JPH0987199A - 腎糸球体疾患治療剤 - Google Patents
腎糸球体疾患治療剤Info
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- JPH0987199A JPH0987199A JP7271942A JP27194295A JPH0987199A JP H0987199 A JPH0987199 A JP H0987199A JP 7271942 A JP7271942 A JP 7271942A JP 27194295 A JP27194295 A JP 27194295A JP H0987199 A JPH0987199 A JP H0987199A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 腎糸球体疾患の治療・予防の有用な薬剤の提
供 【解決手段】 本発明は、ＨＧＦを有効成分する腎糸球
体疾患治療剤に関する。
供 【解決手段】 本発明は、ＨＧＦを有効成分する腎糸球
体疾患治療剤に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は腎糸球体疾患の治療
及び予防に有用な薬剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ
（Hepatocyte Growth Factor）を有効成分として含有す
る腎糸球体疾患治療剤に関する。
及び予防に有用な薬剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ
（Hepatocyte Growth Factor）を有効成分として含有す
る腎糸球体疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】腎臓は多数のネフロンとよばれる機能単
位と原尿を集める集合管から形成された臓器である。ネ
フロンの盲端部は丸く膨らんだ嚢状の構造、ボーマン嚢
とこれに毛細血管が入り込んだ糸球体が存在し、腎小体
を形成している。扁平な上皮細胞と基底膜からなるボー
マン嚢に包まれた糸球体には、輸入細動脈および輸出細
動脈とよばれる小血管が出入りし、糸球体で濾過された
原尿が近位尿細管へと流れる。糸球体は、大別すると、
糸球体表面を覆う糸球体上皮細胞、糸球体毛細血管の基
底膜、内皮細胞、メサンギウム細胞とメサンギウム基質
から構成される。腎疾患は尿細管に病変を起こしたもの
と糸球体に病変を起こしたものに大別される。糸球体に
病変を起こした糸球体腎炎は、臨床的に急性糸球体腎
炎、急速進行性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎に分類でき
る。慢性疾患である糸球体疾患・糸球体腎炎としては、
IgA腎症、全身性エリテマトーデスに伴うループス腎
炎、グッドパスチャー症候群、ハイマン腎炎、悪性腫
瘍、糖尿病性腎症などが知られている。これらの疾患の
発生機序に関しては不明の点が多いが、免疫機序が関与
していることが解明されつつあり、流血中の抗原と抗体
の免疫複合体、腎組織内での抗原・抗体反応などによ
り、腎炎が惹起されると考えられている。 近年、剖
検、腎生検による検査により、臨床病理学的には慢性糸
球体腎炎の進行に伴い、メサンギウム細胞の増殖並びに
メサンギウム基質の増加により糸球体硬化の進展が起こ
ることが知られている。糸球体硬化の病変において、メ
サンギウム細胞等から産生されるTGF-β、PDGFなどが悪
性因子、メディエーターとして関与することが推定され
ている（例えば、腎と透析３７、１９９４年増刊号、
「専門医のための糸球体障害のすべて」Ｐ１６７−１７
２をなど参照）。PDGFはメサンギウム細胞の増殖を促進
し、TGF-βがメサンギウム細胞からの細胞外マトリック
スの合成、分泌を促進し、細胞外マトリックス分解酵素
の活性を抑制することが想定されている。これらの悪性
因子に対する抗体や、悪性因子と結合する高分子を用い
て、糸球体腎炎の動物モデルに対する作用の検討が行わ
れているが、治療薬としての開発には至っていない。
一方、糖尿病性腎症の発症機序に関しても不明の点が多
いが、高血糖の直接の効果とは別に、糖化最終産物のメ
サンギウム細胞に対するメサンギウム基質の産生増加作
用などが報告されている。実際、糖尿病患者に対する腎
生検や糖尿病モデル動物の解析から、糖尿病性腎症の病
変の特徴として糸球体基底膜の肥厚やメサンギウム領域
の拡大などが知られている。
位と原尿を集める集合管から形成された臓器である。ネ
フロンの盲端部は丸く膨らんだ嚢状の構造、ボーマン嚢
とこれに毛細血管が入り込んだ糸球体が存在し、腎小体
を形成している。扁平な上皮細胞と基底膜からなるボー
マン嚢に包まれた糸球体には、輸入細動脈および輸出細
動脈とよばれる小血管が出入りし、糸球体で濾過された
原尿が近位尿細管へと流れる。糸球体は、大別すると、
糸球体表面を覆う糸球体上皮細胞、糸球体毛細血管の基
底膜、内皮細胞、メサンギウム細胞とメサンギウム基質
から構成される。腎疾患は尿細管に病変を起こしたもの
と糸球体に病変を起こしたものに大別される。糸球体に
病変を起こした糸球体腎炎は、臨床的に急性糸球体腎
炎、急速進行性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎に分類でき
る。慢性疾患である糸球体疾患・糸球体腎炎としては、
IgA腎症、全身性エリテマトーデスに伴うループス腎
炎、グッドパスチャー症候群、ハイマン腎炎、悪性腫
瘍、糖尿病性腎症などが知られている。これらの疾患の
発生機序に関しては不明の点が多いが、免疫機序が関与
していることが解明されつつあり、流血中の抗原と抗体
の免疫複合体、腎組織内での抗原・抗体反応などによ
り、腎炎が惹起されると考えられている。 近年、剖
検、腎生検による検査により、臨床病理学的には慢性糸
球体腎炎の進行に伴い、メサンギウム細胞の増殖並びに
メサンギウム基質の増加により糸球体硬化の進展が起こ
ることが知られている。糸球体硬化の病変において、メ
サンギウム細胞等から産生されるTGF-β、PDGFなどが悪
性因子、メディエーターとして関与することが推定され
ている（例えば、腎と透析３７、１９９４年増刊号、
「専門医のための糸球体障害のすべて」Ｐ１６７−１７
２をなど参照）。PDGFはメサンギウム細胞の増殖を促進
し、TGF-βがメサンギウム細胞からの細胞外マトリック
スの合成、分泌を促進し、細胞外マトリックス分解酵素
の活性を抑制することが想定されている。これらの悪性
因子に対する抗体や、悪性因子と結合する高分子を用い
て、糸球体腎炎の動物モデルに対する作用の検討が行わ
れているが、治療薬としての開発には至っていない。
一方、糖尿病性腎症の発症機序に関しても不明の点が多
いが、高血糖の直接の効果とは別に、糖化最終産物のメ
サンギウム細胞に対するメサンギウム基質の産生増加作
用などが報告されている。実際、糖尿病患者に対する腎
生検や糖尿病モデル動物の解析から、糖尿病性腎症の病
変の特徴として糸球体基底膜の肥厚やメサンギウム領域
の拡大などが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】糸球体腎症を治療する
為に、生活規制や食事制限に加えて、副腎皮質ステロイ
ド、血圧降下剤、免疫抑制剤、抗凝固剤などの種々の治
療法が試みられているが、糸球体硬化の進行そのものを
抑制したり、回復させるような根本的な治療には至って
いない。そして、腎糸球体疾患の進行を防ぐことができ
ないまま、透析に至る場合が多い。糖尿病患者に関して
も、一度糖尿病性腎症が発症してしまえば、その治療の
現状は慢性糸球体腎炎と同様である。特に近年、食生活
の向上や社会的ストレスの増加などにより糖尿病患者の
増加が著しく、糖尿病を治療できずに糖尿病性合併症を
併発し、糖尿病性腎症により透析に至る患者は年間約１
万人と推定されている。従って、腎糸球体疾患に対する
新たな予防・治療薬の開発が切望されている。 一方、
近年、糸球体腎症における糸球体内皮細胞の重要性が注
目されており、糸球体内皮細胞の障害はメサンギウム細
胞との相互作用等を通して糸球体障害の進展と関わって
いることが指摘されている（例えば、腎と透析３７、１
９９４年増刊号、「専門医のための糸球体障害のすべ
て」Ｐ６７−７４を参照）。また、ネフローゼ症候群
は、高度な蛋白尿及び低蛋白血症、浮腫、高脂血症等を
伴う症候群であるが、その原因は糸球体基底膜による濾
過機能の異常に求められている。 本発明者等は、前述
の発症機序に基づき、糸球体内皮細胞を迅速に修復で
き、メサンギウム細胞の増殖を抑制し、メサンギウム細
胞と糸球体内皮細胞との相互作用を正常化して、メサン
ギウム細胞の増殖を主体とする病変を予防・治療するこ
とが可能であることを想定したが、現在までそのような
作用を持つ因子はほとんど報告されていない。 本発明
者等は、かかる観点から、メサンギウム細胞の増殖を促
進することなく、内皮細胞のみを増殖させる因子につい
て鋭意研究した結果、ＨＧＦがかかる作用を有すること
を見出し、ＨＧＦが内皮細胞の修復・増殖を促進させ、
サンギウム細胞と糸球体内皮細胞との相互作用を正常化
させることによって、メサンギウム細胞の増殖、メサン
ギウム基質の増加による糸球体硬化を病変とする腎糸球
体疾患の予防・治療に有用であることが判明した。
為に、生活規制や食事制限に加えて、副腎皮質ステロイ
ド、血圧降下剤、免疫抑制剤、抗凝固剤などの種々の治
療法が試みられているが、糸球体硬化の進行そのものを
抑制したり、回復させるような根本的な治療には至って
いない。そして、腎糸球体疾患の進行を防ぐことができ
ないまま、透析に至る場合が多い。糖尿病患者に関して
も、一度糖尿病性腎症が発症してしまえば、その治療の
現状は慢性糸球体腎炎と同様である。特に近年、食生活
の向上や社会的ストレスの増加などにより糖尿病患者の
増加が著しく、糖尿病を治療できずに糖尿病性合併症を
併発し、糖尿病性腎症により透析に至る患者は年間約１
万人と推定されている。従って、腎糸球体疾患に対する
新たな予防・治療薬の開発が切望されている。 一方、
近年、糸球体腎症における糸球体内皮細胞の重要性が注
目されており、糸球体内皮細胞の障害はメサンギウム細
胞との相互作用等を通して糸球体障害の進展と関わって
いることが指摘されている（例えば、腎と透析３７、１
９９４年増刊号、「専門医のための糸球体障害のすべ
て」Ｐ６７−７４を参照）。また、ネフローゼ症候群
は、高度な蛋白尿及び低蛋白血症、浮腫、高脂血症等を
伴う症候群であるが、その原因は糸球体基底膜による濾
過機能の異常に求められている。 本発明者等は、前述
の発症機序に基づき、糸球体内皮細胞を迅速に修復で
き、メサンギウム細胞の増殖を抑制し、メサンギウム細
胞と糸球体内皮細胞との相互作用を正常化して、メサン
ギウム細胞の増殖を主体とする病変を予防・治療するこ
とが可能であることを想定したが、現在までそのような
作用を持つ因子はほとんど報告されていない。 本発明
者等は、かかる観点から、メサンギウム細胞の増殖を促
進することなく、内皮細胞のみを増殖させる因子につい
て鋭意研究した結果、ＨＧＦがかかる作用を有すること
を見出し、ＨＧＦが内皮細胞の修復・増殖を促進させ、
サンギウム細胞と糸球体内皮細胞との相互作用を正常化
させることによって、メサンギウム細胞の増殖、メサン
ギウム基質の増加による糸球体硬化を病変とする腎糸球
体疾患の予防・治療に有用であることが判明した。
【０００４】上記のＨＧＦは肝実質細胞を in vitro で
増殖させる因子として見出されたタンパク質である(Bio
chem Biophys Res Commun, 122, 1450, 1984 、Proc.
Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489, 1986、FEBS Letter,
22, 311, 1987 、Nature,342, 440, 1989、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990) 。 ＨＧＦは、
腎尿細管上皮細胞の増殖を促進し、腎尿細管の損傷を軽
減できることが知られている（例えば、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 91, 4357, 1994、特開平４−４９２４６
号公報など参照）。また、ラットの培養糸球体上皮細胞
株に対し、ＨＧＦが増殖促進効果を示すことが報告され
ている（第３７回日本腎臓学会学術大会、Ｐ−９１、平
成６年１２月１６日）。 上述のようにＨＧＦに関して
は多くの知見が集積されつつあり、ＨＧＦが腎臓を構成
する上皮細胞にも作用することが知られているが、糸球
体腎炎などの腎硬化の進展にとって重要なメサンギウム
細胞の増殖、メサンギウム基質の増加についての知見
や、糸球体疾患の治療に必要と考えられる内皮細胞に対
する効果、メサンギウム細胞と他の細胞との相互調節機
構に関する知見は全く得られていない。 本発明者等
は、ＨＧＦが腎糸球体を構成するメサンギウム細胞の増
殖に作用を示さず、内皮細胞の増殖を促進することを明
らかにした。さらに、メサンギウム細胞がＨＧＦを産生
・分泌して、内皮細胞の増殖を促進すること、糸球体硬
化の病変に関与する悪性因子と考えられるアンジオテン
シンII、TGF-βがメサンギウム細胞からのＨＧＦの産生
・分泌を抑制することを見出した。また、本発明者等
は、内皮細胞がメサンギウム細胞の増殖を抑制するこ
と、内皮細胞からＨＧＦが産生・分泌されており、オー
トクライン的に増殖を促進していることを明らかにし
た。そして、内皮細胞からのＨＧＦの産生・分泌も、TG
F-βにより抑制されることを示した。これらの知見か
ら、ＨＧＦが糸球体を構成する内皮細胞、メサンギウム
細胞間の相互調節において生理的に重要な役割を示して
いること、糸球体硬化の病態においてＨＧＦの産生が低
下していること、メサンギウム細胞の増殖を促進せずに
内皮細胞の増殖を促進するＨＧＦにより有効な治療がで
きることが明確となった。これらの知見は従来知られて
いない新規の知見である。本発明はかかる知見に基づい
てなされたもので、本発明は新規な腎糸球体疾患治療剤
を提供することを目的とする。
増殖させる因子として見出されたタンパク質である(Bio
chem Biophys Res Commun, 122, 1450, 1984 、Proc.
Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489, 1986、FEBS Letter,
22, 311, 1987 、Nature,342, 440, 1989、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990) 。 ＨＧＦは、
腎尿細管上皮細胞の増殖を促進し、腎尿細管の損傷を軽
減できることが知られている（例えば、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 91, 4357, 1994、特開平４−４９２４６
号公報など参照）。また、ラットの培養糸球体上皮細胞
株に対し、ＨＧＦが増殖促進効果を示すことが報告され
ている（第３７回日本腎臓学会学術大会、Ｐ−９１、平
成６年１２月１６日）。 上述のようにＨＧＦに関して
は多くの知見が集積されつつあり、ＨＧＦが腎臓を構成
する上皮細胞にも作用することが知られているが、糸球
体腎炎などの腎硬化の進展にとって重要なメサンギウム
細胞の増殖、メサンギウム基質の増加についての知見
や、糸球体疾患の治療に必要と考えられる内皮細胞に対
する効果、メサンギウム細胞と他の細胞との相互調節機
構に関する知見は全く得られていない。 本発明者等
は、ＨＧＦが腎糸球体を構成するメサンギウム細胞の増
殖に作用を示さず、内皮細胞の増殖を促進することを明
らかにした。さらに、メサンギウム細胞がＨＧＦを産生
・分泌して、内皮細胞の増殖を促進すること、糸球体硬
化の病変に関与する悪性因子と考えられるアンジオテン
シンII、TGF-βがメサンギウム細胞からのＨＧＦの産生
・分泌を抑制することを見出した。また、本発明者等
は、内皮細胞がメサンギウム細胞の増殖を抑制するこ
と、内皮細胞からＨＧＦが産生・分泌されており、オー
トクライン的に増殖を促進していることを明らかにし
た。そして、内皮細胞からのＨＧＦの産生・分泌も、TG
F-βにより抑制されることを示した。これらの知見か
ら、ＨＧＦが糸球体を構成する内皮細胞、メサンギウム
細胞間の相互調節において生理的に重要な役割を示して
いること、糸球体硬化の病態においてＨＧＦの産生が低
下していること、メサンギウム細胞の増殖を促進せずに
内皮細胞の増殖を促進するＨＧＦにより有効な治療がで
きることが明確となった。これらの知見は従来知られて
いない新規の知見である。本発明はかかる知見に基づい
てなされたもので、本発明は新規な腎糸球体疾患治療剤
を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、（１）ＨＧＦを有効成分として
含有することを特徴とする腎糸球体疾患治療剤、（２）
腎糸球体疾患が、メサンギウム細胞の増殖、メサンギウ
ム基質の増加を主体とする腎糸球体疾患である（１）記
載の腎糸球体疾患治療剤、（３）腎糸球体疾患が、内皮
細胞とメサンギウム細胞との相互作用の障害によって惹
起される糸球体の濾過機能の異常を呈する腎糸球体疾患
である（１）記載の腎糸球体疾患治療剤、および（４）
腎糸球体疾患が、糸球体腎症、糖尿病性腎症である
（１）記載の腎糸球体疾患治療剤に関する。
めになされた本発明は、（１）ＨＧＦを有効成分として
含有することを特徴とする腎糸球体疾患治療剤、（２）
腎糸球体疾患が、メサンギウム細胞の増殖、メサンギウ
ム基質の増加を主体とする腎糸球体疾患である（１）記
載の腎糸球体疾患治療剤、（３）腎糸球体疾患が、内皮
細胞とメサンギウム細胞との相互作用の障害によって惹
起される糸球体の濾過機能の異常を呈する腎糸球体疾患
である（１）記載の腎糸球体疾患治療剤、および（４）
腎糸球体疾患が、糸球体腎症、糖尿病性腎症である
（１）記載の腎糸球体疾患治療剤に関する。
【０００６】本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬
として使用できる程度に精製された物であれば、種々の
方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦを
産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培
養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得るこ
ともできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦを
コードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを
適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培
養上清から目的とする組み換えＨＧＦを得ることができ
る（例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平5-111383
号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967,
1989など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従
来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細
胞、例えば大腸菌、古草菌、酵母、糸状菌、植物又は動
物細胞などを用いることができる。かくして得られたＨ
ＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ
酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されて
いたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ
末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合
していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されて
いてもよい。
として使用できる程度に精製された物であれば、種々の
方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦを
産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培
養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得るこ
ともできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦを
コードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを
適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培
養上清から目的とする組み換えＨＧＦを得ることができ
る（例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平5-111383
号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967,
1989など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従
来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細
胞、例えば大腸菌、古草菌、酵母、糸状菌、植物又は動
物細胞などを用いることができる。かくして得られたＨ
ＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ
酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されて
いたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ
末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合
していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されて
いてもよい。
【０００７】本発明の治療剤は上記のＨＧＦを有効成分
とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるように、糸球体内
皮細胞を増殖させ、メサンギウム細胞を増殖させる作用
を示さない。糸球体内皮細胞は、増殖抑制作用を示す因
子や血管拡張作用を示す因子を種々産生・分泌している
ことが知られており、内皮細胞の機能不全や内皮細胞の
減少がメサンギウム細胞の増殖を伴う糸球体疾患の引き
金となることが考えられている。従って、本発明の治療
剤は、腎糸球体疾患、特にメサンギウム細胞の増殖、メ
サンギウム基質の増加を主体とする病変の治療・予防に
有効であり、これらには例えば糸球体腎症、糖尿病性腎
症が包含される。慢性糸球体疾患・糸球体腎炎として
は、IgA腎症、全身性エリテマトーデスに伴うループス
腎炎、グッドパスチャー症候群、ハイマン腎炎、悪性腫
瘍などが含まれる。本発明の治療剤は、急性糸球体腎
炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼを伴う腎糸球体
疾患に対しても有効である。
とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるように、糸球体内
皮細胞を増殖させ、メサンギウム細胞を増殖させる作用
を示さない。糸球体内皮細胞は、増殖抑制作用を示す因
子や血管拡張作用を示す因子を種々産生・分泌している
ことが知られており、内皮細胞の機能不全や内皮細胞の
減少がメサンギウム細胞の増殖を伴う糸球体疾患の引き
金となることが考えられている。従って、本発明の治療
剤は、腎糸球体疾患、特にメサンギウム細胞の増殖、メ
サンギウム基質の増加を主体とする病変の治療・予防に
有効であり、これらには例えば糸球体腎症、糖尿病性腎
症が包含される。慢性糸球体疾患・糸球体腎炎として
は、IgA腎症、全身性エリテマトーデスに伴うループス
腎炎、グッドパスチャー症候群、ハイマン腎炎、悪性腫
瘍などが含まれる。本発明の治療剤は、急性糸球体腎
炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼを伴う腎糸球体
疾患に対しても有効である。
【０００８】本発明の治療剤は、ヒトの他、哺乳動物
（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）
における腎糸球体疾患の治療・予防に適用される。
（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）
における腎糸球体疾患の治療・予防に適用される。
【０００９】
【発明の効果】本発明において、有効成分であるＨＧＦ
は、メサンギウム細胞の増殖を促進せず、さらに内皮細
胞の増殖を促進し、修復された内皮細胞を介してメサン
ギウム細胞の異常な増殖を抑える作用をも有している。
従って、本発明剤は、前述した腎糸球体疾患、特にメサ
ンギウム細胞の増殖とメサンギウム基質の増加を主体と
する障害に起因する各種疾患、内皮細胞とメサンギウム
細胞との相互作用の障害によって惹起される糸球体の濾
過機能の異常を呈する腎糸球体疾患などの治療・予防に
有用である。
は、メサンギウム細胞の増殖を促進せず、さらに内皮細
胞の増殖を促進し、修復された内皮細胞を介してメサン
ギウム細胞の異常な増殖を抑える作用をも有している。
従って、本発明剤は、前述した腎糸球体疾患、特にメサ
ンギウム細胞の増殖とメサンギウム基質の増加を主体と
する障害に起因する各種疾患、内皮細胞とメサンギウム
細胞との相互作用の障害によって惹起される糸球体の濾
過機能の異常を呈する腎糸球体疾患などの治療・予防に
有用である。
【００１０】
【実施例】以下、実験例及び実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、以下の実験で使用した材料及び
方法は以下のとおりである。
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、以下の実験で使用した材料及び
方法は以下のとおりである。
【００１１】実験材料及び方法細胞培養 ラットのメサンギウム細胞（以下、メサンギウム細胞を
ＭＣという）の単離・培養は、基本的には既報（J. Cli
n. Invest. 78, 1443, 1986）に従って行った。ウシの
糸球体内皮細胞およびラット内皮細胞（以下、内皮細胞
をＥＣという）の単離・培養は、ボーラーマンらの方法
（Am. J. Physiol., 256, C182, 1989）に従って行っ
た。メサンギウム細胞の培養は、１０％ウシ血清、ペニ
シリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０
０ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地を使用した。糸球体
内皮細胞の培養は、１０％ウシ血清、ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍ
ｌ）を含むＤＭＥＭ培地を使用した。因子を添加する試
験では、無血清培地または０．５％ウシ血清を加えた培
地を用いた。細胞は、摂氏３７度Ｃにて水蒸気に満たさ
れた９５％空気−５％二酸化炭素の条件下に培養し、２
日に１度培地の交換を行った。
ＭＣという）の単離・培養は、基本的には既報（J. Cli
n. Invest. 78, 1443, 1986）に従って行った。ウシの
糸球体内皮細胞およびラット内皮細胞（以下、内皮細胞
をＥＣという）の単離・培養は、ボーラーマンらの方法
（Am. J. Physiol., 256, C182, 1989）に従って行っ
た。メサンギウム細胞の培養は、１０％ウシ血清、ペニ
シリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０
０ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地を使用した。糸球体
内皮細胞の培養は、１０％ウシ血清、ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍ
ｌ）を含むＤＭＥＭ培地を使用した。因子を添加する試
験では、無血清培地または０．５％ウシ血清を加えた培
地を用いた。細胞は、摂氏３７度Ｃにて水蒸気に満たさ
れた９５％空気−５％二酸化炭素の条件下に培養し、２
日に１度培地の交換を行った。
【００１２】生存細胞数の測定法 生存細胞数の測定は、ＷＳＴ−細胞数測定キット（ワコ
ー社製）を用いて行った。
ー社製）を用いて行った。
【００１３】ＤＮＡ合成の測定法 糸球体内皮細胞は、９６穴組織培養用プレート上にまい
た。細胞が隙間なく付着した状態において、ＭＣは０．
５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養して
も増殖しなかった。細胞の相対的なＤＮＡ合成速度は、
２４時間のトリチウムラベル化チミジン（〔 3Ｈ〕Ｔｄ
Ｒ）の細胞中トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿物質中への
取り込みを測定することで評価した。
た。細胞が隙間なく付着した状態において、ＭＣは０．
５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養して
も増殖しなかった。細胞の相対的なＤＮＡ合成速度は、
２４時間のトリチウムラベル化チミジン（〔 3Ｈ〕Ｔｄ
Ｒ）の細胞中トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿物質中への
取り込みを測定することで評価した。
【００１４】共細胞培養 メサンギウム細胞の増殖に対する内皮細胞の効果を検討
する試験では、内皮細胞を細胞培養用インサート（コー
スター社、孔径０．４５μｍ）にまき、１０％ウシ血清
を加えたＤＭＥＭ培地にて増殖させた。メサンギウム細
胞は、６穴プレートにまき、１０％ウシ血清を加えたＤ
ＭＥＭ培地にて増殖させた。細胞が６０％から８０％コ
ンフルエントに増殖した状態で、内皮細胞を含有したイ
ンサートを、同様に６０％から８０％コンフルエントに
増殖したメサンギウム細胞を入れたウェル中に入れた。
内皮細胞とメサンギウム細胞は、０．５％のウシ血清を
加えたＤＭＥＭ培地中にて２４時間培養し、６穴プレー
トのメサンギウム細胞の生存数をＷＳＴ法にて測定し
た。内皮細胞の増殖に対するメサンギウム細胞の効果を
検討する試験では、メサンギウム細胞を細胞培養用イン
サートにまき、内皮細胞を６穴プレートにまいて、同様
に実験した。
する試験では、内皮細胞を細胞培養用インサート（コー
スター社、孔径０．４５μｍ）にまき、１０％ウシ血清
を加えたＤＭＥＭ培地にて増殖させた。メサンギウム細
胞は、６穴プレートにまき、１０％ウシ血清を加えたＤ
ＭＥＭ培地にて増殖させた。細胞が６０％から８０％コ
ンフルエントに増殖した状態で、内皮細胞を含有したイ
ンサートを、同様に６０％から８０％コンフルエントに
増殖したメサンギウム細胞を入れたウェル中に入れた。
内皮細胞とメサンギウム細胞は、０．５％のウシ血清を
加えたＤＭＥＭ培地中にて２４時間培養し、６穴プレー
トのメサンギウム細胞の生存数をＷＳＴ法にて測定し
た。内皮細胞の増殖に対するメサンギウム細胞の効果を
検討する試験では、メサンギウム細胞を細胞培養用イン
サートにまき、内皮細胞を６穴プレートにまいて、同様
に実験した。
【００１５】材料 ＨＧＦは組換えヒトＨＧＦを用いた。アンジオテンシン
IIはシグマ社より、TGF-βはジェンザイム社より入手し
た。
IIはシグマ社より、TGF-βはジェンザイム社より入手し
た。
【００１６】ＨＧＦの測定法 培養上清中のＨＧＦ濃度は、抗ＨＧＦモノクローナル抗
体を使用したELISAのキット（特殊免疫研究所）により
測定した。
体を使用したELISAのキット（特殊免疫研究所）により
測定した。
【００１７】逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ ラット・メサンギウム細胞、糸球体内皮細胞よりＲＮＡ
をＲＮＡゾル（Tel-Test Inc, Texas）を用いて抽出し
た。ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦレセプター）メッセ
ンジャー（ｍ）ＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ法（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8474, 1993）にて測定
した。なお、プライマーとしては下記の配列のものを使
用した。 ＨＧＦ： ５’側プライマー：５’ーＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣ
ＣＴＧＧＴー３’ ３’側プライマー：５’ーＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴ
ＣＡＴＴＡー３’ ｃ−ｍｅｔ： ５’側プライマー：５’ーＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣ
ＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴー３’ ３’側プライマー：５’ーＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣ
ＴＡＴＧＡＣＴＴＣー３’ 増幅したＤＮＡは２％アガロース電気泳動にかけ、エチ
ジウムプロマイドにて染色した。
をＲＮＡゾル（Tel-Test Inc, Texas）を用いて抽出し
た。ＨＧＦ及びｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦレセプター）メッセ
ンジャー（ｍ）ＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ法（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8474, 1993）にて測定
した。なお、プライマーとしては下記の配列のものを使
用した。 ＨＧＦ： ５’側プライマー：５’ーＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣ
ＣＴＧＧＴー３’ ３’側プライマー：５’ーＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴ
ＣＡＴＴＡー３’ ｃ−ｍｅｔ： ５’側プライマー：５’ーＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣ
ＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴー３’ ３’側プライマー：５’ーＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣ
ＴＡＴＧＡＣＴＴＣー３’ 増幅したＤＮＡは２％アガロース電気泳動にかけ、エチ
ジウムプロマイドにて染色した。
【００１８】統計解析 すべての値は、平均値±標準誤差にて現した。すべての
実験は最低３回繰り返した。測定値の統計的解析、有意
差検定には、ダンカン法を用いた。
実験は最低３回繰り返した。測定値の統計的解析、有意
差検定には、ダンカン法を用いた。
【００１９】試験例１糸球体内皮細胞の増殖に対するメサンギウム細胞の効果 ウシ糸球体内皮細胞の増殖に対するメサンギウム細胞の
効果を、ＭＣを糸球体内皮細胞に添加する共培養法にお
けるＷＳＴを用いた糸球体内皮細胞の生存細胞数の測定
で試験した。その結果を図１に示す。図中、（−）はＭ
Ｃ細胞なしを、（＋）はＭＣ細胞有りを示す。１群８ウ
ェルで実験を行った。図１に示されるように、糸球体内
皮細胞の細胞数が有意に増加しており、ＭＣは糸球体内
皮細胞の増殖を促進していることが認められた。ＭＣは
増殖因子を分泌してＭＣの機能を維持していることが示
唆された。
効果を、ＭＣを糸球体内皮細胞に添加する共培養法にお
けるＷＳＴを用いた糸球体内皮細胞の生存細胞数の測定
で試験した。その結果を図１に示す。図中、（−）はＭ
Ｃ細胞なしを、（＋）はＭＣ細胞有りを示す。１群８ウ
ェルで実験を行った。図１に示されるように、糸球体内
皮細胞の細胞数が有意に増加しており、ＭＣは糸球体内
皮細胞の増殖を促進していることが認められた。ＭＣは
増殖因子を分泌してＭＣの機能を維持していることが示
唆された。
【００２０】試験例２ＥＣの増殖に対するＭＣの効果と抗ＨＧＦ抗体の作用 試験例１に記載のようにＭＣにＥＣの増殖を促進する効
果が認められたことから、この効果におけるＨＧＦの関
与を検討するため、抗ＨＧＦ抗体（２ｎｇ／ｍｌ）の存
在下にＭＣをＥＣに添加する共培養において、ＷＳＴを
用いてＥＣの生存細胞数の測定を行った。その結果を図
２に示す。左図中、（−）はＭＣ細胞なしを、（＋）は
ＭＣ細胞有りを示す。１群８ウェルで実験を行った。図
２に示されるように、ＥＣの細胞数が有意に増加が再現
された。さらに、このＥＣ細胞増加の割合は、抗ＨＧＦ
抗体の添加により８０±５％まで有意に減少した。
果が認められたことから、この効果におけるＨＧＦの関
与を検討するため、抗ＨＧＦ抗体（２ｎｇ／ｍｌ）の存
在下にＭＣをＥＣに添加する共培養において、ＷＳＴを
用いてＥＣの生存細胞数の測定を行った。その結果を図
２に示す。左図中、（−）はＭＣ細胞なしを、（＋）は
ＭＣ細胞有りを示す。１群８ウェルで実験を行った。図
２に示されるように、ＥＣの細胞数が有意に増加が再現
された。さらに、このＥＣ細胞増加の割合は、抗ＨＧＦ
抗体の添加により８０±５％まで有意に減少した。
【００２１】試験例３ＭＣからのＨＧＦの分泌及びそれに対するアンジオテン
シンII、TGF-βの影響 試験例２に記載のように、抗ＨＧＦ抗体はＭＣによるＥ
Ｃ細胞の増殖促進効果を抑制したことから、ＭＣの培養
上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。さら
に、アンジオテンシンII（１０−６Ｍ）、TGF-β（１０
ｎｇ／ｍｌ）存在下におけるＭＣの培養上清中のＨＧＦ
量を測定し、無添加の時と比較した。その結果を図３に
示す。図中、DSFは対照群を示す。１群８ウェルで実験
を行った。図３に示されるように、ＭＣの培養上清中に
はＨＧＦが検出された。ＭＣにより確かにＨＧＦが分泌
されていることが分かった。以上の結果及び試験例２の
結果からして、ＭＣはＨＧＦを分泌してＥＣの増殖を促
進し、ＥＣの機能を維持していることが示された。さら
に、アンジオテンシンII、TGF-βの添加したＭＣの培養
上清中のＨＧＦ量は、無添加の時のよりも有意に減少し
た。アンジオテンシンII、TGF-βにより、ＭＣからのＨ
ＧＦの分泌が抑制されることが明らかになった。
シンII、TGF-βの影響 試験例２に記載のように、抗ＨＧＦ抗体はＭＣによるＥ
Ｃ細胞の増殖促進効果を抑制したことから、ＭＣの培養
上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。さら
に、アンジオテンシンII（１０−６Ｍ）、TGF-β（１０
ｎｇ／ｍｌ）存在下におけるＭＣの培養上清中のＨＧＦ
量を測定し、無添加の時と比較した。その結果を図３に
示す。図中、DSFは対照群を示す。１群８ウェルで実験
を行った。図３に示されるように、ＭＣの培養上清中に
はＨＧＦが検出された。ＭＣにより確かにＨＧＦが分泌
されていることが分かった。以上の結果及び試験例２の
結果からして、ＭＣはＨＧＦを分泌してＥＣの増殖を促
進し、ＥＣの機能を維持していることが示された。さら
に、アンジオテンシンII、TGF-βの添加したＭＣの培養
上清中のＨＧＦ量は、無添加の時のよりも有意に減少し
た。アンジオテンシンII、TGF-βにより、ＭＣからのＨ
ＧＦの分泌が抑制されることが明らかになった。
【００２２】試験例４ＭＣの増殖に対するＥＣの効果 ＭＣの増殖に対するＥＣの効果をＥＣをＭＣに添加する
共培養法におけるＷＳＴ法を用いたＭＣの生存細胞数の
測定で試験した。その結果を図４に示す。図中、（−）
はＥＣ細胞なしを、（＋）はＭＣ細胞有りを示す。１群
８ウェルで実験を行った。 図４に示されるように、Ｍ
Ｃの細胞数が有意に減少しており、ＥＣはＭＣの増殖を
抑制していることが認められた。
共培養法におけるＷＳＴ法を用いたＭＣの生存細胞数の
測定で試験した。その結果を図４に示す。図中、（−）
はＥＣ細胞なしを、（＋）はＭＣ細胞有りを示す。１群
８ウェルで実験を行った。 図４に示されるように、Ｍ
Ｃの細胞数が有意に減少しており、ＥＣはＭＣの増殖を
抑制していることが認められた。
【００２３】試験例５ＥＣの増殖における抗ＨＧＦ抗体の作用 ＥＣの増殖速度に対する抗ＨＧＦ抗体（２ｎｇ／ｍｌ）
の影響をＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍｌ）をコントロールとし
て、ＷＳＴ法により検討した。その結果を図５に示す。
図中、DSFは対照群を示す。１群８ウェルで実験を行っ
た。図５に示されるように、ＥＣ細胞の増殖速度はＩｇ
Ｇにより影響を受けないが、抗ＨＧＦ抗体により有意に
減少した。
の影響をＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍｌ）をコントロールとし
て、ＷＳＴ法により検討した。その結果を図５に示す。
図中、DSFは対照群を示す。１群８ウェルで実験を行っ
た。図５に示されるように、ＥＣ細胞の増殖速度はＩｇ
Ｇにより影響を受けないが、抗ＨＧＦ抗体により有意に
減少した。
【００２４】試験例６ＥＣからのＨＧＦの分泌及びそれに対するTGF-βの影響 ＥＣの培養上清中のＨＧＦ量をＥＬＩＳＡ法により測定
したところ、１．１６±０．０１ｎｇ／ｍｌであった。
ＥＣにより確かにＨＧＦが分泌されていることが明らか
になった。また、ＲＴ−ＰＣＲ法により、培養したＥＣ
からＨＧＦの受容体であるｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡが検出
された。以上の結果及び試験例５の結果からして、ＥＣ
は自らＨＧＦを分泌してオートクライン的にＥＣの増殖
を促進し、ＥＣの機能を維持していることが示された。
さらに、TGF-β（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下におけるＥ
Ｃの培養上清中のＨＧＦ量を測定し、無添加の時と比較
した。その結果、TGF-β存在下のＥＣの培養上清中には
０．７７±０．０３ｎｇ／ｍｌのＨＧＦが検出され、無
添加のときと比べて有意に（Ｐ＜０．０５）減少した。
TGF-βにより、ＭＣからのＨＧＦの分泌が抑制されるこ
とが明らかになった。
したところ、１．１６±０．０１ｎｇ／ｍｌであった。
ＥＣにより確かにＨＧＦが分泌されていることが明らか
になった。また、ＲＴ−ＰＣＲ法により、培養したＥＣ
からＨＧＦの受容体であるｃ−ｍｅｔのｍＲＮＡが検出
された。以上の結果及び試験例５の結果からして、ＥＣ
は自らＨＧＦを分泌してオートクライン的にＥＣの増殖
を促進し、ＥＣの機能を維持していることが示された。
さらに、TGF-β（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下におけるＥ
Ｃの培養上清中のＨＧＦ量を測定し、無添加の時と比較
した。その結果、TGF-β存在下のＥＣの培養上清中には
０．７７±０．０３ｎｇ／ｍｌのＨＧＦが検出され、無
添加のときと比べて有意に（Ｐ＜０．０５）減少した。
TGF-βにより、ＭＣからのＨＧＦの分泌が抑制されるこ
とが明らかになった。
【００２５】試験例７ＲＴ−ＰＣＲ法によるＨＧＦ ｍＲＮＡレベルの測定 ラットＭＣ、ＥＣよりｍＲＮＡ
を抽出し、ＨＧＦ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣ
Ｒを行った。ＭＣ、ＥＣでＨＧＦのｍＲＮＡの発現が確
認された。
を抽出し、ＨＧＦ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣ
Ｒを行った。ＭＣ、ＥＣでＨＧＦのｍＲＮＡの発現が確
認された。
【００２６】試験例８糸球体内皮細胞の細胞増殖に対するＨＧＦの効果 ウシ糸球体内皮細胞の増殖に対するＨＧＦの効果を、〔
3Ｈ〕ＴｄＲ取り込み量で試験した。その結果を図７に
示す。１群８ウェルで実験を行った。図７に示されるよ
うに、ＨＧＦの添加により、糸球体内皮細胞の細胞数が
有意に増加していることが認められた。
3Ｈ〕ＴｄＲ取り込み量で試験した。その結果を図７に
示す。１群８ウェルで実験を行った。図７に示されるよ
うに、ＨＧＦの添加により、糸球体内皮細胞の細胞数が
有意に増加していることが認められた。
【００２７】試験例９ＭＣの細胞増殖に対するＨＧＦの効果 ＭＣの増殖に対するＨＧＦの効果を、ＷＳＴを用いたＭ
Ｃの生存細胞数の測定で試験した。その結果を図８に示
す。１群８ウェルで実験を行った。図８に示されるよう
に、ＨＧＦの添加（１００ｎｇ／ｍｌ）によっては、Ｍ
Ｃの細胞数は影響を受けないことが認められた。
Ｃの生存細胞数の測定で試験した。その結果を図８に示
す。１群８ウェルで実験を行った。図８に示されるよう
に、ＨＧＦの添加（１００ｎｇ／ｍｌ）によっては、Ｍ
Ｃの細胞数は影響を受けないことが認められた。
【００２８】実施例１ 生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール
１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無
菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結
乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無
菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結
乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００２９】実施例２ ０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１０
０ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアル
に分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾
燥製剤を得た。
０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１０
０ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアル
に分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾
燥製剤を得た。
【００３０】実施例３ 注射用蒸留水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、ソルベート
２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇ
を含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分
注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製
剤を得た。
２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇ
を含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分
注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製
剤を得た。
【図１】糸球体内皮細胞の細胞増殖に対するＭＣの効果
を示す図である。
を示す図である。
【図２】ＭＣのＥＣ細胞増殖促進作用に対する抗ＨＧＦ
抗体の効果を示す図である。
抗体の効果を示す図である。
【図３】ＭＣからのＨＧＦの分泌量およびそれに対する
アンジオテンシンII、TGF-βの効果を示す図である。
アンジオテンシンII、TGF-βの効果を示す図である。
【図４】ＭＣの細胞増殖に対するＥＣの効果を示す図で
ある。
ある。
【図５】ＥＣの細胞増殖に対する抗ＨＧＦ抗体の効果を
示す図である。
示す図である。
【図６】ＥＣからのＨＧＦの分泌量およびそれに対する
TGF-βの効果を示す図である。
TGF-βの効果を示す図である。
【図７】糸球体内皮細胞の細胞増殖に対するＨＧＦの効
果を示す図である。
果を示す図である。
【図８】ＭＣの細胞増殖に対するＨＧＦの効果を示す図
である。
である。
Claims (4)
- 【請求項１】 ＨＧＦを有効成分として含有すること
を特徴とする腎糸球体疾患治療剤。 - 【請求項２】 腎糸球体疾患が、メサンギウム細胞の
増殖、メサンギウム基質の増加を主体とする腎糸球体疾
患である請求項１記載の腎糸球体疾患治療剤。 - 【請求項３】 腎糸球体疾患が、内皮細胞とメサンギ
ウム細胞との相互作用の障害によって惹起される糸球体
の濾過機能の異常を呈する腎糸球体疾患である請求項１
記載の腎糸球体疾患治療剤。 - 【請求項４】 腎糸球体疾患が、糸球体腎症、糖尿病
性腎症である請求項１記載の腎糸球体疾患治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27194295A JP3977448B2 (ja) | 1995-09-25 | 1995-09-25 | 腎糸球体疾患治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27194295A JP3977448B2 (ja) | 1995-09-25 | 1995-09-25 | 腎糸球体疾患治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0987199A true JPH0987199A (ja) | 1997-03-31 |
| JP3977448B2 JP3977448B2 (ja) | 2007-09-19 |
Family
ID=17506988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27194295A Expired - Fee Related JP3977448B2 (ja) | 1995-09-25 | 1995-09-25 | 腎糸球体疾患治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3977448B2 (ja) |
-
1995
- 1995-09-25 JP JP27194295A patent/JP3977448B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3977448B2 (ja) | 2007-09-19 |
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