JPH099961A - 組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ - Google Patents
組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼInfo
- Publication number
- JPH099961A JPH099961A JP7308590A JP30859095A JPH099961A JP H099961 A JPH099961 A JP H099961A JP 7308590 A JP7308590 A JP 7308590A JP 30859095 A JP30859095 A JP 30859095A JP H099961 A JPH099961 A JP H099961A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- val
- gly
- ser
- thr
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ Cpro-2 に特
異的なプロテア−ゼ活性を示す組換え型Ｃ型肝炎ウイル
スプロテア−ゼの提供。 【解決手段】 ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 のペプチド
鎖を表わす Ala1026〜 Pro1216 のアミノ酸配列（III）
〔配列番号：３〕に部分アミノ酸配列として含まれてい
る、アミノ酸配列（Ｉ）〔配列番号：１〕で示される V
al1061 〜Val1197 までのアミノ酸配列で表されるペプ
チド鎖をプロテア−ゼ活性領域として含むポリペプチド
からなる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ。 【効果】 ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 に特異的なプロ
テア−ゼ活性を示し、且つ不容なペプチド鎖を含まず、
形質転換微生物を用いて、不溶化、不活性化することな
く大量に生産することができる。
異的なプロテア−ゼ活性を示す組換え型Ｃ型肝炎ウイル
スプロテア−ゼの提供。 【解決手段】 ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 のペプチド
鎖を表わす Ala1026〜 Pro1216 のアミノ酸配列（III）
〔配列番号：３〕に部分アミノ酸配列として含まれてい
る、アミノ酸配列（Ｉ）〔配列番号：１〕で示される V
al1061 〜Val1197 までのアミノ酸配列で表されるペプ
チド鎖をプロテア−ゼ活性領域として含むポリペプチド
からなる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ。 【効果】 ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 に特異的なプロ
テア−ゼ活性を示し、且つ不容なペプチド鎖を含まず、
形質転換微生物を用いて、不溶化、不活性化することな
く大量に生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え型Ｃ型肝炎
ウイルスプロテア−ゼに関し、特には、Ｃ型肝炎ウイル
ス由来のセリンプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペ
プチド鎖をドメイン構造として有する組換え型Ｃ型肝炎
ウイルスプロテア−ゼに関する。
ウイルスプロテア−ゼに関し、特には、Ｃ型肝炎ウイル
ス由来のセリンプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペ
プチド鎖をドメイン構造として有する組換え型Ｃ型肝炎
ウイルスプロテア−ゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の発症に関与するウ
イルスは、種々の医療機関、研究機関で探索され、その
主なウイルスがＣ型肝炎ウイルスと類別されるものであ
ることが明らかになっている。血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（以降、ＨＣ
Ｖと略称する。）は、高頻度に肝炎の慢性化を引き起こ
し、また肝癌に進行させると報告されており（M. Sakam
oto et al, Cancer Res.48, 7294-7297 (1988) などを
参照）、既に、該ＨＣＶの遺伝情報は、約１０ kb の＋
鎖のＲＮＡであり、フラビウイルスやペスチウイルスな
どの近縁性を示すことが明らかになっている（Q.-L. Ch
oo et al, Science 244, 359-362 (1989)、或いは R.H.
Miller & R.H. Purcell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 2057-2061 (1990) などを参照）。種々の機関によ
る、多数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者に由来するＨＣＶウイル
スゲノムの単離と、その塩基配列の解析結果を比較する
と、先に米国 Chiron 社が公表した米国患者に由来する
ＨＣＶのウイルスゲノム（ＰＣＴ出願第 WO89/046699
号国際公開公報などを参照）と、日本の患者に由来する
ＨＣＶのウイルスゲノムとでは、幾つかの違いが、塩基
配列並びに対応するアミノ酸配列に存在することが報告
され(N. Kato et al, Mol. Biol. Med. 7, 495-501 (19
90) 或いは N. Kato et al, Pro. Natl. Acad. Sci. US
A 87, 9524-9528 (1990) など参照）、米国患者に由来
するＨＣＶ-ＵＳ型と日本の患者に由来するＨＣＶ-Ｊ型
と識別されている。
イルスは、種々の医療機関、研究機関で探索され、その
主なウイルスがＣ型肝炎ウイルスと類別されるものであ
ることが明らかになっている。血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（以降、ＨＣ
Ｖと略称する。）は、高頻度に肝炎の慢性化を引き起こ
し、また肝癌に進行させると報告されており（M. Sakam
oto et al, Cancer Res.48, 7294-7297 (1988) などを
参照）、既に、該ＨＣＶの遺伝情報は、約１０ kb の＋
鎖のＲＮＡであり、フラビウイルスやペスチウイルスな
どの近縁性を示すことが明らかになっている（Q.-L. Ch
oo et al, Science 244, 359-362 (1989)、或いは R.H.
Miller & R.H. Purcell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 2057-2061 (1990) などを参照）。種々の機関によ
る、多数の非Ａ非Ｂ型肝炎患者に由来するＨＣＶウイル
スゲノムの単離と、その塩基配列の解析結果を比較する
と、先に米国 Chiron 社が公表した米国患者に由来する
ＨＣＶのウイルスゲノム（ＰＣＴ出願第 WO89/046699
号国際公開公報などを参照）と、日本の患者に由来する
ＨＣＶのウイルスゲノムとでは、幾つかの違いが、塩基
配列並びに対応するアミノ酸配列に存在することが報告
され(N. Kato et al, Mol. Biol. Med. 7, 495-501 (19
90) 或いは N. Kato et al, Pro. Natl. Acad. Sci. US
A 87, 9524-9528 (1990) など参照）、米国患者に由来
するＨＣＶ-ＵＳ型と日本の患者に由来するＨＣＶ-Ｊ型
と識別されている。
【０００３】ＨＣＶウイルスゲノムの解析から、該ゲノ
ムから産出されるポリプロテインは、宿主細胞性のシグ
ナルペプチタ−ゼ及びＨＣＶウイルスゲノムにコ−ドさ
れているプロテア−ゼによりプロセスされ、遺伝子産物
のタンパク質となると報告されている。特に、ＨＣＶウ
イルスの宿主細胞内での構成に必要と予測される、該Ｈ
ＣＶウイルスゲノムの非構造遺伝子領域にコ−ドされる
ＲＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡヘリカ−ゼ、プロテア−ゼ
などは、ＨＣＶウイルス由来のプロテア−ゼにより切断
を受けて、個々の酵素タンパク質となると報告されてい
る（下遠野ら、蛋白質 核酸 酵素 36， 1679-1691 (199
1) などを参照）。なお、ＨＣＶウイルスゲノムの翻訳
産物として、非構造遺伝子領域には２種類のプロテア−
ゼが存在し、一つはメタロプロテア−ゼ型の Cpro-1 と
称されるものであり、他の一つはセリンプロテア−ゼ型
の Cpro-2 と称されるものである。後者のセリンプロテ
ア−ゼ型の Cpro-2 が上記する酵素タンパク質のプロセ
スに関与し、前者のメタロプロテア−ゼ型の Cpro-1
は、 Cpro-2 の存在する非構造遺伝子領域の p70 域と
そのＮ末端に存在する p20 域との間の切断に関与する
ことが報告されている(M. Hijikata et al, J. Virol.
67, 4665-4675 (1993)、或いは M.R. Eckart etal, Bio
chem. Res. Commun. 192, 399-406 (1993) などを参
照)。なお、p70 蛋白質に含まれる上記の Cpro-2 部分
に相当するアミノ酸配列は、ＨＣＶの個々の株間での相
同性は極めて高く、その切断するアミノ酸配列は同じで
あると報告されている(A. Takamizawa et al., J. Viro
l. 65, 1105-1113 (1991) などを参照)。
ムから産出されるポリプロテインは、宿主細胞性のシグ
ナルペプチタ−ゼ及びＨＣＶウイルスゲノムにコ−ドさ
れているプロテア−ゼによりプロセスされ、遺伝子産物
のタンパク質となると報告されている。特に、ＨＣＶウ
イルスの宿主細胞内での構成に必要と予測される、該Ｈ
ＣＶウイルスゲノムの非構造遺伝子領域にコ−ドされる
ＲＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡヘリカ−ゼ、プロテア−ゼ
などは、ＨＣＶウイルス由来のプロテア−ゼにより切断
を受けて、個々の酵素タンパク質となると報告されてい
る（下遠野ら、蛋白質 核酸 酵素 36， 1679-1691 (199
1) などを参照）。なお、ＨＣＶウイルスゲノムの翻訳
産物として、非構造遺伝子領域には２種類のプロテア−
ゼが存在し、一つはメタロプロテア−ゼ型の Cpro-1 と
称されるものであり、他の一つはセリンプロテア−ゼ型
の Cpro-2 と称されるものである。後者のセリンプロテ
ア−ゼ型の Cpro-2 が上記する酵素タンパク質のプロセ
スに関与し、前者のメタロプロテア−ゼ型の Cpro-1
は、 Cpro-2 の存在する非構造遺伝子領域の p70 域と
そのＮ末端に存在する p20 域との間の切断に関与する
ことが報告されている(M. Hijikata et al, J. Virol.
67, 4665-4675 (1993)、或いは M.R. Eckart etal, Bio
chem. Res. Commun. 192, 399-406 (1993) などを参
照)。なお、p70 蛋白質に含まれる上記の Cpro-2 部分
に相当するアミノ酸配列は、ＨＣＶの個々の株間での相
同性は極めて高く、その切断するアミノ酸配列は同じで
あると報告されている(A. Takamizawa et al., J. Viro
l. 65, 1105-1113 (1991) などを参照)。
【０００４】該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2 と称さ
れるＣ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ（以降、ＨＣＶプロ
テア−ゼと略称する。）は、宿主細胞内におけるＨＣＶ
の複製増殖に不可欠なＲＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡヘリ
カ−ゼなどの酵素タンパク質の酵素活性発現に必要であ
るので、この Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を阻害するこ
とにより、ＨＣＶのウイルス粒子複製増殖を抑制するこ
とができる。即ち、ＨＣＶのウイルス粒子複製増殖を抑
制することに伴い、Ｃ型肝炎の慢性化を防止することが
可能と予測されている。かかるＣ型肝炎の慢性化を防止
し、薬物治療に用いる目的で、該セリンプロテア−ゼ型
の Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を阻害する物質、即ちＣ
型肝炎ウイルスプロテア−ゼ阻害剤の開発が待望されて
いる。
れるＣ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ（以降、ＨＣＶプロ
テア−ゼと略称する。）は、宿主細胞内におけるＨＣＶ
の複製増殖に不可欠なＲＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡヘリ
カ−ゼなどの酵素タンパク質の酵素活性発現に必要であ
るので、この Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を阻害するこ
とにより、ＨＣＶのウイルス粒子複製増殖を抑制するこ
とができる。即ち、ＨＣＶのウイルス粒子複製増殖を抑
制することに伴い、Ｃ型肝炎の慢性化を防止することが
可能と予測されている。かかるＣ型肝炎の慢性化を防止
し、薬物治療に用いる目的で、該セリンプロテア−ゼ型
の Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を阻害する物質、即ちＣ
型肝炎ウイルスプロテア−ゼ阻害剤の開発が待望されて
いる。
【０００５】Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ阻害剤の開
発に際しては、プロテア−ゼ活性阻害能を評価すること
が不可欠である。しかしながら、天然のＨＣＶプロテア
−ゼCpro-2 は、宿主細胞内で前記するポリペプチド p7
0 として産出されるものであり大量に入手することが困
難であるので、該ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 と等価な
プロテア−ゼ活性を有する組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプ
ロテア−ゼ、及び該組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア
−ゼを遺伝子工学的な手法により、形質転換微生物を用
いて生産する方法の開発が急がれていた。特には、基質
蛋白質（ペプチド）と拮抗してプロテア−ゼ活性を阻害
するプロテア−ゼインヒビタ−の探索に適する、該ＨＣ
Ｖプロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮する
に必須なアミノ酸配列部分のペプチド鎖を保持し、且つ
遺伝子組換えによる形質転換微生物による生産性を高く
できる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼの開発が
望まれている。
発に際しては、プロテア−ゼ活性阻害能を評価すること
が不可欠である。しかしながら、天然のＨＣＶプロテア
−ゼCpro-2 は、宿主細胞内で前記するポリペプチド p7
0 として産出されるものであり大量に入手することが困
難であるので、該ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 と等価な
プロテア−ゼ活性を有する組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプ
ロテア−ゼ、及び該組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア
−ゼを遺伝子工学的な手法により、形質転換微生物を用
いて生産する方法の開発が急がれていた。特には、基質
蛋白質（ペプチド）と拮抗してプロテア−ゼ活性を阻害
するプロテア−ゼインヒビタ−の探索に適する、該ＨＣ
Ｖプロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮する
に必須なアミノ酸配列部分のペプチド鎖を保持し、且つ
遺伝子組換えによる形質転換微生物による生産性を高く
できる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼの開発が
望まれている。
【０００６】加えて、該ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の
プロテア−ゼ活性は、切断アミノ酸配列の特異性を示す
ので、かかる特異性を利用するエンドペプチダ−ゼとし
ての応用を考慮し、上記する Cpro-2 のプロテア−ゼ活
性を発揮するに必須なアミノ酸配列部分を保存し、残余
のペプチド鎖のアミノ酸配列を種々に人為的な変異、置
換えた組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ開発の要
望も高い。
プロテア−ゼ活性は、切断アミノ酸配列の特異性を示す
ので、かかる特異性を利用するエンドペプチダ−ゼとし
ての応用を考慮し、上記する Cpro-2 のプロテア−ゼ活
性を発揮するに必須なアミノ酸配列部分を保存し、残余
のペプチド鎖のアミノ酸配列を種々に人為的な変異、置
換えた組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ開発の要
望も高い。
【０００７】これらの要望に沿うべく、また該ＨＣＶプ
ロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性の機構、反応部
位の決定を目的とし、該 Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を
発揮するに必須なアミノ酸配列部分の特定を目指す予備
的な研究がなされ、得られた知見が幾つか報告されてい
る。ＨＣＶウイルスゲノムのゲノムから翻訳されるポリ
プロテインのＮ末より表記するアミノ酸配列上、非構造
遺伝子領域のＮＳ３（p70 ）部分のＮ末領域、具体的に
は Ala1027 〜 Ser1207 部分（J. Viorogy, 68, 8147-8
157 (1994) を参照）、或いは Gly1049 〜 Ser1215 部
分(Gene, 145,215-219 (1994) 、特開平６−３１５３７
７号公報を参照)、これら部分のみでプロテア−ゼ活性
があることが報告されている。即ち、 Gly1049 〜 Ser
1207 部分に、プロテア−ゼ活性を発揮するに必須なア
ミノ酸配列が内在されることは、既に判明しているが、
必須なアミノ酸配列の特定には到っていない。
ロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性の機構、反応部
位の決定を目的とし、該 Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を
発揮するに必須なアミノ酸配列部分の特定を目指す予備
的な研究がなされ、得られた知見が幾つか報告されてい
る。ＨＣＶウイルスゲノムのゲノムから翻訳されるポリ
プロテインのＮ末より表記するアミノ酸配列上、非構造
遺伝子領域のＮＳ３（p70 ）部分のＮ末領域、具体的に
は Ala1027 〜 Ser1207 部分（J. Viorogy, 68, 8147-8
157 (1994) を参照）、或いは Gly1049 〜 Ser1215 部
分(Gene, 145,215-219 (1994) 、特開平６−３１５３７
７号公報を参照)、これら部分のみでプロテア−ゼ活性
があることが報告されている。即ち、 Gly1049 〜 Ser
1207 部分に、プロテア−ゼ活性を発揮するに必須なア
ミノ酸配列が内在されることは、既に判明しているが、
必須なアミノ酸配列の特定には到っていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記する課
題を解決するものである。本発明が解決しようとする課
題、その目的は、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2 の
プロテア−ゼ活性を示す組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼ、特には、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2
のプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖をド
メイン構造として有する組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼを提供することにある。更には、該組換え型Ｃ
型肝炎ウイルスプロテア−ゼを、遺伝子組換え技術によ
り形質転換して得られる形質転換微生物を用いて生産す
る方法を提供することにある。
題を解決するものである。本発明が解決しようとする課
題、その目的は、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2 の
プロテア−ゼ活性を示す組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼ、特には、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2
のプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖をド
メイン構造として有する組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼを提供することにある。更には、該組換え型Ｃ
型肝炎ウイルスプロテア−ゼを、遺伝子組換え技術によ
り形質転換して得られる形質転換微生物を用いて生産す
る方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＣＶウ
イルス、例えばＨＣＶ-Ｊ型ウイルスの産出する p70ポ
リペプチドに存在する該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-
2 のプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖を
特定するべく、該 p70 ポリペプチドＮ末領域、即ち Al
a1027 〜 Pro1216 部分に相当する１９０アミノ酸残基
のペプチドを基に、そのＣ末端並びにＮ末端より種々の
ペプチド長を欠失した変異体ペプチドを多数採取し、こ
れら欠失変異体ペプチドが、該セリンプロテア−ゼ型の
Cpro-2に特異的なプロテア−ゼ活性を示すか否かを検
討した。本発明者らは、かかる検討の結果、該セリンプ
ロテア−ゼ型の Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮する
に必須なペプチド鎖のアミノ酸配列を特定して、本発明
を完成するに至った。
イルス、例えばＨＣＶ-Ｊ型ウイルスの産出する p70ポ
リペプチドに存在する該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-
2 のプロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖を
特定するべく、該 p70 ポリペプチドＮ末領域、即ち Al
a1027 〜 Pro1216 部分に相当する１９０アミノ酸残基
のペプチドを基に、そのＣ末端並びにＮ末端より種々の
ペプチド長を欠失した変異体ペプチドを多数採取し、こ
れら欠失変異体ペプチドが、該セリンプロテア−ゼ型の
Cpro-2に特異的なプロテア−ゼ活性を示すか否かを検
討した。本発明者らは、かかる検討の結果、該セリンプ
ロテア−ゼ型の Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮する
に必須なペプチド鎖のアミノ酸配列を特定して、本発明
を完成するに至った。
【００１０】本発明の組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテ
ア−ゼは、上記する該セリンプロテア−ゼ型のＨＣＶプ
ロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮するに必
須なペプチド鎖のアミノ酸配列を内在するポリペプチド
である。即ち、下記するアミノ酸配列（Ｉ）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 （配列中、 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。） で表されるペプチド鎖をプロテア−ゼ活性領域として含
むポリペプチドからなる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼである。
ア−ゼは、上記する該セリンプロテア−ゼ型のＨＣＶプ
ロテア−ゼ Cpro-2 のプロテア−ゼ活性を発揮するに必
須なペプチド鎖のアミノ酸配列を内在するポリペプチド
である。即ち、下記するアミノ酸配列（Ｉ）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 （配列中、 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。） で表されるペプチド鎖をプロテア−ゼ活性領域として含
むポリペプチドからなる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼである。
【００１１】また、本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−
ゼは、特には、上記アミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプ
チド鎖が、下記するアミノ酸配列（II）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 40 45 50 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 で表されるペプチド鎖として含まれてなるポリペプチド
からなる組換え型蛋白質である。
ゼは、特には、上記アミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプ
チド鎖が、下記するアミノ酸配列（II）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 40 45 50 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 で表されるペプチド鎖として含まれてなるポリペプチド
からなる組換え型蛋白質である。
【００１２】更には、本発明の組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼは、下記するアミノ酸配列（III）： (Met) Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly X04 Ile Ile Thr Ser 10 15 20 Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr 175 180 185 Asp Asn Ser Ser Pro *** 190 （配列中、 存在位置： 16 X04 は、 Cys , Thr 又は Ala を示
す。 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。） で表される配列中、アミノ酸の存在位置ｎ1及びアミノ
酸の存在位置ｎ2、（但し、ｎ1、ｎ2は、正の整数であ
り、１≦ｎ1＜ｎ2≦１９０である。）を両端とする部分
アミノ酸配列で表わされ、ｎ1＝２３且つ１７２≦ｎ2≦
１８０、２４≦ｎ1≦３５且つｎ2＝１８１、又は２４≦
ｎ1≦３５且つ１７２≦ｎ2≦１８０の何れかを満たすペ
プチド鎖を、上記するプロテア−ゼ活性領域として含ん
でなるポリペプチドの構成とするとよい。
−ゼは、下記するアミノ酸配列（III）： (Met) Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly X04 Ile Ile Thr Ser 10 15 20 Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr 175 180 185 Asp Asn Ser Ser Pro *** 190 （配列中、 存在位置： 16 X04 は、 Cys , Thr 又は Ala を示
す。 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。） で表される配列中、アミノ酸の存在位置ｎ1及びアミノ
酸の存在位置ｎ2、（但し、ｎ1、ｎ2は、正の整数であ
り、１≦ｎ1＜ｎ2≦１９０である。）を両端とする部分
アミノ酸配列で表わされ、ｎ1＝２３且つ１７２≦ｎ2≦
１８０、２４≦ｎ1≦３５且つｎ2＝１８１、又は２４≦
ｎ1≦３５且つ１７２≦ｎ2≦１８０の何れかを満たすペ
プチド鎖を、上記するプロテア−ゼ活性領域として含ん
でなるポリペプチドの構成とするとよい。
【００１３】加えて、本発明の組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼは、プロテア−ゼ活性領域となる上記するアミノ酸
配列（Ｉ）で表されるペプチド鎖を、非Ｃ型肝炎ウイル
ス由来の蛋白質のペプチド鎖のＣ末に連結してなるポリ
ペプチドである組換え型蛋白質としてもよい。即ち、上
記するアミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプチド鎖を含ん
でなる蛋白質（ドメイン）を、異種の蛋白質（ドメイ
ン）のＣ末に連結した融合蛋白質としてもよい。
−ゼは、プロテア−ゼ活性領域となる上記するアミノ酸
配列（Ｉ）で表されるペプチド鎖を、非Ｃ型肝炎ウイル
ス由来の蛋白質のペプチド鎖のＣ末に連結してなるポリ
ペプチドである組換え型蛋白質としてもよい。即ち、上
記するアミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプチド鎖を含ん
でなる蛋白質（ドメイン）を、異種の蛋白質（ドメイ
ン）のＣ末に連結した融合蛋白質としてもよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼにおいて、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2 のプ
ロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖のアミノ
酸配列（Ｉ）〔配列番号：１を参照〕には、既に報告さ
れているキモトリプシン様セリンプロテア−ゼに特徴的
なアミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端から
1075〜 1185 番目まで : Val1074 〜 Thr1186 ）、よ
り具体的には His1083-X22-Val1104-X-X-Asp1107-X55-G
ly1163-X-Ser1165-Gly1166-X-Pro1168-X9-Gly1178 の配
列を内在する１１１のアミノ酸からなる部分が含まれて
いる。加えて、そのＣ末に Ile1179 〜( Thr1186 )〜 V
al1198 の部分、Ｎ末に Val1061 〜( Val1074 )〜 Tyr
1082の部分がともに存在するとき、即ち、少なくとも V
al1061 〜 Val1198 のペプチド鎖が保持されるとき、は
じめてＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す。また、これらの
Ｎ末及びＣ末に、Ｃ型肝炎ウイルス由来のアミノ酸配列
を残しても勿論よいが、例えば、Ｎ末に非Ｃ型肝炎ウイ
ルス由来の蛋白質のペプチド鎖が存在する融合蛋白質と
しても、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す。
−ゼにおいて、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2 のプ
ロテア−ゼ活性を発揮するに必須なペプチド鎖のアミノ
酸配列（Ｉ）〔配列番号：１を参照〕には、既に報告さ
れているキモトリプシン様セリンプロテア−ゼに特徴的
なアミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端から
1075〜 1185 番目まで : Val1074 〜 Thr1186 ）、よ
り具体的には His1083-X22-Val1104-X-X-Asp1107-X55-G
ly1163-X-Ser1165-Gly1166-X-Pro1168-X9-Gly1178 の配
列を内在する１１１のアミノ酸からなる部分が含まれて
いる。加えて、そのＣ末に Ile1179 〜( Thr1186 )〜 V
al1198 の部分、Ｎ末に Val1061 〜( Val1074 )〜 Tyr
1082の部分がともに存在するとき、即ち、少なくとも V
al1061 〜 Val1198 のペプチド鎖が保持されるとき、は
じめてＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す。また、これらの
Ｎ末及びＣ末に、Ｃ型肝炎ウイルス由来のアミノ酸配列
を残しても勿論よいが、例えば、Ｎ末に非Ｃ型肝炎ウイ
ルス由来の蛋白質のペプチド鎖が存在する融合蛋白質と
しても、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す。
【００１５】本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼは、
以下の手順に従い、該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼをコ
−ドするＤＮＡを含んでなる環状プラスミドベクタ−を
構築し、その環状プラスミドベクタ−を導入して形質転
換してなる該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの生産能を有
する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物を培養
して、その培養物より該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを
単離・採取することができる。
以下の手順に従い、該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼをコ
−ドするＤＮＡを含んでなる環状プラスミドベクタ−を
構築し、その環状プラスミドベクタ−を導入して形質転
換してなる該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの生産能を有
する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物を培養
して、その培養物より該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを
単離・採取することができる。
【００１６】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼをコ−ドす
るＤＮＡを含んでなる環状プラスミドベクタ−の構築、
及び該プラスミドベクタ−を導入した形質転換微生物の
調製〕 先ず、ウイルスゲノム上の非構造遺伝子領域に
位置する NS3 領域のＮ末端側ドメインに相当する、該
ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の領域、具体的には、Ala
1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からなるペプチ
ド鎖をコ−ドする DNAを、既に報告されているＨＣＶ-
Ｊ型のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) などを参照）
を参照して、化学的な合成方法により調製する。即ち、
ウイルスゲノム上、 Leu1026- Ala1027に、開始コドン
ATG (Met) を導入し、その上流に制限酵素 EcoR I 切断
部位を持ち、また、Pro1216- Pro1217に、終止コドン T
AA を導入し、その下流に制限酵素 Hind III 切断部位
を持つ DNA 断片、即ち、図１（配列番号：４を参照）
に示す DNA 断片を合成する。
るＤＮＡを含んでなる環状プラスミドベクタ−の構築、
及び該プラスミドベクタ−を導入した形質転換微生物の
調製〕 先ず、ウイルスゲノム上の非構造遺伝子領域に
位置する NS3 領域のＮ末端側ドメインに相当する、該
ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の領域、具体的には、Ala
1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からなるペプチ
ド鎖をコ−ドする DNAを、既に報告されているＨＣＶ-
Ｊ型のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) などを参照）
を参照して、化学的な合成方法により調製する。即ち、
ウイルスゲノム上、 Leu1026- Ala1027に、開始コドン
ATG (Met) を導入し、その上流に制限酵素 EcoR I 切断
部位を持ち、また、Pro1216- Pro1217に、終止コドン T
AA を導入し、その下流に制限酵素 Hind III 切断部位
を持つ DNA 断片、即ち、図１（配列番号：４を参照）
に示す DNA 断片を合成する。
【００１７】次いで、図２に示す DNA 断片、即ち、制
限酵素 Xmn I 切断部位と制限酵素 EcoR I 切断部位を
両端に有し、ＨＣＶプロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5
B）をコ−ドする合成リンカ−を調製する。市販されて
いる大腸菌由来マルト−ス結合蛋白質( MBP ; maltose-
binding protein ) の発現ベクタ− pMAL-c2 ( NEW ENG
LAND BIOLABS 製 ) の Xmn I - Hind III 部位に、先に
調製した両端に EcoR I- Hind III の切断部位を有する
DNA 断片を、前記の Xmn I - EcoR I 部位を両端とす
る DNA 断片である合成リンカ−を介して、連結挿入し
た、プラスミド pCPCS190 を一旦構築する。得られた A
la1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からなるペプ
チド鎖（以降、Cpro-2 1-190）をコ−ドする DNA を含
むプラスミド pCPCS190 を、大腸菌 ＨＢ１０１株 に導
入し形質転換して、得られる組み換え菌を培養して、該
プラスミド pCPCS190 を大量に調製する。なお、該プラ
スミド pCPCS190 は、その概要を図３に示すように、発
現ベクタ− pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（ P
tac ）とそれに続く MBP をコ−ドする遺伝子ＤＮＡ（
malE ）、その直後に、 Xmn I 切断部位で、図２に示す
合成リンカ−、次いで、 EcoR I 切断部位で、図１に示
す DNA 断片、その端は、 Hind III 部位で、発現ベク
タ− pMAL-c2 の残部に連結され環状構造となる。
限酵素 Xmn I 切断部位と制限酵素 EcoR I 切断部位を
両端に有し、ＨＣＶプロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5
B）をコ−ドする合成リンカ−を調製する。市販されて
いる大腸菌由来マルト−ス結合蛋白質( MBP ; maltose-
binding protein ) の発現ベクタ− pMAL-c2 ( NEW ENG
LAND BIOLABS 製 ) の Xmn I - Hind III 部位に、先に
調製した両端に EcoR I- Hind III の切断部位を有する
DNA 断片を、前記の Xmn I - EcoR I 部位を両端とす
る DNA 断片である合成リンカ−を介して、連結挿入し
た、プラスミド pCPCS190 を一旦構築する。得られた A
la1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からなるペプ
チド鎖（以降、Cpro-2 1-190）をコ−ドする DNA を含
むプラスミド pCPCS190 を、大腸菌 ＨＢ１０１株 に導
入し形質転換して、得られる組み換え菌を培養して、該
プラスミド pCPCS190 を大量に調製する。なお、該プラ
スミド pCPCS190 は、その概要を図３に示すように、発
現ベクタ− pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（ P
tac ）とそれに続く MBP をコ−ドする遺伝子ＤＮＡ（
malE ）、その直後に、 Xmn I 切断部位で、図２に示す
合成リンカ−、次いで、 EcoR I 切断部位で、図１に示
す DNA 断片、その端は、 Hind III 部位で、発現ベク
タ− pMAL-c2 の残部に連結され環状構造となる。
【００１８】次いで、このプラスミド pCPCS190 を鋳型
として、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド鎖のみをコ
−ドし、その上流端に、制限酵素 EcoR I 切断部位と開
始コドン ATG (Met) を、その下流端に、終止コドン TA
A と制限酵素 Hind III 切断部位をそれぞれ持つ DNA
断片を、ＰＣＲ法により増幅し、調製する。なお、該部
分ペプチド鎖は、上記するAla1027 をアミノ酸残基番号
１、Pro1216 をアミノ酸残基番号１９０とした時、Ｎ末
のアミノ酸残基番号ｎ1とＣ末のアミノ酸残基番号ｎ2と
により、Cpro-2ｎ1-ｎ2と表記する。
として、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド鎖のみをコ
−ドし、その上流端に、制限酵素 EcoR I 切断部位と開
始コドン ATG (Met) を、その下流端に、終止コドン TA
A と制限酵素 Hind III 切断部位をそれぞれ持つ DNA
断片を、ＰＣＲ法により増幅し、調製する。なお、該部
分ペプチド鎖は、上記するAla1027 をアミノ酸残基番号
１、Pro1216 をアミノ酸残基番号１９０とした時、Ｎ末
のアミノ酸残基番号ｎ1とＣ末のアミノ酸残基番号ｎ2と
により、Cpro-2ｎ1-ｎ2と表記する。
【００１９】この部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2）
を、大腸菌などの宿主細胞内において、大量に発現する
ことが可能な既知の蛋白質のＣ末に連結してなる融合蛋
白質を発現できるプラスミドベクタ−を、以下のように
構築する。例えば、融合蛋白質のＮ末端部分に、大腸菌
由来のマルト−ス結合蛋白質（以降、MBP と略称す
る。）を利用する場合には、 MBP 発現プラスミドベク
タ− pMAL-c2 を制限酵素 EcoR I と Hind III で切断
し(C.-d. Guan et al., Gene 67, 21-30 (1988) 、 C.
V. Maina et al., Gene 74, 365-373 (1988) などを参
照)、得られる MBP をコ−ドするDNA（mal E）を含むベ
クタ−断片を精製する。上の方法で調製した部分ペプチ
ド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2）をコ−ドし、制限酵素 EcoR I
と Hind III の切断端を持つ DNA 断片を、MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片と T4 DNAリガ−
ゼにより連結し、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 を
得る。得られるプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2は、 M
BP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを p
MAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ptac）の下流に
有し、またマ−カ−遺伝子として、pMAL-c2 に由来する
アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。
を、大腸菌などの宿主細胞内において、大量に発現する
ことが可能な既知の蛋白質のＣ末に連結してなる融合蛋
白質を発現できるプラスミドベクタ−を、以下のように
構築する。例えば、融合蛋白質のＮ末端部分に、大腸菌
由来のマルト−ス結合蛋白質（以降、MBP と略称す
る。）を利用する場合には、 MBP 発現プラスミドベク
タ− pMAL-c2 を制限酵素 EcoR I と Hind III で切断
し(C.-d. Guan et al., Gene 67, 21-30 (1988) 、 C.
V. Maina et al., Gene 74, 365-373 (1988) などを参
照)、得られる MBP をコ−ドするDNA（mal E）を含むベ
クタ−断片を精製する。上の方法で調製した部分ペプチ
ド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2）をコ−ドし、制限酵素 EcoR I
と Hind III の切断端を持つ DNA 断片を、MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片と T4 DNAリガ−
ゼにより連結し、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 を
得る。得られるプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2は、 M
BP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを p
MAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ptac）の下流に
有し、またマ−カ−遺伝子として、pMAL-c2 に由来する
アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。
【００２０】更には、MBP発現プラスミドベクタ− pMAL
-c2 を、制限酵素 Sca I で切断し、アルカリフォスフ
ァタ−ゼにより処理し、切断端を脱リン酸化する。他
方、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)を、該耐性遺伝
子を有するプラスミド pBR322を制限酵素 Ava I と Eco
R I とで切断し、得られる該テトラサイクリン耐性遺伝
子を含む約 1.2 kb 断片を、更にクレノ−処理により平
滑末端化を施し、採取する。この二つのDNA断片を、 T4
DNAリガ−ゼで連結し、テトラサイクリン耐性遺伝子(T
etr)を組み込んだMBP発現プラスミドベクタ− pMAL-Tet
を構築する。一方、先のプラスミドベクタ− pCP ｎ1-
ｎ2 を制限酵素 Hind III で切断し、クレノ−処理によ
り平滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I で更に切断
し、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)をコ−ドする DN
A 断片を調製する。また、プラスミドベクタ− pMAL-Te
t を制限酵素 Xba I で切断し、クレノ−処理により平
滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I で更に切断し、
ベクタ−断片を調製する。この二つの断片を連結するこ
とで、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T を構築する。
このプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T は、 MBP-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを pMAL-c2
に由来する tac プロモ−タ−（Ptac)の下流に有し、ま
たマ−カ−遺伝子として、 該プラスミドベクタ− pMAL
-Tet に由来するテトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)を
組み込んものとなる。
-c2 を、制限酵素 Sca I で切断し、アルカリフォスフ
ァタ−ゼにより処理し、切断端を脱リン酸化する。他
方、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)を、該耐性遺伝
子を有するプラスミド pBR322を制限酵素 Ava I と Eco
R I とで切断し、得られる該テトラサイクリン耐性遺伝
子を含む約 1.2 kb 断片を、更にクレノ−処理により平
滑末端化を施し、採取する。この二つのDNA断片を、 T4
DNAリガ−ゼで連結し、テトラサイクリン耐性遺伝子(T
etr)を組み込んだMBP発現プラスミドベクタ− pMAL-Tet
を構築する。一方、先のプラスミドベクタ− pCP ｎ1-
ｎ2 を制限酵素 Hind III で切断し、クレノ−処理によ
り平滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I で更に切断
し、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)をコ−ドする DN
A 断片を調製する。また、プラスミドベクタ− pMAL-Te
t を制限酵素 Xba I で切断し、クレノ−処理により平
滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I で更に切断し、
ベクタ−断片を調製する。この二つの断片を連結するこ
とで、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T を構築する。
このプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T は、 MBP-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを pMAL-c2
に由来する tac プロモ−タ−（Ptac)の下流に有し、ま
たマ−カ−遺伝子として、 該プラスミドベクタ− pMAL
-Tet に由来するテトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)を
組み込んものとなる。
【００２１】或いは、上記のプラスミドベクタ−pMAL-c
2 を制限酵素 Xmn I と Hind IIIで切断し、得られるMB
Pをコ−ドするＤＮＡ（mal E)を含むベクタ−断片を精
製する。このMBPをコ−ドするＤＮＡ（mal E)を含むベ
クタ−断片、上記する部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2)をコ−ドし、制限酵素 EcoR I と Hind III の切断
端を持つＤＮＡ断片、並びに合成リンカ−をT4 DNAリガ
−ゼにより連結し、プラスミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2
を得る。得られるプラスミドベクタ− pCPCSｎ1-ｎ2
は、上記するMBPのＣ末に、ＨＣＶプロテア−ゼの切断
配列（NS5A/NS5B)に対応する図２に示す部分配列（切断
配列；Cleavage Sequence CS)を介して、該部分ペプチ
ド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2) を連結した MBP-NS5A/5B-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2融合蛋白質をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由
来する tac プロモ−タ−（Ptac)の下流に有し、またマ
−カ−遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を
有するものとなる。
2 を制限酵素 Xmn I と Hind IIIで切断し、得られるMB
Pをコ−ドするＤＮＡ（mal E)を含むベクタ−断片を精
製する。このMBPをコ−ドするＤＮＡ（mal E)を含むベ
クタ−断片、上記する部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2)をコ−ドし、制限酵素 EcoR I と Hind III の切断
端を持つＤＮＡ断片、並びに合成リンカ−をT4 DNAリガ
−ゼにより連結し、プラスミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2
を得る。得られるプラスミドベクタ− pCPCSｎ1-ｎ2
は、上記するMBPのＣ末に、ＨＣＶプロテア−ゼの切断
配列（NS5A/NS5B)に対応する図２に示す部分配列（切断
配列；Cleavage Sequence CS)を介して、該部分ペプチ
ド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2) を連結した MBP-NS5A/5B-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2融合蛋白質をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由
来する tac プロモ−タ−（Ptac)の下流に有し、またマ
−カ−遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を
有するものとなる。
【００２２】これら融合蛋白質を発現できるプラスミド
ベクタ−を、それぞれ宿主の大腸菌ＨＢ１０１株 に導
入し、形質転換して、組み換え菌を得る。なお、組み換
え菌は、マ−カ−遺伝子として内在する、アンピシリン
耐性遺伝子(Ampr)又はテトラサイクリン耐性遺伝子(Tet
r)による薬剤耐性菌株として、選別することができる。
該組み換え菌を培養して、これらプラスミドベクタ−か
ら、 tac プロモ−タ−（Ptac)より、mRNAへの転写、融
合蛋白質への翻訳が行われ、目的とする融合蛋白質を生
産することができる。
ベクタ−を、それぞれ宿主の大腸菌ＨＢ１０１株 に導
入し、形質転換して、組み換え菌を得る。なお、組み換
え菌は、マ−カ−遺伝子として内在する、アンピシリン
耐性遺伝子(Ampr)又はテトラサイクリン耐性遺伝子(Tet
r)による薬剤耐性菌株として、選別することができる。
該組み換え菌を培養して、これらプラスミドベクタ−か
ら、 tac プロモ−タ−（Ptac)より、mRNAへの転写、融
合蛋白質への翻訳が行われ、目的とする融合蛋白質を生
産することができる。
【００２３】例えば、上記の大腸菌由来のマルト−ス結
合蛋白質のＣ末に、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)
を連結した融合蛋白質 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とすると
き、少なくとも、ｎ2≧１７２、ｎ1≦３５とすることに
より、該アミノ酸配列（II)〔配列番号：２を参照〕を
含むものとなり、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す、本発
明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとなる。また、上記の
大腸菌由来のマルト−ス結合蛋白質のＣ末に、ＨＣＶプ
ロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5B)に対応する図２に示
す部分配列を介して、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2)を連結した融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ
2 とするときにも、少なくとも、ｎ2≧１７２、ｎ1≦３
５とすることにより、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す、
本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとなる。なお、こ
の融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-2ｎ1-ｎ2 の場合、内
在している切断配列（NS5A/NS5B)が、自らのＨＣＶプロ
テア−ゼ活性を示す部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)
の作用のため、分子間的な酵素反応により細胞内で切断
を受け、Ｎ末のマルト−ス結合蛋白質の部分とＣ末の部
分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)に分割されることにな
る。
合蛋白質のＣ末に、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)
を連結した融合蛋白質 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とすると
き、少なくとも、ｎ2≧１７２、ｎ1≦３５とすることに
より、該アミノ酸配列（II)〔配列番号：２を参照〕を
含むものとなり、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す、本発
明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとなる。また、上記の
大腸菌由来のマルト−ス結合蛋白質のＣ末に、ＨＣＶプ
ロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5B)に対応する図２に示
す部分配列を介して、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2)を連結した融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ
2 とするときにも、少なくとも、ｎ2≧１７２、ｎ1≦３
５とすることにより、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す、
本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとなる。なお、こ
の融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-2ｎ1-ｎ2 の場合、内
在している切断配列（NS5A/NS5B)が、自らのＨＣＶプロ
テア−ゼ活性を示す部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)
の作用のため、分子間的な酵素反応により細胞内で切断
を受け、Ｎ末のマルト−ス結合蛋白質の部分とＣ末の部
分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)に分割されることにな
る。
【００２４】当該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に
用いるプラスミドベクタ−には、マ−カ−遺伝子とし
て、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン
耐性遺伝子(Tetr) 以外の薬剤耐性遺伝子を用いてもよ
い。なお、これら組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に
用いるプラスミドベクタ−に内在する、種々のマ−カ−
遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、当
該薬剤耐性を指標として形質転換して得られる組み換え
菌の選択を容易に行うことができる。
用いるプラスミドベクタ−には、マ−カ−遺伝子とし
て、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン
耐性遺伝子(Tetr) 以外の薬剤耐性遺伝子を用いてもよ
い。なお、これら組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に
用いるプラスミドベクタ−に内在する、種々のマ−カ−
遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、当
該薬剤耐性を指標として形質転換して得られる組み換え
菌の選択を容易に行うことができる。
【００２５】また、転写・翻訳を司るプロモ−タ−とし
て、 tac プロモ−タ−（Ptac)のみならず、宿主細胞に
おいて汎用公知のプロモ−タ−を用いても勿論よい。更
には、融合蛋白質として発現する際には、該融合蛋白質
を構成する公知の蛋白質を高効率で発現が可能な、固有
のプロモ−タ−領域、又は外来のプロモ−タ−領域を応
用して、転写・翻訳を行わせてもよい。加えて、発現ベ
クタ−を、大腸菌に導入して大量に調製したのち、該発
現ベクタ−を他の宿主に導入し、形質転換した微生物を
利用して、発現生産させてもよい。
て、 tac プロモ−タ−（Ptac)のみならず、宿主細胞に
おいて汎用公知のプロモ−タ−を用いても勿論よい。更
には、融合蛋白質として発現する際には、該融合蛋白質
を構成する公知の蛋白質を高効率で発現が可能な、固有
のプロモ−タ−領域、又は外来のプロモ−タ−領域を応
用して、転写・翻訳を行わせてもよい。加えて、発現ベ
クタ−を、大腸菌に導入して大量に調製したのち、該発
現ベクタ−を他の宿主に導入し、形質転換した微生物を
利用して、発現生産させてもよい。
【００２６】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現、分
取〕上述の手順で得られる、本発明の組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼの生産能を有する組み換え菌を培養して、そ
の培養物中から組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを単離・採
取することにより製造することができる。例えば、組み
換え菌の培養物から、集菌した後、細胞を破砕して得ら
れる上清をカラムにかけ、当該組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼを分離することができる。なお、例えば、融合蛋白
質 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 などでは、既知の蛋白質である
マルト−ス結合蛋白質 MBP の性質を利用して、アミロ
−スカラムにかけ、カラムに吸着させ単離し、次いでカ
ラムから溶出して回収することもできる。即ち、融合蛋
白質を構成する既知の蛋白質の性質を利用して、分離す
る方法を用いてもよい。
取〕上述の手順で得られる、本発明の組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼの生産能を有する組み換え菌を培養して、そ
の培養物中から組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを単離・採
取することにより製造することができる。例えば、組み
換え菌の培養物から、集菌した後、細胞を破砕して得ら
れる上清をカラムにかけ、当該組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼを分離することができる。なお、例えば、融合蛋白
質 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 などでは、既知の蛋白質である
マルト−ス結合蛋白質 MBP の性質を利用して、アミロ
−スカラムにかけ、カラムに吸着させ単離し、次いでカ
ラムから溶出して回収することもできる。即ち、融合蛋
白質を構成する既知の蛋白質の性質を利用して、分離す
る方法を用いてもよい。
【００２７】なお、分離回収した組換え型ＨＣＶプロテ
ア−ゼは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-
PAGE) 法で純度を確認するとともに、分子量の確認を行
い、同時に、それを構成する部分ペプチド鎖（Cpro-2
ｎ1-ｎ2)に対する抗体、或いは、融合蛋白質を構成する
既知の蛋白質に対する抗体をも併用して、ウエスタンブ
ロッティング法に基づき、同定確認できる。即ち、該融
合蛋白質を構成する既知の非Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋
白質、例えば、MBPに対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体な
どを用いたウエスタンブロット法により、該融合蛋白質
の発現を確認する。更には、例えば、組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼが、上記する融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2 である場合には、細胞内で切断を受けたＮ末
のマルト−ス結合蛋白質 MBP の部分とＣ末の部分ペプ
チド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)も得られるが、融合蛋白質 MB
P-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とこれら蛋白質断片を、Ｈ
ＣＶプロテア−ゼを含むペプチド NS3;p70 に対する抗
体、ウサギ抗 NS3 抗体などを用いたウエスタンブロッ
ティング法に基づき、同定確認し、更に、切断されたＣ
末の部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)のＮ末端のアミ
ノ酸配列分析を行い、内在している切断配列（NS5A/NS5
B)での、細胞内における切断を確かめることができる。
ア−ゼは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-
PAGE) 法で純度を確認するとともに、分子量の確認を行
い、同時に、それを構成する部分ペプチド鎖（Cpro-2
ｎ1-ｎ2)に対する抗体、或いは、融合蛋白質を構成する
既知の蛋白質に対する抗体をも併用して、ウエスタンブ
ロッティング法に基づき、同定確認できる。即ち、該融
合蛋白質を構成する既知の非Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋
白質、例えば、MBPに対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体な
どを用いたウエスタンブロット法により、該融合蛋白質
の発現を確認する。更には、例えば、組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼが、上記する融合蛋白質 MBP-NS5A/5B-Cpro-
2 ｎ1-ｎ2 である場合には、細胞内で切断を受けたＮ末
のマルト−ス結合蛋白質 MBP の部分とＣ末の部分ペプ
チド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)も得られるが、融合蛋白質 MB
P-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とこれら蛋白質断片を、Ｈ
ＣＶプロテア−ゼを含むペプチド NS3;p70 に対する抗
体、ウサギ抗 NS3 抗体などを用いたウエスタンブロッ
ティング法に基づき、同定確認し、更に、切断されたＣ
末の部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2)のＮ末端のアミ
ノ酸配列分析を行い、内在している切断配列（NS5A/NS5
B)での、細胞内における切断を確かめることができる。
【００２８】加えて、組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発
現は、その発現ベクタ−を構築に利用した公知のプラス
ミドに由来するプロモ−タ−、或いは、融合蛋白質を構
成する公知蛋白質の発現に用いられるプロモ−タ−領域
を応用して、転写・翻訳される。そのため、該組み換え
菌を培養する際、これらの転写・翻訳を促進する処理、
誘導物質の添加を行うことで、生産量を増すことができ
る。
現は、その発現ベクタ−を構築に利用した公知のプラス
ミドに由来するプロモ−タ−、或いは、融合蛋白質を構
成する公知蛋白質の発現に用いられるプロモ−タ−領域
を応用して、転写・翻訳される。そのため、該組み換え
菌を培養する際、これらの転写・翻訳を促進する処理、
誘導物質の添加を行うことで、生産量を増すことができ
る。
【００２９】具体的には、これら組換え型ＨＣＶプロテ
ア−ゼである融合蛋白質の発現に用いるプラスミドベク
タ−を導入し形質転換して、得られる組み換え菌を、例
えば、宿主菌である大腸菌 ＨＢ１０１株の増殖に適す
る培養条件、培地組成、培養温度で所定の期間培養す
る。当該組み換え菌の増殖が対数増殖期になる時点で、
当該プラスミドベクタ−からの転写を促進する、例え
ば、 pMAL-c2 に由来するtac プロモ−タ−（Ptac)によ
るMBPをコ−ドするDNA（mal E)の転写を促進するIPTG
などを所定濃度で培地に添加し、融合蛋白質の発現を誘
導する。得られる培養物から、例えば、当該組み換え菌
を集菌し、次いで破菌し、超遠心により、目的の組換え
型ＨＣＶプロテア−ゼである融合蛋白質を含む画分を分
離採取する。この粗酵素画分より、目的の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼである融合蛋白質の分子量、或いは、そ
れを構成する例えば、マルト−ス結合蛋白質に固有な活
性を利用して、アミロ−スカラムなどのカラム精製を施
し、目的の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼのみを単離する
ことができる。なお、精製単離した組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼは、例えば、20 mM Na-Pi, pH 7.2 などの溶媒
に溶解し、適量のグリセロ−ルなどを加えて、 -20 ℃
などの低温で、保存するとよい。
ア−ゼである融合蛋白質の発現に用いるプラスミドベク
タ−を導入し形質転換して、得られる組み換え菌を、例
えば、宿主菌である大腸菌 ＨＢ１０１株の増殖に適す
る培養条件、培地組成、培養温度で所定の期間培養す
る。当該組み換え菌の増殖が対数増殖期になる時点で、
当該プラスミドベクタ−からの転写を促進する、例え
ば、 pMAL-c2 に由来するtac プロモ−タ−（Ptac)によ
るMBPをコ−ドするDNA（mal E)の転写を促進するIPTG
などを所定濃度で培地に添加し、融合蛋白質の発現を誘
導する。得られる培養物から、例えば、当該組み換え菌
を集菌し、次いで破菌し、超遠心により、目的の組換え
型ＨＣＶプロテア−ゼである融合蛋白質を含む画分を分
離採取する。この粗酵素画分より、目的の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼである融合蛋白質の分子量、或いは、そ
れを構成する例えば、マルト−ス結合蛋白質に固有な活
性を利用して、アミロ−スカラムなどのカラム精製を施
し、目的の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼのみを単離する
ことができる。なお、精製単離した組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼは、例えば、20 mM Na-Pi, pH 7.2 などの溶媒
に溶解し、適量のグリセロ−ルなどを加えて、 -20 ℃
などの低温で、保存するとよい。
【００３０】本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを特
徴付ける部分ペプチド鎖（Cpro-2ｎ1-ｎ2)は、他の研究
者らによる既に報告された研究結果を統一的に解釈する
ことで、プロテア−ゼ活性を発揮するに必須なアミノ酸
配列が内在されることが判明している Gly1049 〜 Ser
1207 部分、即ち、部分ペプチド鎖 Cpro-2 23-181に対
して、それよりも短いものである。換言するならば、本
発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを特徴付ける部分ペ
プチド鎖は、本発明者らの表記を用いるとき、Cpro-2 2
3-ｎ2、但し 180 ≧ｎ2≧ 172 、 Cpro-2 ｎ1-181、但
し 35 ≧ｎ1≧24 、又は Cpro-2 ｎ1-ｎ2、但し 35 ≧
ｎ1≧ 24 且つ 180 ≧ｎ2≧ 172 の３種に大別されるも
のを、その範囲に含んでいる。加えて、 Cpro-2 ｎ1-17
2、但し23 ≧ｎ1≧ 1 、又は Cpro-2 35-ｎ2、但し 190
≧ｎ2≧ 182 の２種に大別されるものは、従来の知見
よりは、例えば、特開平６−３１５３７７号公報におい
てプロテア−ゼ活性を発揮するに必要最小限とされる部
分ペプチド鎖 Gly1049 〜Ser1215 、即ち Cpro-2 23-18
9 の一部を欠如しており、プロテア−ゼ活性が発揮され
得ないと予測されていた。本発明は、この２種に大別さ
れるものをも、その範囲に含むものである。
徴付ける部分ペプチド鎖（Cpro-2ｎ1-ｎ2)は、他の研究
者らによる既に報告された研究結果を統一的に解釈する
ことで、プロテア−ゼ活性を発揮するに必須なアミノ酸
配列が内在されることが判明している Gly1049 〜 Ser
1207 部分、即ち、部分ペプチド鎖 Cpro-2 23-181に対
して、それよりも短いものである。換言するならば、本
発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを特徴付ける部分ペ
プチド鎖は、本発明者らの表記を用いるとき、Cpro-2 2
3-ｎ2、但し 180 ≧ｎ2≧ 172 、 Cpro-2 ｎ1-181、但
し 35 ≧ｎ1≧24 、又は Cpro-2 ｎ1-ｎ2、但し 35 ≧
ｎ1≧ 24 且つ 180 ≧ｎ2≧ 172 の３種に大別されるも
のを、その範囲に含んでいる。加えて、 Cpro-2 ｎ1-17
2、但し23 ≧ｎ1≧ 1 、又は Cpro-2 35-ｎ2、但し 190
≧ｎ2≧ 182 の２種に大別されるものは、従来の知見
よりは、例えば、特開平６−３１５３７７号公報におい
てプロテア−ゼ活性を発揮するに必要最小限とされる部
分ペプチド鎖 Gly1049 〜Ser1215 、即ち Cpro-2 23-18
9 の一部を欠如しており、プロテア−ゼ活性が発揮され
得ないと予測されていた。本発明は、この２種に大別さ
れるものをも、その範囲に含むものである。
【００３１】本発明者らが、主に参照したＨＣＶ-Ｊ型
のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) などを参照）だけ
でなく、日本人由来のＨＣＶ-ＢＫ型のゲノム核酸配列
（ A. Takamizawa et al., J.Virology 65, 1105-1113
(1990) を参照）、及び米国由来のＨＣＶ-ＵＳ型のゲノ
ム核酸配列（ Q.-L. Choo et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991)、 J. H. Han et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715(1991)、
公表特許公報 平５−５０７６１２号などを参照）が報
告されている。これらの報告を比較すると、該セリンプ
ロテア−ゼ型の Cpro-2 領域、即ち Ala1027 〜 Pro
1216 部分に相当する１９０アミノ酸残基は、僅かに異
なるアミノ酸による置き換えがあるものの、高い相同性
が見出されている。特には、アミノ酸配列（Ｉ）: Val
1061 〜 Val1198 において、極めて高い相同性が見出さ
れる。また、相互でアミノ酸が異なる部分があるもの
の、いずれもＨＶＣウイルスポリペプチドの NS3/NS4a,
NS4a/NS4b, NS4b/NS5a, NS5a/NS5b の切断を行うもの
である。このことからも、本発明の組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼを特徴付ける部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2）は、ＨＣＶ-Ｊ型のもののみでなく、ＨＣＶ-ＢＫ
型或いはＨＣＶ-ＵＳ型のいずれでもよく、少なくとも
アミノ酸配列（Ｉ）: Val1061 〜 Val1198 を保持する
限り、そのＮ末とＣ末の部分配列は、既に報告されてい
る Cpro-2 領域、即ち Ala1027 〜 Pro1216 部分に対応
しているアミノ酸配列のいずれかに存在するアミノ酸
に、対応させて置き換えられてもよい。本発明は、これ
らの相互に改変を受けたものをも、その範囲に含む。本
発明において、改変が可能なアミノ酸配列上の配列位
置、及び該配列位置において改変が可能なアミノ酸残基
の範囲を、具体的に上記したアミノ酸配列（III）〔配
列番号：３を参照〕に示す。本発明の組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼにおいては、上に例示する融合蛋白質 MBP-N
S5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 の如く、その内部に切断配列
（NS5A/NS5B）に相当するアミノ酸部分配列を含む場合
には、自らのプロテア−ゼ活性により、該切断配列 CS
で切断が起こる。そのため、in vitro のアッセイ系に
用いる組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとしては、その内部
に切断配列（NS5A/NS5B）に相当するアミノ酸部分配列
を含まない、例えば MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型
の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼに較べて、使用が困難で
ある。しかしながら、この切断配列（NS5A/NS5B）を内
在する融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼは、
自らの内在する切断配列を基質に利用して、in vivo の
アッセイ系に用いる組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとして
有用である。即ち、種々のＨＣＶプロテア−ゼ阻害剤の
阻害能を評価する in vivo のアッセイ系において、組
み換え細胞内で生産させ、単離することなく、自らのプ
ロテア−ゼ活性による自己消化を指標として、該組み換
え細胞内での阻害能を評価することが可能となり、極め
て有用である。
のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) などを参照）だけ
でなく、日本人由来のＨＣＶ-ＢＫ型のゲノム核酸配列
（ A. Takamizawa et al., J.Virology 65, 1105-1113
(1990) を参照）、及び米国由来のＨＣＶ-ＵＳ型のゲノ
ム核酸配列（ Q.-L. Choo et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991)、 J. H. Han et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715(1991)、
公表特許公報 平５−５０７６１２号などを参照）が報
告されている。これらの報告を比較すると、該セリンプ
ロテア−ゼ型の Cpro-2 領域、即ち Ala1027 〜 Pro
1216 部分に相当する１９０アミノ酸残基は、僅かに異
なるアミノ酸による置き換えがあるものの、高い相同性
が見出されている。特には、アミノ酸配列（Ｉ）: Val
1061 〜 Val1198 において、極めて高い相同性が見出さ
れる。また、相互でアミノ酸が異なる部分があるもの
の、いずれもＨＶＣウイルスポリペプチドの NS3/NS4a,
NS4a/NS4b, NS4b/NS5a, NS5a/NS5b の切断を行うもの
である。このことからも、本発明の組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼを特徴付ける部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-
ｎ2）は、ＨＣＶ-Ｊ型のもののみでなく、ＨＣＶ-ＢＫ
型或いはＨＣＶ-ＵＳ型のいずれでもよく、少なくとも
アミノ酸配列（Ｉ）: Val1061 〜 Val1198 を保持する
限り、そのＮ末とＣ末の部分配列は、既に報告されてい
る Cpro-2 領域、即ち Ala1027 〜 Pro1216 部分に対応
しているアミノ酸配列のいずれかに存在するアミノ酸
に、対応させて置き換えられてもよい。本発明は、これ
らの相互に改変を受けたものをも、その範囲に含む。本
発明において、改変が可能なアミノ酸配列上の配列位
置、及び該配列位置において改変が可能なアミノ酸残基
の範囲を、具体的に上記したアミノ酸配列（III）〔配
列番号：３を参照〕に示す。本発明の組換え型ＨＣＶプ
ロテア−ゼにおいては、上に例示する融合蛋白質 MBP-N
S5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 の如く、その内部に切断配列
（NS5A/NS5B）に相当するアミノ酸部分配列を含む場合
には、自らのプロテア−ゼ活性により、該切断配列 CS
で切断が起こる。そのため、in vitro のアッセイ系に
用いる組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとしては、その内部
に切断配列（NS5A/NS5B）に相当するアミノ酸部分配列
を含まない、例えば MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型
の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼに較べて、使用が困難で
ある。しかしながら、この切断配列（NS5A/NS5B）を内
在する融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼは、
自らの内在する切断配列を基質に利用して、in vivo の
アッセイ系に用いる組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとして
有用である。即ち、種々のＨＣＶプロテア−ゼ阻害剤の
阻害能を評価する in vivo のアッセイ系において、組
み換え細胞内で生産させ、単離することなく、自らのプ
ロテア−ゼ活性による自己消化を指標として、該組み換
え細胞内での阻害能を評価することが可能となり、極め
て有用である。
【００３２】なお、本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−
ゼが、既に報告されているＨＣＶプロテア−ゼ( Cpro-2
)と同じ切断アミノ酸配列特異性を有するプロテア−ゼ
活性を示すことの評価は、下記する方法で行うことがで
きる。対照とするＨＣＶプロテア−ゼは、ＨＣＶが生産
するものであるが、ＨＣＶ自体を培養し採取することは
容易でないため、例えば、公表されている方法（菰田
泰正ら、日本癌学会総会プログラム、145 (1993) など
を参照）に準じ、ＨＣＶプロテア−ゼ( Cpro-21-190 ;
Ala1027 〜 Pro1216)と異種の蛋白質、例えばマルト−
ス結合蛋白質（ＭＢＰ）と融合してなるＨＣＶプロテア
−ゼ融合蛋白質； MBP-Cpro-2 1-190 を、天然のＨＣＶ
プロテア−ゼに換えて用いる。また、ＨＣＶプロテア−
ゼの天然に存在する基質蛋白質も、ＨＣＶが生産するも
のであるが、ＨＣＶ自体を培養し採取することは困難で
あるため、該ＨＣＶプロテア−ゼの切断するアミノ酸配
列部分を異種の蛋白質２種の間に挿入してなる融合蛋白
質を、組換え基質蛋白質として用いる。ＨＣＶプロテア
−ゼ融合蛋白質による組換え基質蛋白質の切断活性を基
準として、in vitro のアッセイ系における対比を基に
組換え型ＨＣＶプロテア−ゼのプロテア−ゼ活性を評価
することができる。
ゼが、既に報告されているＨＣＶプロテア−ゼ( Cpro-2
)と同じ切断アミノ酸配列特異性を有するプロテア−ゼ
活性を示すことの評価は、下記する方法で行うことがで
きる。対照とするＨＣＶプロテア−ゼは、ＨＣＶが生産
するものであるが、ＨＣＶ自体を培養し採取することは
容易でないため、例えば、公表されている方法（菰田
泰正ら、日本癌学会総会プログラム、145 (1993) など
を参照）に準じ、ＨＣＶプロテア−ゼ( Cpro-21-190 ;
Ala1027 〜 Pro1216)と異種の蛋白質、例えばマルト−
ス結合蛋白質（ＭＢＰ）と融合してなるＨＣＶプロテア
−ゼ融合蛋白質； MBP-Cpro-2 1-190 を、天然のＨＣＶ
プロテア−ゼに換えて用いる。また、ＨＣＶプロテア−
ゼの天然に存在する基質蛋白質も、ＨＣＶが生産するも
のであるが、ＨＣＶ自体を培養し採取することは困難で
あるため、該ＨＣＶプロテア−ゼの切断するアミノ酸配
列部分を異種の蛋白質２種の間に挿入してなる融合蛋白
質を、組換え基質蛋白質として用いる。ＨＣＶプロテア
−ゼ融合蛋白質による組換え基質蛋白質の切断活性を基
準として、in vitro のアッセイ系における対比を基に
組換え型ＨＣＶプロテア−ゼのプロテア−ゼ活性を評価
することができる。
【００３３】〔ＨＣＶプロテア−ゼ融合蛋白質； MBP-C
pro-2 1-190 の調製方法〕天然のＨＣＶプロテア−ゼ(
Cpro-2 )に換え、当該ＨＣＶプロテア−ゼをマルト−ス
結合蛋白質（以降、MBP と略称する。）のＣ末に連結し
てなるＨＣＶプロテア−ゼ融合蛋白質（以降、MBP-Cpro
-2 1-190 と略称する。）を調製して用いる。ＨＣＶプ
ロテア−ゼなどのＨＣＶ由来の蛋白質をコ−ドする cDN
A は、ＨＣＶのウイルスゲノム(＋鎖のRNA)から逆転写
して採取され、その核酸配列及び対応するアミノ酸残基
配列は、既に文献に報告されている（A. Takamizawa et
al., J. Virol. 65, 1105-1113 (1991)、N. Kato et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87, 9524-9528 (1990)
などを参照）。既に文献に報告されているＨＣＶ-Ｊ型
のゲノム核酸配列を参照し、該ＨＣＶ-Ｊ型に由来する
ＨＣＶプロテア−ゼ(Cpro-2 )をコ−ドする DNA を合成
により調製し、融合蛋白質の発現に用いるプラスミドベ
クタ−を構築した。
pro-2 1-190 の調製方法〕天然のＨＣＶプロテア−ゼ(
Cpro-2 )に換え、当該ＨＣＶプロテア−ゼをマルト−ス
結合蛋白質（以降、MBP と略称する。）のＣ末に連結し
てなるＨＣＶプロテア−ゼ融合蛋白質（以降、MBP-Cpro
-2 1-190 と略称する。）を調製して用いる。ＨＣＶプ
ロテア−ゼなどのＨＣＶ由来の蛋白質をコ−ドする cDN
A は、ＨＣＶのウイルスゲノム(＋鎖のRNA)から逆転写
して採取され、その核酸配列及び対応するアミノ酸残基
配列は、既に文献に報告されている（A. Takamizawa et
al., J. Virol. 65, 1105-1113 (1991)、N. Kato et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87, 9524-9528 (1990)
などを参照）。既に文献に報告されているＨＣＶ-Ｊ型
のゲノム核酸配列を参照し、該ＨＣＶ-Ｊ型に由来する
ＨＣＶプロテア−ゼ(Cpro-2 )をコ−ドする DNA を合成
により調製し、融合蛋白質の発現に用いるプラスミドベ
クタ−を構築した。
【００３４】図１（配列番号:４を参照）に示す DNA 断
片、即ち両端に制限酵素 EcoR I とHind III の切断部
位を持ち、また EcoR I 切断端に、ウイルスのポリプロ
テインで Leu1026-Ala1027に相当する部分に開始コドン
が挿入され、 Hind III 切断端に、ウイルスのポリプロ
テインで Pro1216-Pro1217に相当する部分に終止コドン
が挿入されたものを化学的に合成し、 EcoR I - Hind I
II 部位の断片に調製する。このＮ末端（ 〔Met〕-Ala
1027）とＣ末端（ Pro1216-〔Stop Codon〕）との間
に、キモトリプシン様セリンプロテア−ゼに特徴的なア
ミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端から 107
5 〜 1185 番目まで）が存在すると報告されている。
片、即ち両端に制限酵素 EcoR I とHind III の切断部
位を持ち、また EcoR I 切断端に、ウイルスのポリプロ
テインで Leu1026-Ala1027に相当する部分に開始コドン
が挿入され、 Hind III 切断端に、ウイルスのポリプロ
テインで Pro1216-Pro1217に相当する部分に終止コドン
が挿入されたものを化学的に合成し、 EcoR I - Hind I
II 部位の断片に調製する。このＮ末端（ 〔Met〕-Ala
1027）とＣ末端（ Pro1216-〔Stop Codon〕）との間
に、キモトリプシン様セリンプロテア−ゼに特徴的なア
ミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端から 107
5 〜 1185 番目まで）が存在すると報告されている。
【００３５】市販されているMBP発現プラスミドベクタ
−（NEW ENGLAND BIOLABS (NEB) 製）pMAL-c2 を制限酵
素 EcoR I と Hind III で切断し(C.-d. Guan et al.,
Gene67, 21-30 (1988) 、 C. V. Maina et al., Gene 7
4, 365-373 (1988) などを参照)、得られるMBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片を精製する。この
ベクタ−断片と、前記する Cpro-2 1-190 ; Ala1027 〜
Pro1216 をコ−ドするＤＮＡ断片を、 T4 DNAリガ−ゼ
により連結し、プラスミドベクタ− pCP190を得る。得
られるプラスミドベクタ−は、上記する MBP-Cpro-2 1-
190 融合蛋白質をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由来する
tac プロモ−タ−（Ｐtac）の下流に有し、またマ−カ
−遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有する
ものとなる。この MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質発現ベ
クタ− pCP190 を用い、大腸菌 HB101 株に導入し形質
転換する。マ−カ−遺伝子によるアンピシリン耐性、並
びにウサギ抗 MBP 抗体を用いるウエスタンブロット法
によるスクリ−ニングを行ない、該 発現ベクタ− pCP1
90 を有する組み換え菌を得た。
−（NEW ENGLAND BIOLABS (NEB) 製）pMAL-c2 を制限酵
素 EcoR I と Hind III で切断し(C.-d. Guan et al.,
Gene67, 21-30 (1988) 、 C. V. Maina et al., Gene 7
4, 365-373 (1988) などを参照)、得られるMBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片を精製する。この
ベクタ−断片と、前記する Cpro-2 1-190 ; Ala1027 〜
Pro1216 をコ−ドするＤＮＡ断片を、 T4 DNAリガ−ゼ
により連結し、プラスミドベクタ− pCP190を得る。得
られるプラスミドベクタ−は、上記する MBP-Cpro-2 1-
190 融合蛋白質をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由来する
tac プロモ−タ−（Ｐtac）の下流に有し、またマ−カ
−遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有する
ものとなる。この MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質発現ベ
クタ− pCP190 を用い、大腸菌 HB101 株に導入し形質
転換する。マ−カ−遺伝子によるアンピシリン耐性、並
びにウサギ抗 MBP 抗体を用いるウエスタンブロット法
によるスクリ−ニングを行ない、該 発現ベクタ− pCP1
90 を有する組み換え菌を得た。
【００３６】このベクタ− pCP190 を有する組み換え菌
を、500 ml の 2×YTを含有する培地を用いて、5 l 容
三角フラスコで 30 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養す
る。その間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の
イソプロピル-β-D-チオガラクシド（IPTG）を添加し
て、該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の発現を誘導す
る。その後、４回分の培養物（2 l ; 4 × 500 ml ）か
ら集菌し、菌体を破菌、超遠心し、sonic sup 137.5 ml
を得た。この可溶性画分を、20 mM トリス塩酸バッフ
ァ−（pH 7.4、0.2 M NaCl、1 mM EDTA ）で平衡化した
アミロ−スカラムにのせ、同バッファ−で洗浄した後、
10 mM マルト−スを含む同バッファ−で吸着画分を溶出
する。この吸着画分を、限外濾過（ＹＭ３０メンブレ
ン）で濃縮し、次いで PBS で平衡化したSephacryl S-3
00 HR カラム( 2.2 × 100 cm )にのせる。分画を 3.8
ml ずつとし、流出する該 MBP-Cpro-2 1-190 を含む画
分を採取する。このプ−ルした画分を、例えば、Sephad
ex G-25 を用いて、20 mM Na-Pi（pH 7.2 ）に溶媒置換
した後、該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の溶液に、等
体積のグリセロ−ルを加えて、 -20 ℃で保存する。
を、500 ml の 2×YTを含有する培地を用いて、5 l 容
三角フラスコで 30 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養す
る。その間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の
イソプロピル-β-D-チオガラクシド（IPTG）を添加し
て、該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の発現を誘導す
る。その後、４回分の培養物（2 l ; 4 × 500 ml ）か
ら集菌し、菌体を破菌、超遠心し、sonic sup 137.5 ml
を得た。この可溶性画分を、20 mM トリス塩酸バッフ
ァ−（pH 7.4、0.2 M NaCl、1 mM EDTA ）で平衡化した
アミロ−スカラムにのせ、同バッファ−で洗浄した後、
10 mM マルト−スを含む同バッファ−で吸着画分を溶出
する。この吸着画分を、限外濾過（ＹＭ３０メンブレ
ン）で濃縮し、次いで PBS で平衡化したSephacryl S-3
00 HR カラム( 2.2 × 100 cm )にのせる。分画を 3.8
ml ずつとし、流出する該 MBP-Cpro-2 1-190 を含む画
分を採取する。このプ−ルした画分を、例えば、Sephad
ex G-25 を用いて、20 mM Na-Pi（pH 7.2 ）に溶媒置換
した後、該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の溶液に、等
体積のグリセロ−ルを加えて、 -20 ℃で保存する。
【００３７】なお、上記するSephacryl S-300 HR カラ
ムによるクロマトグラフィ−の結果、ボイドボリュ−ム
に大きなピ−クの溶出が見られるが、その後、これは M
BP-Cpro-2 1-190 の多量体であることが判明した。その
直後にピ−クを与える画分は、単体の MBP-Cpro-2 1-19
0 であり、上記で採取しプ−ルした画分である。なお、
上記の多量体を溶解させたもの、並びにこの単体を、SD
S-PAGE で分析したところ、 MBP-Cpro-2 1-190 の分子
量に相当する位置に、単一のバンドを与えた。
ムによるクロマトグラフィ−の結果、ボイドボリュ−ム
に大きなピ−クの溶出が見られるが、その後、これは M
BP-Cpro-2 1-190 の多量体であることが判明した。その
直後にピ−クを与える画分は、単体の MBP-Cpro-2 1-19
0 であり、上記で採取しプ−ルした画分である。なお、
上記の多量体を溶解させたもの、並びにこの単体を、SD
S-PAGE で分析したところ、 MBP-Cpro-2 1-190 の分子
量に相当する位置に、単一のバンドを与えた。
【００３８】〔組換え基質蛋白質の調製方法〕天然のＨ
ＣＶプロテア−ゼが切断する基質蛋白質は、ＨＣＶウイ
ルスの遺伝子産物であるので、該基質蛋白質に換え、Ｈ
ＣＶプロテア−ゼの切断するアミノ酸残基配列を含む組
換え基質蛋白質を用いる。具体的には、該切断配列（NS
5A/NS5B）に対応する図２に示す部分配列（切断配列；C
leavage Sequence CS）を、MBPのＣ末とブタ-アデニレ
−トキナ−ゼ（以降、ADK と略称する。）のＮ末の間に
挿入し、このMBPとADKの融合蛋白質（以降、MBP-NS5A/5
B-ADK と略称する。）を組換え基質蛋白質として用い
る。
ＣＶプロテア−ゼが切断する基質蛋白質は、ＨＣＶウイ
ルスの遺伝子産物であるので、該基質蛋白質に換え、Ｈ
ＣＶプロテア−ゼの切断するアミノ酸残基配列を含む組
換え基質蛋白質を用いる。具体的には、該切断配列（NS
5A/NS5B）に対応する図２に示す部分配列（切断配列；C
leavage Sequence CS）を、MBPのＣ末とブタ-アデニレ
−トキナ−ゼ（以降、ADK と略称する。）のＮ末の間に
挿入し、このMBPとADKの融合蛋白質（以降、MBP-NS5A/5
B-ADK と略称する。）を組換え基質蛋白質として用い
る。
【００３９】該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の発現に
用いる組み換え大腸菌は、次の方法で得た。市販されて
いるMBP発現プラスミドベクタ−（NEW ENGLAND BIOLABS
(NEB) 製）pMAL-c2 を制限酵素 Xmn I と Hind III で
切断し( C.-d. Guan et al.,Gene 67, 21-30 (1988) 、
C. V. Maina et al., Gene 74, 365-373 (1988) など
を参照)、得られるMBPをコ−ドするDNA（mal E）を含む
ベクタ−断片を精製する。一方、ADKをコ−ドするDNA断
片を、クロ−ンされた該ADK遺伝子（ T. Hibino et a
l., J. Biotechnol. 32, 139-148 などを参照）を含む
ADK発現ベクタ−pMKAK3 等（特開平 1-51087 号公報、
特開平 1-51088 号公報などを参照）より制限酵素 EcoR
I と Hind III で切断し、精製する。前記MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片とADKをコ−ドす
るDNA断片を、図２に示す合成リンカ−を介して、 T4 D
NAリガ−ゼにより連結する。得られるプラスミドベクタ
−は、上記する MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質をコ−ド
するDNAを pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ｐt
ac）の下流に有し、またマ−カ−遺伝子としてアンピシ
リン耐性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。この MBP-N
S5A/5B-ADK 融合蛋白質発現ベクタ− pMAL-AK2 を用
い、大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。マ−カ−
遺伝子によるアンピシリン耐性、並びにウサギ抗MBP抗
体を用いるウエスタンブロット法によるスクリ−ニング
を行ない、該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質発現ベクタ
− pMAL-AK2 を有する組み換え菌を得た。なお、該合成
リンカ−部分により、基質となるアミノ酸配列部分はコ
−ドされる。
用いる組み換え大腸菌は、次の方法で得た。市販されて
いるMBP発現プラスミドベクタ−（NEW ENGLAND BIOLABS
(NEB) 製）pMAL-c2 を制限酵素 Xmn I と Hind III で
切断し( C.-d. Guan et al.,Gene 67, 21-30 (1988) 、
C. V. Maina et al., Gene 74, 365-373 (1988) など
を参照)、得られるMBPをコ−ドするDNA（mal E）を含む
ベクタ−断片を精製する。一方、ADKをコ−ドするDNA断
片を、クロ−ンされた該ADK遺伝子（ T. Hibino et a
l., J. Biotechnol. 32, 139-148 などを参照）を含む
ADK発現ベクタ−pMKAK3 等（特開平 1-51087 号公報、
特開平 1-51088 号公報などを参照）より制限酵素 EcoR
I と Hind III で切断し、精製する。前記MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片とADKをコ−ドす
るDNA断片を、図２に示す合成リンカ−を介して、 T4 D
NAリガ−ゼにより連結する。得られるプラスミドベクタ
−は、上記する MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質をコ−ド
するDNAを pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ｐt
ac）の下流に有し、またマ−カ−遺伝子としてアンピシ
リン耐性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。この MBP-N
S5A/5B-ADK 融合蛋白質発現ベクタ− pMAL-AK2 を用
い、大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。マ−カ−
遺伝子によるアンピシリン耐性、並びにウサギ抗MBP抗
体を用いるウエスタンブロット法によるスクリ−ニング
を行ない、該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質発現ベクタ
− pMAL-AK2 を有する組み換え菌を得た。なお、該合成
リンカ−部分により、基質となるアミノ酸配列部分はコ
−ドされる。
【００４０】このベクタ− pMAL-AK2 を有する組み換え
菌を、500 ml の 2×YTを含有する培地を用いて、5 l
容三角フラスコで 30 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養
する。その間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の
IPTG を添加して、該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の
発現を誘導する。その後、培養物から集菌し、菌体を破
菌、超遠心し、sonic sup 44 ml を得た。この可溶性画
分を、20 mM トリス塩酸バッファ−（pH 7.4、0.2 M Na
Cl、1 mM EDTA ）で平衡化したアミロ−スカラムにの
せ、同バッファ−で洗浄した後、10 mM マルト−スを含
む同バッファ−で吸着画分を溶出する。この吸着画分
を、Sephadex G-25 を用いて、20 mM トリス塩酸バッフ
ァ−（pH 7.6、60 mM NaCl ）に溶媒置換した後、限外
濾過（ＹＭ３０メンブレン）で濃縮する。濃縮された該
MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の溶液は、タンパク濃度
3.0 mg/ml となるように、トリス塩酸バッファ−( 100
mM Tris-HCl , pH 8.5 / 15 mM DTT/50 ％ グリセロ−
ル )に溶かして、 -20 ℃で保存する。なお、上記の濃
縮した液を、SDS-PAGE で分析したところ、 MBP-NS5A/5
B-ADK の分子量に相当する位置に、単一のバンドを与え
た。
菌を、500 ml の 2×YTを含有する培地を用いて、5 l
容三角フラスコで 30 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養
する。その間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の
IPTG を添加して、該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の
発現を誘導する。その後、培養物から集菌し、菌体を破
菌、超遠心し、sonic sup 44 ml を得た。この可溶性画
分を、20 mM トリス塩酸バッファ−（pH 7.4、0.2 M Na
Cl、1 mM EDTA ）で平衡化したアミロ−スカラムにの
せ、同バッファ−で洗浄した後、10 mM マルト−スを含
む同バッファ−で吸着画分を溶出する。この吸着画分
を、Sephadex G-25 を用いて、20 mM トリス塩酸バッフ
ァ−（pH 7.6、60 mM NaCl ）に溶媒置換した後、限外
濾過（ＹＭ３０メンブレン）で濃縮する。濃縮された該
MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の溶液は、タンパク濃度
3.0 mg/ml となるように、トリス塩酸バッファ−( 100
mM Tris-HCl , pH 8.5 / 15 mM DTT/50 ％ グリセロ−
ル )に溶かして、 -20 ℃で保存する。なお、上記の濃
縮した液を、SDS-PAGE で分析したところ、 MBP-NS5A/5
B-ADK の分子量に相当する位置に、単一のバンドを与え
た。
【００４１】〔in vitro のＨＣＶプロテア−ゼ活性測
定法〕上記する方法で調製されるＨＣＶプロテア−ゼ融
合蛋白質 MBP-Cpro-2 1-190及び組換え基質蛋白質 MBP-
NS5A/5B-ADK を用いて、in vitro のＨＣＶプロテア−
ゼ活性測定を行なった。アッセイ手順の一例を、次に述
べる。 MBP-Cpro-2 1-190 酵素液（タンパク濃度 0.27
mg/ml ） 6 μl 、 MBP-NS5A/5B-ADK 組換え基質（タン
パク濃度 3.0 mg/ml ） 10 μl 、トリス塩酸バッファ
−溶液 ( 0.5 MTris-HCl , pH 8.5 ) 5 μl を混合し、
75 ％ グリセロ−ルの適量を加え、グリセロ−ル濃度
を終濃度 50 ％ にして、合計容積 50 μl の反応液に
調整する。
定法〕上記する方法で調製されるＨＣＶプロテア−ゼ融
合蛋白質 MBP-Cpro-2 1-190及び組換え基質蛋白質 MBP-
NS5A/5B-ADK を用いて、in vitro のＨＣＶプロテア−
ゼ活性測定を行なった。アッセイ手順の一例を、次に述
べる。 MBP-Cpro-2 1-190 酵素液（タンパク濃度 0.27
mg/ml ） 6 μl 、 MBP-NS5A/5B-ADK 組換え基質（タン
パク濃度 3.0 mg/ml ） 10 μl 、トリス塩酸バッファ
−溶液 ( 0.5 MTris-HCl , pH 8.5 ) 5 μl を混合し、
75 ％ グリセロ−ルの適量を加え、グリセロ−ル濃度
を終濃度 50 ％ にして、合計容積 50 μl の反応液に
調整する。
【００４２】この反応液を、 37 ℃、 4 時間インキュ
ベ−ションし、組換え基質の切断をする。その後、反応
液に、SDS-PAGE用のサンプルバッファ−液 50 μl を加
える。この混合液から、 20 μl を採取して、ＳＤＳ-
ＰＡＧＥに供し、クマシ−染色する。該組換え基質及び
そのプロテア−ゼ消化で生成する ADK 断片と MBP 断片
が与えるバンドの強度を、デンシトメ−タ−で測定す
る。即ち、組換え基質 MBP-NS5A/5B-ADK の残存量と、
新たに生成する ADK 断片、 MBP 断片の量を、測定され
たそれぞれのバンド強度を基に求め、プロテア−ゼ活性
を算定する。
ベ−ションし、組換え基質の切断をする。その後、反応
液に、SDS-PAGE用のサンプルバッファ−液 50 μl を加
える。この混合液から、 20 μl を採取して、ＳＤＳ-
ＰＡＧＥに供し、クマシ−染色する。該組換え基質及び
そのプロテア−ゼ消化で生成する ADK 断片と MBP 断片
が与えるバンドの強度を、デンシトメ−タ−で測定す
る。即ち、組換え基質 MBP-NS5A/5B-ADK の残存量と、
新たに生成する ADK 断片、 MBP 断片の量を、測定され
たそれぞれのバンド強度を基に求め、プロテア−ゼ活性
を算定する。
【００４３】因みに、上記の酵素反応で得られる消化物
をＰＶＤＦ膜にブロッティングして、該 ADK 断片が与
えるバンドを切り出し、そのＮ末端アミノ酸配列分析を
（株）島津製作所製 プロテインシ−ケンサ− ＰＳＱ-
１型を用いて行なった。この分析結果より、該 ADK 断
片のＮ末端アミノ酸配列は、 Ser-Met-Ser-Tyr-Thr-で
あることが判明し、切断配列 NS5A/NS5B 中の Cys と S
er の間で切断が行なわれることが確認された。
をＰＶＤＦ膜にブロッティングして、該 ADK 断片が与
えるバンドを切り出し、そのＮ末端アミノ酸配列分析を
（株）島津製作所製 プロテインシ−ケンサ− ＰＳＱ-
１型を用いて行なった。この分析結果より、該 ADK 断
片のＮ末端アミノ酸配列は、 Ser-Met-Ser-Tyr-Thr-で
あることが判明し、切断配列 NS5A/NS5B 中の Cys と S
er の間で切断が行なわれることが確認された。
【００４４】なお、このアッセイで測定される ADK 断
片のバンドの強度が、組換え基質当初の量の８０％を超
えない範囲になるように、プロテア−ゼの濃度、並びに
反応時間を調整して行なった。 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融
合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼでは、該酵素
液（タンパク濃度 0.27 mg/ml ）の使用量を 0 〜 8μl
の範囲で種々に換えて、酵素の濃度依存性を確認し
た。
片のバンドの強度が、組換え基質当初の量の８０％を超
えない範囲になるように、プロテア−ゼの濃度、並びに
反応時間を調整して行なった。 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融
合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼでは、該酵素
液（タンパク濃度 0.27 mg/ml ）の使用量を 0 〜 8μl
の範囲で種々に換えて、酵素の濃度依存性を確認し
た。
【００４５】本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼとし
て、 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼを用いて、上記する方法によりin vitro
のＨＣＶプロテア−ゼ活性を評価したところ、図１０
に例示するように、アミノ酸配列（Ｉ）を保持するもの
は、 MBP-NS5A/5B-ADK 組換え基質を切断し、新たに生
成する ADK 断片が得られることが確認された。一方、
該アミノ酸配列（Ｉ）のＣ末端を、更に欠失させたも
の、例えば、 MBP-Cpro-2 1-171 、 MBP-Cpro-21-170
、或いは、該アミノ酸配列（Ｉ）のＮ末端を、更に欠
失させたもの、例えば、 MBP-Cpro-2 36-172 、 MBP-Cp
ro-2 37-172 、 MBP-Cpro-2 38-172 などは、もはやＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を有していないことが確認され
た。
て、 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼを用いて、上記する方法によりin vitro
のＨＣＶプロテア−ゼ活性を評価したところ、図１０
に例示するように、アミノ酸配列（Ｉ）を保持するもの
は、 MBP-NS5A/5B-ADK 組換え基質を切断し、新たに生
成する ADK 断片が得られることが確認された。一方、
該アミノ酸配列（Ｉ）のＣ末端を、更に欠失させたも
の、例えば、 MBP-Cpro-2 1-171 、 MBP-Cpro-21-170
、或いは、該アミノ酸配列（Ｉ）のＮ末端を、更に欠
失させたもの、例えば、 MBP-Cpro-2 36-172 、 MBP-Cp
ro-2 37-172 、 MBP-Cpro-2 38-172 などは、もはやＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を有していないことが確認され
た。
【００４６】また、アミノ酸配列（Ｉ）を保持する MBP
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼについては、それぞれ組み換え大腸菌を
用いて発現させたところ、細胞内において、自らのプロ
テア−ゼ活性により自己消化を起こし、融合蛋白質は僅
かに採取できるのみで、図３に例示するように、自己消
化で生成する MBP が多く得られた。即ち、アミノ酸配
列（Ｉ）を保持する MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合
蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼは、宿主細胞内
において、プロテア−ゼ活性を有することが確認され
た。他方、該アミノ酸配列（Ｉ）のＣ末端を、更に欠失
させたもの、例えば、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-171 、或
いは、該アミノ酸配列（Ｉ）のＮ末端を、更に欠失させ
たもの、例えば、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 36-172 など
は、もはやＨＣＶプロテア−ゼ活性を有していないこと
が確認された。
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣ
Ｖプロテア−ゼについては、それぞれ組み換え大腸菌を
用いて発現させたところ、細胞内において、自らのプロ
テア−ゼ活性により自己消化を起こし、融合蛋白質は僅
かに採取できるのみで、図３に例示するように、自己消
化で生成する MBP が多く得られた。即ち、アミノ酸配
列（Ｉ）を保持する MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合
蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼは、宿主細胞内
において、プロテア−ゼ活性を有することが確認され
た。他方、該アミノ酸配列（Ｉ）のＣ末端を、更に欠失
させたもの、例えば、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-171 、或
いは、該アミノ酸配列（Ｉ）のＮ末端を、更に欠失させ
たもの、例えば、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 36-172 など
は、もはやＨＣＶプロテア−ゼ活性を有していないこと
が確認された。
【００４７】以下に、本発明の組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼの調製方法、即ち、当該組換え型ＨＣＶプロテア−
ゼを生産する形質転換大腸菌の培養物より単離する方
法、並びに、該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼをコ−ドす
るＤＮＡを含むプラスミドの調製と、そのプラスミドに
より形質転換された形質転換大腸菌を採取する方法、及
び該組換え蛋白質のＨＣＶプロテア−ゼ活性を詳しく説
明する。
−ゼの調製方法、即ち、当該組換え型ＨＣＶプロテア−
ゼを生産する形質転換大腸菌の培養物より単離する方
法、並びに、該組換え型ＨＣＶプロテア−ゼをコ−ドす
るＤＮＡを含むプラスミドの調製と、そのプラスミドに
より形質転換された形質転換大腸菌を採取する方法、及
び該組換え蛋白質のＨＣＶプロテア−ゼ活性を詳しく説
明する。
【００４８】
【実施例１】キモトリプシン様セリンプロテア−ゼに特
徴的なアミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端
から 1075 〜 1185 番目まで）を内在するアミノ酸配列
（Ｉ）を含む部分ペプチド鎖、即ち、１９０アミノ酸残
基の 〔Met〕- Ala1027 〜 Pro1216 までのペプチド
鎖、並びに、更に種々のＮ末及び／又はＣ末の欠失変異
を施したペプチド鎖を、大腸菌マルト−ス結合蛋白質 M
BP のＣ末端に NS5A/NS5B 切断配列（ウイルスポリプロ
テインのＮ末端から 2413 〜 2427 番目まで; Ser2413
〜 Gly2427 ）を介して連結した MBP-NS5A/5B-Cpro-2
ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを
下記する手段で調製し、該組換え蛋白質のＨＣＶプロテ
ア−ゼ活性を評価した。
徴的なアミノ酸配列（ウイルスポリプロテインのＮ末端
から 1075 〜 1185 番目まで）を内在するアミノ酸配列
（Ｉ）を含む部分ペプチド鎖、即ち、１９０アミノ酸残
基の 〔Met〕- Ala1027 〜 Pro1216 までのペプチド
鎖、並びに、更に種々のＮ末及び／又はＣ末の欠失変異
を施したペプチド鎖を、大腸菌マルト−ス結合蛋白質 M
BP のＣ末端に NS5A/NS5B 切断配列（ウイルスポリプロ
テインのＮ末端から 2413 〜 2427 番目まで; Ser2413
〜 Gly2427 ）を介して連結した MBP-NS5A/5B-Cpro-2
ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼを
下記する手段で調製し、該組換え蛋白質のＨＣＶプロテ
ア−ゼ活性を評価した。
【００４９】以下に、該 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2
融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に用
いるプラスミドべクタ−の構築、該プラスミドべクタ−
を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製、組換え型Ｈ
ＣＶプロテア−ゼの単離、及びその in vivo でのＨＣ
Ｖプロテア−ゼ活性の検証結果を述べる。
融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に用
いるプラスミドべクタ−の構築、該プラスミドべクタ−
を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製、組換え型Ｈ
ＣＶプロテア−ゼの単離、及びその in vivo でのＨＣ
Ｖプロテア−ゼ活性の検証結果を述べる。
【００５０】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現べク
タ−の構築〕先ず、ウイルスゲノム上の非構造遺伝子領
域に位置する NS3 領域のＮ末端側ドメインに相当す
る、該ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の領域、具体的に
は、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からな
るペプチド鎖をコ−ドする DNA を、既に報告されてい
るＨＣＶ-Ｊ型のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) など
を参照）を参照して、化学的な合成方法により調製す
る。即ち、ウイルスゲノム上、 Leu1026-Ala1027に、開
始コドン ATG (Met) を導入し、その上流に制限酵素 Ec
oR I 切断部位を持ち、また、Pro1216-Pro1217に、終止
コドン TAA を導入し、その下流に制限酵素 Hind III
切断部位を持つ DNA 断片、即ち、図１（配列番号：４
を参照）に示すDNA 断片を合成により調製した。
タ−の構築〕先ず、ウイルスゲノム上の非構造遺伝子領
域に位置する NS3 領域のＮ末端側ドメインに相当す
る、該ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の領域、具体的に
は、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基からな
るペプチド鎖をコ−ドする DNA を、既に報告されてい
るＨＣＶ-Ｊ型のゲノム核酸配列（ N. Kato et al., Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990) など
を参照）を参照して、化学的な合成方法により調製す
る。即ち、ウイルスゲノム上、 Leu1026-Ala1027に、開
始コドン ATG (Met) を導入し、その上流に制限酵素 Ec
oR I 切断部位を持ち、また、Pro1216-Pro1217に、終止
コドン TAA を導入し、その下流に制限酵素 Hind III
切断部位を持つ DNA 断片、即ち、図１（配列番号：４
を参照）に示すDNA 断片を合成により調製した。
【００５１】次いで、図２に示す DNA 断片、即ち、制
限酵素 Xmn I 切断部位と制限酵素 EcoR I 切断部位を
両端に有し、ＨＣＶプロテア−ゼの NS5A/NS5B 切断配
列（ Ser2413 〜 Gly2427 に相当）をコ−ドする合成リ
ンカ−を調製した。市販されている大腸菌由来マルト−
ス結合蛋白質( MBP ; maltose-binding protein ) の発
現ベクタ− pMAL-c2 ( NEW ENGLAND BIOLABS 製 ) の X
mn I - Hind III 部位に、先に調製した両端に EcoR I
- Hind III の切断部位を有する DNA 断片を、前記の X
mn I - EcoR I 部位を両端とする DNA 断片である合成
リンカ−を介して、連結挿入した、プラスミド pCPCS19
0 を一旦構築した。得られた Ala1027 〜Pro1216 の１
９０アミノ酸残基からなるペプチド鎖、Cpro-2 1-190
をコ−ドする DNA を含むプラスミド pCPCS190 を、大
腸菌 ＨＢ１０１株 に導入し形質転換して、得られる組
み換え菌を培養して、該プラスミド pCPCS190 を大量に
調製した。該プラスミド pCPCS190 の構成の概要は図３
に示す。
限酵素 Xmn I 切断部位と制限酵素 EcoR I 切断部位を
両端に有し、ＨＣＶプロテア−ゼの NS5A/NS5B 切断配
列（ Ser2413 〜 Gly2427 に相当）をコ−ドする合成リ
ンカ−を調製した。市販されている大腸菌由来マルト−
ス結合蛋白質( MBP ; maltose-binding protein ) の発
現ベクタ− pMAL-c2 ( NEW ENGLAND BIOLABS 製 ) の X
mn I - Hind III 部位に、先に調製した両端に EcoR I
- Hind III の切断部位を有する DNA 断片を、前記の X
mn I - EcoR I 部位を両端とする DNA 断片である合成
リンカ−を介して、連結挿入した、プラスミド pCPCS19
0 を一旦構築した。得られた Ala1027 〜Pro1216 の１
９０アミノ酸残基からなるペプチド鎖、Cpro-2 1-190
をコ−ドする DNA を含むプラスミド pCPCS190 を、大
腸菌 ＨＢ１０１株 に導入し形質転換して、得られる組
み換え菌を培養して、該プラスミド pCPCS190 を大量に
調製した。該プラスミド pCPCS190 の構成の概要は図３
に示す。
【００５２】次いで、このプラスミド pCPCS190 を鋳型
として、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド鎖 Cpro-2
ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドし、その上流端に、制限酵素 Eco
R I 切断部位と開始コドン ATG (Met) を、その下流端
に、終止コドン TAA と制限酵素 Hind III 切断部位を
それぞれ持つ DNA 断片を、ＰＣＲ法により増幅し、調
製した。具体的には、表１に示すＰＣＲプライマ−、CP
F1 〜 CPF8 に示すＮ末の部分アミノ酸配列をコ−ドす
る核酸配列と相補的な塩基配列を有するもの、及び CPR
1 〜 CPR6 に示すＣ末の部分アミノ酸配列をコ−ドする
核酸配列と相補的な塩基配列を有するもの、この二種の
ＰＣＲプライマ−組から、種々の対を選択して、部分ペ
プチド鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドする DNA 断片
を調製した。なお、該部分ペプチド鎖は、上記するAla
1027 をアミノ酸残基番号１、Pro1216 をアミノ酸残基
番号１９０とした時、Ｎ末のアミノ酸残基番号ｎ1とＣ
末のアミノ酸残基番号ｎ2とによりCpro-2 ｎ1-ｎ2と表
記するときに、各プライマ−が与えるＮ末のアミノ酸残
基番号ｎ1又はＣ末のアミノ酸残基番号ｎ2を参考のため
併記してある。
として、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド鎖 Cpro-2
ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドし、その上流端に、制限酵素 Eco
R I 切断部位と開始コドン ATG (Met) を、その下流端
に、終止コドン TAA と制限酵素 Hind III 切断部位を
それぞれ持つ DNA 断片を、ＰＣＲ法により増幅し、調
製した。具体的には、表１に示すＰＣＲプライマ−、CP
F1 〜 CPF8 に示すＮ末の部分アミノ酸配列をコ−ドす
る核酸配列と相補的な塩基配列を有するもの、及び CPR
1 〜 CPR6 に示すＣ末の部分アミノ酸配列をコ−ドする
核酸配列と相補的な塩基配列を有するもの、この二種の
ＰＣＲプライマ−組から、種々の対を選択して、部分ペ
プチド鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドする DNA 断片
を調製した。なお、該部分ペプチド鎖は、上記するAla
1027 をアミノ酸残基番号１、Pro1216 をアミノ酸残基
番号１９０とした時、Ｎ末のアミノ酸残基番号ｎ1とＣ
末のアミノ酸残基番号ｎ2とによりCpro-2 ｎ1-ｎ2と表
記するときに、各プライマ−が与えるＮ末のアミノ酸残
基番号ｎ1又はＣ末のアミノ酸残基番号ｎ2を参考のため
併記してある。
【００５３】
【表１】
【００５４】これらの部分ペプチド鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2
のみをコ−ドする DNA 断片と、発現ベクタ− pMAL-c2
( NEW ENGLAND BIOLABS 製 ) の Xmn I - Hind III 部
位のベクタ−断片とを、前記 NS5A/NS5B 切断配列（ Se
r2413 〜 Gly2427 に相当）をコ−ドする合成リンカ−
を介して、 T4 DNAリガ−ゼにより連結挿入した、プラ
スミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を、それぞれ構築し
た。
のみをコ−ドする DNA 断片と、発現ベクタ− pMAL-c2
( NEW ENGLAND BIOLABS 製 ) の Xmn I - Hind III 部
位のベクタ−断片とを、前記 NS5A/NS5B 切断配列（ Se
r2413 〜 Gly2427 に相当）をコ−ドする合成リンカ−
を介して、 T4 DNAリガ−ゼにより連結挿入した、プラ
スミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を、それぞれ構築し
た。
【００５５】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現べク
タ−を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製〕先の工
程で構築したプラスミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を、
宿主の大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。マ−カ
−遺伝子によるアンピシリン耐性、並びにウサギ抗 MBP
抗体を用いるウエスタンブロット法によるスクリ−ニ
ングを行ない、該 発現ベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を有す
る組み換え菌を得た。
タ−を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製〕先の工
程で構築したプラスミドベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を、
宿主の大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。マ−カ
−遺伝子によるアンピシリン耐性、並びにウサギ抗 MBP
抗体を用いるウエスタンブロット法によるスクリ−ニ
ングを行ない、該 発現ベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を有す
る組み換え菌を得た。
【００５６】〔in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性の検
証〕該 発現ベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を有する組み換え
菌を、 2×YTを含有する培地を用いて、 37 ℃、一晩
(約 14 時間)振とう培養した。その間、対数増殖期に、
終濃度 1 mM となる量の イソプロピル-β-D-チオガラ
クシド（IPTG）を添加して、該 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ
1-ｎ2 融合蛋白質の発現を誘導した。その後、培養物か
ら集菌した。
証〕該 発現ベクタ− pCPCS ｎ1-ｎ2 を有する組み換え
菌を、 2×YTを含有する培地を用いて、 37 ℃、一晩
(約 14 時間)振とう培養した。その間、対数増殖期に、
終濃度 1 mM となる量の イソプロピル-β-D-チオガラ
クシド（IPTG）を添加して、該 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ
1-ｎ2 融合蛋白質の発現を誘導した。その後、培養物か
ら集菌した。
【００５７】これらの組み換え菌の菌体内で、発現され
た該 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2融合蛋白質が、in vi
vo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を有するか否かを、以下
の方法で検証した。
た該 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2融合蛋白質が、in vi
vo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を有するか否かを、以下
の方法で検証した。
【００５８】先ず、Ｃ末の欠失する MBP-NS5A/5B-Cpro-
2 1-ｎ2 融合蛋白質を系統的に発現させて、比較を行っ
た。集菌した菌体を破菌し、全菌体蛋白質を SDS-PAGE
に供し、蛋白質を分析した。その比較の一例を、図４に
示す。ＨＣＶプロテア−ゼ活性を有することが既に判っ
ている MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-190 融合蛋白質では、MB
P の断片に相当する 45 kDa と、Cpro-2 1-190 の断片
に相当する 23 kDa とに明確なバンドが存在するが、融
合蛋白質自体に相当する 45＋23 kDa には、明確なバン
ドは観測されていない。図３と図４に示すように、MBP
に対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体を用いたイムノブロ
ット法、並びにＨＣＶプロテア−ゼを含むペプチド NS
3;p70 に対する抗体、ウサギ抗 NS3 抗体を用いたイム
ノブロット法により、 45 kDa のバンドは MBP の断片
であり、 23 kDa のバンドはCpro-21-190 の断片である
ことが確認された。更に、融合蛋白質自体に相当する 4
5＋23 kDa にも、イムノブロット法では、かすかではあ
るがバンドの存在が見られ、該融合蛋白質の発現を確認
することができた。
2 1-ｎ2 融合蛋白質を系統的に発現させて、比較を行っ
た。集菌した菌体を破菌し、全菌体蛋白質を SDS-PAGE
に供し、蛋白質を分析した。その比較の一例を、図４に
示す。ＨＣＶプロテア−ゼ活性を有することが既に判っ
ている MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-190 融合蛋白質では、MB
P の断片に相当する 45 kDa と、Cpro-2 1-190 の断片
に相当する 23 kDa とに明確なバンドが存在するが、融
合蛋白質自体に相当する 45＋23 kDa には、明確なバン
ドは観測されていない。図３と図４に示すように、MBP
に対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体を用いたイムノブロ
ット法、並びにＨＣＶプロテア−ゼを含むペプチド NS
3;p70 に対する抗体、ウサギ抗 NS3 抗体を用いたイム
ノブロット法により、 45 kDa のバンドは MBP の断片
であり、 23 kDa のバンドはCpro-21-190 の断片である
ことが確認された。更に、融合蛋白質自体に相当する 4
5＋23 kDa にも、イムノブロット法では、かすかではあ
るがバンドの存在が見られ、該融合蛋白質の発現を確認
することができた。
【００５９】同じく、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2 融合
蛋白質で、ｎ2が 172 以上では、 45 kDa に MBP の断
片が、 23 kDa より小さい領域に Cpro-2 1-ｎ2 の断片
がｎ2に従い減少する位置に確認されている。更には、
融合蛋白質自体に相当するバンドも、 45＋23 kDa に近
い位置に、やはり見いだされている。 MBP-NS5A/5B-Cpr
o-2 1-ｎ2 融合蛋白質は、ｎ2が 172 以上では、in viv
o のＨＣＶプロテア−ゼ活性を有するため、内在してい
る NS5A/NS5B 切断配列で自己切断した断片が生成して
いることが判った。
蛋白質で、ｎ2が 172 以上では、 45 kDa に MBP の断
片が、 23 kDa より小さい領域に Cpro-2 1-ｎ2 の断片
がｎ2に従い減少する位置に確認されている。更には、
融合蛋白質自体に相当するバンドも、 45＋23 kDa に近
い位置に、やはり見いだされている。 MBP-NS5A/5B-Cpr
o-2 1-ｎ2 融合蛋白質は、ｎ2が 172 以上では、in viv
o のＨＣＶプロテア−ゼ活性を有するため、内在してい
る NS5A/NS5B 切断配列で自己切断した断片が生成して
いることが判った。
【００６０】一方、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2 融合蛋
白質で、ｎ2が 171 以下では、例えば、 MBP-NS5A/5B-C
pro-2 1-171 融合蛋白質でも、もはや 45 kDa に予測さ
れるMBP の断片、 Cpro-2 1-ｎ2 の断片に当たる 23 kD
a より小さい領域でｎ2に従い減少する位置に存在する
と予測されるバンドのいずれも確認されなかった。だ
だ、融合蛋白質自体に相当するバンドのみが、 45＋23
kDa に近い位置に、やはり見いだされている。即ち、 M
BP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2 融合蛋白質は、ｎ2が171 以
下では、in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を示さない
ため、内在している NS5A/NS5B 切断配列で自己切断し
た断片が生成していないことが判った。
白質で、ｎ2が 171 以下では、例えば、 MBP-NS5A/5B-C
pro-2 1-171 融合蛋白質でも、もはや 45 kDa に予測さ
れるMBP の断片、 Cpro-2 1-ｎ2 の断片に当たる 23 kD
a より小さい領域でｎ2に従い減少する位置に存在する
と予測されるバンドのいずれも確認されなかった。だ
だ、融合蛋白質自体に相当するバンドのみが、 45＋23
kDa に近い位置に、やはり見いだされている。即ち、 M
BP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2 融合蛋白質は、ｎ2が171 以
下では、in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を示さない
ため、内在している NS5A/NS5B 切断配列で自己切断し
た断片が生成していないことが判った。
【００６１】確認のため、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2
融合蛋白質において、ｎ2が 172 以上としたものを発現
させた組み換え菌の菌体を破菌して、 Cpro-2 1-ｎ2 の
断片の単離を試みた。 Cpro-2 1-ｎ2 の断片は、不溶性
画分に存在しており、4 ％ Triton により可溶化を図っ
たが、可溶化されなかった。細胞内において、大量に発
現、自己切断を受けた後、高い濃度のため、凝集して封
入体を形成したと考えられる。この Cpro-2 1-ｎ2 の断
片を PVDF 膜にブロッティングした後、Ｎ-端アミノ酸
配列分析を行った。その結果、 Ser-Met-Ser-Tyr-Thr-T
rp-Thr- であり、 NS5A/NS5B 切断配列で自己切断され
ていることが確認された。即ち、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2
1-ｎ2 融合蛋白質において、ｎ2が 172 以上としたもの
は、 NS5A/NS5B 切断配列を選択的に認識し、特異的な
プロテア−ゼ活性を示すことが確認された。
融合蛋白質において、ｎ2が 172 以上としたものを発現
させた組み換え菌の菌体を破菌して、 Cpro-2 1-ｎ2 の
断片の単離を試みた。 Cpro-2 1-ｎ2 の断片は、不溶性
画分に存在しており、4 ％ Triton により可溶化を図っ
たが、可溶化されなかった。細胞内において、大量に発
現、自己切断を受けた後、高い濃度のため、凝集して封
入体を形成したと考えられる。この Cpro-2 1-ｎ2 の断
片を PVDF 膜にブロッティングした後、Ｎ-端アミノ酸
配列分析を行った。その結果、 Ser-Met-Ser-Tyr-Thr-T
rp-Thr- であり、 NS5A/NS5B 切断配列で自己切断され
ていることが確認された。即ち、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2
1-ｎ2 融合蛋白質において、ｎ2が 172 以上としたもの
は、 NS5A/NS5B 切断配列を選択的に認識し、特異的な
プロテア−ゼ活性を示すことが確認された。
【００６２】次いで、Ｎ末の欠失する MBP-NS5A/5B-Cpr
o-2 ｎ1-172 融合蛋白質を系統的に発現させて、同じく
比較を行った。集菌した菌体を破菌し、全菌体蛋白質を
SDS-PAGE に供し、蛋白質を分析した。その比較の一例
を、図５、図６及び図７に示す。ＨＣＶプロテア−ゼ活
性を有することが判った MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-172融
合蛋白質、及び ｎ1 が 35以下の MBP-NS5A/5B-Cpro-2
ｎ1-172 融合蛋白質では、MBP の断片に相当する 45 kD
a と、Cpro-2 ｎ1-172 の断片に相当する約 20kDa 以下
とに明確なバンドが存在する。融合蛋白質自体に相当す
る約 64 kDaにも、僅かにバンドが観測されている。図
５に示すように、MBPに対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体
を用いたイムノブロット法、並びにＨＣＶプロテア−ゼ
を含むペプチド NS3;p70 に対する抗体、ウサギ抗 NS3
抗体を用いたイムノブロット法により、 45 kDa のバン
ドは MBP の断片であり、約 20 kDa 以下 に存在するバ
ンドはCpro-2 ｎ1-172 の断片であることが確認され
る。即ち、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-172 融合蛋白質
は、ｎ1が 35 以下では、in vivo のＨＣＶプロテア−
ゼ活性を有するため、内在している NS5A/NS5B 切断配
列で自己切断した断片が生成していることが判った。
o-2 ｎ1-172 融合蛋白質を系統的に発現させて、同じく
比較を行った。集菌した菌体を破菌し、全菌体蛋白質を
SDS-PAGE に供し、蛋白質を分析した。その比較の一例
を、図５、図６及び図７に示す。ＨＣＶプロテア−ゼ活
性を有することが判った MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-172融
合蛋白質、及び ｎ1 が 35以下の MBP-NS5A/5B-Cpro-2
ｎ1-172 融合蛋白質では、MBP の断片に相当する 45 kD
a と、Cpro-2 ｎ1-172 の断片に相当する約 20kDa 以下
とに明確なバンドが存在する。融合蛋白質自体に相当す
る約 64 kDaにも、僅かにバンドが観測されている。図
５に示すように、MBPに対する抗体、ウサギ抗 MBP 抗体
を用いたイムノブロット法、並びにＨＣＶプロテア−ゼ
を含むペプチド NS3;p70 に対する抗体、ウサギ抗 NS3
抗体を用いたイムノブロット法により、 45 kDa のバン
ドは MBP の断片であり、約 20 kDa 以下 に存在するバ
ンドはCpro-2 ｎ1-172 の断片であることが確認され
る。即ち、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-172 融合蛋白質
は、ｎ1が 35 以下では、in vivo のＨＣＶプロテア−
ゼ活性を有するため、内在している NS5A/NS5B 切断配
列で自己切断した断片が生成していることが判った。
【００６３】一方、 MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-172 融合
蛋白質で、ｎ1が 36 以上では、例えば、 MBP-NS5A/5B-
Cpro-2 36-172 融合蛋白質でも、もはや 45 kDa に予測
される MBP の断片、 Cpro-2 ｎ1-172 の断片に当たる
20 kDa より小さい領域でｎ1に従い減少する位置に存在
すると予測されるバンドのいずれも確認されなかった。
だだ、融合蛋白質自体に相当するバンドのみが、 64 kD
a に近い位置に、やはり見いだされている。即ち、 MBP
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-172 融合蛋白質は、ｎ1が 36 以
上では、in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を示さない
ため、内在している NS5A/NS5B 切断配列で自己切断し
た断片が生成していないことが判った。
蛋白質で、ｎ1が 36 以上では、例えば、 MBP-NS5A/5B-
Cpro-2 36-172 融合蛋白質でも、もはや 45 kDa に予測
される MBP の断片、 Cpro-2 ｎ1-172 の断片に当たる
20 kDa より小さい領域でｎ1に従い減少する位置に存在
すると予測されるバンドのいずれも確認されなかった。
だだ、融合蛋白質自体に相当するバンドのみが、 64 kD
a に近い位置に、やはり見いだされている。即ち、 MBP
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-172 融合蛋白質は、ｎ1が 36 以
上では、in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性を示さない
ため、内在している NS5A/NS5B 切断配列で自己切断し
た断片が生成していないことが判った。
【００６４】以上の結果を総合すると、組換え型ＨＣＶ
プロテア−ゼが、例えば、上記する融合蛋白質 MBP-NS5
A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 である場合、Ｃ末の部分ペプチド
鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 として、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 19
0 ≧ ｎ2 ≧ 172 の範囲であれば、ＨＣＶプロテア−ゼ
活性を示すことが判った。
プロテア−ゼが、例えば、上記する融合蛋白質 MBP-NS5
A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 である場合、Ｃ末の部分ペプチド
鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 として、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 19
0 ≧ ｎ2 ≧ 172 の範囲であれば、ＨＣＶプロテア−ゼ
活性を示すことが判った。
【００６５】
【実施例２】MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質
型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼと異なり、 NS5A/NS5B
切断配列を内在していない MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合
蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼにおいても、35
≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧ｎ2 ≧ 172 の範囲であれ
ば、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示すこと検証した。具体
的には、１９０アミノ酸残基の 〔Met〕- Ala1027 〜 P
ro1216 までのペプチド鎖、並びに、更に種々のＮ末及
び／又はＣ末の欠失変異を施したペプチド鎖を、大腸菌
マルト−ス結合蛋白質 MBP のＣ末端に直接連結した MB
P-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼを下記する手段で調製し、該組換え蛋白質のＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を評価した。
型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼと異なり、 NS5A/NS5B
切断配列を内在していない MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合
蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼにおいても、35
≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧ｎ2 ≧ 172 の範囲であれ
ば、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を示すこと検証した。具体
的には、１９０アミノ酸残基の 〔Met〕- Ala1027 〜 P
ro1216 までのペプチド鎖、並びに、更に種々のＮ末及
び／又はＣ末の欠失変異を施したペプチド鎖を、大腸菌
マルト−ス結合蛋白質 MBP のＣ末端に直接連結した MB
P-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質型の組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼを下記する手段で調製し、該組換え蛋白質のＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を評価した。
【００６６】以下に、該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白
質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に用いるプラ
スミドべクタ−の構築、該プラスミドべクタ−を導入し
形質転換した組換え大腸菌の調製、組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼの単離、及びその in vivo でのＨＣＶプロテ
ア−ゼ活性の検証結果を述べる。
質型の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現に用いるプラ
スミドべクタ−の構築、該プラスミドべクタ−を導入し
形質転換した組換え大腸菌の調製、組換え型ＨＣＶプロ
テア−ゼの単離、及びその in vivo でのＨＣＶプロテ
ア−ゼ活性の検証結果を述べる。
【００６７】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現べク
タ−の構築〕先ず、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミ
ノ酸残基からなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド
鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドし、その上流端に、制
限酵素 EcoR I 切断部位と開始コドン ATG (Met) を、
その下流端に、終止コドン TAA と制限酵素 Hind III
切断部位をそれぞれ持つ DNA 断片を、ＰＣＲ法により
増幅し、調製する。この DNA 断片を、 MBP 発現ベクタ
− pMAL-c2 を制限酵素EcoR I と Hind III で切断して
得られるベクタ−断片と T4 DNAリガ−ゼにより連結
し、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 を得る。得られ
るプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2は、 MBP-Cpro-2 ｎ
1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを pMAL-c2 に由
来する tac プロモ−タ−（Ptac）の下流に有し、マ−
カ−遺伝子として、pMAL-c2 に由来するアンピシリン耐
性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。
タ−の構築〕先ず、Ala1027 〜 Pro1216 の１９０アミ
ノ酸残基からなるペプチド鎖に含まれる、部分ペプチド
鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 のみをコ−ドし、その上流端に、制
限酵素 EcoR I 切断部位と開始コドン ATG (Met) を、
その下流端に、終止コドン TAA と制限酵素 Hind III
切断部位をそれぞれ持つ DNA 断片を、ＰＣＲ法により
増幅し、調製する。この DNA 断片を、 MBP 発現ベクタ
− pMAL-c2 を制限酵素EcoR I と Hind III で切断して
得られるベクタ−断片と T4 DNAリガ−ゼにより連結
し、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 を得る。得られ
るプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2は、 MBP-Cpro-2 ｎ
1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡを pMAL-c2 に由
来する tac プロモ−タ−（Ptac）の下流に有し、マ−
カ−遺伝子として、pMAL-c2 に由来するアンピシリン耐
性遺伝子(Ampr)を有するものとなる。
【００６８】更には、MBP発現ベクタ− pMAL-c2 を、制
限酵素 Sca I で切断し、アルカリフォスファタ−ゼに
より処理し、切断端を脱リン酸化する。他方、テトラサ
イクリン耐性遺伝子(Tetr)を、該耐性遺伝子を有するプ
ラスミド pBR322 を制限酵素Ava I と EcoR I とで切断
し、得られる該耐性遺伝子を含む約 1.2 kb 断片を、更
にクレノ−処理により平滑末端化を施し、採取する。こ
の二つのDNA断片を、 T4 DNAリガ−ゼで連結し、テトラ
サイクリン耐性遺伝子(Tetr)を組み込んだMBP発現ベク
タ− pMAL-Tet を構築する。一方、先のプラスミドベク
タ− pCP ｎ1-ｎ2 を制限酵素 Hind III で切断し、ク
レノ−処理により平滑末端化を施した後、制限酵素 Eco
R I で更に切断し、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2）
をコ−ドする DNA 断片を調製する。また、プラスミド
ベクタ− pMAL-Tet を制限酵素Xba I で切断し、クレノ
−処理により平滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I
で更に切断し、ベクタ−断片を調製する。この二つの断
片を連結することで、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2
T を構築した。このプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T
は、 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮ
Ａを pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ptac）の
下流に有し、またマ−カ−遺伝子として、 該プラスミ
ドベクタ− pMAL-Tet に由来するテトラサイクリン耐性
遺伝子(Tetr)を組み込んものとなる。
限酵素 Sca I で切断し、アルカリフォスファタ−ゼに
より処理し、切断端を脱リン酸化する。他方、テトラサ
イクリン耐性遺伝子(Tetr)を、該耐性遺伝子を有するプ
ラスミド pBR322 を制限酵素Ava I と EcoR I とで切断
し、得られる該耐性遺伝子を含む約 1.2 kb 断片を、更
にクレノ−処理により平滑末端化を施し、採取する。こ
の二つのDNA断片を、 T4 DNAリガ−ゼで連結し、テトラ
サイクリン耐性遺伝子(Tetr)を組み込んだMBP発現ベク
タ− pMAL-Tet を構築する。一方、先のプラスミドベク
タ− pCP ｎ1-ｎ2 を制限酵素 Hind III で切断し、ク
レノ−処理により平滑末端化を施した後、制限酵素 Eco
R I で更に切断し、部分ペプチド鎖（Cpro-2 ｎ1-ｎ2）
をコ−ドする DNA 断片を調製する。また、プラスミド
ベクタ− pMAL-Tet を制限酵素Xba I で切断し、クレノ
−処理により平滑末端化を施した後、制限酵素 EcoR I
で更に切断し、ベクタ−断片を調製する。この二つの断
片を連結することで、プラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2
T を構築した。このプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2T
は、 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質をコ−ドするＤＮ
Ａを pMAL-c2 に由来する tac プロモ−タ−（Ptac）の
下流に有し、またマ−カ−遺伝子として、 該プラスミ
ドベクタ− pMAL-Tet に由来するテトラサイクリン耐性
遺伝子(Tetr)を組み込んものとなる。
【００６９】〔組換え基質蛋白質の発現べクタ−の構
築〕ＨＣＶプロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5B）を含
む組換え基質蛋白質として、該切断配列（NS5A/NS5B）
を、MBPのＣ末とADKのＮ末の間に挿入し、このMBPとADK
の融合蛋白質（以降、MBP-NS5A/5B-ADK と略称する。）
を用いた。
築〕ＨＣＶプロテア−ゼの切断配列（NS5A/NS5B）を含
む組換え基質蛋白質として、該切断配列（NS5A/NS5B）
を、MBPのＣ末とADKのＮ末の間に挿入し、このMBPとADK
の融合蛋白質（以降、MBP-NS5A/5B-ADK と略称する。）
を用いた。
【００７０】該 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の発現に
用いるベクタ−は、次の方法で得た。MBP発現プラスミ
ドベクタ−pMAL-c2 を制限酵素 Xmn I と Hind III で
切断し、得られるMBPをコ−ドするDNA（mal E）を含む
ベクタ−断片を精製する。一方、ブタADKをコ−ドするD
NA断片を、クロ−ンされた該ADK遺伝子（ T. Hibino et
al., J. Biotechnol. 32, 139-148 などを参照）を含む
ADK発現ベクタ− pMKAK3 等（特開平 1-51087 号公報、
特開平 1-51088 号公報などを参照）より制限酵素 EcoR
I と Hind III で切断し、精製する。前記MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片とADKをコ−ドす
るDNA断片を、図２に示す合成リンカ−を介して、 T4 D
NAリガ−ゼにより連結する。得られるは、上記する MBP
-NS5A/5B-ADK をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由来する
tac プロモ−タ（Ｐtac）の下流に有し、またマ−カ−
遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有するも
のとなる。
用いるベクタ−は、次の方法で得た。MBP発現プラスミ
ドベクタ−pMAL-c2 を制限酵素 Xmn I と Hind III で
切断し、得られるMBPをコ−ドするDNA（mal E）を含む
ベクタ−断片を精製する。一方、ブタADKをコ−ドするD
NA断片を、クロ−ンされた該ADK遺伝子（ T. Hibino et
al., J. Biotechnol. 32, 139-148 などを参照）を含む
ADK発現ベクタ− pMKAK3 等（特開平 1-51087 号公報、
特開平 1-51088 号公報などを参照）より制限酵素 EcoR
I と Hind III で切断し、精製する。前記MBPをコ−ド
するDNA（mal E）を含むベクタ−断片とADKをコ−ドす
るDNA断片を、図２に示す合成リンカ−を介して、 T4 D
NAリガ−ゼにより連結する。得られるは、上記する MBP
-NS5A/5B-ADK をコ−ドするDNAを pMAL-c2 に由来する
tac プロモ−タ（Ｐtac）の下流に有し、またマ−カ−
遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有するも
のとなる。
【００７１】〔組換え型ＨＣＶプロテア−ゼの発現べク
タ−を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製〕先の工
程で構築したプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T の1
μgと、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の発現ベクタ− p
MAL-AK2 の1 μgを用いて、この２種の発現ベクタ−を
宿主の大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。アンピ
シリン耐性とテトラサイクリン耐性をともに有する菌株
を、アンピシリン 100 μg/ml 及びテトラサイクリン 2
5 μg/ml を添加した LB プレ−トを用いて、選別し
た。参照とするため、MBP発現ベクタ− pMAL-Tet と前
記の pMAL-AK2 を有する組換え大腸菌も調製した。プラ
スミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T と MBP-NS5A/5B-ADK 融
合蛋白質の発現ベクタ− pMAL-AK2 を有する組換え大腸
菌の概要を図８に例示する。
タ−を導入し形質転換した組換え大腸菌の調製〕先の工
程で構築したプラスミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T の1
μgと、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の発現ベクタ− p
MAL-AK2 の1 μgを用いて、この２種の発現ベクタ−を
宿主の大腸菌 HB101 株に導入し形質転換する。アンピ
シリン耐性とテトラサイクリン耐性をともに有する菌株
を、アンピシリン 100 μg/ml 及びテトラサイクリン 2
5 μg/ml を添加した LB プレ−トを用いて、選別し
た。参照とするため、MBP発現ベクタ− pMAL-Tet と前
記の pMAL-AK2 を有する組換え大腸菌も調製した。プラ
スミドベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T と MBP-NS5A/5B-ADK 融
合蛋白質の発現ベクタ− pMAL-AK2 を有する組換え大腸
菌の概要を図８に例示する。
【００７２】〔in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性の検
証〕該 発現ベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T と pMAL-AK2 を有
する組み換え菌を、アンピシリン 100 μg/ml 及びテト
ラサイクリン 25 μg/ml を添加した、 2×YT 培地を用
いて、 37 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養した。その
間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の イソプロ
ピル-β-D-チオガラクシド（IPTG）を添加して、該 MBP
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質の発現を誘導し
た。その後、培養物から集菌した。
証〕該 発現ベクタ− pCP ｎ1-ｎ2 T と pMAL-AK2 を有
する組み換え菌を、アンピシリン 100 μg/ml 及びテト
ラサイクリン 25 μg/ml を添加した、 2×YT 培地を用
いて、 37 ℃、一晩(約 14 時間)振とう培養した。その
間、対数増殖期に、終濃度 1 mM となる量の イソプロ
ピル-β-D-チオガラクシド（IPTG）を添加して、該 MBP
-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質の発現を誘導し
た。その後、培養物から集菌した。
【００７３】これらの組み換え菌の菌体内で、発現され
た該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質が、in vivo のＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を有するか否かを、以下の方法で
検証した。
た該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質が、in vivo のＨ
ＣＶプロテア−ゼ活性を有するか否かを、以下の方法で
検証した。
【００７４】集菌した菌体を破菌し、全菌体蛋白質を S
DS-PAGE に供し、蛋白質を分析した。一例として、プラ
スミドベクタ− pCP 1-190 T 、 pCP 1-175 T 、 pCP 3
5-172 T 、MBP発現ベクタ− pMAL-Tet をそれぞれ有す
る組み換え菌の全菌体蛋白質を分析した結果の比較を、
図９に示す。 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質を発現した
ものでは、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の切断によ
る、MBP の断片に相当する 45 kDa と、ADK の断片に相
当する 26 kDa とに明確なバンドが存在するが、MBP-NS
5A/5B-ADK 融合蛋白質自体に相当する 45＋26 kDa に
は、明確なバンドは観測されていない。図９に示すよう
に、ウサギ抗 MBP 抗体、抗 ADK 抗体を用いたイムノブ
ロット法により、 45 kDa のバンドは MBP の断片であ
り、 26 kDaのバンドは ADK の断片であることが確認さ
れた。更に、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自体に相当
する 45＋26 kDa には、イムノブロット法でも、バンド
の存在は見られなかった。なお、参照としたMBP発現ベ
クタ− pMAL-Tet と pMAL-AK2を有する菌と比較する
と、約 66 kDa にある MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自
体のバンドとは、分子量が少し異なる小さい位置に、相
当する該プロテア−ゼ融合蛋白質の発現を確認すること
ができた。
DS-PAGE に供し、蛋白質を分析した。一例として、プラ
スミドベクタ− pCP 1-190 T 、 pCP 1-175 T 、 pCP 3
5-172 T 、MBP発現ベクタ− pMAL-Tet をそれぞれ有す
る組み換え菌の全菌体蛋白質を分析した結果の比較を、
図９に示す。 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質を発現した
ものでは、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の切断によ
る、MBP の断片に相当する 45 kDa と、ADK の断片に相
当する 26 kDa とに明確なバンドが存在するが、MBP-NS
5A/5B-ADK 融合蛋白質自体に相当する 45＋26 kDa に
は、明確なバンドは観測されていない。図９に示すよう
に、ウサギ抗 MBP 抗体、抗 ADK 抗体を用いたイムノブ
ロット法により、 45 kDa のバンドは MBP の断片であ
り、 26 kDaのバンドは ADK の断片であることが確認さ
れた。更に、 MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自体に相当
する 45＋26 kDa には、イムノブロット法でも、バンド
の存在は見られなかった。なお、参照としたMBP発現ベ
クタ− pMAL-Tet と pMAL-AK2を有する菌と比較する
と、約 66 kDa にある MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自
体のバンドとは、分子量が少し異なる小さい位置に、相
当する該プロテア−ゼ融合蛋白質の発現を確認すること
ができた。
【００７５】MBP-Cpro-2 1-175 融合蛋白質、 MBP-Cpro
-2 35-172 融合蛋白質を発現したものでも、 MBP-NS5A/
5B-ADK 融合蛋白質の切断による、MBP の断片に相当す
る45 kDa と、ADK の断片に相当する 26 kDa とに明確
なバンドが存在する確認された。なお、 MBP-NS5A/5B-A
DK 融合蛋白質自体に相当する約 66 kDa にも、僅かな
がらバンドが存在している。この約 66 kDa にある MBP
-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自体のバンドとは、分子量が
少し異なる小さい位置に、相当する該プロテア−ゼ融合
蛋白質の発現を確認することができた。
-2 35-172 融合蛋白質を発現したものでも、 MBP-NS5A/
5B-ADK 融合蛋白質の切断による、MBP の断片に相当す
る45 kDa と、ADK の断片に相当する 26 kDa とに明確
なバンドが存在する確認された。なお、 MBP-NS5A/5B-A
DK 融合蛋白質自体に相当する約 66 kDa にも、僅かな
がらバンドが存在している。この約 66 kDa にある MBP
-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質自体のバンドとは、分子量が
少し異なる小さい位置に、相当する該プロテア−ゼ融合
蛋白質の発現を確認することができた。
【００７６】なお、本例において、組換え大腸菌の調製
に利用した宿主、大腸菌 HB101 株は、上述する組換え
基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK の産出にも利用され、該
大腸菌 HB101 株に由来するＨＣＶプロテア−ゼ活性を
示す酵素は存在していないことが確認されている。この
ことも考慮すると、上記の細胞内で組換え基質蛋白質MB
P-NS5A/5B-ADK の切断は、それぞれ該プロテア−ゼ融合
蛋白質のＨＣＶプロテア−ゼ活性に因るものであること
が判り、切断は、トランスの切断であることが確認され
る。この切断部位 NS5A/NS5B をトランスの切断で分断
する点でも、天然の Cpro-2 ＨＣＶプロテア−ゼの酵素
反応の特異性を保持している。
に利用した宿主、大腸菌 HB101 株は、上述する組換え
基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK の産出にも利用され、該
大腸菌 HB101 株に由来するＨＣＶプロテア−ゼ活性を
示す酵素は存在していないことが確認されている。この
ことも考慮すると、上記の細胞内で組換え基質蛋白質MB
P-NS5A/5B-ADK の切断は、それぞれ該プロテア−ゼ融合
蛋白質のＨＣＶプロテア−ゼ活性に因るものであること
が判り、切断は、トランスの切断であることが確認され
る。この切断部位 NS5A/NS5B をトランスの切断で分断
する点でも、天然の Cpro-2 ＨＣＶプロテア−ゼの酵素
反応の特異性を保持している。
【００７７】上記の実施例１及ぶ２の結果より、組換え
型ＨＣＶプロテア−ゼに含まれる、部分ペプチド鎖 Cpr
o-2 ｎ1-ｎ2 として、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧
ｎ2≧ 172 の範囲であれば、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を
示すことが判った。即ち、少なくとも部分ペプチド鎖 C
pro-2 35-172 ( Val1061 〜 Val1198 ) のみを保持する
限り、その前後に存在するアミノ酸配列に依らず、ＨＣ
Ｖプロテア−ゼ活性を保持することが判った。
型ＨＣＶプロテア−ゼに含まれる、部分ペプチド鎖 Cpr
o-2 ｎ1-ｎ2 として、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧
ｎ2≧ 172 の範囲であれば、ＨＣＶプロテア−ゼ活性を
示すことが判った。即ち、少なくとも部分ペプチド鎖 C
pro-2 35-172 ( Val1061 〜 Val1198 ) のみを保持する
限り、その前後に存在するアミノ酸配列に依らず、ＨＣ
Ｖプロテア−ゼ活性を保持することが判った。
【００７８】（参考例）これらの組み換え菌の菌体内
で、発現された該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質が、
in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性と同様に、in vitro
でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を示すことを、以下の方
法で検証した。なお、大腸菌 HB101 株に発現ベクタ−
pCP ｎ1-ｎ2 を導入した組み換え菌を、上記実施例１の
手段に準じて調製した。
で、発現された該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質が、
in vivo のＨＣＶプロテア−ゼ活性と同様に、in vitro
でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を示すことを、以下の方
法で検証した。なお、大腸菌 HB101 株に発現ベクタ−
pCP ｎ1-ｎ2 を導入した組み換え菌を、上記実施例１の
手段に準じて調製した。
【００７９】一例として、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白
質のin vitro でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を確認した
結果を述べる。先ず、発現ベクタ− pCP 1-190 を導入
した大腸菌 HB101 株を、2 × YT 培地を用い、 30 ℃
で 14 時間培養し、次いで IPTG を終濃度 1 mM となる
ように添加後、引き続いて 4 時間培養した。計 2 lの
培養液から、集菌した菌体を 1 mM DDT を添加したアミ
ロ−ス緩衝液 ( 20 mMTris-HCl, pH 7.4 / 200 mM NaCl
/ 1 mM EDTA ) 100 ml に懸濁し、超音波破砕した。 4
5,000 rpm で 30 分間超遠心分離した後、上清を分取し
た。この上清をアミロ−スカラム ( 3.2 × 6.25 cm)
にアプライし、アフィニティクロマトグラフィ−にか
け、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の分離を行った。ア
ミロ−ス緩衝液で洗浄した後、10 mM マルト−スを含む
同緩衝液で吸着画分を溶出させた。この吸着画分に含ま
れる蛋白質を SDS-PAGE 法で分析したところ、図１１に
示すように、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質のバンドが
見られ、精製されていることが判る。
質のin vitro でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を確認した
結果を述べる。先ず、発現ベクタ− pCP 1-190 を導入
した大腸菌 HB101 株を、2 × YT 培地を用い、 30 ℃
で 14 時間培養し、次いで IPTG を終濃度 1 mM となる
ように添加後、引き続いて 4 時間培養した。計 2 lの
培養液から、集菌した菌体を 1 mM DDT を添加したアミ
ロ−ス緩衝液 ( 20 mMTris-HCl, pH 7.4 / 200 mM NaCl
/ 1 mM EDTA ) 100 ml に懸濁し、超音波破砕した。 4
5,000 rpm で 30 分間超遠心分離した後、上清を分取し
た。この上清をアミロ−スカラム ( 3.2 × 6.25 cm)
にアプライし、アフィニティクロマトグラフィ−にか
け、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質の分離を行った。ア
ミロ−ス緩衝液で洗浄した後、10 mM マルト−スを含む
同緩衝液で吸着画分を溶出させた。この吸着画分に含ま
れる蛋白質を SDS-PAGE 法で分析したところ、図１１に
示すように、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質のバンドが
見られ、精製されていることが判る。
【００８０】この精製された吸着画分を、アミコン社製
DIAFLO (TM) 限外濾過器を用いて、ＹＭ３０メンブレ
ンで 10 ml まで濃縮した。次いで、セファクリル (Sep
hacryl) S-300 HR カラム( 2.2 × 100 cm )にのせ、ゲ
ル濾過を行った。分画を 3.8ml ずつとし、流出する該
MBP-Cpro-2 1-1900 を含む画分を採取した。このゲル濾
過クロマトグラフィ−の結果、図１２に示すように、画
分 40 付近と画分 65 付近に二つのピ−クとして得られ
た。即ち、画分 40 付近のボイドの位置に多くの部分
は、凝集体として存在しているが、単量体の位置に当た
る画分 65 付近に少しであるが分離されていた。 SDS-P
AGE 法で分析したところ、図１２（Ｂ）に示すように、
画分 61 〜 67 に、単量体の MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋
白質が溶出していることが確認できた。
DIAFLO (TM) 限外濾過器を用いて、ＹＭ３０メンブレ
ンで 10 ml まで濃縮した。次いで、セファクリル (Sep
hacryl) S-300 HR カラム( 2.2 × 100 cm )にのせ、ゲ
ル濾過を行った。分画を 3.8ml ずつとし、流出する該
MBP-Cpro-2 1-1900 を含む画分を採取した。このゲル濾
過クロマトグラフィ−の結果、図１２に示すように、画
分 40 付近と画分 65 付近に二つのピ−クとして得られ
た。即ち、画分 40 付近のボイドの位置に多くの部分
は、凝集体として存在しているが、単量体の位置に当た
る画分 65 付近に少しであるが分離されていた。 SDS-P
AGE 法で分析したところ、図１２（Ｂ）に示すように、
画分 61 〜 67 に、単量体の MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋
白質が溶出していることが確認できた。
【００８１】画分 63 を酵素溶液とし、予め調製した組
換え基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK溶液を用いて、in vit
ro のＨＣＶプロテア−ゼアッセイを行なった。図１０
に示すように、酵素溶液の使用量に依存して、切断で生
成する MBP の断片と ADKの断片の量は増加していた。
即ち、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質は、酵素量に依存
した、特異的なＨＣＶプロテア−ゼ活性を in vitro で
も示すことが判った。同じく、組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼに含まれる、部分ペプチド鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とし
て、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧ ｎ2 ≧ 172 の範囲
であれば、invitro でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す
ことが判った。
換え基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK溶液を用いて、in vit
ro のＨＣＶプロテア−ゼアッセイを行なった。図１０
に示すように、酵素溶液の使用量に依存して、切断で生
成する MBP の断片と ADKの断片の量は増加していた。
即ち、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質は、酵素量に依存
した、特異的なＨＣＶプロテア−ゼ活性を in vitro で
も示すことが判った。同じく、組換え型ＨＣＶプロテア
−ゼに含まれる、部分ペプチド鎖 Cpro-2 ｎ1-ｎ2 とし
て、35 ≧ ｎ1 ≧ 1 、且つ 190 ≧ ｎ2 ≧ 172 の範囲
であれば、invitro でもＨＣＶプロテア−ゼ活性を示す
ことが判った。
【００８２】
【発明の効果】本発明の組換え型ＨＣＶプロテア−ゼ
は、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2の特異的なプロ
テア−ゼ活性に不可欠なペプチド鎖を含有するので、天
然のＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 に特異的なプロテア−
ゼ活性を有し、また、形質転換大腸菌などの微生物細胞
内において大量に生産することができる。天然のＨＣＶ
プロテア−ゼ（p70）に存在する、ＲＮＡヘリカ−ゼな
どの不要なペプチド鎖を含まないので、相互に集塊して
不溶化、不活性化を生ずることが少ない利点がある。更
には、ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の有する切断部位ア
ミノ酸配列の特異性を保持するので、係る切断部位アミ
ノ酸配列を有する種々のポリペプチドの消化酵素とし
て、高い利用価値を持つ。即ち、ポリペプチドの酵素消
化により、複合タンパク質から酵素活性を示す部分ペプ
チドの分離などに利用することができる。
は、該セリンプロテア−ゼ型の Cpro-2の特異的なプロ
テア−ゼ活性に不可欠なペプチド鎖を含有するので、天
然のＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 に特異的なプロテア−
ゼ活性を有し、また、形質転換大腸菌などの微生物細胞
内において大量に生産することができる。天然のＨＣＶ
プロテア−ゼ（p70）に存在する、ＲＮＡヘリカ−ゼな
どの不要なペプチド鎖を含まないので、相互に集塊して
不溶化、不活性化を生ずることが少ない利点がある。更
には、ＨＣＶプロテア−ゼ Cpro-2 の有する切断部位ア
ミノ酸配列の特異性を保持するので、係る切断部位アミ
ノ酸配列を有する種々のポリペプチドの消化酵素とし
て、高い利用価値を持つ。即ち、ポリペプチドの酵素消
化により、複合タンパク質から酵素活性を示す部分ペプ
チドの分離などに利用することができる。
配列番号：１ 配列の長さ： 138 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。 配列 Val 1 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 5 10 15 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 35 40 45 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 50 55 60 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 65 70 75 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 80 85 90 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 95 100 105 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 110 115 120 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 125 130 135 Pro Val 138 配列番号：２ 配列の長さ： 138 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val 1 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 5 10 15 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 35 40 45 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 50 55 60 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 65 70 75 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 80 85 90 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 95 100 105 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 110 115 120 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 125 130 135 Pro Val 138 配列番号：３ 配列の長さ： 190 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置： 16 X04 は、 Cys , Thr 又は Ala を示
す。 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。 配列 (Met) Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly X04 Ile Ile Thr Ser 10 15 20 Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr 175 180 185 Asp Asn Ser Ser Pro *** 190 配列番号：４ 配列の長さ： 570 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC 15 G TAC CGC GGA TAG TGC CGG Met Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 TAT TCC CAA CAA ACG CGG GGC CTG CTT GGC TGT ATC ATC ACT AGC 60 ATA AGG GTT GTT TGC GCC CCG GAC GAA CCG ACA TAG TAG TGA GTG Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser 10 15 20 CTC ACA GGT CGG GAC AAG AAC CAG GTC GAT GGG GAG GTT CAG TCG 105 CTC TCC ACC GCA ACG CAA TCT TTC CTG GCG ACC TGC GTC AAT CAC Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 GAG TGT CCA GCC CTG TTC TTG GTC CAG CTA CCC CTC CAA GTC GGC 150 GAG AGG TGG CGT TGC GTT AGA AAG GAC CGC TGG ACG CAG TTA GCC Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 40 45 50 GTG TGT TGG ACC GTC TAC CAT GGT GCC GGC TCG AAG ACC CTG CCG 195 GGC CCG AAG GGT CCA ATC ACC CAA ATG TAC ACC AAT GTA GAC CGG Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 CAC ACA ACC TGG CAG ATG GTA CCA CGG CCG AGC TTC TGG GAC CAG 240 CCG GGC TTC CCA GGT TAG TGG GTT TAC ATG TGG TTA CAT CTG GTC Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 GAC CTC GTC GGC TGG CCG GCG CCC CCC GGG GCG CGC TCC ATG ACA 285 CTG GAG CAG CCG ACC GGC CGC GGG GGG CCC CGC GCG AGG TAC TGT Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 CCG TGC ACC TGC GGC AGC TCG GAC CTT TAC TTG GTC ACG AGG CAT 330 GGC ACG TGG ACG CCG TCG AGC CTG GAA ATG AAC CAG TGC TCC GTA Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ １００
１０５ １１０ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＡ
ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＡＧＴ ３７５ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ
ＣＣＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＡ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １１５
１２０ １２５ ＣＴＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＡＣ
ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＧＧＴ ４２０ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＴＧ
ＧＡＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＣＡ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １３０
１３５ １４０ ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＣＧ ＧＧＧ ＣＡＣ
ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ４６５ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＣＣ ＧＴＧ
ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ １４５
１５０ １５５ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＣＧ
ＡＡＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＴＡ ５１０ ＣＧＡ ＣＧＡ ＣＡＣ ＡＣＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＧＣ
ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｉｌｅ １６０
１６５ １７０ ＣＣＣ ＧＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ５５５ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＡＣ
ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＧＴ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ １７５
１８０ １８５ ＧＡＣ ＡＡＣ ＴＣＡ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＡ
５７０ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＧＡ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ＊＊＊ １９０
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。 配列 Val 1 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 5 10 15 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 35 40 45 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 50 55 60 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 65 70 75 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 80 85 90 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 95 100 105 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 110 115 120 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 125 130 135 Pro Val 138 配列番号：２ 配列の長さ： 138 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val 1 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 5 10 15 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 35 40 45 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 50 55 60 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 65 70 75 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 80 85 90 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 95 100 105 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 110 115 120 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 125 130 135 Pro Val 138 配列番号：３ 配列の長さ： 190 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置： 16 X04 は、 Cys , Thr 又は Ala を示
す。 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。 配列 (Met) Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly X04 Ile Ile Thr Ser 10 15 20 Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr 175 180 185 Asp Asn Ser Ser Pro *** 190 配列番号：４ 配列の長さ： 570 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC 15 G TAC CGC GGA TAG TGC CGG Met Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 TAT TCC CAA CAA ACG CGG GGC CTG CTT GGC TGT ATC ATC ACT AGC 60 ATA AGG GTT GTT TGC GCC CCG GAC GAA CCG ACA TAG TAG TGA GTG Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser 10 15 20 CTC ACA GGT CGG GAC AAG AAC CAG GTC GAT GGG GAG GTT CAG TCG 105 CTC TCC ACC GCA ACG CAA TCT TTC CTG GCG ACC TGC GTC AAT CAC Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 GAG TGT CCA GCC CTG TTC TTG GTC CAG CTA CCC CTC CAA GTC GGC 150 GAG AGG TGG CGT TGC GTT AGA AAG GAC CGC TGG ACG CAG TTA GCC Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 40 45 50 GTG TGT TGG ACC GTC TAC CAT GGT GCC GGC TCG AAG ACC CTG CCG 195 GGC CCG AAG GGT CCA ATC ACC CAA ATG TAC ACC AAT GTA GAC CGG Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 CAC ACA ACC TGG CAG ATG GTA CCA CGG CCG AGC TTC TGG GAC CAG 240 CCG GGC TTC CCA GGT TAG TGG GTT TAC ATG TGG TTA CAT CTG GTC Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 GAC CTC GTC GGC TGG CCG GCG CCC CCC GGG GCG CGC TCC ATG ACA 285 CTG GAG CAG CCG ACC GGC CGC GGG GGG CCC CGC GCG AGG TAC TGT Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 CCG TGC ACC TGC GGC AGC TCG GAC CTT TAC TTG GTC ACG AGG CAT 330 GGC ACG TGG ACG CCG TCG AGC CTG GAA ATG AAC CAG TGC TCC GTA Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ １００
１０５ １１０ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＡ
ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＡＧＴ ３７５ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ
ＣＣＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＡ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １１５
１２０ １２５ ＣＴＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＡＣ
ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＧＧＴ ４２０ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＴＧ
ＧＡＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＣＡ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １３０
１３５ １４０ ＧＧＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＣＧ ＧＧＧ ＣＡＣ
ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ４６５ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＣＣ ＧＴＧ
ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ １４５
１５０ １５５ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＣＧ
ＡＡＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＴＡ ５１０ ＣＧＡ ＣＧＡ ＣＡＣ ＡＣＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＧＣ
ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｉｌｅ １６０
１６５ １７０ ＣＣＣ ＧＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ５５５ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＡＣ
ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＧＴ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ １７５
１８０ １８５ ＧＡＣ ＡＡＣ ＴＣＡ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＡ
５７０ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＧＡ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ＊＊＊ １９０
【図１】 ＨＣＶセリンプロテア−ゼの活性ドメイン C
pro-2 の Ala1027〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖をコ−ドする DNA の核酸配列を示
す。
pro-2 の Ala1027〜 Pro1216 の１９０アミノ酸残基か
らなるペプチド鎖をコ−ドする DNA の核酸配列を示
す。
【図２】 ＨＣＶセリンプロテア−ゼの活性ドメイン C
pro-2 が特異的に切断するアミノ酸配列 NS5A/NS5B の
部分をコ−ドする DNA の核酸配列を示す。
pro-2 が特異的に切断するアミノ酸配列 NS5A/NS5B の
部分をコ−ドする DNA の核酸配列を示す。
【図３】 プラスミド pCPCS190 の構成の概要と該発現
ベクタ− pCPCS190を有する組み換え菌を培養して得ら
れる蛋白質を分析した結果を示す。
ベクタ− pCPCS190を有する組み換え菌を培養して得ら
れる蛋白質を分析した結果を示す。
【図４】 Ｃ末の欠失する MBP-NS5A/5B-Cpro-2 1-ｎ2
融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） SDS
-PAGE 法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブ
ロット法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット
法で分析評価した結果を比較する。
融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） SDS
-PAGE 法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブ
ロット法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット
法で分析評価した結果を比較する。
【図５】 Ｎ末の欠失する MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-17
2 融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） S
DS-PAGE 法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノ
ブロット法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロッ
ト法で分析評価した結果を比較する。
2 融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） S
DS-PAGE 法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノ
ブロット法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロッ
ト法で分析評価した結果を比較する。
【図６】 種々の MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋
白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ｄ） SDS-PAGE
法、（Ｅ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブロット
法、（Ｆ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット法で分
析評価した結果を比較する。
白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ｄ） SDS-PAGE
法、（Ｅ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブロット
法、（Ｆ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット法で分
析評価した結果を比較する。
【図７】 Ｎ末の欠失する MBP-NS5A/5B-Cpro-2 ｎ1-17
2 融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） S
DS-PAGE 法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロッ
ト法で分析評価した結果を比較する。
2 融合蛋白質の菌体内での自己切断の有無を、（Ａ） S
DS-PAGE 法、（Ｃ） 抗 MBP 抗体を用いたイムノブロッ
ト法で分析評価した結果を比較する。
【図８】 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 融合蛋白質の発現ベク
タ− pCP ｎ1-ｎ2 Tと MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の
発現ベクタ− pMAL-AK2 を有する組換え大腸菌の概要及
び細胞内で組換え基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK の該プ
ロテア−ゼ融合蛋白質による切断の過程を示す。
タ− pCP ｎ1-ｎ2 Tと MBP-NS5A/5B-ADK 融合蛋白質の
発現ベクタ− pMAL-AK2 を有する組換え大腸菌の概要及
び細胞内で組換え基質蛋白質 MBP-NS5A/5B-ADK の該プ
ロテア−ゼ融合蛋白質による切断の過程を示す。
【図９】 組換え大腸菌の細胞内での、組換え基質蛋白
質 MBP-NS5A/5B-ADKの該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 プロテア
−ゼ融合蛋白質による切断の有無を、（Ａ） SDS-PAGE
法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブロット
法、（Ｃ）抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット法で分
析評価した結果を比較する。
質 MBP-NS5A/5B-ADKの該 MBP-Cpro-2 ｎ1-ｎ2 プロテア
−ゼ融合蛋白質による切断の有無を、（Ａ） SDS-PAGE
法、（Ｂ） 抗 NS3(p70) 抗体を用いたイムノブロット
法、（Ｃ）抗 MBP 抗体を用いたイムノブロット法で分
析評価した結果を比較する。
【図１０】 in vitro のＨＣＶプロテア−ゼアッセイ
で、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質による組換え基質蛋
白質 MBP-NS5A/5B-ADK の切断を評価した結果、及びそ
のＨＣＶプロテア−ゼ活性の酵素量依存性を示す。
で、 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋白質による組換え基質蛋
白質 MBP-NS5A/5B-ADK の切断を評価した結果、及びそ
のＨＣＶプロテア−ゼ活性の酵素量依存性を示す。
【図１１】 組換え大腸菌の培養による MBP-Cpro-2 1-
190 融合蛋白質の発現及び該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋
白質のアフィニティクロマトグラフィ−による分離精製
を示す。
190 融合蛋白質の発現及び該 MBP-Cpro-2 1-190 融合蛋
白質のアフィニティクロマトグラフィ−による分離精製
を示す。
【図１２】 ゲル濾過クロマトグラフィ−による MBP-C
pro-2 1-190 融合蛋白質単量体の分割精製を示す。
pro-2 1-190 融合蛋白質単量体の分割精製を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 知場 伸介 埼玉県戸田市新曽南三丁目17番35号 株式 会社ジャパンエナジ−内 (72)発明者 林 秀也 埼玉県戸田市新曽南三丁目17番35号 株式 会社ジャパンエナジ−内
Claims (5)
- 【請求項１】 下記するアミノ酸配列（Ｉ）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 （配列中、 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。） で表されるペプチド鎖をプロテア−ゼ活性領域として含
むポリペプチドからなる組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロ
テア−ゼ。 - 【請求項２】 アミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプチド
鎖が、下記するアミノ酸配列（II）： Val 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly 40 45 50 Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val 172 で表されるペプチド鎖であることを特徴とする請求項１
に記載の組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ。 - 【請求項３】 下記するアミノ酸配列（III）： (Met) Ala Pro Ile Thr Ala -1 1 5 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly X04 Ile Ile Thr Ser 10 15 20 Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu Val Gln Val 25 30 35 Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr X01 Val Asn Gly 40 45 50 Val X02 Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala 55 60 65 Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His 100 105 110 Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg 145 150 155 Ala Ala Val X03 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile 160 165 170 Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr 175 180 185 Asp Asn Ser Ser Pro *** 190 （配列中、 存在位置： 16 X04 は、 Cys , Thr 又は Ala を示
す。 存在位置： 47 X01 は、 Cys , Thr 又は Ser を示
す。 存在位置： 52 X02 は、 Cys 又は Leu を示す。 存在位置： 159 X03 は、 Cys 又は Ala を示す。) で表される配列中、アミノ酸の存在位置ｎ1及びアミノ
酸の存在位置ｎ2、（但し、ｎ1、ｎ2は、正の整数であ
り、１≦ｎ1＜ｎ2≦１９０である。）を両端とする部分
アミノ酸配列で表わされ、ｎ1＝２３且つ１７２≦ｎ2≦
１８０、２４≦ｎ1≦３５且つｎ2＝１８１、又は２４≦
ｎ1≦３５且つ１７２≦ｎ2≦１８０の何れかを満たすペ
プチド鎖を、上記するプロテア−ゼ活性領域として含む
ポリペプチドからなることを特徴とする請求項１又は２
に記載の組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ。 - 【請求項４】 プロテア−ゼ活性領域となる上記するア
ミノ酸配列（Ｉ）で表されるペプチド鎖を、非Ｃ型肝炎
ウイルス由来の蛋白質のペプチド鎖のＣ末に連結してな
るポリペプチドである請求項１に記載の組換え型Ｃ型肝
炎ウイルスプロテア−ゼ。 - 【請求項５】 請求項１〜４に記載の組換え型Ｃ型肝炎
ウイルスプロテア−ゼを製造するにあたり、該組換え型
Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼをコ−ドするＤＮＡを含
んでなる環状プラスミドベクタ−により形質転換してな
る該組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼの生産能を
有する形質転換微生物を培養して、その培養物より該組
換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼを採取することを
特徴とする組換え型Ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼの製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7308590A JPH099961A (ja) | 1995-04-28 | 1995-11-02 | 組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12738195 | 1995-04-28 | ||
| JP7-127381 | 1995-04-28 | ||
| JP7308590A JPH099961A (ja) | 1995-04-28 | 1995-11-02 | 組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH099961A true JPH099961A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=26463353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7308590A Pending JPH099961A (ja) | 1995-04-28 | 1995-11-02 | 組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH099961A (ja) |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP7308590A patent/JPH099961A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2219637T3 (es) | Proteasa del virus de la hepatitis c. | |
| JP3091231B2 (ja) | 可溶性で活性なｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ | |
| AU691259B2 (en) | Method for reproducing in vitro the proteolytic activity of the NS3 protease of hepatitis C virus (HCV) | |
| US5989905A (en) | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility | |
| IE84608B1 (en) | Hepatitis C virus protease | |
| CA2228265C (en) | Methodology to produce, purify and assay polypeptides with the proteolytic activity of the hcv ns3 protease | |
| JP3045778B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの不溶性凝集物をリフォールディングするための方法 | |
| JPH10506539A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの可溶性の切断可能な基質 | |
| WO2000040707A1 (en) | Modified forms of hepatitis c virus ns3 protease | |
| JPH099961A (ja) | 組換え型ｃ型肝炎ウイルスプロテア−ゼ | |
| IE911130A1 (en) | Hepatitis c protease inhibitors | |
| KR100254830B1 (ko) | 비(b)형 간염 바이러스 표면항원과 씨(c)형 간염 바이러스 초변화 영역 단백질의 융합 단백질인 프리에스2에이치브이 및 그의 제조 방법 | |
| JPH07184648A (ja) | Ｈｃｖプロテイナーゼ活性物質、その製造法並びに同プロテイナーゼおよび同プロテイナーゼ阻害剤のアッセイ法 | |
| WO1998013482A1 (en) | Detergent-free hepatitis c protease | |
| IE85503B1 (en) | Hepatitis c virus protease | |
| JPH06315377A (ja) | 分子間反応により部位特異的切断を行うｈｃｖ由来プロテイナーゼ活性物質およびその精製法 | |
| KR19980069020A (ko) | 히스티딘이 표지된 한국형 c 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4a 및 그의 제조방법 |