られていない、新規な、
細胞付着タンパク質の誘導体を固定化した細胞付着部材
を見いだし、該タンパク質の誘導体を遺伝子工学で生産
して、本発明を完成するにいたった。

【０００６】つまり、本発明は前記の背景のもとになさ
れたものであり、本発明の細胞付着タンパク質の誘導体
を担体に固定化した新規な細胞付着部材は、前記の課題
を解決する方法を提供することを目的とするものであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、Ｄ
２領域およびＴＭ領域をもたず細胞質内領域を部分的に
もつカルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有する
ＬＦＡ−３誘導体タンパク質を担体に固定化した細胞付
着部材ならびにＤ２領域およびＴＭ領域をもたず細胞質
内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステ
イン残基を有するＬＦＡ−３誘導体タンパク質のチオー
ル基を介して該タンパク質を担体に固定化した細胞付着
部材に関する。

【０００８】前記細胞付着部材において好ましくは、前
記ＬＦＡ−３誘導体タンパク質がヒツジまたはヒトに由
来し、さらに好ましくは、前記ＬＦＡ−３誘導体タンパ
ク質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒ
ツジ由来のタンパク質または配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列からなるヒト由来のタンパク質である。また、
前記細胞付着部材は、好ましくは白血球を除去しうる、
Ｔ細胞を分離回収しうる、白血球からのＤＮＡあるいは
ＲＮＡの分離を可能とする細胞付着部材である。

【０００９】さらに本発明は、前記細胞付着部材を用い
て、ＣＤ２陽性細胞または白血球を付着分離する方法に
関する。好ましくは、前記方法は前記細胞付着部材と、
ＣＤ２陽性細胞または白血球を含みうる体液を接触させ
ることにより付着分離する方法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明にしたがい担体への固定化
に用いるタンパク質について説明する。

【００１１】本発明に用いるタンパク質である、Ｄ２領
域およびＴＭ領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつ
ＬＦＡ−３誘導体タンパク質は、特開平５−２７１２９
２号公報に示している通り、一本鎖のポリペプチドで、
タンパク質部分の分子量約１３，０００のタンパク質で
あり、ＬＦＡ−３タンパク質（Ｔ細胞に存在するＣＤ２
に対する受容体）からＤ２領域およびＴＭ領域が除か
れ、かつ細胞質内領域が部分的に除かれたものでカルボ
キシル末端に唯一のシステイン残基が存在する構成を有
している。ここでＤ２領域とは、ＬＦＡ−３タンパク質
の２つの免疫グロブリン様領域のうち、アミノ末端から
２番目の免疫グロブリン様領域であって、ゲノム性ＤＮ
Ａ上でイントロンによって他の領域と分断されてコード
されている領域をいい、ヒトおよびヒツジでは６つのシ
ステイン残基を有する。ＬＦＡ−３に比べ、カルボキシ
ル末端に唯一のシステイン残基を有するＤ２領域をもた
ない本発明に用いられるＬＦＡ−３誘導体タンパク質は
低分子量であり、ＬＦＡ−３では分子内に複数のジスル
フィド結合があるのに対して、本発明に用いられるＬＦ
Ａ−３誘導体タンパク質では２つ以上ない。したがっ
て、本発明に用いるタンパク質は抗原性が低く、遺伝子
組み換え技術によって生産する上で、誤ったジスルフィ
ド結合を形成する心配のないことから、大変有利であ
る。このようにして唯一のシステイン残基が導入された
誘導体からは、そのシステイン残基のチオール基を介し
て種々の担体に固定化することができる。疎水結合によ
り担体に固定化する方法に関しては、すでに、特開平５
−２７１２９２号公報に示している通りである。

【００１２】本発明に用いるＬＦＡ−３誘導体タンパク
質を担体に固定化する方法を説明する。前記担体の材料
としては、ポリスチレン、ガラス、セルロース、ポリビ
ニルアルコール、ポリサルフォン、シリカゲルなどがあ
げられる。固定化に用いる担体の形状としては、タンパ
ク質を固定化しうるものであれば何でも用いられうる。
たとえば、ポリスチレンを用いるときにはリガンドであ
るタンパク質を固定化する面積が広くなるので、好まし
くはプレート、シャーレおよびビーズ、より好ましくは
ビーズである。本発明に用いるタンパク質は共有結合な
どの結合によって担体に固定化することができる。

【００１３】より効果的に本発明に用いるタンパク質を
固定化するには、カルボキシル末端に存在するシステイ
ン残基のチオール基を介して担体に固定化する。このこ
とによりタンパク質分子の方向性を揃えることが可能に
なる（図１参照）。さらに加えてタンパク質分子をより
高密度に固定化するには、チオール基を活性ハロゲン
法、活性エステル法、ビピリジンジスルフィドの交換反
応法、マレイミド法やチオフタルイミド法などを用いて
共有結合的に担体に固定化する。

【００１４】ここで「ＣＤ２陽性細胞」とはＣＤ２分子
を細胞表面に発現している細胞を意味する。

【００１５】本発明に用いるタンパク質を担体に固定化
した細胞付着部材を用いて、ＣＤ２陽性細胞の付着分離
を行うには、担体がプレートのばあいは、ＣＤ２陽性細
胞とＣＤ２陰性細胞の混合細胞を前記タンパク質固定化
プレートの上にまき、ついでリン酸緩衝液などでプレー
トを洗浄したのちにプレート上の細胞が、ＣＤ２陽性か
陰性かを細胞を回収してフローサイトメトリーを用いた
方法によって調べればよい。担体がビーズのばあいは、
ビーズをカラムに充填したものに、ＣＤ２陽性細胞とＣ
Ｄ２陰性細胞の混合細胞をアプライし、ついでリン酸緩
衝液などでカラムを洗浄したのちにカラム内の細胞がＣ
Ｄ２陽性か陰性かを前記と同様に調べればよい。

【００１６】本発明によるタンパク質を担体に固定化し
た細胞付着部材を用いて、白血球の付着分離を行うに
は、担体がビーズのばあいは、ビーズをカラムに充填し
たものに、末梢血を直接アプライし、ついでリン酸緩衝
液などでカラムを洗浄したのちにカラム内の細胞を同定
するか、もしくはカラムを通過してきた細胞を同定し、
カラム内の細胞を推定することにより前記カラムに白血
球細胞、中でも主にＴ細胞、単球、そして好中球が付着
することを示すことができる。

【００１７】ここで「体液」とは血液、血漿、血清、腹
水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた画分
成分、ならびにその他の生体由来の液性成分を意味す
る。

【００１８】本発明の細胞付着部材が、Ｔ細胞の表面抗
原であるＣＤ３、ＣＤ４あるいはＣＤ８に対する抗体を
担体に固定化したビーズを充填したカラムやプレートに
比べて、ＣＤ２陽性細胞の回収率が高いことを示すに
は、たとえばＣＤ３に対する抗体との比較であれば、Ｃ
Ｄ３に対する抗体と本発明に用いる誘導体タンパク質の
等量を担体の１例としてポリスチレンビーズに固定化し
てカラムを作製し、このカラムに細胞、たとえばＴ細胞
の株化細胞であるジャーカット細胞（ＣＤ２陽性細胞）
やヒト末梢血をアプライし、溶出された細胞数を数える
ことで示すことができる。

【００１９】慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の主
たる病因物質は自己抗体および自己抗体と抗原の複合体
であるとされているので、自己抗体の産生に関係する白
血球を除去することにより、自己免疫疾患の根本的な治
療となる。本細胞付着部材は白血球を付着除去できるの
で、自己免疫疾患患者の末梢血を本細胞付着部材に接触
させ自己抗体を産生する白血球を除去することができ
る。

【００２０】輸血後の副作用として知られている移植片
対宿主反応や非溶血性発熱反応、サイトメガロウイル
ス、ＨＴＬＶ−１などのウイルスの伝播は輸血中に含ま
れる白血球が原因で起こることが知られているので、白
血球を除去することにより、これらの副作用を防止する
ことができる。本発明の細胞付着部材は白血球を付着除
去できるので、輸血する血液を本細胞付着部材で処理す
ることによりこれらの副作用を防止することができる。

【００２１】また本細胞付着部材は、コーエンら（ベン
−ヌンエー、ウェカールエイチおよびコーエンア
イアール（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ，Ａ．，Ｗｅｋｅｒｌｅ，
Ｈ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｉ．Ｒ．）：ワクシネーション・ア
ゲインスト・オートイムン・エンセファロマイリティス
・ウイズ・ティー・リンホサイト・ライン・セルズ・リ
アクティブ・アゲインスト・ミエリン・ベーシック・プ
ロテイン（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔ
ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉ
ｔｉｓｗｉｔｈＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌｉｎ
ｅｃｅｌｌｓｒｅａｃｔｉｖｅａｇａｉｎｓｔｍ
ｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２巻：６０頁、１９８１年参
照）が提唱したＴ細胞ワクチンの考え方を治療に応用す
るばあいの、Ｔ細胞を大量に回収する際に利用すること
ができる。多発性硬化症などの自己免疫疾患患者の末梢
血から、本細胞付着部材を用いて白血球、中でも主とし
てＴ細胞を撹拌、もしくはトリプシンなどのタンパク質
分解酵素処理により回収してから、抗原もしくはコンカ
ナバリンＡのようなマイトジェンで活性化し、Ｘ線照射
やマイトマイシン処理して不活化したのち、患者に免疫
することにより、抗原特異的な免疫寛容が誘導されて、
自己免疫疾患が治療できる。

【００２２】さらに本細胞付着部材を使って非常に簡便
に、白血球からＤＮＡあるいはＲＮＡを分離することも
できる。本発明に用いるタンパク質をビーズに固定化し
てカラムを作製し、そのカラムに末梢血をアプライする
と、カラムには白血球、主としてＴ細胞が付着している
ので、動物細胞からのＤＮＡの調製方法にしたがい、ま
ずドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳともいう）お
よびプロテインキナーゼＫを含むリシス緩衝液をカラム
内にアプライし、５０℃で３時間加温する。つぎに細胞
中の高分子ＤＮＡをカラムから溶出し、フェノール抽出
によりＤＮＡを精製することによりＤＮＡがえられる。
ＲＮＡのばあいはグアニジン−イソチオシアネイト液を
カラム内にアプライし細胞を溶解してトータルＲＮＡを
抽出する。あるいはより簡便に行うには、加温したフェ
ノールをアプライし、ホットフェノール法によりトータ
ルＲＮＡを調製することもできる。これに対しＲＴ−Ｐ
ＣＲを行い相補的ＤＮＡを調製することもできる。

【００２３】このようにして調製したＤＮＡを鋳型にし
て、ＰＣＲ法により、遺伝子診断を行うこともできる。

【００２４】

【実施例】つぎに本発明を実施例にもとづいて説明する
が、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定されるも
のではない。

【００２５】実施例１ａ．ポリスチレンと反応する活性化ハロゲンの作製２−ブロモアセトアミド（アルドリッチ社製）３７ｇを
蒸留水７５ｍｌに懸濁し、そこに３７％ホルムアルデヒ
ド２０ｍｌと炭酸カリウム２．５ｇを加え、スターラー
で１０分間、室温で撹拌して沈殿を完全に溶解した。こ
の溶液をナス型フラスコに入れて、４℃で一晩静置した
のち、上清をデカンテーションにより捨て、蒸留水を５
０ｍｌ加えたのち４２℃で沈殿を溶解し、４℃で一晩再
び静置した。この操作を４回繰り返してから、生じた沈
殿をＧ−３のガラスフィルター（フィルター径３０ｍ
ｍ：日本理化学器械（株）社製）を通過させることによ
り回収し、１時間アスピレーターにて吸引乾燥してか
ら、２４時間凍結乾燥し、ポリスチレンと反応する活性
化ハロゲンであるＮ−ヒドロキシルメチル−２−ブロモ
アセトアミドを調製した。

【００２６】ｂ．活性化ハロゲンポリスチレンプレート
の作製ポリスチレンプレート（高さ２０ｍｍ×直径９０ｍｍ：
西部（株）社製）はガンマー線滅菌処理していないもの
を用い、１Ｍ塩酸で室温、１時間処理後、蒸留水で洗浄
し、つぎに１Ｍ水酸化ナトリウムで室温、１時間処理
し、蒸留水で洗浄した。つぎに前記ａで調製したＮ−ヒ
ドロキシルメチル−２−ブロモアセトアミド３３５ｍｇ
をテトラメチレンスルホン１０ｍｌに溶解し、一方、ト
リフルオロメチルスルホン酸３ｍｌをテトラメチレンス
ルホン７ｍｌに混合したものと前記溶液を合体し、それ
を速やかに前記の洗浄後のポリスチレンプレート上にア
プライした。外気を遮断し密封した状態で室温で５時間
振とうした。さらに反応液を捨てたのち、蒸留水で１回
プレートを洗浄して乾燥し、活性化ハロゲンポリスチレ
ンプレートを作製した。

【００２７】ｃ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質のポリス
チレンプレートへの固定化以下の参考例に記載されたように大腸菌を宿主にして作
製したＬＦＡ−３誘導体タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）
２．５ｍｌにジチオスレイトールを最終濃度５０ｍＭに
なるように加え、室温で１時間反応させたのち、速やか
にゲル濾過カラムＰＤ１０（９．１ｍｌ、口径１５ｍｍ
×高さ５０ｍｍ：ファルマシア社製）にアプライし、ホ
ウ酸０．６２ｇ、塩化カリウム０．７５ｇ、１Ｍ水酸化
ナトリウム２ｍｌおよび蒸留水１４８ｍｌを混合して作
製した５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）３．０ｍｌ
で溶出し、タンパク質画分のみを回収した。この回収画
分（１００μｇ／ｍｌ）３００μｌを前記ｂでえた活性
化ハロゲンポリスチレンプレート上に加え、室温で２時
間静置したのち、前記の５０ｍＭホウ酸緩衝液に２−メ
ルカプトエタノールを最終濃度５０ｍＭになるように加
えた溶液３００μｌに置換し、室温で１時間静置した。
前記プレート上の溶液を捨ててから、プレート表面を等
張リン酸緩衝液３００μｌで２回洗浄した。

【００２８】ｄ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンプレートへのＣＤ２陽性細胞の付着ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポリスチレンプレー
ト上に、等張リン酸緩衝液に懸濁したヒト株化細胞であ
るＣＤ２陽性のジャーカット細胞とＣＤ２陰性のジャー
カット細胞（２×１０⁶個／ｍｌ）３００μｌをそれぞ
れ４℃で１時間静置し、一方、対照として、２−メルカ
プトエタノールをＬＦＡ−３誘導体タンパク質と同様に
して固定化したポリスチレンプレートにも同様の細胞を
静置した。１時間後、細胞懸濁液を捨て、等張リン酸緩
衝液１ｍｌでプレートを洗浄した。前記プレートを倒立
顕微鏡（倍率×１００）で見て付着している細胞の有無
を確認すると、ＬＦＡ−３誘導体タンパク質を固定化し
たプレートにＣＤ２陽性の細胞はほとんど付着していた
が、ＣＤ２陰性の細胞はほとんど付着していなかった
（図２参照）。一方、タンパク質を用いなかった以外は
前記ｃと同様にして作製した、対照の２−メルカプトエ
タノールを固定化したプレートには、ＣＤ２陽性、陰性
いずれの細胞もほとんど付着しなかった。

【００２９】実施例２ｅ．活性化ハロゲンポリスチレンビーズの作製ポリスチレンビーズ（直径４５０μｍ：鐘淵化学工業株
式会社製）はガンマー線滅菌処理していないものを用
い、１．５ｇをメタノール５ｍｌに懸濁し、ガラスカラ
ム（口径１．０ｃｍ×高さ２．０ｃｍ：バイオラッド社
製）に充填した。つぎにメタノール１５ｍｌでポリスチ
レンビーズを洗浄後、さらにテトラメチレンスルホン１
５ｍｌで洗浄、ついで蒸留水１５ｍｌで洗浄した。引き
続き１Ｍ塩酸１５ｍｌで１時間処理後、蒸留水で洗浄
し、つぎに１Ｍ水酸化ナトリウム１５ｍｌで１時間処理
し、蒸留水で洗浄した。つぎに再びポリスチレンビーズ
をテトラメチレンスルホン１５ｍｌで洗浄後、前記ａで
調製したＮ−ヒドロキシルメチル−２−ブロモアセトア
ミド３３５ｍｇをテトラメチレンスルホン１０ｍｌに溶
解し、一方、トリフルオロメチルスルホン酸３ｍｌをテ
トラメチレンスルホン７ｍｌに混合したものと前記溶液
を合体し、そのうち７．５ｍｌを前記のポリスチレンビ
ーズカラムにアプライした。外気を遮断し密封した状態
で室温で２．５時間振とうした。さらに反応液を捨てた
のち、再び７．５ｍｌの合体溶液をカラムにアプライ
し、密封状態で室温にて２．５時間振とうしたのち、蒸
留水で１回カラムを洗浄してから、デシケーター内で乾
燥し、活性化ハロゲンポリスチレンビーズを作製した。

【００３０】ｆ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質のポリス
チレンビーズへの固定化前記ｃと同様に大腸菌を宿主にして作製したＬＦＡ−３
誘導体タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌにジチオ
スレイトールを最終濃度５０ｍＭになるように加え、室
温で１時間反応させたのち、速やかにゲル濾過カラムＰ
Ｄ１０（９．１ｍｌ、口径１５ｍｍ×高さ５０ｍｍ：フ
ァルマシア社製）にアプライし、ホウ酸０．６２ｇ、塩
化カリウム０．７５ｇ、１Ｍ水酸化ナトリウム２ｍｌお
よび蒸留水１４８ｍｌを混合して作製した５０ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．５）３．０ｍｌで溶出し、タンパク
質画分のみを回収した。活性化ハロゲンポリスチレンビ
ーズ０．５ｇを充填したカラム（直径１．０ｃｍ、孔径
１００μｍ、高さ７ｍｍ：バイオラッド社製）に対し、
この回収画分（１００μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌをアプラ
イし、タンパク質溶液を０．１ｍｌ／分の流速で通過さ
せ、通過液を再びカラムに通し、この操作を５回繰り返
した。つぎに前記ｃで調製した５０ｍＭホウ酸緩衝液に
１％ウシ血清アルブミンを加えた溶液５ｍｌを、同様の
流速でカラムを通過させ、さらに等張リン酸緩衝液５ｍ
ｌを通過させた。

【００３１】ｇ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンビーズカラムでの末梢血からの白血球の付着
除去ヒト末梢血０．５ｍｌを１０％クエン酸ナトリウム採血
し、前記ｆでえられたＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定
化ポリスチレンビーズカラムに０．０２ｍｌ／分の流速
でアプライし、さらに等張リン酸緩衝液１．０ｍｌにて
０．０６〜０．１８ｍｌ／分の流速で３回カラムを洗浄
した（えられたカラムを以下、「ＬＦＡ−３カラム」と
いう）。対照としてＬＦＡ−３誘導体タンパク質のかわ
りにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を固定化したポリス
チレンビーズカラムでも全く同様の操作を行った（えら
れたカラムを以下、「ＢＳＡカラム」という）。１０％
クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血０．５ｍｌに等
張リン酸緩衝液３ｍｌを加えたものと、カラムを通過し
た回収血液からそれぞれ２ｍｌを血液成分検査に供し、
残りは標識抗体を用いたフローサイトメトリー実験（コ
ールター社製フローサイトメーター使用）に用いた。

【００３２】以下にフローサイトメトリー実験の条件に
ついて述べる。

【００３３】ポリスチレンチューブ（直径１２ｍｍ×高
さ７５ｍｍ、ベクトンディッキンソン社製）に、抗ＣＤ
３抗体（ＰＥ標識、コールター社製）１０μｌを分注し
た。

【００３４】つぎにカラムを通過した回収血液１．５ｍ
ｌおよび１０％クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血
０．５ｍｌに等張リン酸緩衝液３ｍｌを加えたものから
１．５ｍｌをそれぞれ前記の抗体を入れたチューブに加
え、ボルテックスミキサー（井内盛栄堂社製）で５秒間
よく混和した。前記チューブを砕氷を入れた保冷箱に入
れ、アルミホイルで遮光し、３０分間放置した。塩化ナ
トリウム８．２６ｇに、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム４５ｍｇおよび重炭酸カリウム１．０ｇを加え、
蒸留水に溶解し１ｌにした溶血試薬の１．５ｍｌを前記
チューブに加え、ボルテックスミキサーで１０秒間よく
混和し、再度、前記溶血試薬１．５ｍｌをチューブに加
え、ボルテックスミキサーで１０秒間よく混和した。つ
ぎに３７℃で１５分間遮光放置し、赤血球を溶血させ、
１，４００ｒｐｍ（４１０×ｇ）、４℃で３分間遠心
し、上清をアスピレーターで吸引除去した。細胞を洗浄
するために、ボルテックスミキサーで３秒間細胞ペレッ
トをほぐし、０．１％アジ化ナトリウムを含む等張リン
酸緩衝液３ｍｌを前記チューブに加え、ボルテックスミ
キサーで５秒間よく混和し、１，４００ｒｐｍ（４１０
×ｇ）、４℃で３分間遠心し、上清をアスピレーターで
吸引除去した。これに０．１％アジ化ナトリウムを含む
等張リン酸緩衝液１ｍｌを加え、ボルテックスミキサー
で軽く混和し、フローサイトメーターの測定サンプルと
した。

【００３５】フローサイトメーターでの測定にあたって
は、リンパ球領域にゲーティングし、ＰＥ（抗体ＣＤ３
抗体）の陽性比率を分析した。

【００３６】血液成分検査では白血球数、赤血球数、血
小板数は多項目自動血球分析装置（東亜医用電子社製）
を用いて測定算出した。白血球像はメイギムザ染色によ
り観察した。このようにして実施したカラム通過前後の
細胞分析では、赤血球数（アプライ時７７×１０⁴／ｍ
ｍ³、ＬＦＡ−３カラム通過８０×１０⁴／ｍｍ³、ＢＳ
Ａカラム通過７７×１０⁴／ｍｍ³）、血小板数（アプラ
イ時３．２０×１０⁴／ｍｍ³、ＬＦＡ−３カラム通過
２．７５×１０⁴／ｍｍ³、ＢＳＡカラム通過３．１０×
１０⁴／ｍｍ³）にはほとんど変化は認められなかった
が、白血球数は減少（アプライ時７００／ｍｍ³、ＬＦ
Ａ−３カラム通過４６７／ｍｍ³、ＢＳＡカラム通過６
６７／ｍｍ³）しており、ＬＦＡ−３カラムには白血球
が付着していることが示された。その白血球の中でも、
白血球像解析の結果から、顆粒球（アプライ時４６．８
％（好塩基球：１．３５％＋好酸球：４．０５％＋好中
球：４１．３５％）、ＬＦＡ−３カラム通過５６．６％
（好塩基球：１．８５％＋好酸球：５．６０％＋好中
球：４９．１０％）、ＢＳＡカラム通過４８．３％（好
塩基球：２．０５％＋好酸球：５．４５％＋好中球：４
０．８０％））、単球（アプライ時８．２％、ＬＦＡ−
３カラム通過８．１％、ＢＳＡカラム通過８．７％）の
比率よりもリンパ球（アプライ時４４．８％（リンパ球
中のＴ細胞（ＣＤ２⁺およびＣＤ３⁺）の比率：５３．７
％）、ＬＦＡ−３カラム通過３５．１％（リンパ球中の
Ｔ細胞（ＣＤ２⁺およびＣＤ３⁺）の比率：４２．０
％）、ＢＳＡカラム通過４２．９％（リンパ球中のＴ細
胞（ＣＤ２⁺およびＣＤ３⁺）の比率：５５．０％）の比
率の減少が認められた。そのリンパ球の解析には、Ｔ細
胞はＣＤ３抗体（ＰＥ標識）を用いたフローサイトメト
リー実験により行った。その結果、カラムアプライ時の
ＣＤ３⁺率（標識ＣＤ３抗体と結合したＣＤ３陽性細胞
の％）が５３．７％に対して、ＬＦＡ−３カラム通過後
では４２．０％と減少していた。以上のデータを総合し
て考えると、カラムアプライ時のＴ細胞を１００％とす
ると、本ＬＦＡ−３カラムによりＴ細胞の５９．１％が
除去できたことになる。同様にして算出したＬＦＡ−３
固定化カラムおよびＢＳＡカラムのヒト末梢血細胞の除
去率を表１に示す。

【００３７】

【表１】実施例３ｈ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビ
ーズカラムとＣＤ３抗体固定化ポリスチレンビーズカラ
ムへのジャーカット細胞の付着率の比較ＣＤ３抗体固定化ポリスチレンビーズカラムおよびウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）固定化ポリスチレンビーズカ
ラムの作製は以下のように実施した。等張リン酸緩衝液
を用いて調製した、ジチオスレイトールによる還元処理
を行っていない８００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度のＣ
Ｄ３抗体溶液およびウシ血清アルブミン溶液をそれぞ
れ、実施例２のｅと同様にしてえた０．５ｇの活性化ハ
ロゲンポリスチレンビーズを充填したカラム（口径１．
０ｃｍ×高さ７ｍｍ：バイオラッド社製）（以下、前者
を「ＣＤ３抗体カラム」、後者を「ＢＳＡカラム」とい
う）にアプライし、タンパク質溶液を０．１ｍｌ／分の
流速で通過させ、通過液を再びカラムに通し、この操作
を５回繰り返した。つぎに、前記ｃで調製した５０ｍＭ
ホウ酸緩衝液に１％ＢＳＡを加えた溶液５ｍｌを、同様
の流速でカラムを通過させ、さらに等張リン酸緩衝液５
ｍｌを通過させた。ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化
ポリスチレンビーズカラム（以下、「ＬＦＡ−３カラ
ム」という）は活性化ハロゲンポリスチレンビーズ０．
５ｇを用い前記ｆの方法で作製した（０．５ｇのビーズ
中ＬＦＡ−３誘導体タンパク質の固定化量は３００μｇ
であった）。これら３つのカラムに、１０％ウシ胎児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌを通したのち、Ｃ
Ｄ２陽性かつＣＤ３陽性のジャーカット細胞２×１０⁶
を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍ
ｌに懸濁して、カラムに０．２ｍｌ／分の流速でアプラ
イし、通過してきた細胞を回収した。つぎに、１０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌでカラム
を４回洗浄した。このときに通過してきた細胞も回収し
た。カラムを通過してきた細胞数を血球計算盤で数える
と、各カラムの全溶出細胞数は、ＬＦＡ−３カラムで
８．５％、ＣＤ３抗体カラムで４６．０％、そしてＢＳ
Ａカラムで８１．８％であった。逆にいうと、ＬＦＡ−
３カラムは９１．５％の細胞を付着し、ＣＤ３抗体カラ
ムは５４．０％、ＢＳＡカラムは１８．２％の細胞しか
付着できなかったことを示している。

【００３８】ｉ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンビーズカラムとＣＤ３抗体固定化ポリスチレ
ンビーズカラムへのヒト末梢血からのリンパ球の付着率
の比較ＬＦＡ−３カラム、ＣＤ３抗体カラムおよびＢＳＡカラ
ムの作製方法は前記ｈと同様にして行った。これら３つ
のカラムに、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地５ｍｌを通したのち、１０％クエン酸ナトリウム
採血したヒト末梢血１．２ｍｌを前記カラムにアプライ
した。１．２ｍｌの等張リン酸緩衝液で前記カラムを洗
浄し、さらに、１．６ｍｌの等張リン酸緩衝液で再度洗
浄した。ここで各カラム通過画分からフィコールパック
（ファルマシア社製）でリンパ球画分を調製し、リンパ
球数を血球計算盤で数えた。各カラムの溶出リンパ球数
は、ＬＦＡ−３カラムで５７．３％、ＣＤ３抗体カラム
で８８．４％、そしてＢＳＡカラムで８７．４％であっ
た。逆にいうと、ＬＦＡ−３カラムは４２．７％のリン
パ球を付着し、ＣＤ３抗体カラムは１１．６％、ＢＳＡ
カラムは１２．６％のリンパ球しか付着できなかったこ
とを示している。

【００３９】実施例４ｊ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビ
ーズカラムでの、簡便な白血球からのＤＮＡの分離前記ｆで作製したＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンビーズカラムに、１０％クエン酸ナトリウム
採血したヒト末梢血０．５ｍｌをアプライし、さらに等
張リン酸緩衝液１．０ｍｌにて、０．０６〜０．１８ｍ
ｌ／分の流速で３回カラムを洗浄すると、カラムには白
血球、主としてＴ細胞が付着しているので、動物細胞か
らのＤＮＡ調製方法にしたがい、１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１５ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００μｇ
／ｍｌプロテイナーゼＫおよび１％ＳＤＳからなるリシ
ス緩衝液を５ｍｌカラムにアプライし、リシス緩衝液が
カラムから流出しないようにして、５０℃で３時間加温
した。この操作によりＤＮＡは細胞外に出てくるので、
こののち、リシス緩衝液をカラム内から流出させてＤＮ
Ａを回収した。さらにＤＮＡの精製を行なうために、え
られたＤＮＡ５ｍｌ（１００μｇ含有）に１０ｍＭトリ
スおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムか
らなる溶液（ｐＨ８．０）で飽和したフェノールを等量
加えて、混和したのち、３，０００回転で室温で１０分
間遠心分離し、フェノール層を除去し、水層を回収し
た。再度このフェノール抽出を繰り返した。さらに、こ
の水層を透析チューブ（和光純薬工業社製）に移し、１
０ｍＭトリスおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウムからなる溶液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに対
し１回目は室温で１２時間透析し、２回目、３回目の透
析は４℃で１２時間ずつ実施した。透析チューブからポ
リアロマーチューブにＤＮＡを移し、１００分の１量の
アールエヌエースＡ液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７
℃で３時間インキュベートした。等量のフェノール／ク
ロロホルムを加え、混和し、３，０００回転、５分間遠
心分離し、フェノール／クロロホルム層を捨て、さらに
もう１回この操作を繰り返した。最後に、１０ｍＭトリ
スおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムか
らなる溶液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに対し１回目は
室温で１２時間透析し、２回目、３回目の透析は４℃で
１２時間ずつ実施した。

【００４０】ｋ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンビーズカラムでの、簡便な白血球からのＲＮ
Ａの分離前記ｆで作製したＬＦＡ−３誘導体タンパク質固定化ポ
リスチレンビーズカラムに、１０％クエン酸ナトリウム
採血したヒト末梢血０．５ｍｌをアプライし、さらに等
張リン酸緩衝液１．０ｍｌにて０．０６〜０．１８ｍｌ
／分の流速で３回カラムを洗浄すると、カラムには白血
球、主としてＴ細胞が付着しているので、１０ｍＭトリ
ス塩酸、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液（ｐＨ７．
５）５ｍｌをカラムに通したのち、氷冷した１０ｍＭト
リス塩酸、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液（ＰＨ
７．５）５ｍｌをカラムにアプライし、カラムから流出
させないようにして、ビーズごと細胞を懸濁した。これ
に０．２５ｍｌの１０％ＳＤＳを加え、直ちにあらかじ
め６５℃に加温したフェノールを加えた。撹拌しなが
ら、６５℃に１５分間放置したのち、さらに室温で１０
分間振とうした。ここでカラム中の溶液を通過させ、通
過してきた溶液を３，０００回転、１０分間遠心し、水
層を回収した。さらにフェノール抽出を２回、クロロホ
ルム抽出を１回行い、エタノール沈殿した。この沈殿を
１０ｍＭトリス塩酸および１０ｍＭ塩化マグネシウムか
らなる溶液（ｐＨ７．５）３００μｌに溶解し、１４０
単位のディーエヌエースＩを加え、４℃、３時間反応さ
せた。このものからＲＮＡをフェノール／クロロホルム
抽出およびエタノール沈殿し、精製したＲＮＡをえた。

【００４１】実施例５ l.固定化方法のちがいによるＬＦＡ−３誘導体タンパク
質へのＣＤ２陽性細胞の付着の比較実施例１のｂで作製した活性化ハロゲンポリスチレンプ
レートでは、チオール基を介した結合のほうがアミノ基
を介した結合よりも優先的に反応するので、ＬＦＡ−３
誘導体タンパク質を実施例１のｃに記載の方法で固定化
ポリスチレンプレート上に固定化した付着部材と、以下
の参考例に記載されたように作製したＬＦＡ−３誘導体
タンパク質を２００μｇ／ｍｌとなるように等張リン酸
緩衝液４００ｍｌに溶解し、その溶液を活性化ポリスチ
レンプレート（実施例１のｂで作製したもの）上で室
温、１時間静置することによりアミノ基を介して固定し
た付着部材とを作製した。等張リン酸緩衝液に懸濁した
ヒトＴ細胞株化細胞であるＣＤ２陽性のジャーカット細
胞とＣＤ２陰性のジャーカット細胞（２×１０⁶個／ｍ
ｌ）３００μｌをそれぞれ４℃で１時間静置した。一
方、対照として、フリーのシステイン残基を１つもつカ
ルボニックアンヒドラーゼ２００μｇ／ｍｌおよび２−
メルカプトエタノール５０ｍＭを前記と同様にして固定
化ポリスチレンプレートおよび活性化されたポリスチレ
ンプレートに前記と同様にして細胞を静置した。１時間
後、細胞懸濁液を捨ててから、等張リン酸緩衝液で各プ
レートを洗浄した。各プレートを倒立顕微鏡（倍率×１
００）で観察し、付着している細胞の有無を確認した。
写真をとり、一定面積下の付着している細胞数をカウン
トした。その結果、チオール基を介して固定化したＬＦ
Ａ−３誘導体タンパク質を固定化したプレートには、Ｃ
Ｄ２陽性の細胞がほとんど付着していたが、ＣＤ２陰性
の細胞はほとんど付着していなかった。一方、対照のカ
ルボニックアンヒドラーゼおよび２−メルカプトエタノ
ールを固定化したプレートには、ＣＤ２陽性、陰性いず
れの細胞もほとんど付着しなかった。またアミノ基を介
して固定化したプレートにはいずれの細胞もほとんど付
着しなかった。なお、ＬＦＡ−３誘導体タンパク質（Ｍ
Ｗ：約１３，０００）およびカルボニックアンヒドラー
ゼ（ＭＷ：約３００００）のプレートへの固定化された
タンパク質量はそれぞれ４．５μｇ／ｃｍ²および３．
６μｇ／ｃｍ²であった。

【００４２】表２に、０．０５％クリスタルバイオレッ
トにより染色した各プレートを写真に撮り、写真（３ｃ
ｍ×３ｃｍ）の細胞数をカウントした結果を示す。

【００４３】

【表２】実施例６ｍ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質とＣＤ３抗体を固定化
したプレートのＣＤ２陽性およびＣＤ３陽性細胞の付着
の比較実施例５のｌと同様にして、ＬＦＡ−３誘導体タンパク
質をチオール基を介してプレートに固定化した（以下、
ＬＦＡ−３固定化プレートともいう）。固定化したタン
パク質量は４．５μｇ／ｃｍ²であった。一方、等張リ
ン酸緩衝液を用いて調製した、ＣＤ３抗体１００μｇ／
ｍｌ（３．１μｇ／ｃｍ²）およびウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）３００μｌ（３．６μｇ／ｃｍ²）を室温で
１時間静置することによりアミノ基を介してプレートに
固定化した（以下、「ＣＤ３抗体固定化プレート」およ
び「ＢＳＡ固定化プレート」ともいう）。フローサイト
メーター（コールター社製）により等張リン酸緩衝液に
懸濁したＣＤ２、ＣＤ３共に同程度ジャーカット細胞の
表面に発現していることを確認している細胞（ＣＤ２⁺
およびＣＤ３⁺のジャーカット細胞）および両者共に発
現していないジャーカット細胞（ＣＤ２^-およびＣＤ３^-
のジャーカット細胞）をプレートに（２×１０⁶個／ｍ
ｌ）３００μｌアプライし、４℃で１時間静置し、その
のち細胞懸濁液を捨て、等張リン酸緩衝液で洗浄した。
その結果、ＬＦＡ−３誘導体タンパク質をチオール基を
介して固定化したプレートにのみＣＤ２⁺およびＣＤ３⁺
のジャーカット細胞が付着した。その他のプレートには
付着しなかった。またＣＤ２^-およびＣＤ３^-のジャーカ
ット細胞はいずれのプレートにもほとんど付着しなかっ
た。付着の程度はプレートに付着しているジャーカット
細胞を０．０５％クリスタルバイオレットで染色するこ
とにより観察した。

【００４４】図３にその結果を示す。

【００４５】参考例大腸菌を宿主としたＬＦＡ−３誘導体タンパク質の作製ａ．ヒツジＤ２領域欠失型ＬＦＡ−３様タンパク質（以
下、ヒツジ△Ｄ２タンパク質と呼ぶ）ｃＤＮＡのＰＣＲ
用プライマーの合成ヒツジＣＤ２抗原受容体については配列番号３に示した
ように２９アミノ酸残基からなるＮ末端アミノ酸配列が
開示されている（特開昭６３−１５０２２８号公報参
照）。ヒツジ△Ｄ２タンパク質ｃＤＮＡのＰＣＲ用プラ
イマーとして、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む配
列と引き続く配列番号３の１番から７番のアミノ酸配列
から予想されるＤＮＡ配列とを有する配列番号４で示さ
れる混合プライマー、および制限酵素ＰｓｔＩの認識配
列を含む配列と引き続く配列番号３の２７番から２２番
のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列とを有する配
列番号５で示される混合プライマーをＤＮＡ合成機（ア
プライドバイオシステムズ社、モデル３８１Ａ）を使用
し合成した。

【００４６】ｂ．ヒツジ細胞由来二重鎖ｃＤＮＡの調製ヒツジから血液１００ｍｌをヘパリン採血し、３５０
Ｇ，１０分の遠心によりバフィーコート画分をえた。赤
血球溶解液で赤血球を溶解後、等張リン酸緩衝液で２回
洗浄しヒツジ白血球細胞をえた。つぎにヒツジ白血球細
胞からチオシアン酸グアニジン法によりＲＮＡを抽出
し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによりポリ
（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した（ラボマニュアル遺伝子工
学、村松正実編、丸善１９８８年）。ポリ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡからの二重鎖ｃＤＮＡの合成は市販のキット（Ｙｏ
ｕ−ＰｒｉｍｅｃＤＮＡ合成キットファルマシア社
製）を用いて合成した。

【００４７】ｃ．ヒツジ△Ｄ２タンパク質のＤＮＡ配列
のＰＣＲ法による増幅とクローニングヒツジ△Ｄ２タンパク質のｃＤＮＡをＰＣＲ法によって
試験管内で増幅した。すなわち１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．３）,1００ｍＭ塩化カリウム，１．５ｍＭ塩化マ
グネシウム，０．０１％ゼラチン，前記ａで合成した２
種類の混合プライマー各々１０μＭ，前記ｂで調製した
ヒツジ白血球ｃＤＮＡ１０ｎｇ，０．２ｍＭ４種の
デオキシリボヌクレオチド三リン酸，ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ２．５単位を含む反応混合物１００μｌを９
４℃１分、３７℃２分、７２℃２分の反応条件で３５サ
イクルのＰＣＲを行なった。反応後、ＰＣＲ生成物の大
きさをポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
結果、約１００塩基対のＤＮＡが増幅されていることを
認めた。この約100 塩基対のＤＮＡをゲルから抽出し、
制限酵素ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩ処理後、Ｍ１３ｍｐ１９
ファージベクター（宝酒造製）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ
部位に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９を宿主として用いて
クローニングした。

【００４８】ｄ．ＰＣＲによって増幅された遺伝子の配
列決定前記ｃでえられた陽性クローンから調製した約１００塩
基対のＤＮＡの配列をダイデオキシヌクレオチド三リン
酸を用いた常法により決定した。その結果、ＰＣＲに用
いた２種のプライマー間の配列は、配列番号６で示され
るＤＮＡの配列の１９番から６５番までの塩基配列であ
ると決定された。この配列はのちに決定されたヒツジ△
Ｄ２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号７の７番
のＧｌｙから２２番のＰｒｏに対応しており、ヒツジ△
Ｄ２タンパク質のｃＤＮＡが前記の塩基配列を有するこ
とを示している。このＤＮＡ配列は配列番号７の７番か
ら２２番のアミノ酸をコードしている。

【００４９】ｅ．ヒツジ△Ｄ２タンパク質のｃＤＮＡの
取得ヒツジ△Ｄ２タンパク質の全長のｃＤＮＡをクローニン
グするために、前記ｄで決定したヒツジ△Ｄ２タンパク
質のＮ末端のｃＤＮＡ配列をプローブとしてヒツジｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングした。すなわち、前
記ｂで作ったヒツジ白血球由来の二重鎖ｃＤＮＡをＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で平滑末端にし、ＥｃｏＲＩリンカ
ー（ファルマシア社製）を接続し、さらにＥｃｏＲＩで
切断し、アルカリフォスファターゼ処理したλｇｔｌｌ
（ストラタジーン社製）の左右のアームを接続した。イ
ンビトロパッケージングを行ないｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ヒツジ△Ｄ２タンパク質のＮ末端近傍のｃ
ＤＮＡ配列を有するプローブ、配列番号８および配列番
号９を合成した。約２０万の組換えファージをこれらの
プローブでスクリーニングした結果、１．０ｋｂ（キロ
ベース）〜１．２ｋｂのインサートｃＤＮＡを含有する
３株の陽性クローン（ＳＬ−６、ＳＬ−４０、ＳＬ−４
３）をえた。これらの陽性クローンのうち、ＳＬ−４０
のｃＤＮＡ配列をＭ１３ファージを用いたダイデオキシ
法により決定した結果、ヒツジ△Ｄ２タンパク質は配列
番号６に示した塩基配列によりコードされ、また配列番
号７に示したアミノ酸配列を有することがわかった。ま
たメチオニンから始まる２８アミノ酸残基のシグナルペ
プチドを有することもわかった。このえられたヒツジ△
Ｄ２タンパク質のｃＤＮＡ塩基配列の情報にもとづき天
然型のヒツジ△Ｄ２タンパク質および誘導体を、遺伝子
工学的に組換え体で生産できる。配列番号１０は、ウォ
ルナーら（ビーピーウォルナーら、（1987年）ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン１６６
巻、９２３頁）によって報告されているヒトＬＦＡ−３
のアミノ酸配列、配列番号１１はそのＤＮＡ配列であ
る。

【００５０】ｆ．可溶性であるヒツジ△Ｄ２タンパク質
誘導体（以下、ヒツジＤ１ＨＣタンパク質と呼ぶ）の大
腸菌の発現ベクターの作製ヒツジＤ１ＨＣタンパク質を大腸菌で発現するための発
現ベクターを構築した。

【００５１】すなわち、前記ｅでえられたｃＤＮＡクロ
ーンＳＬ−４０に含まれるインサートＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩで切り出し、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏ
ＲＩ部位にサブクローニングした。つぎに、このプラス
ミドについてＰＣＲを行なった。使用した５′側プライ
マーは配列番号１２に示されている。このプライマーは
ＢａｍＨＩ認識配列、ＮｃｏＩ認識配列および配列番号
６の１番から７番のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ
配列とから構成されている。使用した３′側プライマー
は配列番号１３に示されている。このプライマーはＰｓ
ｔＩ認識配列、終止コドンの配列、配列番号６の３７１
番から３５８および３０１から２７７の塩基配列とから
構成されている。配列番号１２と１３のプライマーを用
いてＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断しＭ１３ｍｐ１９ファージ
ベクターのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、ダイデ
オキシ法により導入されたＤＮＡの塩基配列を確認し
た。つぎにＭ１３ファージベクターからヒツジＤ１ＨＣ
タンパク質の遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ
で切りだし、発現用ベクターｐＫＫ２３３−２（ファル
マシア社製）のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位に接続し、発現
ベクターを作製した。この発現ベクターをｐＫＳＬＤ１
ＨＣと呼ぶ。ｐＫＳＬＤ１ＨＣに含まれるヒツジＤ１Ｈ
Ｃタンパク質誘導体をコードする開始コドンから終止コ
ドンまでの塩基配列を配列番号１４に示した。

【００５２】ｇ．システイン残基を含むヒツジＤ１ＨＣ
タンパク質（以下、ヒツジＤ１ＨＣｃｙｓタンパク質と
呼ぶ）誘導体の大腸菌用発現ベクターの作製システイン残基をカルボキシ末端に持つヒツジＤ１ＨＣ
タンパク質を大腸菌で発現するための発現ベクターを構
築した。前記ｆでえられたヒツジＤ１ＨＣタンパク質の
ｃＤＮＡを持つプラスミドｐＫＳＬＤ１ＨＣのＤＮＡを
鋳型にしてＰＣＲを行なった。使用した５′側プライマ
ーは前記ｆで使用したものであり、配列番号１２に示さ
れている。使用した３′側プライマーは配列番号１５に
示されている。このプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ認識
配列、ＰｓｔＩ認識配列、終止コドン配列、システイン
残基の配列、続いて配列番号１４の３１８から２９５の
塩基配列とから構成されている。配列番号１２と１５の
プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断
片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断しＭ１３ｍｐ
１９ファージベクターのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿
入し、ダイデオキシ法により導入されたＤＮＡの塩基配
列を確認した。つぎにＭ１３ファージベクターから、ヒ
ツジＤ１ＨＣｃｙｓタンパク質の遺伝子を制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＰｓｔＩで切りだし、発現用ベクターｐＫＫ
２３３−２（ファルマシア社製）のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ
部位に接続し、発現ベクターｐＫＳＬＤ１ＨＣｃｙｓを
作製した。ｐＫＳＬＤ１ＨＣｃｙｓに含まれるヒツジＤ
１ＨＣｃｙｓタンパク質（以下、「ＬＦＡ−３誘導体タ
ンパク質」という）をコードする開始コドンから終止コ
ドンまでの塩基配列を配列番号１に示した。

【００５３】ｈ．大腸菌を宿主としたＬＦＡ−３誘導体
タンパク質の生産ＬＦＡ−３誘導体タンパク質の発現ベクターｐＫＳＬＤ
１ＨＣｃｙｓを持つ大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造製）を前
培養後、１０ｍｇのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬ
Ｂ培地に接種し、５００ｍｌの坂口フラスコでＡ500が
０．３になるまで３７℃で振とう培養した。つぎにＩＰ
ＴＧを終濃度１ｍＭで加え、さらに６時間培養した。培
養した菌体を遠心により集め、５０ｍＭＥＤＴＡ、５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭジチオスレイトール、
８％ショ糖を含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）１０ｍｌに懸濁し、リゾチームを終濃度０．１
％加えた。この菌体懸濁液を超音波処理、遠心分離し不
溶性の顆粒体をえた。この顆粒体をＳＤＳで溶解させ、
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動するとＭｒが
約１３，０００のバンドが検出された。

【００５４】ｉ．ＬＦＡ−３誘導体タンパク質の顆粒体
の可溶化と再活性化前記ｈでえられた顆粒体全量を６Ｍ塩酸グアニジン、２
ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを
含有する５０ｍＭトリス塩酸（ＰＨ７．４）１０ｍｌで
溶解し、遠心後上清をとった。上清を等張リン酸緩衝液
に透析し、ＬＦＡ−３誘導体タンパク質を含む溶液をえ
た。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、ＣＤ２陽性細胞、とくに
白血球を付着分離することができ、自己免疫疾患を治療
するための細胞付着部材、輸血後の副作用を防止するた
めの輸血用血液から白血球を除去しうる細胞付着部材、
Ｔ細胞を分離回収しうる細胞付着部材、Ｔ細胞の分離回
収がＴ細胞ワクチン療法を単時間にかつ簡単に行なうこ
とを実施するための細胞付着部材、および白血球からの
ＤＮＡあるいはＲＮＡの分離を短時間にかつ簡便に行な
うことを可能とするための細胞付着部材が提供される。

【００５６】本発明の細胞付着部材を用いることによ
り、自己免疫疾患の治療、輸血後の副作用防止、Ｔ細胞
ワクチン療法および遺伝子診断が可能となる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：324 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状ハイポセティカル配列：No 配列 ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 90 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TGT TAG 324 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser Cys 100 105 配列番号：２配列の長さ：336 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状ハイポセティカル配列：No 配列 ATG TTT TCC CAA CAA ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC 48 Met Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 CAT GTA CCA AGC AAT GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA 96 His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GCA GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA 144 Lys Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGG GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr 50 55 60 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGT TGA 336 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn Cys 100 105 110 配列番号：３配列の長さ：29 配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチドハイポセティカル配列：Yes フラグメント型：Ｎ末端ペプチド配列の特徴配列中、12番目および28番目のXaa は天然に存在するア
ミノ酸を表わし、ここで12番目のXaa は好ましくはセリ
ンである。

【００５８】１番目のアミノ酸はバリンまたはフェニル
アラニン、３番目のアミノ酸はグルタミンまたはセリン
である。配列 Val/Phe Ser Gln/Ser Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Xaa Lys 20 25 配列番号：４配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 GTTGGATCCT TYWSNCARGA YATHTAYGG 29 配列番号：５配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：Yes 配列 ACACTGCAGC ATDATYTCNG TRAANGG 27 配列番号：６配列の長さ：393 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No 起源生物名：オーヴィス（Ovis）細胞の種類：白血球細胞配列 GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT TAT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 GCA AGG CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC ATA CTG CCA GCA GTA ATA TGT 336 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 GGC TTG CTG TTT TTA AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC 384 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 TCA GGG CCC 393 Ser Gly Pro 130 配列番号：７配列の長さ：131 配列の型：アミノ酸起源生物名：オーヴィス（Ovis）細胞の種類：白血球細胞配列 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 Ser Gly Pro 130 配列番号：８配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT 24 配列番号：９配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA 24 配列番号：10 配列の長さ：222 配列の型：アミノ酸ハイポセティカル配列：No 起源生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）細胞の種類：PBL （末梢血リンパ球(Peripheral Blood
Lymphocytes)）配列 Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His 1 5 10 15 Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys 20 25 30 Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser 35 40 45 Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val 100 105 110 Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met 115 120 125 Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr 165 170 175 Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly 195 200 205 Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 210 215 220 配列番号：11 配列の長さ：753 配列の型：核酸鎖の数：両形態配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No 起源生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）配列 ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48 Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val -28 -25 -20 -15 GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96 Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln -10 -5 1 ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144 Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn 5 10 15 20 GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192 Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala 25 30 35 GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG 240 Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg 40 45 50 GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 288 Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr 55 60 65 TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT 336 Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp 70 75 80 ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GAG TCT CTT CCA TCT CCC ACA 384 Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr 85 90 95 100 CTA ACT TGT GCA TTG ACT AAT GGA AGC ATT GAA GTC CAA TGC ATG ATA 432 Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile 105 110 115 CCA GAG CAT TAC AAC AGC CAT CGA GGA CTT ATA ATG TAC TCA TGG GAT 480 Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp 120 125 130 TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC AGT ATA TAT TTT AAG 528 Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Ans Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys 135 140 145 ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576 Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro 150 155 160 TTA TTT AAT ACA ACA TCA TCA ATC ATT TTG ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624 Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser 165 170 175 180 AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA TTA GCA 672 Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala 185 190 195 GTA ATT ACA ACA TGT ATT GTG CTG TAT ATG AAT GGT ATT CTG AAA TGT 720 Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys 200 205 210 GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 753 Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 215 220 配列番号：12 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No 配列 TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATATTTAT GG 32 配列番号：13 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：Yes 配列 CAACTGCAGC TACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCTTGCA TAATCAATCA C 51 配列番号：14 配列の長さ：321 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状ハイポセティカル配列：No 配列 ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 90 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TAG 321 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 100 105 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 333 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 100 105 110 配列番号：15 配列の長さ：46 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：Yes 配列 TTTTTTCGAA CTGCAGCTAA CACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCT 46

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いるＬＦＡ−３誘導体タンパク質の
担体への結合を示す図である。(ａ）は従来の方法にし
たがいＬＦＡ−３誘導体タンパク質をアミノ基を介して
担体に結合した図を示し、（ｂ）は本発明にしたがいＬ
ＦＡ−３誘導体タンパク質をチオール基を介して担体に
結合した図を示している。図中、○は唯一のシステイン
残基、白抜き三角はアミノ基に特異性をもつ分子、斜線
を付した三角はアミノ基よりもチオール基に特異性をも
つ活性化ハロゲン分子を示す。

【図２】本発明の細胞付着部材および対照である２−メ
ルカプトエタノールを固定化した部材について付着した
ＣＤ２陽性および陰性のジャーカット細胞を０．０５％
クリスタルバイオレットにより染色した結果を示す図で
ある。

【図３】プレートに付着されたＣＤ２およびＣＤ３陽性
のジャーカット細胞、またはＣＤ２およびＣＤ３陰性の
ジャーカット細胞を０．０５％クリスタルバイオレット
により染色した結果を示す図である。ＬＦＡ−３誘導体
タンパク質がチオール基を介して結合されたプレート、
ＣＤ３抗体がアミノ基を介して結合されたプレートおよ
びＢＳＡがアミノ基を介して結合されたプレートを用い
たばあいの結果をそれぞれ示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｄ２領域およびＴＭ領域をもたず細胞質
内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステ
イン残基を有するＬＦＡ−３誘導体タンパク質を担体に
固定化した細胞付着部材。
【請求項２】Ｄ２領域およびＴＭ領域をもたず細胞質
内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステ
イン残基を有するＬＦＡ−３誘導体タンパク質のチオー
ル基を介して該タンパク質を担体に固定化した細胞付着
部材。
【請求項３】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質がヒツジ
に由来する請求項１記載の細胞付着部材。
【請求項４】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質がヒトに
由来する請求項１記載の細胞付着部材。
【請求項５】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質が、配列
番号１で示されるアミノ酸配列からなる、ヒツジ由来の
タンパク質である請求項１記載の細胞付着部材。
【請求項６】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質が、配列
番号２で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト由来のタ
ンパク質である請求項１記載の細胞付着部材。
【請求項７】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質がヒツジ
に由来する請求項２記載の細胞付着部材。
【請求項８】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質がヒトに
由来する請求項２記載の細胞付着部材。
【請求項９】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質が、配列
番号１で示されるアミノ酸配列からなる、ヒツジ由来の
タンパク質である請求項２記載の細胞付着部材。
【請求項１０】該ＬＦＡ−３誘導体タンパク質が、配
列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト由来の
タンパク質である請求項２記載の細胞付着部材。
【請求項１１】白血球を除去しうる請求項１ないし１
０のいずれかに記載の細胞付着部材。
【請求項１２】Ｔ細胞を分離回収しうる請求項１ない
し１０のいずれかに記載の細胞付着部材。
【請求項１３】白血球からのＤＮＡあるいはＲＮＡの
分離を可能とする請求項１ないし１０のいずれかに記載
の細胞付着部材。
【請求項１４】請求項１ないし１０のいずれかに記載
の細胞付着部材を用いてＣＤ２陽性細胞を付着分離する
方法。
【請求項１５】該細胞付着部材とＣＤ２陽性細胞を含
みうる体液を接触させる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】請求項１ないし１０のいずれかに記載
の細胞付着部材を用いて白血球を付着分離する方法。
【請求項１７】該細胞付着部材と白血球を含みうる体
液を接触させる請求項１６記載の方法。