JPH0980053A - 改良された免疫測定法 - Google Patents
改良された免疫測定法Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、臨床検査薬などに用いられる免疫
測定法において、反応試薬のロット差により生じる、検
体の測定値の差を克服し得る測定法を提供する。 【解決手段】 検体中の測定対象物質を免疫測定する
際、反応液の塩の濃度を変動させて、由来の異なる固相
抗体の、標準物質および検体中の測定対象物に対する反
応性の差を制御し、検体中の測定対象物の測定値を一定
に保つことを特徴とする免疫測定法。
測定法において、反応試薬のロット差により生じる、検
体の測定値の差を克服し得る測定法を提供する。 【解決手段】 検体中の測定対象物質を免疫測定する
際、反応液の塩の濃度を変動させて、由来の異なる固相
抗体の、標準物質および検体中の測定対象物に対する反
応性の差を制御し、検体中の測定対象物の測定値を一定
に保つことを特徴とする免疫測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定法におい
て、測定試薬の品質を向上させるための改良された免疫
測定法に関するものである。詳しくは、抗原等の免疫測
定を行う際、反応液の塩濃度を変動させることで、該抗
原の測定値を一定の範囲に収めることを特徴とする改良
された免疫測定法に関するものである。
て、測定試薬の品質を向上させるための改良された免疫
測定法に関するものである。詳しくは、抗原等の免疫測
定を行う際、反応液の塩濃度を変動させることで、該抗
原の測定値を一定の範囲に収めることを特徴とする改良
された免疫測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、血清、尿などの生体試料中に含
まれる微量の物質（測定対象物質）、例えば蛋白質類の
含有量などは、抗体や抗原を利用した免疫測定法により
測定できる。特にヘテロジニアス酵素免疫測定法は、種
々の測定対象物の測定に用いられている。その場合、生
体試料中の測定対象物質の濃度を決定するためには、既
知濃度の測定対象物を含む標準物質を測定して得られた
検量線を用いることが一般的である。また、該標準物質
中の測定対象物質は、生体試料から精製されたものが用
いられることが一般的である。
まれる微量の物質（測定対象物質）、例えば蛋白質類の
含有量などは、抗体や抗原を利用した免疫測定法により
測定できる。特にヘテロジニアス酵素免疫測定法は、種
々の測定対象物の測定に用いられている。その場合、生
体試料中の測定対象物質の濃度を決定するためには、既
知濃度の測定対象物を含む標準物質を測定して得られた
検量線を用いることが一般的である。また、該標準物質
中の測定対象物質は、生体試料から精製されたものが用
いられることが一般的である。
【０００３】しかしながら、精製された測定対象物質
は、精製前の血清などの生体試料中に存在していた時と
比べ、免疫反応性などの性状が異なる場合がある。ま
た、精製された測定対象物質が添加された標準物質と、
血清などの検体では、非特異的反応の程度、粘度などの
物理的性状がことなるため、結果として正しい測定値を
示さない場合がある。この様なことを回避するため、標
準物質や反応液に、種々の添加剤を加えること（特開平
４−１２２８５８号公報、特開平２−３６３５３号公
報、特開平４−３７０７６１号公報など）が行われてい
る。
は、精製前の血清などの生体試料中に存在していた時と
比べ、免疫反応性などの性状が異なる場合がある。ま
た、精製された測定対象物質が添加された標準物質と、
血清などの検体では、非特異的反応の程度、粘度などの
物理的性状がことなるため、結果として正しい測定値を
示さない場合がある。この様なことを回避するため、標
準物質や反応液に、種々の添加剤を加えること（特開平
４−１２２８５８号公報、特開平２−３６３５３号公
報、特開平４−３７０７６１号公報など）が行われてい
る。
【０００４】また、測定に用いられる免疫測定試薬の製
造ロットにより、検出感度が異なることがあり、特開平
７−０３５７５０号公報には、反応液のｐＨを変動させ
て検出感度を制御する方法が示されている。
造ロットにより、検出感度が異なることがあり、特開平
７−０３５７５０号公報には、反応液のｐＨを変動させ
て検出感度を制御する方法が示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】免疫測定法では、同一
の検体は常に一定の測定値を示す必要がある。しかしな
がら、実際の測定値は、用いられる試薬の製造ロットに
より異なる場合がある。これは、測定に用いられる由来
の異なる固相抗体により、検体中の測定対象物質と、標
準物質中の精製された測定対象物質への反応性に違いが
あることに起因すると思われる。従って、固相抗体に用
いられる抗体の由来や、固相への抗体の結合量などによ
って測定値は変化するという問題がある。
の検体は常に一定の測定値を示す必要がある。しかしな
がら、実際の測定値は、用いられる試薬の製造ロットに
より異なる場合がある。これは、測定に用いられる由来
の異なる固相抗体により、検体中の測定対象物質と、標
準物質中の精製された測定対象物質への反応性に違いが
あることに起因すると思われる。従って、固相抗体に用
いられる抗体の由来や、固相への抗体の結合量などによ
って測定値は変化するという問題がある。
【０００６】従来の技術では、非特異的反応に起因する
測定値の変動（一般に変動は少ない）や検出感度の変動
は制御できるが、由来の異なる固相抗体に起因すると思
われる標準物質と検体中の測定対象物質の反応性の差を
制御することは難しく、結果として測定値は大きく変動
してしまう。このため、測定値を一定に保つには、標準
物質の測定対象物の含量を調節するなどの煩雑な試薬製
造工程を行う必要があった。また、同一の抗体を用いた
場合でも、常に同一性能の固相抗体を作成する事は困難
で、測定値の変動を解消できなかった。
測定値の変動（一般に変動は少ない）や検出感度の変動
は制御できるが、由来の異なる固相抗体に起因すると思
われる標準物質と検体中の測定対象物質の反応性の差を
制御することは難しく、結果として測定値は大きく変動
してしまう。このため、測定値を一定に保つには、標準
物質の測定対象物の含量を調節するなどの煩雑な試薬製
造工程を行う必要があった。また、同一の抗体を用いた
場合でも、常に同一性能の固相抗体を作成する事は困難
で、測定値の変動を解消できなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、試薬の製造ロットすな
わち由来の異なる固相抗体に標準物質と検体との反応性
の差があっても、検体中の測定対象物の測定値を一定に
保つことが可能な本発明に到達した。すなわち、検体中
の測定対象物質を免疫測定する際、反応液の塩の濃度を
変動させて、由来の異なる固相抗体の、標準物質および
検体中の測定対象物質に対する反応性の差を制御し、検
体中の測定対象物質の測定値を一定に保つことを特徴と
する免疫測定法である。
解決するため鋭意検討した結果、試薬の製造ロットすな
わち由来の異なる固相抗体に標準物質と検体との反応性
の差があっても、検体中の測定対象物の測定値を一定に
保つことが可能な本発明に到達した。すなわち、検体中
の測定対象物質を免疫測定する際、反応液の塩の濃度を
変動させて、由来の異なる固相抗体の、標準物質および
検体中の測定対象物質に対する反応性の差を制御し、検
体中の測定対象物質の測定値を一定に保つことを特徴と
する免疫測定法である。
【０００８】本発明は、従来公知の免疫測定法、特にＲ
ＩＡ、ＥＩＡ、ＣＬＥＩＡ、ＣＬＩＡなどヘテロジニア
ス免疫測定法に適応できる。特に好ましくはＥＩＡ、Ｃ
ＬＥＩＡなどのヘテロジニアス酵素免疫測定法である。
標識に用いられる酵素の種類、検出方法などは従来公知
の方法が適応できる。
ＩＡ、ＥＩＡ、ＣＬＥＩＡ、ＣＬＩＡなどヘテロジニア
ス免疫測定法に適応できる。特に好ましくはＥＩＡ、Ｃ
ＬＥＩＡなどのヘテロジニアス酵素免疫測定法である。
標識に用いられる酵素の種類、検出方法などは従来公知
の方法が適応できる。
【０００９】本発明に用いられる、測定対象物は、一般
的に免疫測定法で測定される、抗原、抗体、ハプテンな
どいずれも可能である。特に、癌関連抗原や下垂体ホル
モンなどの糖蛋白が好ましく、特に好ましくは、ＣＡ１
９−９、α−フェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡ、
甲状腺刺激ホルモンである。
的に免疫測定法で測定される、抗原、抗体、ハプテンな
どいずれも可能である。特に、癌関連抗原や下垂体ホル
モンなどの糖蛋白が好ましく、特に好ましくは、ＣＡ１
９−９、α−フェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡ、
甲状腺刺激ホルモンである。
【００１０】本発明の固相抗体および標識抗体に用いら
れる抗体は、固相ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体およびそれらの抗体活性を有する断片など従来公知
のものが使用できる。特にモノクローナル抗体を使用し
たとき、塩の濃度により測定値を制御しやすい。
れる抗体は、固相ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体およびそれらの抗体活性を有する断片など従来公知
のものが使用できる。特にモノクローナル抗体を使用し
たとき、塩の濃度により測定値を制御しやすい。
【００１１】本発明に用いられる塩は、免疫反応を著し
く阻害しないものであれば使用可能である。特に好まし
くは、塩化ナトリウムである。塩の濃度の変動範囲は、
使用する塩の種類および測定対象物により種々である
が、反応液中で０〜２モル／リットルの範囲で変動させ
ることが好ましい。測定対象物質がＣＡ１９−９、α−
フェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡの場合、塩化ナ
トリウムでは、０．４〜１．２モル／リットルの範囲で
変動させることが特に好ましい。測定対象物質が甲状腺
刺激ホルモンの場合、塩化ナトリウムでは、０〜０．１
モル／リットルの範囲で変動させることが特に好まし
い。
く阻害しないものであれば使用可能である。特に好まし
くは、塩化ナトリウムである。塩の濃度の変動範囲は、
使用する塩の種類および測定対象物により種々である
が、反応液中で０〜２モル／リットルの範囲で変動させ
ることが好ましい。測定対象物質がＣＡ１９−９、α−
フェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡの場合、塩化ナ
トリウムでは、０．４〜１．２モル／リットルの範囲で
変動させることが特に好ましい。測定対象物質が甲状腺
刺激ホルモンの場合、塩化ナトリウムでは、０〜０．１
モル／リットルの範囲で変動させることが特に好まし
い。
【００１２】本発明に用いられる塩は、免疫反応の行わ
れる反応液に添加される。反応液は従来公知のものが使
用できる。即ち、適当な緩衝液に、免疫反応に関与しな
いタンパク質、界面活性剤などを添加した溶液である。
れる反応液に添加される。反応液は従来公知のものが使
用できる。即ち、適当な緩衝液に、免疫反応に関与しな
いタンパク質、界面活性剤などを添加した溶液である。
【００１３】また、塩を添加する反応液は、検体と直接
混合されて反応するものの方が効果が高い。例えば、２
ステップサンドウィッチ測定法の場合、第１ステップに
用いる反応液に塩を添加した方が、第２ステップの反応
液に添加した場合より、塩濃度の変動により測定値を一
定に保ち易い。
混合されて反応するものの方が効果が高い。例えば、２
ステップサンドウィッチ測定法の場合、第１ステップに
用いる反応液に塩を添加した方が、第２ステップの反応
液に添加した場合より、塩濃度の変動により測定値を一
定に保ち易い。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。
が本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】実施例１ 本実施例は、製造ロットの異なる固相抗体で反応液中の
塩濃を変えることで、血清測定値を制御できることを示
したものである。
塩濃を変えることで、血清測定値を制御できることを示
したものである。
【００１６】１）抗体ビーズの製造 ＡＦＰを認識するモノクローナル抗体（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を、米国特許第６５２７６１号記載の方
法に従い、直径６．５ｍｍの真球状スリガラスビーズに
結合した。製造日時を変えロットＡ，Ｂ，Ｃの３ロット
を作成した。
ンハイム社製）を、米国特許第６５２７６１号記載の方
法に従い、直径６．５ｍｍの真球状スリガラスビーズに
結合した。製造日時を変えロットＡ，Ｂ，Ｃの３ロット
を作成した。
【００１７】２）ペルオキシダーゼ標識抗体の作成 ＡＦＰを認識するポリクローナル抗体（ダコ社製）を文
献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカ
ワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１
９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキ
シダーゼで標識し、１％牛血清アルブミン含有緩衝液で
希釈して使用した。
献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカ
ワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１
９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキ
シダーゼで標識し、１％牛血清アルブミン含有緩衝液で
希釈して使用した。
【００１８】３）反応緩衝液の作成 １％牛血清アルブミン含有緩衝液に、塩化ナトリウムを
０モル／リットル，０．４モル／リッル，１．２モル／
リットル，２モル／リットルの濃度で添加した。
０モル／リットル，０．４モル／リッル，１．２モル／
リットル，２モル／リットルの濃度で添加した。
【００１９】４）測定 測定試料５０μｌ、各塩濃度の反応緩衝液３００μｌを
入れた試験管に各ロットの抗体ビーズ１個を入れ３７
℃、１５分反応した後、生理食塩水でビーズを洗浄し
た。次にペルオキシダーゼ標識抗体を３００μｌの入っ
た試験管にビーズを移し、３７℃、１５分反応した後、
再度生理食塩水で洗浄した。ビーズを基質液（過酸化水
素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５００μｌ中
に移し、３７℃、１５分反応した後、１．５規定硫酸溶
液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の吸光度を測
定波長４９２ｎｍで測定した。
入れた試験管に各ロットの抗体ビーズ１個を入れ３７
℃、１５分反応した後、生理食塩水でビーズを洗浄し
た。次にペルオキシダーゼ標識抗体を３００μｌの入っ
た試験管にビーズを移し、３７℃、１５分反応した後、
再度生理食塩水で洗浄した。ビーズを基質液（過酸化水
素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）５００μｌ中
に移し、３７℃、１５分反応した後、１．５規定硫酸溶
液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の吸光度を測
定波長４９２ｎｍで測定した。
【００２０】測定試料として、市販ＥＩＡキット「グラ
ザイムＡＦＰ（和光純薬）」の標準ＡＦＰ溶液と、市販
ＥＩＡキット「グラザイムＡＦＰ（和光純薬）」での測
定値（基準値）が判明している血清検体を測定し、標準
ＡＦＰ溶液の測定吸光度で検量線を作成し、血清検体の
測定値を求めた。
ザイムＡＦＰ（和光純薬）」の標準ＡＦＰ溶液と、市販
ＥＩＡキット「グラザイムＡＦＰ（和光純薬）」での測
定値（基準値）が判明している血清検体を測定し、標準
ＡＦＰ溶液の測定吸光度で検量線を作成し、血清検体の
測定値を求めた。
【００２１】５）結果 各ロットの抗体ビーズと各塩濃度の反応緩衝液を組み合
わせて測定した場合の、標準ＡＦＰ溶液８０ｎｇ／ｍｌ
と血清検体（基準値７２．８ｎｇ／ｍｌ）の測定吸光度
を表１に示した。
わせて測定した場合の、標準ＡＦＰ溶液８０ｎｇ／ｍｌ
と血清検体（基準値７２．８ｎｇ／ｍｌ）の測定吸光度
を表１に示した。
【００２２】
【表１】
【００２３】塩濃度０モル／リットルの反応緩衝液を用
いた場合の吸光度を基準（１００％）として、各塩濃度
の吸光度を比較すると、抗体ビーズのロットにより、標
準ＡＦＰと血清検体の測定吸光度の変化に差があること
が判る。
いた場合の吸光度を基準（１００％）として、各塩濃度
の吸光度を比較すると、抗体ビーズのロットにより、標
準ＡＦＰと血清検体の測定吸光度の変化に差があること
が判る。
【００２４】表２に、表１の血清検体の測定結果を濃度
値に換算した値を示した。抗体ビーズの製造ロットが異
なっても、反応緩衝液の塩濃度を変えることにより、基
準値に近い値に制御できることが判る。
値に換算した値を示した。抗体ビーズの製造ロットが異
なっても、反応緩衝液の塩濃度を変えることにより、基
準値に近い値に制御できることが判る。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、一定品質、即ち検体の
測定値が一定の範囲に収まった試薬を提供することがで
きる。これは例えば、製造された各ロットの測定試薬に
ついて血清測定値を調査し、これが均一になるように反
応緩衝液の塩濃度を変動させれば良いのである。従っ
て、試薬製造の立場からは、より均一な性能の試薬を製
造するための方法となる。また、試薬を使用して免疫反
応を実施する立場の者にとっては、種々の製造ロットに
依存した測定値の変化を除去できるのであるから、より
正確な結果を得ることができる。
測定値が一定の範囲に収まった試薬を提供することがで
きる。これは例えば、製造された各ロットの測定試薬に
ついて血清測定値を調査し、これが均一になるように反
応緩衝液の塩濃度を変動させれば良いのである。従っ
て、試薬製造の立場からは、より均一な性能の試薬を製
造するための方法となる。また、試薬を使用して免疫反
応を実施する立場の者にとっては、種々の製造ロットに
依存した測定値の変化を除去できるのであるから、より
正確な結果を得ることができる。
Claims (7)
- 【請求項１】 検体中の測定対象物質を免疫測定する
際、反応液の塩の濃度を変動させて、由来の異なる固相
抗体の、標準物質および検体中の測定対象物質に対する
反応性の差を制御し、検体中の測定対象物質の測定値を
一定に保つことを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項２】 塩が塩化ナトリウムである請求項１記載
の免疫測定法。 - 【請求項３】 塩濃度が、０〜２モル／リットルの範囲
である請求項１または２記載の免疫測定法。 - 【請求項４】 酵素を標識物質として用いるヘテロジニ
アス酵素免疫測定法であることを特徴とした請求項１〜
３いずれか記載の免疫測定法。 - 【請求項５】 測定対象物質が、糖蛋白である請求項４
記載の免疫測定法。 - 【請求項６】 測定対象物質が、ＣＡ１９−９、α−フ
ェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡ、甲状腺刺激ホル
モンである請求項４記載の免疫測定法。 - 【請求項７】 少なくとも１種類以上のモノクローナル
抗体を用いる請求項４〜６いずれか記載の免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26077395A JPH0980053A (ja) | 1995-09-12 | 1995-09-12 | 改良された免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26077395A JPH0980053A (ja) | 1995-09-12 | 1995-09-12 | 改良された免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0980053A true JPH0980053A (ja) | 1997-03-28 |
Family
ID=17352532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26077395A Pending JPH0980053A (ja) | 1995-09-12 | 1995-09-12 | 改良された免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0980053A (ja) |
-
1995
- 1995-09-12 JP JP26077395A patent/JPH0980053A/ja active Pending
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