JPH0984478A - 試験管内偽受精による半数体植物及び半数体倍加植物の作出方法 - Google Patents
試験管内偽受精による半数体植物及び半数体倍加植物の作出方法Info
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- JPH0984478A JPH0984478A JP17822396A JP17822396A JPH0984478A JP H0984478 A JPH0984478 A JP H0984478A JP 17822396 A JP17822396 A JP 17822396A JP 17822396 A JP17822396 A JP 17822396A JP H0984478 A JPH0984478 A JP H0984478A
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 植物の卵細胞または精細胞のいずれか一
方の核を不活化させた後、両者をそれらが属する個体の
組織又は器官から単離した状態で融合させ、この融合細
胞を培養して植物体とする半数体植物の作出方法、及び
前記半数体植物を倍加処理して二倍体とする半数体倍加
植物の作出方法。 【効果】 より高い頻度で半数体植物もしくは半数体倍
加植物を作出することができる。
方の核を不活化させた後、両者をそれらが属する個体の
組織又は器官から単離した状態で融合させ、この融合細
胞を培養して植物体とする半数体植物の作出方法、及び
前記半数体植物を倍加処理して二倍体とする半数体倍加
植物の作出方法。 【効果】 より高い頻度で半数体植物もしくは半数体倍
加植物を作出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試験管内受精によ
り、半数体植物を作出する方法に関する。
り、半数体植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、多くの作物において一代雑種（Ｆ
１）品種が普及してきている。Ｆ１品種の種はそれぞれ
遺伝的に固定した父親系統と母親系統の交配により生産
されている。Ｆ１品種は、雑種強勢を示すことが知ら
れ、固定系統もしくは自殖系統の品種に比べ、強健かつ
高収量になる場合が多い。また、固定系統間で作出され
るため均一性が高いという利点を供えている。Ｆ１品種
育成のためにはその両親を遺伝的に固定する作業が必要
である。従来法では、自殖を５〜８回繰り返すことによ
り固定系統を作出していたが、その作業には長い年月を
必要としてきた。
１）品種が普及してきている。Ｆ１品種の種はそれぞれ
遺伝的に固定した父親系統と母親系統の交配により生産
されている。Ｆ１品種は、雑種強勢を示すことが知ら
れ、固定系統もしくは自殖系統の品種に比べ、強健かつ
高収量になる場合が多い。また、固定系統間で作出され
るため均一性が高いという利点を供えている。Ｆ１品種
育成のためにはその両親を遺伝的に固定する作業が必要
である。従来法では、自殖を５〜８回繰り返すことによ
り固定系統を作出していたが、その作業には長い年月を
必要としてきた。
【０００３】近年、組織培養技術の進展により、花粉や
胚珠を培養し、半数体植物を作出することが多くの種で
可能になってきている。半数体は薬剤処理等により染色
体を倍加することにより、直ちに遺伝的に固定した系統
を育成できるという大きな利点を持っている。しかしな
がら、半数体もしくは半数体倍加系統の作出技術は、タ
バコ、ハクサイ、ナス等の一部の作物においては実用化
されているものもあるが、発生率とその再現性等の理由
により、育種では利用が難しい状況にある種も多い。そ
のため、より効率的な半数体もしくは半数倍加系統の作
出が可能となる新しい技術開発が望まれている。
胚珠を培養し、半数体植物を作出することが多くの種で
可能になってきている。半数体は薬剤処理等により染色
体を倍加することにより、直ちに遺伝的に固定した系統
を育成できるという大きな利点を持っている。しかしな
がら、半数体もしくは半数体倍加系統の作出技術は、タ
バコ、ハクサイ、ナス等の一部の作物においては実用化
されているものもあるが、発生率とその再現性等の理由
により、育種では利用が難しい状況にある種も多い。そ
のため、より効率的な半数体もしくは半数倍加系統の作
出が可能となる新しい技術開発が望まれている。
【０００４】Ｘ線等の電離放射線を利用した半数体もし
くは半数体倍加植物の作出方法としては、放射線を花粉
に照射した後受粉し得られた種をは種し、植物体を得る
方法、電離放射線を照射した花粉を受粉させた後、子房
もしくは胚珠を培養し植物体を作出する偽受精胚珠培養
法などが知られている。しかしながら、これらの処理に
より半数体が効率的に作出される種は限られており、ま
た品種間によっても植物体の発生率に大きな違いが認め
られる場合も多い。
くは半数体倍加植物の作出方法としては、放射線を花粉
に照射した後受粉し得られた種をは種し、植物体を得る
方法、電離放射線を照射した花粉を受粉させた後、子房
もしくは胚珠を培養し植物体を作出する偽受精胚珠培養
法などが知られている。しかしながら、これらの処理に
より半数体が効率的に作出される種は限られており、ま
た品種間によっても植物体の発生率に大きな違いが認め
られる場合も多い。
【０００５】ところで、Kranz らは、1993年にトウモロ
コシの試験管内受精に成功している（Kranz, E and Loe
rz, H (1993) In vitro fertilization with isolated,
single gametes results in zygotic embryogenesis an
d fertile maize plants. The Plant Cell 5:739-74
6.）。この試験管内受精とは、花粉から単離した精細胞
と胚珠から単離した卵細胞を試験管内で細胞融合により
受精させ、得られた接合子を培養して植物体とする技術
である。この方法は、受精時点から試験管内で培養条件
を管理することができ、極めて有用な技術であるが、胚
珠からの卵細胞の単離、卵細胞と精細胞との融合など技
術的に困難のステップを数多く含むため、限られた種で
しか成功していない。特に、卵細胞の単離については、
既に幾つかの成功例はあるものの、その多くは酵素を用
いて胚珠を消化した後、卵細胞を摘出するものである。
アブラナ科植物のように卵細胞が単離される前に胚のう
もしくは卵装置が認識が困難な植物では、このような酵
素処理をした場合、卵細胞と他の細胞を区別するのが困
難となり、卵細胞を単離するのは事実上不可能である。
また、単離された卵細胞を生存させておくための条件
は、その植物ごとに異なるため、アブラナ科植物のごと
く未だ生きた状態で卵細胞が単離されたことのない植物
では、試験管内受精は一層困難なことであった。
コシの試験管内受精に成功している（Kranz, E and Loe
rz, H (1993) In vitro fertilization with isolated,
single gametes results in zygotic embryogenesis an
d fertile maize plants. The Plant Cell 5:739-74
6.）。この試験管内受精とは、花粉から単離した精細胞
と胚珠から単離した卵細胞を試験管内で細胞融合により
受精させ、得られた接合子を培養して植物体とする技術
である。この方法は、受精時点から試験管内で培養条件
を管理することができ、極めて有用な技術であるが、胚
珠からの卵細胞の単離、卵細胞と精細胞との融合など技
術的に困難のステップを数多く含むため、限られた種で
しか成功していない。特に、卵細胞の単離については、
既に幾つかの成功例はあるものの、その多くは酵素を用
いて胚珠を消化した後、卵細胞を摘出するものである。
アブラナ科植物のように卵細胞が単離される前に胚のう
もしくは卵装置が認識が困難な植物では、このような酵
素処理をした場合、卵細胞と他の細胞を区別するのが困
難となり、卵細胞を単離するのは事実上不可能である。
また、単離された卵細胞を生存させておくための条件
は、その植物ごとに異なるため、アブラナ科植物のごと
く未だ生きた状態で卵細胞が単離されたことのない植物
では、試験管内受精は一層困難なことであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述したよ
うな従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、
その目的とするところは、効率的な半数体もしくは半数
体倍加系統の作出技術を提供することにある。
うな従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、
その目的とするところは、効率的な半数体もしくは半数
体倍加系統の作出技術を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、卵細胞または精
細胞のいずれか一方の核を不活化させた後、試験管内受
精を行うことにより、効率的に半数体もしくは半数体倍
加系統を作出できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、植物の卵細胞または精細胞のいずれか
一方の核を不活化させた後、両者をそれらが属する個体
の組織又は器官から単離した状態で融合させ、この融合
細胞を培養して植物体とすることを特徴とする半数体植
物の作出方法である。また、本発明は、上記記載の方法
により得られた半数体植物を倍加処理して二倍体とする
ことを特徴とする半数体倍加植物の作出方法である。
を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、卵細胞または精
細胞のいずれか一方の核を不活化させた後、試験管内受
精を行うことにより、効率的に半数体もしくは半数体倍
加系統を作出できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、植物の卵細胞または精細胞のいずれか
一方の核を不活化させた後、両者をそれらが属する個体
の組織又は器官から単離した状態で融合させ、この融合
細胞を培養して植物体とすることを特徴とする半数体植
物の作出方法である。また、本発明は、上記記載の方法
により得られた半数体植物を倍加処理して二倍体とする
ことを特徴とする半数体倍加植物の作出方法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、植物であればどのような植物にも適用することがで
きる。本発明の半数体植物の作出方法は、例えば、以下
のようにして行うことができる。まず、卵細胞又は精細
胞のいずれか一方の核を不活化する。核の不活化は、紫
外線、Ｘ線、γ線等の電離放射線の照射により行うこと
ができる。Ｘ線の照射量は、植物の種類や、卵細胞、精
細胞のいずれを不活化するかにより異なるが、５０ｋＲ
〜２００ｋＲが好ましく、トウモロコシの精細胞の核を
不活化するのであれば、８０ｋＲ〜１２０ｋＲが好まし
い。
は、植物であればどのような植物にも適用することがで
きる。本発明の半数体植物の作出方法は、例えば、以下
のようにして行うことができる。まず、卵細胞又は精細
胞のいずれか一方の核を不活化する。核の不活化は、紫
外線、Ｘ線、γ線等の電離放射線の照射により行うこと
ができる。Ｘ線の照射量は、植物の種類や、卵細胞、精
細胞のいずれを不活化するかにより異なるが、５０ｋＲ
〜２００ｋＲが好ましく、トウモロコシの精細胞の核を
不活化するのであれば、８０ｋＲ〜１２０ｋＲが好まし
い。
【０００９】核を不活化した後、植物体から卵細胞及び
精細胞を単離する。卵細胞の単離は、トウモロコシのよ
うに胚のうを外観上認識できる植物とアブラナのように
胚のうを外観上認識できない植物とでは異なる手法を用
いる。胚のうを外観上認識できる場合は、植物体から摘
出した胚珠を細胞壁を溶解する酵素で処理した後、胚の
うを取り出し、それから卵細胞を単離する。卵細胞は、
胚のう中で助細胞を伴って存在しているので、それを指
標として他の細胞と区別することができる。胚のうを外
観上認識できない場合は、酵素処理をせず、胚珠を解剖
し、分離してくる多数の細胞の中から卵細胞を選抜して
単離する。胚珠をどのように解剖するかは、その植物の
胚珠の構造に応じて決めればよく、アブラナの場合は、
本実施例に示したような方法により解剖すればよい。胚
珠の解剖により多数の細胞が分離してくるが、その中か
ら卵細胞のみを単離するには、以下の３つの指標により
選抜することができる。１）一定の浸透圧の下で、球形
となるか否か（卵細胞は細胞壁が完全に形成されていな
いので一定の浸透圧下で球形となる）、２）細胞の直径
（アブラナであれば約１０μｍ）、３）大きな核小体を
含んでいるか否か（卵細胞中には核小体がある）。単離
した卵細胞を生存させておくためには、浸透圧を適正な
値に維持する必要がある。この条件は、用いる植物の種
類により異なり４００〜９００mosmol/kgH2Oの範囲であ
ればよい、例えば、トウモロコシであれば４５０〜７０
０mosmol/kgH2O、アブラナであれば、６５０〜８５０mo
smol/kgH2Oである。精細胞の単離は、花粉を低浸透圧溶
液中で破裂させ、放出されたる精細胞と栄養核のうち、
精細胞のみを選抜することにより行うことができるが、
この方法に限定されるものではなく、例えば、花粉を押
しつぶす方法等によっても行うことができる。精細胞の
選抜は、精細胞と栄養核とは大きさが違うので、それを
指標として行うことができる。なお、精細胞は、卵細胞
に比べると生存時間が短いので、卵細胞の単離が終了し
たのちに、精細胞の単離を行うのが好ましい。ここで
は、核の不活化後、卵細胞及び精細胞を単離する手順を
例として示したが、これらの細胞を単離後、核を不活性
化してもよい。
精細胞を単離する。卵細胞の単離は、トウモロコシのよ
うに胚のうを外観上認識できる植物とアブラナのように
胚のうを外観上認識できない植物とでは異なる手法を用
いる。胚のうを外観上認識できる場合は、植物体から摘
出した胚珠を細胞壁を溶解する酵素で処理した後、胚の
うを取り出し、それから卵細胞を単離する。卵細胞は、
胚のう中で助細胞を伴って存在しているので、それを指
標として他の細胞と区別することができる。胚のうを外
観上認識できない場合は、酵素処理をせず、胚珠を解剖
し、分離してくる多数の細胞の中から卵細胞を選抜して
単離する。胚珠をどのように解剖するかは、その植物の
胚珠の構造に応じて決めればよく、アブラナの場合は、
本実施例に示したような方法により解剖すればよい。胚
珠の解剖により多数の細胞が分離してくるが、その中か
ら卵細胞のみを単離するには、以下の３つの指標により
選抜することができる。１）一定の浸透圧の下で、球形
となるか否か（卵細胞は細胞壁が完全に形成されていな
いので一定の浸透圧下で球形となる）、２）細胞の直径
（アブラナであれば約１０μｍ）、３）大きな核小体を
含んでいるか否か（卵細胞中には核小体がある）。単離
した卵細胞を生存させておくためには、浸透圧を適正な
値に維持する必要がある。この条件は、用いる植物の種
類により異なり４００〜９００mosmol/kgH2Oの範囲であ
ればよい、例えば、トウモロコシであれば４５０〜７０
０mosmol/kgH2O、アブラナであれば、６５０〜８５０mo
smol/kgH2Oである。精細胞の単離は、花粉を低浸透圧溶
液中で破裂させ、放出されたる精細胞と栄養核のうち、
精細胞のみを選抜することにより行うことができるが、
この方法に限定されるものではなく、例えば、花粉を押
しつぶす方法等によっても行うことができる。精細胞の
選抜は、精細胞と栄養核とは大きさが違うので、それを
指標として行うことができる。なお、精細胞は、卵細胞
に比べると生存時間が短いので、卵細胞の単離が終了し
たのちに、精細胞の単離を行うのが好ましい。ここで
は、核の不活化後、卵細胞及び精細胞を単離する手順を
例として示したが、これらの細胞を単離後、核を不活性
化してもよい。
【００１０】以上のようにして、単離された卵細胞と精
細胞とを、それらが属する個体の組織又は器官から単離
した状態で融合させる。卵細胞と精細胞の融合は、組織
又は器官から単離した状態、即ち、生体外であれば特に
限定されないが、本実施例にあるようにオイル中の液滴
内で行うことが好ましい。このような液滴中では、水が
蒸発しないので長期間浸透圧が一定に維持されるからで
ある。細胞融合は、ポリエチレングリコールを用いる方
法、高濃度のカルシウムを用いる方法等により行うこと
ができるが、本実施例にあるように電気パルスを利用し
た方法により行うのが好ましい。電気パルスにより細胞
融合を行う場合、その電圧、パルスの回数等の諸条件
は、植物の種類、液滴中の塩濃度等に応じて決めればよ
い。
細胞とを、それらが属する個体の組織又は器官から単離
した状態で融合させる。卵細胞と精細胞の融合は、組織
又は器官から単離した状態、即ち、生体外であれば特に
限定されないが、本実施例にあるようにオイル中の液滴
内で行うことが好ましい。このような液滴中では、水が
蒸発しないので長期間浸透圧が一定に維持されるからで
ある。細胞融合は、ポリエチレングリコールを用いる方
法、高濃度のカルシウムを用いる方法等により行うこと
ができるが、本実施例にあるように電気パルスを利用し
た方法により行うのが好ましい。電気パルスにより細胞
融合を行う場合、その電圧、パルスの回数等の諸条件
は、植物の種類、液滴中の塩濃度等に応じて決めればよ
い。
【００１１】細胞融合を行った後、融合細胞を液体培地
中で振盪培養する。ここで用いる培地は、植物の組織培
養に常用されるものであれば特に制限はなく、例えば、
ＭＳ培地、ＢＳ培地、Ｎ６培地等を用いることができ
る。培地中の浸透圧は、グルコースや浸透圧調節剤等を
加えて、６００mosmol/kgH2O程度とすることが好まし
い。培地に添加する植物ホルモンとしては、オーキシン
類が用いられ、具体的には２，４−Ｄ、ナフタレン酢酸
などが好ましく、その濃度は、２，４−Ｄであれば２ｍ
ｇ／ｌ程度が好ましい。また、培養に際しては、培地中
にフィーダー細胞を加えておくのが好ましい。以上のよ
うな条件で培養を行うと、植物の種類にもよるが、およ
そ７日程度でカルスが形成されてくる。
中で振盪培養する。ここで用いる培地は、植物の組織培
養に常用されるものであれば特に制限はなく、例えば、
ＭＳ培地、ＢＳ培地、Ｎ６培地等を用いることができ
る。培地中の浸透圧は、グルコースや浸透圧調節剤等を
加えて、６００mosmol/kgH2O程度とすることが好まし
い。培地に添加する植物ホルモンとしては、オーキシン
類が用いられ、具体的には２，４−Ｄ、ナフタレン酢酸
などが好ましく、その濃度は、２，４−Ｄであれば２ｍ
ｇ／ｌ程度が好ましい。また、培養に際しては、培地中
にフィーダー細胞を加えておくのが好ましい。以上のよ
うな条件で培養を行うと、植物の種類にもよるが、およ
そ７日程度でカルスが形成されてくる。
【００１２】培養開始後、８〜１２日程度でカルスは３
８０〜７００μｍの球状体に成長し、一部では胚形成が
開始されてくる。１０〜１２日後、胚形成過程にある培
養体を植物ホルモンである２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ベンジ
ルアデニン（ＢＡ）等を組み合わせ添加したＭＳ培地も
しくはホルモンが無添加であるＭＳ培地に移植しさらに
培養を継続する。培養開始後１から３ケ月程度で植物体
が発生する。なお、上記のように融合後の細胞は、通
常、カルスを経て、植物体へと分化していくが、植物の
種類によっては、カルスを経ずに直接植物体となるもの
もある。本発明は、そのようなカルスを経由しない場合
も、その技術的範囲に含むものである。また、得られた
半数体植物を常法により、コルヒチン等により、倍加処
理することで、半数体倍加植物とすることもできる。
８０〜７００μｍの球状体に成長し、一部では胚形成が
開始されてくる。１０〜１２日後、胚形成過程にある培
養体を植物ホルモンである２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ベンジ
ルアデニン（ＢＡ）等を組み合わせ添加したＭＳ培地も
しくはホルモンが無添加であるＭＳ培地に移植しさらに
培養を継続する。培養開始後１から３ケ月程度で植物体
が発生する。なお、上記のように融合後の細胞は、通
常、カルスを経て、植物体へと分化していくが、植物の
種類によっては、カルスを経ずに直接植物体となるもの
もある。本発明は、そのようなカルスを経由しない場合
も、その技術的範囲に含むものである。また、得られた
半数体植物を常法により、コルヒチン等により、倍加処
理することで、半数体倍加植物とすることもできる。
【００１３】
〔実施例１〕 試験管内偽受精技術によるトウモロコシ
のカルス誘導 １）材料植物 温室で栽培した”Ａ１８８”を用いた。天候が不順な時
期は補光を行い育成した。 ２）卵細胞の単離方法 植物体から受粉適期の状態にある雌穂を採取した。雌穂
の発育ステージは絹糸の長さから判断することができ、
１５〜２０ｃｍ程度のものを用いた。採取した雌穂は７
０％のエタノールを噴霧することにより滅菌した。それ
以外の滅菌操作は不要であった。アルコール噴霧後クリ
ーンベンチ内でゴム手袋をし、苞穎等を除去し、雌穂を
扱い易いように、ナイフで３〜４分割した。その際基部
と先端部は除去した。雌穂から胚のうを含んだ子房断片
組織を摘出し、速やかに５４０ mosmol/kgH2O のマンニ
トール水溶液に浮かべた。
のカルス誘導 １）材料植物 温室で栽培した”Ａ１８８”を用いた。天候が不順な時
期は補光を行い育成した。 ２）卵細胞の単離方法 植物体から受粉適期の状態にある雌穂を採取した。雌穂
の発育ステージは絹糸の長さから判断することができ、
１５〜２０ｃｍ程度のものを用いた。採取した雌穂は７
０％のエタノールを噴霧することにより滅菌した。それ
以外の滅菌操作は不要であった。アルコール噴霧後クリ
ーンベンチ内でゴム手袋をし、苞穎等を除去し、雌穂を
扱い易いように、ナイフで３〜４分割した。その際基部
と先端部は除去した。雌穂から胚のうを含んだ子房断片
組織を摘出し、速やかに５４０ mosmol/kgH2O のマンニ
トール水溶液に浮かべた。
【００１４】この方法により２０〜３０の子房断片組織
をマンニトール水溶液に移した後、ピンセットを用いて
それぞれの子房断片組織から子房壁をはがし、１ｃｃの
５４０ mosmol/kgH2O マンニトール水溶液が入った直径
３．５ｃｍのシャーレに胚珠断片組織を移した。このシ
ャーレにマンニトールで浸透圧が５７０mosmol/kghH
2O，PH４．９〜５．０に調整された表１の組成の酵素液
を０．５ｃｃ加え、１０〜２０分室温で放置し、その後
倒立顕微鏡下で、ガラス針を用いて卵細胞の単離を行っ
た。
をマンニトール水溶液に移した後、ピンセットを用いて
それぞれの子房断片組織から子房壁をはがし、１ｃｃの
５４０ mosmol/kgH2O マンニトール水溶液が入った直径
３．５ｃｍのシャーレに胚珠断片組織を移した。このシ
ャーレにマンニトールで浸透圧が５７０mosmol/kghH
2O，PH４．９〜５．０に調整された表１の組成の酵素液
を０．５ｃｃ加え、１０〜２０分室温で放置し、その後
倒立顕微鏡下で、ガラス針を用いて卵細胞の単離を行っ
た。
【００１５】
【００１６】シャーレ数が多く単離にすぐにとりかかれ
ないときは、冷蔵庫にいれ単離開始まで保管した。顕微
鏡を用いることにより胚珠断片組織内の胚のうの位置が
確認できるので、一方のガラス針で組織を固定し他方の
針で胚のうを掻き出す作業を行った。卵細胞は胚のうの
中で２個の助細胞を伴い存在しているので、それを指標
として他の細胞と判別することができた。大きさはおお
よそ６０〜７０μｍであった。単離された卵細胞はコン
ピューターで制御されたマイクロポンプ(dispenser/dil
uter; Microlab-M, Hamilton )を用い、細胞融合を行う
カバースリップ上のマンニトールの液滴内に移動した。
ないときは、冷蔵庫にいれ単離開始まで保管した。顕微
鏡を用いることにより胚珠断片組織内の胚のうの位置が
確認できるので、一方のガラス針で組織を固定し他方の
針で胚のうを掻き出す作業を行った。卵細胞は胚のうの
中で２個の助細胞を伴い存在しているので、それを指標
として他の細胞と判別することができた。大きさはおお
よそ６０〜７０μｍであった。単離された卵細胞はコン
ピューターで制御されたマイクロポンプ(dispenser/dil
uter; Microlab-M, Hamilton )を用い、細胞融合を行う
カバースリップ上のマンニトールの液滴内に移動した。
【００１７】３）Ｘ線による精細胞核の不活化 開葯前の葯を植物体から採取しＸ線を１００ｋＲまたは
２００ｋＲ照射した。照射後葯を乾燥させ葯から花粉を
取り出した。照射花粉を温室の植物に受粉させ、種子が
全く得られないこと、すなわち精細胞の核が不活化され
ていることを確認した。 ４）精細胞の単離方法 材料とする花粉を葯からシャーレに集めた。この際、滅
菌処理はしなかった。単離された精細胞の生存時間はさ
ほど長くないので、卵細胞の単離作業がすべて終了し融
合を開始する直前に精細胞の単離を開始した。シャーレ
に５４０〜６６０ mosmol/kgH2O のマンニトール水溶液
を加えると、浸透圧ショックにより破裂した花粉粒から
精細胞がでてきた。花粉粒からは栄養核（大型）も放出
されるが精細胞（小型）とは大きさで容易に区別するこ
とができた。でてきた精細胞をマイクロポンプにより細
胞融合を行う液滴に移送した。
２００ｋＲ照射した。照射後葯を乾燥させ葯から花粉を
取り出した。照射花粉を温室の植物に受粉させ、種子が
全く得られないこと、すなわち精細胞の核が不活化され
ていることを確認した。 ４）精細胞の単離方法 材料とする花粉を葯からシャーレに集めた。この際、滅
菌処理はしなかった。単離された精細胞の生存時間はさ
ほど長くないので、卵細胞の単離作業がすべて終了し融
合を開始する直前に精細胞の単離を開始した。シャーレ
に５４０〜６６０ mosmol/kgH2O のマンニトール水溶液
を加えると、浸透圧ショックにより破裂した花粉粒から
精細胞がでてきた。花粉粒からは栄養核（大型）も放出
されるが精細胞（小型）とは大きさで容易に区別するこ
とができた。でてきた精細胞をマイクロポンプにより細
胞融合を行う液滴に移送した。
【００１８】５）細胞融合 細胞融合を行うために卵細胞及び精細胞を入れる液滴は
次のように準備した。厚めのカバースリップの周囲３ｍ
ｍ程度を Repel-Silane(Pharmacia, Dimethyldichloros
ilane solution 20g/l in 1.1.1.-trichloroethane) で
浸漬処理し、１０分間乾燥した。なおこの作業はドラフ
トチャンバー内で行った。この処理の目的はカバースリ
ップの上にのせるオイルの流出を防ぐためのものであ
る。その後ＵＶライトでカバースリップを保管する容器
ごと１５分間殺菌した。次にカバースリップの上に約
０．３ｍｌの Paraffin Oil をのせマイクロポンプを用
い Paraffin Oil 内に５４０〜６６０ mosmol/kgH2O マ
ンニトールの２μｌの液滴をつくった。この液滴内に
１）及び３）の処理により得た卵細胞、精細胞を移送し
た。
次のように準備した。厚めのカバースリップの周囲３ｍ
ｍ程度を Repel-Silane(Pharmacia, Dimethyldichloros
ilane solution 20g/l in 1.1.1.-trichloroethane) で
浸漬処理し、１０分間乾燥した。なおこの作業はドラフ
トチャンバー内で行った。この処理の目的はカバースリ
ップの上にのせるオイルの流出を防ぐためのものであ
る。その後ＵＶライトでカバースリップを保管する容器
ごと１５分間殺菌した。次にカバースリップの上に約
０．３ｍｌの Paraffin Oil をのせマイクロポンプを用
い Paraffin Oil 内に５４０〜６６０ mosmol/kgH2O マ
ンニトールの２μｌの液滴をつくった。この液滴内に
１）及び３）の処理により得た卵細胞、精細胞を移送し
た。
【００１９】電気融合を行うための電極には白金を用
い、顕微鏡のコンデンサーの下に取り付けた。電極間の
間隔は顕微鏡のステージを上下することにより調整し
た。融合は１ＭＨｚ（交流），７１Ｖ／ｃｍの加電によ
る位置調整後５０μsec ０．９〜１．０ｋＶ／ｃｍのＤ
Ｃパルスを１〜３回与えることにより行った。融合効率
はおおよそ８０％であった。
い、顕微鏡のコンデンサーの下に取り付けた。電極間の
間隔は顕微鏡のステージを上下することにより調整し
た。融合は１ＭＨｚ（交流），７１Ｖ／ｃｍの加電によ
る位置調整後５０μsec ０．９〜１．０ｋＶ／ｃｍのＤ
Ｃパルスを１〜３回与えることにより行った。融合効率
はおおよそ８０％であった。
【００２０】６）培養作業 融合した細胞は、直径３．５ｃｍのプラスチックシャー
レ中に置かれた直径１２ｍｍのミリセル上の半透膜の上
で振盪培養した。培地は ２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌ加
え、グルコースにより浸透圧を６００ mosmol/kgH2O に
調整したＭＳ培地を用いた。上述の直径３．５ｃｍのシ
ャーレには、１．５ｍｌの培地とトウモロコシの未熟胚
に由来するフィーダーカルスを加えた。フィーダーカル
スには直径が３〜５ｍｍ程度のものが適していて、各シ
ャーレに３〜４個加えた。Ｘ線を照射した精細胞と卵細
胞との電気融合により得られた接合子の数は、１回目の
実験では７個、２回目の実験では２２個であり、そのう
ちそれぞれ６個、１個の接合子で分裂もしくはマイクロ
カルスの形成が確認できた。
レ中に置かれた直径１２ｍｍのミリセル上の半透膜の上
で振盪培養した。培地は ２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌ加
え、グルコースにより浸透圧を６００ mosmol/kgH2O に
調整したＭＳ培地を用いた。上述の直径３．５ｃｍのシ
ャーレには、１．５ｍｌの培地とトウモロコシの未熟胚
に由来するフィーダーカルスを加えた。フィーダーカル
スには直径が３〜５ｍｍ程度のものが適していて、各シ
ャーレに３〜４個加えた。Ｘ線を照射した精細胞と卵細
胞との電気融合により得られた接合子の数は、１回目の
実験では７個、２回目の実験では２２個であり、そのう
ちそれぞれ６個、１個の接合子で分裂もしくはマイクロ
カルスの形成が確認できた。
【００２１】〔実施例２〕 アブラナの卵細胞の単離 １）材料植物 温室で栽培したアブラナ、品種Ｔｏｐａｓを用いた。 ２）材料の採取及び滅菌処理について 開花直前から開花直後の発達段階にある蕾もしくは花を
採取した。採取した材料から花弁、がく等を除去し子房
を露出させた。それらの子房を７０％エタノールに２０
秒程度沈め、滅菌を行った。滅菌後２回滅菌水により洗
浄した。滅菌処理後、卵摘出作業に移るまで子房は滅菌
水内で保存した。
採取した。採取した材料から花弁、がく等を除去し子房
を露出させた。それらの子房を７０％エタノールに２０
秒程度沈め、滅菌を行った。滅菌後２回滅菌水により洗
浄した。滅菌処理後、卵摘出作業に移るまで子房は滅菌
水内で保存した。
【００２２】３）卵細胞の単離について 子房を７５０〜８５０ mosmol/kgH2O マンニトール水溶
液が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレにいれその
中でピンセットとナイフにより胚珠を摘出した。マンニ
トール水溶液の浸透圧は、限られたものでなく８５０ m
osmol/kgH2O 以上でも卵細胞は維持されることを確認し
ている。その後ガラス針を用いて単離作業を行った。片
方のガラス針で胚珠を固定したが、その際図１のＡの部
分には卵細胞が位置しているのでできるだけ損傷を与え
ないようにした。もう一方のガラス針を用いて胚珠の解
剖を行った。顕微鏡下で珠心にあたるＢの組織が確認で
きるのでその部分を指標としてラインＸを切る。この操
作により珠心がでてくる場合があり、時として珠心に卵
細胞及び中心細胞等の半数性細胞も付随してでてきた。
次に点ＣをおさえラインＹを浅く切った。この時卵細胞
を傷つけないよう注意を要した。この操作により胚のう
から球形の細胞がでてくる場合が多かった。これらの操
作によりでてこない場合はＡの部分をガラス針でえぐり
出すことにより卵細胞を摘出した。
液が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレにいれその
中でピンセットとナイフにより胚珠を摘出した。マンニ
トール水溶液の浸透圧は、限られたものでなく８５０ m
osmol/kgH2O 以上でも卵細胞は維持されることを確認し
ている。その後ガラス針を用いて単離作業を行った。片
方のガラス針で胚珠を固定したが、その際図１のＡの部
分には卵細胞が位置しているのでできるだけ損傷を与え
ないようにした。もう一方のガラス針を用いて胚珠の解
剖を行った。顕微鏡下で珠心にあたるＢの組織が確認で
きるのでその部分を指標としてラインＸを切る。この操
作により珠心がでてくる場合があり、時として珠心に卵
細胞及び中心細胞等の半数性細胞も付随してでてきた。
次に点ＣをおさえラインＹを浅く切った。この時卵細胞
を傷つけないよう注意を要した。この操作により胚のう
から球形の細胞がでてくる場合が多かった。これらの操
作によりでてこない場合はＡの部分をガラス針でえぐり
出すことにより卵細胞を摘出した。
【００２３】以上の操作によりでてきた球形の細胞のう
ち何れかが卵細胞である可能性が非常に高いと推定され
た。摘出されうる球形の細胞として考えられるものとし
て、卵細胞、中央細胞、助細胞、反足細胞そして体細胞
があげられるが本方法では酵素を使っていないので体細
胞が単離されてくる可能性は低く、それらから卵細胞を
判別するのはさほど困難ではない。卵細胞を他の細胞か
ら区別する指標としては以下のようなものを用いた。
ち何れかが卵細胞である可能性が非常に高いと推定され
た。摘出されうる球形の細胞として考えられるものとし
て、卵細胞、中央細胞、助細胞、反足細胞そして体細胞
があげられるが本方法では酵素を使っていないので体細
胞が単離されてくる可能性は低く、それらから卵細胞を
判別するのはさほど困難ではない。卵細胞を他の細胞か
ら区別する指標としては以下のようなものを用いた。
【００２４】（１）卵細胞は完全に細胞壁が形成されて
いないので、マンニトール水溶液中で容易に球形とな
る。 （２）直径がおおよそ１０μｍである。 （３）核の中に大きな核小体を含んでいる。 これらの特徴により識別された卵細胞をマイクロポンプ
により移送し目的とする処理を行った。
いないので、マンニトール水溶液中で容易に球形とな
る。 （２）直径がおおよそ１０μｍである。 （３）核の中に大きな核小体を含んでいる。 これらの特徴により識別された卵細胞をマイクロポンプ
により移送し目的とする処理を行った。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、受精時点から試験管内で
培養条件を管理することが可能となるので、従来法に比
べ、より高い頻度で半数体植物もしくは半数体倍加植物
を作出することができる。
培養条件を管理することが可能となるので、従来法に比
べ、より高い頻度で半数体植物もしくは半数体倍加植物
を作出することができる。
【図１】アブラナ卵細胞単離のための解剖方法を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エルハルト クランツ ドイツ連邦共和国 ディー−22609 ハン ブルグ，オーンホルストシュトラーセ 18 番地 ハンブルグ ウニヴァージテート
Claims (4)
- 【請求項１】 植物の卵細胞または精細胞のいずれか一
方の核を不活化させた後、両者をそれらが属する個体の
組織又は器官から単離した状態で融合させ、この融合細
胞を培養して植物体とすることを特徴とする半数体植物
の作出方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法により得られた半数
体植物を倍加処理して二倍体とすることを特徴とする半
数体倍加植物の作出方法。 - 【請求項３】 植物が、イネ科植物であることを特徴と
する請求項１又は２記載の作出方法。 - 【請求項４】 イネ科植物が、トウモロコシ属植物であ
ることを特徴とする請求項３記載の作出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19535313.7 | 1995-09-22 | ||
| DE1995135313 DE19535313A1 (de) | 1995-09-22 | 1995-09-22 | Verfahren zur Herstellung einer haploiden Pflanze durch in vitro Schein-Fertilisation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0984478A true JPH0984478A (ja) | 1997-03-31 |
Family
ID=7772920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17822396A Pending JPH0984478A (ja) | 1995-09-22 | 1996-07-08 | 試験管内偽受精による半数体植物及び半数体倍加植物の作出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0984478A (ja) |
| DE (1) | DE19535313A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012532617A (ja) * | 2009-07-14 | 2012-12-20 | ライク・ズワーン・ザードテールト・アン・ザードハンデル・ベスローテン・フェンノートシャップ | 倍加半数体植物を作出する方法 |
| US8859846B2 (en) | 2005-09-21 | 2014-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Doubling of chromosomes in haploid embryos |
-
1995
- 1995-09-22 DE DE1995135313 patent/DE19535313A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-07-08 JP JP17822396A patent/JPH0984478A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8859846B2 (en) | 2005-09-21 | 2014-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Doubling of chromosomes in haploid embryos |
| JP2012532617A (ja) * | 2009-07-14 | 2012-12-20 | ライク・ズワーン・ザードテールト・アン・ザードハンデル・ベスローテン・フェンノートシャップ | 倍加半数体植物を作出する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19535313A1 (de) | 1997-03-27 |
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