JPH0980039A - 電気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は糖たんぱく質の分析に用いて好適な電
気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装置に関
し、分析精度の向上を図ることを目的とする。 【解決手段】移動相内の被測定試料を分離カラム７によ
り分離してＵＶ検出装置８に供給して分析処理を行うと
共に、このＵＶ検出装置８で検出処理された被測定試料
に添加液を添加した上でＰＡＤ（電気化学検出器）１１
に供給して電気化学検出処理を行う構成とされた装置に
おいて、上記分離カラム７としてセミミクロカラムを用
い、ＵＶ検出装置８からＰＡＤ１１に向け流出される該
被測定試料を含む移動相の流量を２５０マイクロリット
ル／分以下となるよう構成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は電気化学検出器を有
する液体クロマトグラフィ装置に係り、特に糖たんぱく
質に代表される生化学上重要な配糖物質の分析に用いて
好適な電気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装
置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、糖タンパク質の新規な生理活性が
次々と報告されており、これに伴いより高感度で情報量
の多い分析を行うため、クロマトグラフィー，酵素処理
法，分光学的手段等の分析手法のあらゆる角度からの改
良が行われている。

【０００３】その中で、トリプシン等の酵素処理による
タンパク質のペプチドマッピング（以下、マッピングと
いう）は、バイオテクノロジーや天然より得られるタン
パク質の同定，或いは構造解析の補佐的手段として頻繁
に用いられている。マッピングの一つとしてＬＣペプチ
ドマッピングが知られている。このＬＣペプチドマッピ
ングは、紫外線吸収検出器によりペプチド結合のカルボ
ニル基の吸収(214nm) を測定し、側鎖の異なるアミノ酸
の集合体であるペプチド鎖を非選択的に観測する方法で
ある。しかるに、上記した高情報化の要望に伴い、糖ペ
プチドの配糖位置情報をも得たいという要望がある。

【０００４】この糖ペプチドの配糖位置情報を得る手段
として、糖のイオンクロマトグラフィーに多用されてい
るパルス式電気化学検出器(Pulsed Amperomeric Detect
or:以下、ＰＡＤと略称する）が知られている。このＰ
ＡＤは糖の水酸基に反応する特性を有しているため、Ｐ
ＡＤを用いることにより糖ペプチドを選択的に検出する
ことができる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】周知のように、液体ク
ロマトグラフィ装置に用いる移動相は分析処理において
重要な要素となり、特定の被測定試料を分離しようとし
た場合には、その分離に適合した移動相を選定する必要
がある。一方、ＰＡＤに用いる添加液は高アルカリであ
る必要がある。

【０００６】また、従来の液体クロマトグラフィ装置
は、例えば内径が4.6mm 〜6.0mm の径寸法の大きな分離
カラムを用いていたため、液体クロマトグラフィ装置か
らＰＡＤに向け大流量（例えば、３００マイクロリット
ル／分以上）の移動相が流れ込む構成とされていた。従
って、ＰＡＤの添加液は、その大きな割合が液体クロマ
トグラフィ装置から流入する移動相により占められるこ
ととなる。

【０００７】従って、従来では液体クロマトグラフィ装
置とＰＡＤとを直列に接続した構成の分析装置では、液
体クロマトグラフィ装置に用いる移動相として、ＰＡＤ
における分析処理にも適応できるようよう高アルカリの
移動相が選定されていた。しかるに、上記したように液
体クロマトグラフィ装置に用いる移動相は分析処理にお
いて重要な要素であり、この移動相の選定により分離で
きる物質が特定される。このため、ＰＡＤ側の特性によ
り移動相が選定される従来構成では、移動相の選定にお
ける自由度が低下して所望する分離処理が行えないとい
う問題点があった。

【０００８】本発明は上記の点に鑑みてさなれたもので
あり、ＰＡＤ使用に関する移動相の選択を大幅に広げる
液体クロマトグラフィ装置を提供することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明では、被測定試料を分離カラムにより分離して
検出手段に供給し、上記検出手段において被測定試料に
添加液を添加した上で電気化学検出器に供給し、この電
気化学検出器において被測定試料に対して電気化学検出
処理を行う構成とされた電気化学検出器を有する液体ク
ロマトグラフィ装置において、上記分離カラムとしてセ
ミミクロカラム又はミクロカラムを用い、上記分離カラ
ムから電気化学検出器に向け流出される被測定試料を含
む移動相の流量を２５０マイクロリットル／分以下とな
るよう構成したことを特徴とするものである。

【００１０】上記のように分離カラムとしてセミミクロ
カラム又はミクロカラムを用いることにより、検出手段
から電気化学検出器に向け流出される被測定試料を含む
移動相の流量を２５０マイクロリットル／分以下の微流
量とすることが可能となる。このように、分離カラムか
ら電気化学検出器に流入する移動相の流量を少なくする
ことにより、電気化学検出器に流入する溶液（添加液と
移動相とが混合されたもの）は移動相の含有割合に対し
て添加液の占める割合が大きくなる。即ち、電気化学検
出器に流入する溶液の特性は添加液により決まることと
なる。

【００１１】このため、液体クロマトグラフィ装置に用
いる移動相と電気化学検出器に用いる添加液を異ならせ
ても、電気化学検出器で行われる分析処理に問題が生じ
ることはなく、かつ液体クロマトグラフィ装置において
は所望する分析に適合した移動相を選定することが可能
となり、液体クロマトグラフィ装置及び電気化学検出器
で行われる分析の対象物質が広範なものとなる。

【００１２】

【発明の実施の形態】次に本発明の実施の形態について
図面と共に説明する。図１は本発明の一実施例である電
気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装置１（以
下、単に装置という）の全体構成図である。尚、以下の
説明においては、装置１を糖タンパク質の分析に用いた
例について説明する。

【００１３】先ず、図１を用いて装置１の全体構成図に
ついて説明する。装置１は、大略すると通常の液体クロ
マトグラフィ装置として構成されるＬＣペプチドマッピ
ング処理部２と、パルス式電気化学検出器（ＰＡＤ）と
して構成される糖ペプチド分析処理部３とにより構成さ
れる。

【００１４】ＬＣペプチドマッピング処理部２はグラジ
エント法に対応したものであり、第１及び第２のポンプ
４，５、インジェクター６、分離カラム７、紫外線検出
装置８（以下、ＵＶ検出装置という）等により構成され
ている。第１のポンプ４は水に 0.1％のトリクロロ酢酸
（ＴＦＡ）を混合した溶液をインジェクター６に向け搬
送するものであり、第２のポンプ５はアセトニトリル
（ＣＨ₃ ＣＮ）に 0.1％のトリクロロ酢酸（ＴＦＡ）を
混合した溶液をインジェクター６に向け搬送するもので
ある。第１及び第２のポンプ４，５から流出された溶液
は配管９において混合されて移動相を構成し、この移動
相は各ポンプ４，５のポンプ圧力によりインジェクター
６に向け搬送される。

【００１５】インジェクター６は、各ポンプ４，５から
搬送されてくる移動相に被測定試料（本実施例の場合に
は、糖タンパク質）を所定のグラジエント条件となるよ
う添加すると共に、この被測定試料が添加された移動相
を分離カラム７に向け供給する。

【００１６】分離カラム７としては、内径が２mm以下の
セミミクロカラムが採用されており、具体的には本実施
例ではCapcell Pack C18 UG120(1.0mm i.d.X 250mm) が
採用されている。このように、本実施例では分離カラム
７としてセミミクロカラムを用いているため、従来用い
られていた内径が４mm以上の大径の分離カラムを用いる
構成に比べて感度を向上させることができる。

【００１７】尚、小径のカラムを用いることにより感度
が向上することは、例えば(1)R.P.Scott,and P.J.Krcer
a, "J.Chromatogr.,125(1978)271" 、(2)T.Tsrda, and
M.Novotny,"Anal.Chem.50(1978)632" 、(3)D.Ishi,K.As
ai,K.Hibi,T.Janokuchi,andM.J.Nagaya,"J.Chromatog
r.,124(1977)157" 、(4)M.Novotny,"Anal.Chem.60(198
8)500A等の文献に記載されている。

【００１８】上記の分離カラム７において、所定の分離
処理が行われた移動相は、続いてＵＶ検出装置８に供給
されて紫外線の吸収度を利用した分析処理が行われる。
このＵＶ検出装置８で検出されたデータはコンピュータ
１０に供給され、通常のＬＣペプチドマッピング処理が
行われる。尚、ＵＶ検出装置８は、分離カラム７から供
給される移動相の流量が0.05〜0.07ミリリットル／分の
微流量領域においても安定したグラジエント分析が行え
るよう構成されている。

【００１９】このＬＣペプチドマッピング処理は、前述
したように側鎖の異なるアミノ酸の集合体であるペプチ
ド鎖を非選択的に観測する方法であり、従ってＬＣペプ
チドマッピング処理のみではそのペプチドが糖ペプチド
か否かの情報を得ることはできない。そこで本実施例に
係る装置１では、ＬＣペプチドマッピング処理部２に直
列に糖ペプチド分析処理部３を接続し、ＵＶ検出装置８
において分析処理が終了した被検出試料をＰＡＤ１１に
供給し、これにより糖ペプチドが感度良く検出出来る構
成としている。

【００２０】また、ＬＣペプチドマッピング処理部２か
ら糖ペプチド分析処理部３に流入する移動相の流量、即
ちＵＶ検出装置８から流出する移動相の流量は２５０マ
イクロリットル／分以下となるよう構成されている。こ
の移動相流量は、分離カラム７の内径寸法と第１及び第
２のポンプ４，５のポンプ圧力により設定することがで
きる。

【００２１】また、分離カラム７を通過する移動相の流
量は分離カラム７の内径寸法と関係を有し、内径が小さ
いほど分離カラム７を通過する移動相の流量も小さくな
る。従って、分離カラムの内径が４mm以上のものでは、
ＵＶ検出装置８から流出する移動相の流量を有る程度の
流量（例えば５００マイクロリットル／分以上）を必要
とする。そこで、本実施例ではＵＶ検出装置８から流出
する移動相流量を２５０マイクロリットル／分以下とす
る点より、分離カラム７として内径が２mm以下のセミミ
クロカラムを採用している。

【００２２】続いて、糖ペプチド分析処理部３について
説明する。糖ペプチド分析処理部３は、ＰＡＤ１１と第
３のポンプ１２等により構成されている。第３のポンプ
１２は、ペーハー１３（ｐＨ１３）のアルカリ性添加液
を例えば 0.3ミリリットル／分の流量でＰＡＤ１１に向
け流出する構成とされている。この第３のポンプ１２か
ら流出した添加液は、配管１３においてＵＶ検出装置８
から流出する移動相と混合された上でＰＡＤ１１に供給
される構成となっている。

【００２３】ここで、ＰＡＤ１１の原理について説明す
る。糖類は、光学機器による検出に都合のよい発色団を
持たないため、その分析は生化学上重要な物質に比べて
困難とされてきた。しかるに、糖は強アルカリ下ではプ
ロトンを放出する弱酸と見ることが出来る。また、解離
した糖の酸化電位は十分に通常の電極反応で扱える範囲
である（下式参照）。

【００２４】

【化１】

【００２５】上記の反応式は、糖を含めた脂肪族アルコ
ール一般に当てはまる。しかし、実際は反応生成物が作
用電極を急激に劣化させるため通常の電気化学検出は行
えない。これを解決したのがＰＡＤである。ＰＡＤの典
型的な設定では、１秒のサイクルの中に検出用のポテン
シャルと反応物除去用のポテンシャルを組み込む。そし
て、検出用ポテンシャルの間に得られる断続的な信号を
連続的な波形に変換することにより、あたかも通常の電
気化学検出器（Electrochemical Detector:ECD)と同等
の結果を得ることができる。上記のＰＡＤを用いること
により、解離した糖の長期のわたる分析が機能となっ
た。

【００２６】上記のように、ＰＡＤ１１は特異的に糖に
反応する特性を有しているため、ＰＡＤ１１を用いるこ
とにより糖ペプチドであるか否かの情報を得ることが可
能となる。また上記の理由により、ＰＡＤ１１の添加液
としてはｐＨ１３という強アルカリ性を有する添加液を
用いる必要があるのである。

【００２７】再び図１に戻り糖ペプチド分析処理部３の
構成の説明を続ける。前記したように、第３のポンプ１
２から流出した添加液は、配管１３においてＵＶ検出装
置８から流出する移動相と混合された上でＰＡＤ１１に
供給される。ここで、ＵＶ検出装置８から流出する移動
相の流量は前述したように２５０マイクロリットル／分
以下の微流量である。これに対し、第３のポンプ１２か
ら流出する添加液の流量は例えば 0.3ミリリットル／分
の流量であり、移動相の流量に対して大きな流量となっ
ている。従って、ＰＡＤ１１に流入する溶液（移動相と
添加液の混合された溶液）の特性は、移動相の特性より
も添加液の特性をより大きく反映したものとなることが
想像される。

【００２８】いま、上記推定に基づき、ＰＡＤ１１に流
入する溶液の特性が添加液により決定されるとした場
合、ＬＣペプチドマッピング処理部２に用いる移動相と
糖ペプチド分析処理部３において添加される添加液とを
異ならせても、ＰＡＤ１１で行われる分析処理に問題が
生じることはなく、かつＬＣペプチドマッピング処理部
２においては所望する分析に適合した移動相を選定する
ことが可能となる。

【００２９】そこで、本発明者は上記構成とされた装置
１により糖タンパク質の分析処理を行い、上記推論を実
証する実験を行った。以下、本発明者が行った実験の結
果について説明する。先ず、本実験で用いた試料及び試
薬について説明する。ペプチド混合物の標準試料は、ウ
シフェツイン(Bovine Fetuin: 以下ＢＦと略称する）２
０ｍｇとトリプシン１ｍｇをリン酸バッファー 0.1ミリ
リットル（１００ｍＭ，ｐＨ7.6)に溶かし、これを３７
℃にて４時間放置して作成した。また、Glycopeptidase
F（以下、ＧＦと略称する）による糖鎖除去は、上記の
ペプチド混合物１０マイクロリットルに対し、0.5 unit
のＧＦを加え３７℃にて４時間放置することにより行っ
た。尚、単糖から多糖までの標準試料は東京化成から購
入し、ＢＦ及びトリプシンはシグマ社のものを使用し、
更にＧＦはカルボケム社（米国）のものを使用した。

【００３０】図２は、分離カラム７を流れる流量が６０
マイクロリットル／分における、ＢＦ（酵素処理条件は
前記のものと異なる）から得られたペプチド混合物を用
いて再現性の試験結果を示している。同図より、設定さ
れたグラジエント条件下で、全ての時間領域においてピ
ーク溶出位置の良好な再現性が得られているのが判る。
即ち、本実施例のＬＣペプチドマッピング処理部２によ
れば、精度の高いＬＣペプチドマッピング処理を行うこ
とができる。

【００３１】一方、本実験においては、基本的な感度の
事前検討には、図３（図１と同一構成については同一符
号を付している）に示されるように、フローインジェク
ションを用いた。これは、分離カラムを用いると絶対的
なＰＡＤ１１の応答を議論するのが困難となるからであ
る。この基本的な感度の事前検討においては、最初に標
準単糖としてグルコースを選定し、検出限界を調べたと
ころ、約 16ng,98pmolとの結果を得た。尚、図３におい
て、符号１４で示すのは、５０％のアセトニトリルと
0.1％のＴＦＡをインジェクター６に向け圧送するポン
プである。

【００３２】ところで、本発明で注目する化学種は糖タ
ンパク質に結合された分子量2000〜3000の大きい糖質で
ある。分子量の大きい糖の場合、単糖単位当たりの水酸
基（ＯＨ基）の数が、５（６炭糖の場合）から３に近づ
き減少していくため（糖鎖の中間の残基では、２つ以上
のＯＨ基がグルコシド結合に消費される）、当然に感度
が減少することが予想される。また、大きい分子は拡散
係数が小さく、電極反応には不利であることも想像され
る。

【００３３】図４は感度の分子量依存性を示す図であ
る。横軸は重合度を示しており、また縦軸はＰＡＤ１１
の応答特性を示している。同図に示されるように、重合
度の増加に伴いＰＡＤ１１の応答特性は減少する特性を
示す。しかるに、上記のフローインジェクションでは、
デキストリンのような高分子であってもある程度の感度
を保つことが確認された。

【００３４】更に、本発明者はＬＣペプチドマッピング
処理部２からＰＡＤ１１に被測定試料を導入するのに用
いる溶液（即ち、移動相）の種類が、最終的にＰＡＤ１
１における分析処理に及ぼす影響について調べた。具体
的には、図３に示される装置において、第３のポンプ１
２からＰＡＤ１１に向け供給される添加液として水１０
０％としたり、また有機溶媒やＴＦＡを含む液を用いて
ＰＡＤ１１の応答の比較を行った。

【００３５】その結果、ＬＣペプチドマッピング処理部
２からの移動相の流量を２５０マイクロリットル／分以
下とした場合には、これを第３のポンプ１２から0.3 ミ
リリットル／分の流量で供給される添加液と混合しても
ＰＡＤ１１の応答には何ら悪影響を及ぼさないことが判
明した。従って、ＬＣペプチドマッピング処理部２に用
いる移動相とＰＡＤ１１に用いる添加液を異ならせて
も、ＰＡＤ１１で行われる分析処理に問題が生じること
はなく、かつＬＣペプチドマッピング処理部２において
は所望する分析に適合した移動相を選定することが可能
となった。

【００３６】続いて、本実施例に係る装置１を用いて実
際に糖タンパク質の分析処理を行った実施例について説
明する。本実施例に係る装置１の測定対象はトリプシン
により断片化された糖タンパク質であり、その目的はＬ
Ｃペプチドマッピングによるタンパク質の分離パターン
情報とタンパク質の配当位置に関する情報とを共に精度
よく得ることである。

【００３７】典型的な糖ペプチドの糖鎖部分の分子量は
2000〜3000と非常に大きい。この部分には、多量のＯＨ
基が存在し、ＰＡＤ１１に対するかなりの応答が期待さ
れる。しかるに、ＰＡＤ１１に応答するのは糖鎖部分の
みではなく、あるアルカリ条件下ではチロシン，トリプ
トファン，システインのみならず（これには通常電気化
学活性を持つ）、他のアミノ酸やペプチド鎖も電気化学
活性を持つことが知られている。従って、精度の高い分
析処理を行うには、一般のペプチドと糖ペプチドとの差
別化が明確にできるかどうかが重要な点となる。

【００３８】図５は、本実施例に係る装置１によるモデ
ル糖タンパク質及びＢＦの分析結果を示している（尚、
同図において、糖ペプチドの既存は後述する酵素ＧＦを
使った検証実験の結果を解析した上で記入している）。
また、同図において上部に位置する分析結果はＵＶ検出
装置８により検出されたデータをコンピュータ８でＬＣ
ペプチドマッピング処理したものであり、また下部に位
置する分析結果はＰＡＤ１１により検出されたデータを
コンピュータ８で処理したものである。更に、各分析結
果は横軸（保持時間）においては一致しているが、ＵＶ
検出装置８とＰＡＤ１１とは異なる原理に基づき分析処
理をおこなっているため縦軸（ピーク高さ）は異なって
いる。

【００３９】同図から明らかなように、ＰＡＤ１１によ
る応答では、２本のピーク（図中、矢印で示す）が他の
ビーク群に比べ約２倍の高さで測定されている。この２
本のピーク位置に相当するＵＶ検出装置８によるピーク
強度を調べると、これは必ずしもＰＡＤ１１による応答
と一致しない。前記したＰＡＤの原理説明より、ＰＡＤ
１１による応答で突出している２本のピークは糖ペプチ
ドであることが容易に予想される。

【００４０】これを実証するために、ＢＦのペプチド混
合物に酵素ＧＦの処理を行い、酵素ＧＦ処理を行わない
ものとの比較を行った実験結果を図６に示す。この酵素
ＧＦは、アスパラギン残基に修飾された糖鎖を切り離す
ことが知られている。同図に示されるように、ＧＦ処理
を行ったＬＣペプチドマップにはＰＡＤ１１による応答
では現れていた２本のピークは見当たらず、その代わり
に若干遅れて新しい２本のピークが観測される（一点鎖
線の矢印で各ピークの遅れを示している）。

【００４１】これは、ＧＦ処理を行うことにより、前記
した２本のピークに相当する糖ペプチドから糖鎖部分が
取り除かれ、物質の極性で分離する逆相分離では２つの
ペプチドの保持時間が夫々増大したことを意味してい
る。よって、以上の結果より本実施例に係る装置１で
は、確実に糖ペプチドを認識することができることが実
証された。

【００４２】

【発明の効果】上述の如く本発明によれば、液体クロマ
トグラフィ装置に用いる移動相と電気化学検出器に用い
る添加液を異ならせても、電気化学検出器で行われる分
析処理に問題が生じることはなく、かつ液体クロマトグ
ラフィ装置においては所望する分析に適合した移動相を
選定することが可能となり、よって液体クロマトグラフ
ィ装置及び電気化学検出器で行われる分析の応用範囲を
広げることができる等の特長を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例である装置の全体構成図であ
る。

【図２】分離カラムを流れる流量が６０マイクロリット
ル／分における、ＢＦから得られたペプチド混合物を用
いて再現性の試験結果を示す図である。

【図３】基本的な感度の事前検討に用いるフローインジ
ェクションを説明するための図である。

【図４】ＰＡＤにおける感度の分子量依存性を示す図で
ある。

【図５】本実施例に係る装置によるモデル糖タンパク質
及びＢＦの分析結果を示す図である。

【図６】ＢＦのペプチド混合物に酵素ＧＦの処理を行っ
たものと行わないものとの比較を行った実験結果を示す
図である。

【符号の説明】

１ 装置 ２ ＬＣペプチドマッピング処理部 ３ 糖ペプチド分析処理部 ４ 第１のポンプ ５ 第２のポンプ ６ インジェクター ７ 分離カラム ８ ＵＶ検出装置 １０ コンピュータ １１ ＰＡＤ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定試料を分離カラムにより分離して
   検出手段に供給し、 該検出手段において該被測定試料に添加液を添加した上
   で電気化学検出器に供給し、該電気化学検出器において
   該被測定試料に対して電気化学検出処理を行う構成とさ
   れた電気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装置
   であって、 該分離カラムとしてセミミクロカラム又はミクロカラム
   を用い、該分離カラムから該電気化学検出器に向け流出
   される該被測定試料を含む移動相の流量を２５０マイク
   ロリットル／分以下となるよう構成したことを特徴とす
   る電気化学検出器を有する液体クロマトグラフィ装置。