JPH0998797A

JPH0998797A - 酵素活性測定装置および酵素活性阻害物質のスクリーニング方法

Info

Publication number: JPH0998797A
Application number: JP7284634A
Authority: JP
Inventors: Miwa Miyamoto; 美輪宮本; Koji Onishi; 功二大西; Toru Sugawara; 徹菅原
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1995-10-04
Publication date: 1997-04-15

Abstract

(57)【要約】【課題】活性が低下しやすい酵素であっても、多数の
検体化合物から酵素活性を阻害する目的化合物を高い精
度で効率よく検出する。【解決手段】複数の反応容器に、酵素液と、検体化合
物および補酵素を含む反応液とを順次注入し、インキュ
ベータ３１内へ移送し、所定時間経過後にを取出し、反
応停止装置４１の反応停止部位において複数の反応容器
を冷却して反応を停止させ、複数の反応容器をフローイ
ンジェクションシステムの自動サンプリング部位に移送
する一連の操作を順次自動的に行うロボットシステム
１，２１と、複数の反応容器から所定の間隔で順次自動
的にサンプリングし、反応生成物を検出するフローイン
ジェクションシステム５１とを組み合わせることによ
り、酵素活性を阻害する化合物を検出する。酵素には一
酸化窒素合成酵素などが含まれ、フローインジェクショ
ンシステム５１では、酵素反応により生成するＮＯ₂と
の反応により生じるジアゾ化合物から色素を生成させ、
生成した色素の吸光度を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多数の化合物の中
から酵素活性を阻害する化合物を効率よくスクリーニン
グする上で有用な酵素活性測定装置およびこの装置を用
いた酵素活性阻害物質のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は生物体の様々な機能に関与してお
り、酵素活性阻害物質などの酵素反応に関わる活性化合
物を探索することは、医薬品などの開発において重要で
ある。酵素反応に関与する化合物のスクリーニングは、
通常、酵素、検体化合物および必要に応じて補酵素を含
む混合液をインキュベートし、反応生成物を定量するこ
とにより行なわれている。しかし、酵素は一般に安定性
が低く、時間の経過に伴なって酵素活性が低下する。そ
のため、多数の検体化合物の中から酵素活性を阻害する
化合物を高い再現性で精度よくスクリーニングすること
が困難である。

【０００３】多数の検体化合物からのスクリーニング操
作性を高めるため、酵素、検体化合物および必要に応じ
て補酵素を含む混合液を反応容器に注入し、インキュベ
ートした後、冷却して反応を停止させ、吸光度を測定す
る操作を自動的に行なうロボットシステムが知られてい
る（例えば、ベックマン社製，「バイオメック」な
ど）。このロボットシステムでは、比較的多数の検体化
合物を反応操作に自動的に供することができ、多数の検
体の処理に有利である。しかし、一般的に吸光光度法は
感度が低いため、検出感度を高めるためには、酵素、検
体化合物および補酵素の使用量を増加させることが考え
られるものの、高価な酵素を多量に使用することは経済
的に不利である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、多数の検体化合物から目的化合物を高精度かつ高感
度で効率よく検出できる酵素活性測定装置、およびこの
装置を用いた酵素活性阻害物質のスクリーニング方法を
提供することにある。本発明の他の目的は、少量の酵素
量であっても反応生成物を高い精度で再現性よく検出で
き、多数の検体化合物から目的化合物を円滑かつ効率よ
く検出できる酵素活性測定装置、およびこの装置を用い
た酵素活性阻害物質のスクリーニング方法を提供するこ
とにある。本発明のさらに他の目的は、活性が低下しや
すい酵素を有効に利用できるとともに、短時間内に、多
数の検体化合物を処理し、酵素活性を阻害する化合物を
有効に検出できる酵素活性測定装置、およびこの装置を
用いた酵素活性阻害物質のスクリーニング方法を提供す
ることにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するため鋭意検討の結果、酵素と検体化合物との
反応操作を自動的に行なうことができるロボットシステ
ムと、フローインジェクションシステムとを組み合わせ
ると、少量の酵素量であっても多数の検体化合物から目
的化合物を高精度かつ高感度で効率よく検出できること
を見いだし、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明の酵素活性測定装置は、
（１）酵素および検体化合物を反応容器に注入する注入
操作、反応容器を反応槽へ自動的に移送する移送操作、
および反応槽から反応容器を取り出し、反応を停止させ
るための反応停止操作を順次自動的に行うロボットシス
テムと、反応容器内の反応混合液を自動的にサンプリン
グし、酵素活性を測定するためのフローインジェクショ
ンシステムとを備えている。この装置において、（２）
ロボットシステムは、反応停止操作の後、反応容器をフ
ローインジェクションシステムの自動サンプリング部位
に移送する移送操作を行なうシステムであってもよい。
また、前記装置は、（３）複数の反応容器に酵素液と、
検体化合物および補酵素を含む反応液を順次注入する注
入操作、インキュベータの扉を自動的に開かせ、複数の
反応容器をインキュベータ内へ自動的に収容して扉を閉
じる移送操作、所定時間経過後にインキュベータの扉を
自動的に開かせ、インキュベータ内の複数の反応容器を
取出して扉を閉じる移送操作、反応停止部位において複
数の反応容器を冷却して反応を停止させるための反応停
止操作、複数の反応容器をフローインジェクションシス
テムの自動サンプリング部位に移送する移送操作で構成
された一連の操作を順次自動的に行うロボットシステム
と、反応混合液を複数の反応容器から所定の間隔で順次
自動的にサンプリングし、反応生成物を検出するフロー
インジェクションシステムとを備えていてもよい。これ
らの装置において、（４）酵素は一酸化窒素合成酵素で
あり、酵素反応により生成するＮＯ由来のＮＯ₂と芳香
族化合物との反応により生じるジアゾ化合物を還元し、
色素を生成させ、生成した色素の吸光度を測定するため
のフローインジェクションシステムを備えていてもよ
い。

【０００７】本発明の方法では、（５）酵素および検体
化合物を反応容器に注入し、反応容器をインキュベート
した後、反応を停止させる操作をロボットシステムによ
り自動的に行ない、反応容器内の反応混合液を自動的に
サンプリングしてフローインジェクションシステムに供
することにより、酵素活性を測定する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下に、添付図面を参照しつつ本
発明を詳細に説明する。図１は本発明の酵素活性測定装
置の構成の一例を示す概略平面図、図２は図１のロボッ
トシステムを構成する第１のロボットを示す概略斜視
図、図３は図１のロボットシステムを構成する第２のロ
ボットを示す概略斜視図である。

【０００９】前記測定装置は、図１に示されるように、
複数の反応容器内に、一酸化窒素合成酵素などの酵素
液、検体化合物および補酵素を含む反応液をピペッティ
ング操作により調製するための、ＸＹＺ軸方向に可動な
第１のロボット１と、前記複数の反応容器をインキュベ
ータ３１へ移送するための第２のロボット２１とで構成
されたロボットシステムを備えており、第２のロボット
２１は、酵素液などを収容する容器を交換する機能など
も有する。なお、第１のロボット１は、例えば、ベック
マン社製，「バイオメックBiomek 1000」などで構成で
き、第２のロボットは、例えば、ベックマン社製，「自
動ラブウェア交換装置サイドローダーSideLoader」など
で構成できる。これらのロボットの動作は、一連のアッ
セイ操作に対応して基本操作に分類されているととも
に、サブルーチン化された自動アッセイシステムを利用
したコンピュータシステムにより自動的に制御されてい
る。すなわち、ロボットの各基本操作は、それぞれ、所
定のプログラムが格納された記憶手段、コンピュータか
らの指令信号に応答して、この記憶手段との間で信号の
授受を行なうとともに、判別回路、演算回路などを備え
た制御手段、この制御手段からの制御量に対応する制御
信号に応答してアクチュエータを駆動するための駆動手
段とを備えたコンピュータシステムにより制御されてい
る。

【００１０】すなわち、第１のロボット１は、ケース８
内に収容された複数の反応容器９（この例では８連のチ
ューブ状ガラス製容器）に酵素液、検体化合物および補
酵素を含む反応液を、それぞれ順次注入（分注）し、撹
拌する操作を行なう。この第１のロボットシステム１
は、図２に示されるように、基台２上に立設したエレベ
ータータワー３と、Ｙ軸方向に移動可能なブリッジ４
と、Ｘ軸方向に移動可能なポッド５と、前記基台２上を
Ｚ軸方向にスライド可能なスライド台６とで構成されて
いる。前記ポッド５の下端部には、チップ１０を掴むツ
ールとしてのピペット７が装着され、このピペットに
は、ケース８の複数の反応容器９に酵素液などを吸引し
て分注し、撹拌するための複数のチップ１０が装着され
ている。なお、前記ピペット７は目的に応じたツールと
交換可能である。前記スライド台６には、前記ポッド５
の下端部に装着される複数のツール１１を保持するホル
ダー１２、前記複数の反応容器９を収容するケース８、
酵素液、検体化合物および補酵素を含む反応液、洗浄液
などを収容する容器と、これらの容器を収容して保持す
るための孔が形成されたプレートなどが保持されてい
る。

【００１１】この第１のロボット１は、スライド台６を
Ｚ軸方向に移動させて、ブリッジ４をＹ軸方向に下降さ
せ、ポッド５をＸ軸方向に移動させてスライド台６の容
器に収容された所定量の酵素液を複数のチップ１０でそ
れぞれ吸引し、Ｙ軸方向に上昇させ、ポッド５をＸ軸方
向に移動させた後、複数の反応容器９に対応する部位で
Ｙ軸方向に下降させ前記酵素液を複数の反応容器９に注
入する動作、この注入動作に逆行して、スライド台６の
うち検体化合物の溶液を収容する容器に対応する部位に
チップ１０を復帰させる動作を繰り返し、検体化合物お
よび補酵素を含む反応液とを、前記複数の反応容器９へ
注入し、チップ１０により混合液を吸引・排出により混
合する操作、すなわち、ピペッティング操作を行なう。

【００１２】なお、ツールとしてのピペットの交換が必
要でない場合、前記スライド台のうちピペットを保持す
るホルダーは必ずしも必要ではない。また、酵素液など
を収容する容器のサイズや容量は特に制限されない。

【００１３】前記第１のロボット１では、自動的に分注
操作、撹拌操作が連続的に行なわれるものの、反応容器
９、酵素液などが消費され、長時間に亘り連続的に操作
することが困難となる。そのため、使用済みの反応容器
や容器などを新たな反応容器や容器などと交換するた
め、第２のロボット２１が利用される。この第２のロボ
ット２１は、図３に示されるように、ベース２２に立設
されたタワー２３と、このタワーの軸方向（Ｙ軸方向）
に移動可能であるとともに、前記タワー２３を軸として
水平面に沿って周方向に移動可能なアーム２４とを備え
ており、アーム２４の先端には、棚２６に置かれた反応
容器９を収容するケース８やケース８などを掴むための
グリッパー２５が取り付けられている。なお、符号２７
は、使用済みのチップラックの蓋を廃棄するための廃棄
口である。

【００１４】さらに第２のロボット２１は、第１のロボ
ット１の操作により調製された混合液を、反応槽として
のインキューベータ３１に移送して反応させるため、反
応容器９を収容するケース８をグリッパー２５で掴み、
インキュベータ３１内に自動的に移送する。すなわち、
図４に示されるように、コンピュータから制御回路へ与
えられる信号に応答して、エアーバルブ３２が作動して
エアーシリンダー３７へエアーコンプレッサからの圧縮
空気が供給される。圧縮空気の供給に伴って、エアーシ
リンダー３７の軸３７ａが、図中、半時計方向へ回転
し、前記軸３７ａから延び、かつインキュベータ３１の
ドア３５に取り付けられたアーム３４も図中、手前側に
回転し、ドア３５を開かせる。ドア３５が開くことに伴
って、開ドア位置の電磁石３３が磁化し、ドアを磁気的
に固定する。

【００１５】ドアが開くと、第２のロボット２１は、ア
ーム２４を伸長させて、前記グリッパー２５により掴ま
れたケース８をインキュベータ３１内の棚に載置した
後、インキュベータ３１からアーム２４を後退させる。
アーム２４の後退動作に応答して、ドアを閉じるための
信号が制御回路に与えられ、電磁石３３は消磁され、エ
アーバルブ３２が動作してエアーシリンダー３７へ圧縮
空気が送られる。圧縮空気の供給に伴って、エアーシリ
ンダー３７の軸３７ａおよびアーム３４が時計方向に回
転し、ドア３５が閉じられる。ドア３５が閉じることに
伴って、閉ドア位置の電磁石３６が磁化し、ドアを閉ド
ア位置に固定する。

【００１６】また、インキュベータ３１内で混合液を所
定時間反応させた後、コンピュータはドアを開放するた
めの信号を制御回路に与え、駆動回路はインキュベータ
３１のドア３５を上記と同様にして自動的に開かせ、第
２のロボット２１は、インキュベータ３１内のケース８
を取出す。また、ケース８の取出し操作に応答して、コ
ンピュータはインキュベータ３１のドア３５を閉じるた
めの信号を制御回路に与え、駆動回路はインキュベータ
３１のドア３５を閉じさせる。なお、混合液は温浴や油
浴などでインキュベートしてもよいが、空気浴中でイン
キュベートするのが好ましい。

【００１７】グリッパー２５を備えたアーム２４を利用
して、インキュベータ３１から取出されたケース８の反
応容器９は、酵素反応を停止させるための反応停止装置
（冷却装置）４１の反応停止部位に自動的に移送され、
アーム２４を下降させて、ケース８とともに反応容器９
を冷却することにより、酵素反応が停止される。さら
に、前記第２のロボット２１は、複数の反応容器９を収
容するケース８を、フローインジェクションシステム５
１の自動サンプリング部位に移送した後、前記インキュ
ベータ３１へケース８を移送するための操作部位に復帰
する。前記第１のロボット１と第２のロボット２１とイ
ンキュベータ３１のドア３５の開閉の一連の操作は、い
ずれもコンピュータからの指令に応答して順次自動的に
行なわれる。

【００１８】前記フローインジェクションシステム５１
では、ケース８とともに移送された複数の反応容器９内
から所定の間隔で反応混合液を順次サンプリングしてフ
ローインジェクションシステムに供することにより、検
体化合物に対する酵素活性を測定している。この例で
は、一酸化窒素合成酵素とＬ−アルギニンとの反応によ
り、ＯＨ−Ａｒｇ、オキソアルギニンを経て、一酸化窒
素とシトルリンが生成し、一酸化窒素からＮＯ₂，ＮＯ
₃が生成すること（Michael A. Marletta, TIBS,14, 48
8(1989)）を利用して、検体化合物に対する酵素活性の
阻害の程度を測定している。すなわち、ＮＯ₂は安定性
が高いだけでなく、芳香族化合物との反応によりジアゾ
化合物を生成するので、フローインジェクションシステ
ムにより、生成したジアゾ化合物や色素を簡便かつ高感
度で迅速に検出している。より詳細には、図５に示され
るフローインジェクションシステム５１では、ポンプ５
３により、容器５２に貯溜されたテトラブチルアンモニ
ウムホスフェート溶液などのイオンペア剤が流れるフロ
ーライン５４に、前記ケース８の反応容器９から反応混
合液をオートサンプラー５５でサンプリングして合流さ
せ、トラッピングカラム５６により反応混合液中の測定
妨害物をトラップする。測定妨害物が除去された反応混
合液には、容器５７内の亜硝酸の定量試薬（例えば、亜
硝酸との反応によりジアゾ化合物を生成するスルファニ
ル酸など）および容器５９内のカップリング試薬（例え
ば、前記ジアゾ化合物と反応して赤色色素などを生成す
るＮ−１−ナフチルエチレンジアミンやα−ナフチルア
ミンなど）が、それぞれポンプ５８，６０により供給さ
れて合流し、混合液は、反応管６１に供給される。この
反応管６１に供給された混合液は、フローライン５４を
流れながら反応により前記亜硝酸の生成量に応じて発色
する。そのため、反応混合液の発色度を、検出器６２で
検出するとともに検出値をレコーダ又はインテグレータ
ー６３で記録することにより、酵素活性を測定できる。

【００１９】しかも、ジアゾ化合物や色素をフローイン
ジェクションシステムを利用した吸光光度法により検出
する場合には、例えば、１〜３ｍｌ程度の試料を必要と
する吸光光度法などに比べて、極めて少量（例えば、５
０μｌ程度）の反応混合液であっても反応生成物を検出
できるだけでなく、検出感度は、例えば、１００倍以上
である。そのため、酵素の使用量を大幅に低減できる。
さらに、多量の検体化合物を迅速に処理でき、効率よく
酵素活性阻害物質を検索できる。例えば、８連の反応容
器を用いる場合、前記ロボットシステムとフローインジ
ェクションシステムとを組み合わせると、一日当たり７
２０検体をスクリーニングできるのに対して、前記ロボ
ットシステムと従来の分光光度法とを組み合わせたシス
テムでは、一日当たり１００検体をスクリーニングでき
るに過ぎない。

【００２０】なお、前記の例では、酵素として一酸化窒
素合成酵素を用いているが、酵素の種類は特に制限され
ず、補酵素は、必要であれば酵素の種類に応じて選択で
きる。例えば、本発明は、吸光光度法による心筋小細胞
体カルシウムポンプ活性の測定方法にも利用できる。こ
の場合、検体液とカルシウムキレート剤とを分注した
後、反応液を分注し、酵素反応開始液（例えば、ＡＴＰ
など）を添加して撹拌し、インキュベート（例えば、温
度３７℃で２０分間など）した後、反応停止液（ヒドラ
ジンの塩酸溶液など）を添加して酵素反応を停止させ、
所定の温度でインキュベートし、発色液を分注し、フロ
ーインジェクションシステムで反応液の吸光度を所定の
波長（例えば、４５０ｎｍ）で検出することにより、酵
素活性を測定できる。酵素活性阻害化合物を検索して医
薬品を開発する場合、ヒト型に近い酵素が好ましく用い
られ、純度が安定した酵素を用いる場合が多い。好まし
い検出系では、酵素反応により高感度に検出可能な生成
物を生成する酵素が使用される。酵素反応による反応生
成物を検出するための検出手段は、精度よく検出できる
限り特に制限されないが、高い精度で再現性よく反応生
成物を吸光光度法により検出するためには、フローイン
ジェクションシステムを利用するのが有利である。

【００２１】前記第１のロボットによるピペッティング
操作は、単一の反応容器について自動的に連続して行っ
てもよいが、数多くの酵素活性阻害物質を迅速かつ効率
よく検索するためには、互いに隣接して連なった複数の
反応容器（例えば、４連、８連，１６連などのチューブ
状反応容器）について自動的に連続して行なうのが有利
である。なお、第２のロボットは必ずしも必要ではな
く、第１のロボットで、インキュベータへの反応容器の
出し入れ、反応停止や自動サンプリング部位への移送操
作などを行ってもよい。ロボットシステムは、反応容器
に酵素液などを注入する注入操作、反応容器をインキュ
ベータへ移送して出し入れする操作、反応停止部位へ移
送して反応停止操作を順次自動的に行う限り、特に制限
されない。例えば、酵素液と検体化合物との注入順序は
いずれを先行させてもよく、反応停止操作の後、反応容
器をフローインジェクションシステムの自動サンプリン
グ部位に移送する操作を行なうと、ロボットシステム
と、反応容器内の反応混合液を自動的にサンプリングす
るフローインジェクションシステムとを有効に結合させ
ることができる。前記インキュベータのドアは、前記エ
アーシリンダーなどを利用したドア開閉機構に限らず、
種々の開閉機構、例えば、ロボットアームや容器又はケ
ースの接近を光学的に検出し、この検出に基づいてスラ
イド式又は巻き上げ方式でドアを開くための駆動回路と
駆動機構、ロボットアームを伸長させてケースなどを反
応槽内に収容した後、ロボットアームの後退を光学的に
検出し、ドアを閉じるための駆動回路と駆動機構、ドア
を閉じた後、所定の時間保持するためのタイマー手段、
および所定の時間経過後、タイマー手段からの信号に応
答してドアを開くための駆動回路と駆動機構を備えたド
ア開閉機構であってもよい。さらに、前記反応停止手段
は反応を停止できる限り特に制限されないが、例えば、
前記のように冷却手段を採用する場合が多い。

【００２２】検体化合物を迅速に検索処理するために
は、複数の反応容器内の反応混合液を自動的にサンプリ
ングして、フローインジェクションシステムに供するの
が有利である。このフローインジェクションシステム
は、緩衝液などが定量的に供給されるフローラインと、
このフローラインに反応混合物を合流させるための合流
ラインと、酵素反応による反応生成物（例えば、ＮＯ₂
など）と、この反応生成物との反応によりジアゾ化合物
又は色素を生成させる試薬（例えば、亜硝酸との反応に
よりジアゾ化合物を生成するスルファニル酸、芳香族ア
ミンなどのカップリング試薬などの芳香族化合物）とを
合流させるための合流ラインと、前記フローラインを構
成し、かつ前記成分を反応させるための加熱可能な反応
ラインと、生成した色素の吸光度を測定するための検出
器とを備えている。また、前記フローライン、合流ライ
ン、および反応ラインとで反応系が構成される。なお、
フローラインは、不要物を除去するためトラッピングカ
ラムを備えていてもよいが、必ずしも必要ではない。

【００２３】本発明のスクリーニング方法は、前記のよ
うに、酵素および検体化合物を反応容器に注入し、反応
容器をインキュベートした後、反応を停止させる操作を
ロボットシステムにより自動的に行なう自動ロボット操
作と、反応容器内の反応混合液を自動的にサンプリング
してフローインジェクションシステムにより分析する操
作とで構成され、これらの操作により、酵素活性阻害物
質をスクリーニングする。これらの操作は連続的に行な
うと、前記のように多量の検体化合物であっても、酵素
活性を阻害する物質を有効かつ迅速に検出できる。

【００２４】

【発明の効果】本発明の酵素活性測定装置およびスクリ
ーニング方法では、ロボットシステムとフローシンジェ
クションシステムとを組み合わせているため、多数の検
体化合物から酵素の活性を阻害する目的化合物を高精度
かつ高感度で円滑かつ効率よく検出できる。また、少量
の酵素量であっても反応生成物を高精度かつ高感度で再
現性よく検出できる。さらに、活性が低下しやすい酵素
を有効に利用できるとともに、短時間内に、多数の検体
化合物を処理し、酵素活性を阻害する化合物を有効に検
出できる。

【００２５】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定され
るものではない。一酸化窒素合成酵素の調製３種類の一酸化窒素合成酵素アイソフォーム（誘導型，
脳型および内皮型）を、下記のようにして、それぞれ、
ラットマクロファージ、ラット小脳およびウシ内皮細胞
から調製した。誘導型一酸化窒素合成酵素６週齢の雄性ウィスターラット（４匹）に、日本薬局方
乾燥ＢＣＧワクチン（４０ｍｇ／１０ｍｌ食塩水）を腹
腔内投与する。２週間後、無菌操作で腹腔内からマクロ
ファージを採取し、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）を含む血
清培地でシャーレにまく（２．５×１０⁷cells／１５
ｍｌ）。３７℃で２４時間培養し、接着したマクロファ
ージをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、プロテアーゼインヒ
ビター緩衝液（０．１ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ，０．０１ｍ
ｇ／ｍｌトリプシンインヒビター，０．０１ｍｇ／ｍｌ
ロイペプチン，０．０１ｍｇ／ｍｌアンチパイン，０．
０１ｍｇ／ｍｌペプスタチン，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４））に懸濁する。超音波処理
した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，１０分）した上
清を誘導型一酸化窒素合成酵素とした。

【００２６】脳型一酸化窒素合成酵素ウィスターラット（１２匹）の小脳を摘出し、生理食塩
水で洗浄した後、２倍量のホモジネート緩衝液（５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４），１ｍＭＤＴＴ）を添加
し、ホモジナイズする。超遠心（１００，０００ｇ，１
０分）した後、上清に９倍量のｐ−セルロース（p-cell
ulose）（１０ｍｇ／ｍｌＫ−Ｐｉ（ｐＨ６．５））
を添加し、４℃で３０分間放置した後、遠心分離（３０
００ｒｐｍ，１０分）し、上清を脳型一酸化窒素合成酵
素とした。

【００２７】内皮型一酸化窒素合成酵素ウシ大動脈（４本）の内皮をカミソリで削ぎ、緩衝液
（１ｍＭＤＴＴ，０．５％トリトン（Triton）Ｘ−１
００，５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４））に懸濁す
る。超音波処理（出力６，２秒間）した後、遠心分離
（１２０００ｒｐｍ，１０分）し、上清を内皮型一酸化
窒素合成酵素とした。

【００２８】酵素液濃度および酵素反応液の組成酵素濃度は、下記の酵素反応液を用いる酵素反応により
１００ｐｐｂのＮＯ₂が生成する量とした。［酵素反応液の組成］５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）１ｍＭＮＡＤＰＨ６μＭＬ−Ａｒｇ１ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）０．１ｍＭ（６Ｒ）−ＢＨ₄ １μＭＦＡＤ１ｍＭＦＡＤ１ｍＭＣａＣｌ₂ １７μＭ検体化合物０．３μＭカルモジュリンそして、自動アッセイ装置（ベックマン社製，バイオメ
ック（Biomek）１０００）の第１のロボットシステム
（バイオメックス１０００）により、ケース内の８連の
ポリプロピレン製反応容器（容量１．５ｍｌ）に、ピペ
ッティング操作によりそれぞれ検体化合物５μｌおよび
酵素液１００μｌ、酵素反応液１９５μｌを注入し、吸
引排出により撹拌する操作を順次行ない、別のケース内
の８連のガラス製反応容器（容量０．２５ｍｌ）に移送
し、第２のロボットシステム（サイドローダー（Side L
oader））により前記ケースを自動開閉ドア付きの恒温
槽に移送し、酵素反応を３７℃で３０分間反応させた。
反応終了後、第２のロボットシステム（サイドローダ
ー）により前記ケースを恒温槽から取出し、急速に氷冷
することにより酵素反応を停止させ、フローインジェク
ション分析装置の自動サンプリング部位に移送し、自動
的にサンプリングして定量分析した。なお、サンプリン
グするまで、反応容器はフローインジェクション分析装
置の恒温槽で０℃に保った。このような操作は前記ロボ
ットシステムにより自動的に連続して繰り返した。

【００２９】前記フローインジェクション分析装置は、
５ｍＭＴＢＡ（テトラブチルアンモニウムホスフェー
ト）を１ｍｌ／分の速度でラインに流すための送液ポン
プ（日立製作所（株）製，Ｌ−６３００）、反応容器か
ら反応混合液５０μｌを１．８分間隔で自動的に順次サ
ンプリングして前記ラインに注入するためのオートサン
プラー（日立製作所（株）製，ＡＳ−４０００）、補酵
素をトラップするためのトラップカラム（野村化学
（株）製，Develosil ODS-UG-5, ４．６ｍｍφ×３０ｍ
ｍ）、１％スルファニル酸／２Ｎ塩酸溶液を前記ライン
へ０．３ｍｌ／分の速度で供給するための試薬ポンプ
（島津製作所（株）製，ＬＣ−１０Ａｉ）、１％Ｎ−１
−ナフチルエチレンジアミンを前記ラインへ０．３ｍｌ
／分の速度で供給するための試薬ポンプ（島津製作所
（株）製，ＬＣ−１０ＡＤ）、反応により生成したジア
ゾ化合物を検出するための検出機（日立製作所（株）
製，Ｌ−４２５０，検出波長５４８ｎｍ）、インテグレ
ータ（日立製作所（株）製，Ｄ−２５００）およびイン
テグレータからのデータを記録するための記録計を備え
ている。

【００３０】前記フローインジェクション分析装置によ
り反応容器から自動的にサンプリングして吸光度を測定
する操作を繰り返し、１日当たり７２０個の検体化合物
について酵素活性の阻害の程度を測定した。なお、コン
トロール、酵素による一酸化窒素合成を阻害する化合物
（ポジティブコントロールとしてのモノメチルアルギニ
ン）についてそれぞれ２４検体を分析し、繰り返し精度
を測定したところ。コントロールの変動係数（ＣＶ）は
３．９％、ポジティブコントロールの変動係数（ＣＶ）
は４．１％であり、高い精度および再現性で反応生成物
を検出できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素活性測定装置の構成の一例を示す
概略平面図である。

【図２】図２は図１のロボットシステムを構成する第１
のロボットを示す概略斜視図である。

【図３】図３は図１のロボットシステムを構成する第２
のロボットを示す概略斜視図である。

【図４】図４は反応槽としてのインキューベータを示す
概略図である。

【図５】図５はフローインジェクションシステムを示す
フロー図である。

【符号の説明】

１…第１のロボット２１…第２のロボット３１…インキュベータ５１…フローインジェクションシステム

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素および検体化合物を反応容器に注入
する注入操作、反応容器を反応槽へ自動的に移送する移
送操作、および反応槽から反応容器を取り出し、反応を
停止させるための反応停止操作を順次自動的に行うロボ
ットシステムと、反応容器内の反応混合液を自動的にサ
ンプリングし、酵素活性を測定するためのフローインジ
ェクションシステムとを備えている酵素活性測定装置。
【請求項２】ロボットシステムが、反応停止操作の
後、反応容器をフローインジェクションシステムの自動
サンプリング部位に移送する移送操作を行なう請求項１
記載の酵素活性測定装置。
【請求項３】複数の反応容器に酵素液と、検体化合物
および補酵素を含む反応液を順次注入する注入操作、イ
ンキュベータの扉を自動的に開かせ、複数の反応容器を
インキュベータ内へ自動的に収容して扉を閉じる移送操
作、所定時間経過後にインキュベータの扉を自動的に開
かせ、インキュベータ内の複数の反応容器を取出して扉
を閉じる移送操作、反応停止部位において複数の反応容
器を冷却して反応を停止させるための反応停止操作、複
数の反応容器をフローインジェクションシステムの自動
サンプリング部位に移送する移送操作で構成された一連
の操作を順次自動的に行うロボットシステムと、反応混
合液を複数の反応容器から所定の間隔で順次自動的にサ
ンプリングし、反応生成物を検出するフローインジェク
ションシステムとを備えている請求項１記載の酵素活性
測定装置。
【請求項４】酵素が一酸化窒素合成酵素であり、酵素
反応により生成するＮＯ₂と芳香族化合物との反応によ
り生じるジアゾ化合物を還元し、色素を生成させ、生成
した色素の吸光度を測定するためのフローインジェクシ
ョンシステムを備えている請求項１記載の酵素活性測定
装置。
【請求項５】酵素および検体化合物を反応容器に注入
し、反応容器をインキュベートした後、反応を停止させ
る操作をロボットシステムにより自動的に行ない、反応
容器内の反応混合液を自動的にサンプリングしてフロー
インジェクションシステムに供する、酵素活性阻害物質
のスクリーニング方法。