JPH0975099A - 改良された化学発光試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、臨床検査薬などに使用可能な、よ
り高感度で安定な化学発光試薬を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ（ａ）、２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）および酸
化剤（ｃ）を化学発光増強剤（ｄ）の存在下、溶液中で
反応させて生じる化学発光の強さにより、ペルオキシダ
ーゼ（ａ）を定量するために用いられる化学発光試薬に
おいて、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物（ｂ）、化学発光増強剤（ｄ）、酸化剤（ｃ）と
キレート剤（ｅ）を組み合わせてなることを特徴とする
化学発光試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査薬などに
応用可能な、化学発光法と化学発光試薬およびそれらを
用いた酵素免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペルオキシダーゼ（ａ）、２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）および酸
化剤（ｃ）を化学発光増強剤（ｄ）の存在下で反応させ
て生じる化学発光の強さにより、ペルオキシダーゼ
（ａ）を定量する化学発光法および発光試薬において
は、種々の方法で感度すなわちＳ／Ｎ比（シグナル／ノ
イズの比）の改善が試みられてきた。Ｓ／Ｎ比の改善の
方策として、発光増強効果の高い化学発光増強剤を用
いる方法（特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５
９−１７１８３９号公報、特開平７−１４３８９９号公
報など）、非特異的発光反応すなわち試薬ブランク
（ノイズ）を低下させる添加剤を用いる方法（特開平６
−２２７９５号公報、特開平６−２４２１１１号公報、
特開平６−３４６３０号公報など）、化学発光増強剤
の効果を増す添加剤の使用（特開平６−２２７９５号公
報、特開平６−２４２１１１号公報など）が知られてい
る。また、一般に高純度の試薬を用いた場合、Ｓ／Ｎ比
が高くなることが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、の方
法は、新規の化学発光増強剤を見いだす点で非常に困難
である。及びの方法は、比較的簡単に実施できる
が、タンパク質や界面活性剤を用いることから、安定的
な効果が期待できない場合がある。また、高純度の試薬
を用いることは、試薬製造のコストが高くなるという問
題がある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、簡単に、安定的に、Ｓ
／Ｎ比を向上し、しかも高純度の試薬を用いない場合で
も効果のある本発明に到達した。さらに本発明は、２次
的効果として発光試薬の保存安定性をも向上させる。

【０００５】すまわち、本発明は、ペルオキシダーゼ
（ａ）、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物（ｂ）および酸化剤（ｃ）を化学発光増強剤
（ｄ）の存在下、溶液中で反応させて生じる化学発光の
強さにより、ペルオキシダーゼ（ａ）を定量するために
用いられる化学発光試薬において、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）、化学発光増強
剤（ｄ）および酸化剤（ｃ）とキレート剤（ｅ）を組み
合わせてなることを特徴とする化学発光試薬である。

【０００６】本発明において、ペルオキシダーゼ（ａ）
としては、西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球などから
抽出したペルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち
好ましいのは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。ま
た、ペルオキシダーゼ（ａ）は、遊離の状態であって
も、免疫測定において用いられるような配位子（例え
ば、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、
ビオチンなど）と結合した複合体の状態であってもよ
い。

【０００７】本発明において、２，３−ジヒドロ−１，
４−フタラジンジオン化合物（ｂ）としては、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチル
イソルミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−
Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。
これらのうち好ましいものはルミノールである。

【０００８】本発明において、酸化剤（ｃ）としては、
過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウムな
どが挙げられる。これらのうち好ましいのは過酸化水素
である。

【０００９】本発明において、化学発光増強剤（ｄ）は
従来公知のものが使用できる。例えば、特開昭５９−５
００２５２号公報記載の化合物、特開昭５９−１７１８
３９号公報記載、特開平７−１４３８９９号公報記載の
化合物、特開平４−２９３４９８号公報記載の化合物な
どが使用できる。このうちに好ましいのは、Ｐ−ヨード
フェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４
−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールである。

【００１０】本発明において、キレート剤（ｅ）は金属
イオンに配位してキレート化合物をつくる多座配位子を
いう。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎ
ａ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ウラミル二酢酸（Ｕ
ＤＡ）等があげられる。これらのうち好ましいのはＥＤ
ＴＡ２Ｎａである。溶液中でのキレート剤の濃度は、
０．０１ミリモル／リットル〜１ミリモル／リットルの
範囲が好ましく、特に好ましくは０．１ミリモル／リッ
トル〜０．５ミリモル／リットルの範囲である。

【００１１】本発明において、発光反応は、アルカリ性
の溶液中で行われることが好ましく、特にｐＨ７〜１１
が好適である。用いられる緩衝液は、前記のｐＨを満足
するものであればどの様な種類の緩衝液を用いることも
可能であるが、リン酸緩衝液、グリシン／ＮａＯＨ緩衝
液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩
衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液などが好まし
いものとして挙げられる。

【００１２】本発明においては、キレート剤（ｅ）、化
学発光増強剤（ｄ）および２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン化合物（ｂ）の水溶液（第１液）とし
て保存、使用するのが良い。酸化剤（ｃ）は、第１液と
は別に、上記の反応ｐＨを変化させない溶媒（通常は
水）に溶解された溶液（第２液）として保存、使用され
る。通常、発光反応は、ペルオキシダーゼを含むサンプ
ルに第１液および第２液を加えることで行われる。あら
かじめ、第１液と第２液を混和た後、測定に用いること
も可能であるが、混和後の保存安定性は低下する。

【００１３】該第１液には、Ｓ／Ｎ比をさらに改善する
ため、界面活性剤、タンパク質等を添加することもでき
る。勿論、これらの界面活性剤、タンパク質などを、該
（ａ）、該（ｂ）、該（ｃ）、該（ｄ）の個別あるいは
組み合わせた溶液に添加することもできる。

【００１４】本発明に用いられる、該（ｂ）、該
（ｃ）、該（ｄ）の各濃度は、用いる化合物の種類、測
定方法、条件によって最適濃度が設定されなければなら
ない。通常、該（ｄ）は１０^-4〜１．０（Ｗ／Ｖ％）、
該（ｂ）は０．１ミリモル／リットル〜１モル／リット
ル、該（ｃ）は０．１ミリモル／リットル〜１モル／リ
ットルの範囲で設定できる。

【００１５】一般に化学発光に用いられる、試薬および
水は、高純度であることが要求され、再結晶などの精製
を行う場合が多い。特に２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン化合物（ｂ）の精製度は、Ｓ／Ｎ比に影
響することが知られている。本発明の方法では、市販の
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物
（ｂ）を再結晶などの精製を行わずに使用できる。勿
論、精製度の高い２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジ
ンジオン化合物（ｂ）を用いればよりＳ／Ｎ比は改善す
る。

【００１６】本発明の化学発光試薬は、従来公知のペル
オキシダーゼを利用した測定法および測定用キット、特
に免疫測定法および免疫測定用キットに使用することが
できる。ペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法につ
いては広く知られている。試料中の測定対象物質の量
は、ペルオキシダーゼ標識された配位子（例えば、抗
原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチ
ンなど）の量に対応させて、そのペルオキシダーゼ活性
を定量することで定量できる。本発明は、従来のペルオ
キシダーゼを用いる全ての酵素免疫測定法に適応可能な
ものである。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。

【００１８】実施例１ 本実施例は、本発明によるキレート剤の添加が、発光試
薬自体のブランク（ノイズ）を低下し、かつペルオシダ
ーゼを含む検体の発光（シグナル）に影響しないため、
Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が高くなることを示すも
のである。

【００１９】１）発光試薬第１液の調製 市販ルミノール（東京化成）を再結晶化で精製したルミ
ノール０．１８ｇおよび４−（シアノメチルチオ）フェ
ノール０．１ｇを０．１モル／リットル（ｐＨ８．５）
のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。本溶液を
３つに分け、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以
下、ＥＤＴＡ２Ｎａと略す。和光純薬純薬工業（株）
製）を無添加のもの、０．１ミリモル／リットルの
濃度で添加したもの、０．５ミリモル／リットルの濃
度で添加したもの作製し、発光試薬第１液、発光試薬
第１液、発光試薬第１液とした。これらの溶液は、
使用するまで冷蔵保存した。

【００２０】２）発光試薬第２液の調製 酸化剤（ｃ）としては、過酸化水素を用いた。２００μ
ｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解
し、発光試薬第２液とした。使用するまで冷蔵保存し
た。

【００２１】２）免疫反応用試薬と免疫反応操作 ペルオキシダーゼを標識に用いた市販の酵素免疫測定試
薬「グラザイムＡＦＰ−ＥＩＡ ＴＥＳＴ」（三洋化成
工業（株）製）を用いて、添付の説明書に準じて免疫反
応を行った。すなわち、試験管中で、ＡＦＰを含むサン
プル２０μｌと免疫反応用緩衝液３００μｌおよび抗体
ビーズ１個を３７℃、１時間反応した。反応液を廃棄し
た後、緩衝液を加え、ビーズを緩衝液で洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識抗体液３００μｌを加え３７℃、１時間
反応した。緩衝液で洗浄後下記の方法で、酵素活性の測
定を行った。

【００２２】３）発光測定操作 酵素活性の測定は、次のように行った。上記のビーズの
入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーに
セットし、発光試薬第１液２００μｌおよび発光試薬
第２液２００μｌを加え発光反応を開始した。発光量
は、発光反応開始４０秒後から１０秒間の平均値として
示した。試薬盲検（ブランク測定）も、上記ビーズの無
い条件で同様に測定した。

【００２３】４）測定結果 発光試薬第１液、及びを用いた場合のブランクと
標準ＡＦＰ溶液（６４０ng/ml）の発光量を表１に示し
た。またＳ／Ｎ比も表１に示した。ＥＤＴＡ２Ｎａを添
加することにより、発光試薬自体のブランク（ノイズ）
が低下したのに対し、標準ＡＦＰ溶液６４０ｎｇ／ｍｌ
の測定発光量（シグナル）は変化しない。従って、表１
の通り、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比は、ＥＤＴＡ２
Ｎａの添加により著しく向上した。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例２ 本実施例は、本発明により市販のルミノールを再精製な
しに使用できることを示すものである。

【００２６】市販ルミノール（東京化成）をそのまま用
いて、実施例１と同様に、発光試薬第１液を調製し、ブ
ランクと標準ＡＦＰ溶液（６４０ｎｇ／ｍｌ）を測定し
た。結果を表２に示した。ＥＤＴＡ２Ｎａの添加により
ブランクが下がり、Ｓ／Ｎ比が向上し、市販ルミノール
を直接用いても感度が低下しない。

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例３ 本実施例は、本発明により発光試薬の保存安定性が改善
されることを示すものである。

【００２９】実施例１で作成した、発光試薬第１液、
及びを２５℃で保存し、ブランク及び標準ＡＦＰ溶
液（６４０ｎｇ／ｍｌ）の発光量、Ｓ／Ｎ比を実施例１
と同様に、１週間後および１ケ月後に測定した。

【００３０】測定結果を表３に示した。ＥＴＤＡ２Ｎａ
の添加により、標準ＡＦＰ溶液の測定発光量の低下が少
なく、保存安定性が高まったことが判る。

【００３１】

【表３】

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、簡単に、安定的に、試
薬ブランクを低下させ、Ｓ／Ｎ比を向上することが可能
で、しかも市販の試薬を精製せずそのまま用いても充分
なＳ／Ｎ比を得ることができる。また、発光試薬の保存
安定性が高まるという効果もある。従って、本発明を適
応することで、より高感度で安定なペルオキシダーゼの
化学発試薬を作ることが可能であり、それを用いること
で高感度の免疫測定が可能となる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペルオキシダーゼ（ａ）、２，３−ジヒ
   ドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）および酸
   化剤（ｃ）を化学発光増強剤（ｄ）の存在下、溶液中で
   反応させて生じる化学発光の強さにより、ペルオキシダ
   ーゼ（ａ）を定量するために用いられる化学発光試薬に
   おいて、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
   化合物（ｂ）、化学発光増強剤（ｄ）および酸化剤
   （ｃ）とキレート剤（ｅ）を組み合わせてなることを特
   徴とする化学発光試薬。
2. 【請求項２】 キレート剤（ｅ）、化学発光増強剤
   （ｄ）および２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
   オン化合物（ｂ）の水溶液からなる第１液と、酸化剤
   （ｃ）を含む第２液とを構成要素とする請求項１記載の
   化学発光試薬。
3. 【請求項３】 溶液中に、キレート剤（ｅ）が、０．１
   ミリモル／リットル〜０．５ミリモル／リットルの濃度
   で添加されている請求項１または２記載の化学発光試
   薬。
4. 【請求項４】 キレート剤（ｅ）が、エチレンジアミン
   四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその塩である請求項１〜３いず
   れか記載の化学発光試薬。