JPH1010065A - イムノセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗体抗原反応を抗体固定化電極上であるいは
抗原固定化電極上で行わせ、その反応の有無あるいは進
行の程度を抗体抗原反応に伴う抗体固定化電極間のある
いは抗原固定化電極間の電気的性質の変化として測定で
きる、安価で操作が簡単なイムノセンサの提供。 【解決手段】（Ａ）表面に抗体あるいは抗原を固定した
１対の抗体固定化電極あるいは抗原固定化電極を有し、
該抗体固定化電極あいるは抗原固定化電極の間には抗体
あるいは抗原を含むタンパク質層によって電気的に結合
している電極部および（Ｂ）これら電極間の電気的性質
を測定する計測器から構成されていることを特徴とする
イムノセンサ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗体抗原反応の有
無、あるいは進行の程度を検知するための装置すなわち
イムノセンサに関する。

【０００２】

【従来技術】抗体を用いた物質の検出法としては、抗体
あるいは抗原をプラスチックス等の固相に固定化し、抗
原あるいは抗体を放射同位体や酵素で標識化する方法が
広く知られており、例えば井上國世の総説に詳細が記さ
れている（化学と生物、ｖｏｌ．３４、ｐ２４０、１９
９６）。さらに例えば特開平６−２６１７８４号公報、
特開平７−１５９４０３号公報、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．
２７，ｐ４９，１９８５およびＪｏｕｒｎａｌｏｆ ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．
１６，ｐ２１１，１９９２等で具体的な方法が提案され
ている。

【０００３】抗体抗原反応に伴う質量変化を測定する方
法としてピエゾ素子を用いる方法（例えば特開平３−２
９５４４３号公報やＳｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕ
ａｔｏｒｓ Ｂ，ｖｏｌ．１３−１４，ｐ１８８，１９
９３等）や光音響を用いる方法（例えば特開平３−２９
８３６号公報）あるいは弾性表面波を利用した方法（例
えば特開平６−１３３７５９号公報）が提案されてい
る。

【０００４】抗体抗原反応を光学的に測定する方法とし
て表面プラズモン共鳴を用いた方法が例えば特開平１−
２２４６４７号公報、特開平２−１０３４６９号公報、
特開平２−２９７０５３号公報等で提案されている。

【０００５】抗体抗原反応を電気変化として測定する方
法としては、抗体あるいは抗原を固定化した膜の膜電位
差を測定する方法（例えばＪｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍ
ｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．７，ｐ１，１９
８０やＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，
ｖｏｌ．２７４，ｐ５９，１９９３等）、抗体あるいは
抗原を固定化した電極の電極電位差を測定する方法（例
えば特公昭５９−３７４６２やＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，
２６，ｐ１５６９，１９８０等）、ゲート部分に抗体あ
るいは抗原を固定化したイオン感受性電解効果型トラン
ジスタを用いる方法（例えば特開平１−１１９７５３号
公報や特公平３−２６３４５号公報）等も提案されてい
る。

【０００６】抗体あるいは抗原を固定化した電極を用い
て、抗体あるいは抗原を固定化した電極間に満たした純
水の電気伝導度変化を測定する方法が、特表平６−８２
３２８７号公報や平成５年度電気化学協会大会講演要旨
集，ｖｏｌ．６０ｔｈ，ｐ２１４，１９９３において提
案されている。

【０００７】抗原あるいは抗体を放射同位体や酵素で標
識化したものを使う方法は、抗体抗原反応後に洗浄した
のちに放射活性や酵素活性を測定するため、操作が煩雑
であり、測定に時間がかかる。さらに分子量の小さい抗
原（ハプテン）の測定は、競合法によるため高感度測定
が期待できない。

【０００８】ピエゾ素子、光音響、弾性表面波あるいは
表面プラズモン共鳴を利用した方法は、測定装置が大型
かつ高価なため汎用方法とは成り得ない。また従来の抗
体抗原反応を電気的変化として測定する方法は、多くの
方法が提案されているものの測定感度や操作性に問題が
あり、いまだ実用化されていない。

【０００９】電気伝導度変化を測定する方法として提案
されている特表平６−８２３２８７号公報の記載内容を
詳細に検討すると、極面積０．７８５ｃｍ²、極間０．
０５ｃｍの電極セルで測られた純水の電気伝導度は６５
μＳ／ｃｍであり、通常の純水の概念である１μＳ／ｃ
ｍ以下とは大きく異なる。

【００１０】さらにこの公報に記載の極面積０．７８５
ｃｍ²、極間０．０５ｃｍの電極セルを用いて通常の純
水の概念である１μＳ／ｃｍ以下を測定するには、対向
した抗体固定化電極間の距離を約８μｍにする必要があ
ると算出されるが、極面積０．７８５ｃｍ²で電極間の
距離が約８μｍの電極セルの作成が極めて困難であるこ
とは容易に推定できる。このように特表平６−８２３２
８７公号報において提案されている方法は、記載事項に
誤りがあるか、あるいは実現性に乏しいものと言わざる
を得ない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗体
抗原反応を抗体固定化電極上であるいは抗原固定化電極
上で行わせ、その反応の有無あるいは進行の程度を抗体
抗原反応に伴う抗体固定化電極間のあるいは抗原固定化
電極間の電気的性質の変化として測定できる、安価で操
作が簡単なイムノセンサを提供する点にある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗体抗原
反応に伴う抗体あるいは抗原固定化電極間の電気的性質
の変化を汎用の測定器で測定することにより、抗体抗原
反応を測定する安価で単純な方法を提供することを目的
として多くの実験を行った。

【００１３】その結果抗体あるいは抗原を表面に固定化
した２枚の抗体固定化電極あるいは抗原固定化電極を用
いて、抗体抗原反応に伴う当該抗体固定化電極あるいは
抗原固定化電極間の電気的性質の変化が測定可能である
ことを見いだした。さらにその場合において、抗体固定
化電極あるいは抗原固定化電極の面積を互いに異ならせ
ることにより、抗体固定化電極間あるいは抗原固定化電
極間の電気的性質の変化が大きくなることおよびこの電
気的性質の変化には抗体固定化電極間あるいは抗原固定
化電極間を電気的に結合させる抗体あるいは抗原含有層
が必要であることを見い出し、本発明に至った。

【００１４】本発明は、（Ａ）表面に抗体あるいは抗原
を固定した１対の抗体固定化電極あるいは抗原固定化電
極を有し、該抗体固定化電極あいるは抗原固定化電極の
間には抗体あるいは抗原を含むタンパク質層によって電
気的に結合している電極部および（Ｂ）これら電極間の
電気的性質を測定する計測器から構成されていることを
特徴とするイムノセンサに関する。

【００１５】本発明のイムノセンサを用いるにあたって
は、測定対象物が抗原である場合は、前記電極部は２枚
の抗体固定化電極を、逆に測定対象物が抗体である場合
は、前記電極部は２枚の抗原固定化電極を各々使用す
る。

【００１６】測定対象物が抗原であり、前記電極部が２
枚の抗体固定化電極である場合、抗体は測定対象物であ
る抗原を特異的に認識する性質を有していれば、モノク
ローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれもが
利用可能である。しかし、検出感度や抗体の性質の安定
性を考慮すれば、モノクローナル抗体の方がポリクロー
ナル抗体より優れていることは、言うまでもない。

【００１７】抗体あるいは抗原を固定化する電極の材質
は電極部の電気的性質の変化を検出可能なものであれば
どのようなものでも利用が可能であり、例えば金、銀、
銅、白金、ニッケル、スズ等の金属や酸化亜鉛等の酸化
金属、あるいは導電性の各種合成樹脂等を挙げることが
できる。

【００１８】抗体あるいは抗原を電極表面に固定化する
方法としては、電気化学法−応用測定マニュアル（逢
坂、小山編、講談社サイエンティフィク、１９９１年）
に記載されているように、例えば吸着による固定化や電
極表面への化学的結合法等を挙げることができる。さら
に、このうち電極表面への化学的結合法の具体的な方法
としては、特表平６−８２３２８７号公報や平成５年度
電気化学協会大会講演要旨集（ｖｏｌ．６０ｔｈ，ｐ２
１４，１９９３）に記載されているδ−アミノプロピル
トリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用いて
電極表面に導入したアミノ基等の官能基にグルタルアル
デヒド等の架橋剤によって抗体あるいは抗原を結合させ
る方法を挙げることができる。

【００１９】電極表面に導入したアミノ基やカルボキシ
ル基等の官能基に抗体あるいは抗原を結合させるための
架橋剤としては、グルタルアルデヒドの他に１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、ジメチルホルムアミド、マレイミドベンゾイルオキ
シサクシンイミド等を挙げることができる。

【００２０】本発明に用いる電極部を構成する１対の抗
体固定化電極あるいは抗原固定化電極は、互いの面積が
異なることにより測定感度が向上する性質を有する。特
表平６−８２３２８７号公報で提案されている方法にお
いては、感度を高めるために抗体固定化電極の面積を大
きくする工夫が種々提案されているが、電極部を構成す
る２枚の抗体固定化電極の１方を大きくしたりあるいは
小さくしたりするという技術思想は見られない。

【００２１】本発明者らは細い電極を１枚の基板上に並
行に配置した櫛形電極部を用いて、抗体固定化電極ある
いは抗原固定化電極の対となる２枚の電極の面積比と検
出感度について検討を行った。その結果、対となる２枚
の抗体あるいは抗原固定化電極の面積比が１より異なる
ほど検出感度が向上することを見いだしている。

【００２２】勿論、本発明においても１対の電極のうち
の一方はその電極面積が大きい方が好ましい。そのため
には特表平６−８２３２８７号公報記載の櫛型電極やラ
セン型電極という概念を応用することができる。

【００２３】本発明に用いる電極部は、抗体固定化電極
あるいは抗原固定化電極の間が抗体あるいは抗原を含む
タンパク質によって電気的に結合していることが重要で
ある。特表平６−８２３２８７号公報で提案されている
方法においては抗体は電極上に固定することについは記
載されているが、電極間に前記抗体あるいは抗原を含む
タンパク質層を介在させるという技術思想については何
の示唆もない。前記抗体あるいは抗原を含むタンパク質
層は、その導電率が１０^-4Ｓ／ｃｍ以下であり、好まし
くは１０^-7Ｓ／ｃｍ以上である。とくに好ましい導電率
の範囲は１０^-5〜１０^-6Ｓ／ｃｍである。

【００２４】本発明においては、抗体固定化電極あるい
は抗原固定化電極の１対のみを有する電極部を用いて抗
体抗原反応を検出する場合には、抗体抗原反応の前と後
で電極間の電気的変化をそれぞれ測定する必要があり、
２回の測定作業が不可欠である。ところが、電極部に抗
体あるいは抗原を固定化していない参照用電極を組み入
れると、抗体抗原反応の測定を１回ですますことができ
る。

【００２５】抗体あるいは抗原を固定化しない参照用電
極の作成は、参照用電極表面をテフロンテープ等を用い
て物理的にマスキングすることにより、抗体あるいは抗
原の固定化反応が及ばないようにすることによって容易
に行うことがで可能である。

【００２６】さらに本発明に用いる電極部にガード電極
を組み入れることにより、電気的なノイズを除き、より
感度を向上させることもできる。

【００２７】本発明の電極部の電気的変化を測定する計
測器の具体的な例としては、汎用の電気伝導度計を挙げ
ることができる。しかし電気伝導度は溶液の抵抗値の逆
数であり、さらに抵抗値は電流値と電圧値の関数である
ので、計測器は電極間の抵抗値や電流値あるいは電圧値
等を測定することのできるものであればいかなる計測器
でも良いことは言うまでもない。

【００２８】本発明のイムノセンサはメタンフェタミン
の検出方法に極めて有用である。

【００２９】覚醒剤に関連する事件の増加にともない、
メタンフェタミンの使用者を簡便、迅速かつ正確に認知
する必要性が高まり、簡便かつ高感度、高選択的にメタ
ンフェタミンを測定する方法及び測定キットが望まれて
いる。

【００３０】現在、メタンフェタミンを特異的に認識す
るモノクローナル抗体を用いた測定システムは、酵素免
疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法；ＥＬＩＳＡ法）を基本
にした競合法によるものが提案されている。しかしこの
方法では、結果の判定に分光光度計などの特殊な科学機
器が必要であり、また操作が複雑なことから使用者には
特殊な技術を要求される。

【００３１】また、現在提案されているモノクローナル
抗体を用いた測定キットはキットの構成要素である固定
化抗原がメタンフェタミンであるため、製造、販売にお
いて法律の規制を受ける。特開平７−６３７５５号公報
および特開平７−１５９４０３号公報においては、キッ
トの構成要素としてメタンフェタミンの代わりに擬似抗
原としてＮ−メチルフェネチルアミン等を用いる方法が
提案されている。本発明のイムノセンサはこれらのメタ
ンフェタミンやＮ−メチルフェネチルアミンなどの検出
に有効に利用できる。

【００３２】本発明で用いる抗体としては、抗メタンフ
ェタミン抗体であればいかなる抗体でも使用することが
できる。具体的には、例えば特開平１−９６１９８号公
報や特開平６−２６１７８４号公報に記載されている、
動物に免疫して得られた細胞株を培養することによって
得られたメタンフェタミンに対して非常に高い特異的な
反応性を示すモノクローナル抗体を挙げることができ
る。

【００３３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。

【００３４】実施例１−１：免疫用抗原の調製 （１）Ｎ−メチル−Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフ
ェタミンの合成 メタンフェタミンを適当なタンパク質に結合させるため
に、例えばＣｈｅｎｇらの方法〔ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥ
ＲＳ ３６，３３９（１９７３）〕、Ｉｗａｓａｋｉら
の方法〔日法医誌４１（３）、２１７（１９８７）〕に
準じ、Ｎ−メチルフェネチルアミンにアミノ基の導入を
行った。すなわち、４００ｍｇのメタンフェタミンを４
０ｍｌの脱水したベンゼンに溶解し、２．３ｇのＮ−
（４−ブロモブチル）フタルイミドと０．９ｇの炭酸ナ
トリウムを添加して、窒素ガス存在下で８０℃、４０時
間還流した。次に、炭酸ナトリウムを濾過により除去
し、等量の１ＭのＨＣｌを加え、更に等量のベンゼンで
３回抽出した。水層に等量のクロロホルムを加え、３回
抽出した。得られたクロロホルム層を合し、脱水後、濃
縮した。この操作により、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチルフタ
ルイミド−メタンフェタミンが得られた。

【００３５】得られたＮ−メチル−Ｎ−ブチルフタルイ
ミド−メタンフェタミンに１０ｍｌのエタノールと０．
１ｍｌの９０％の抱水ヒドラジンを添加して窒素ガス存
在下で２時間、８０℃で反応させた。反応終了後、エタ
ノールを留去し１Ｎの塩酸を２０ｍｌ添加した。この水
溶液を等量のクロロホルムを用いて３回抽出し、水層に
２Ｎの水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ１０に調整し
た。この水溶液を等量のクロロホルムを用いて３回抽出
し、クロロホルム層を合し脱水後、濃縮した。このよう
にして、１．２７ｍｇのＮ−メチル−Ｎ−（４−アミノ
ブチル）メタンフェタミンを得た。また、マススペクト
ル、核磁気共鳴分析機を用いて、このＮ−メチル−Ｎ−
（４−アミノブチル）メタンフェタミンの構造を確認し
た。

【００３６】（２）Ｎ−メタル−Ｎ−（４−アミノブチ
ル）メタンフェタミン−ウシ血清アルブミン複合体の調
製 免疫用抗原の合成は上記のＮ−メチル−Ｎ−（４−アミ
ノブチル）メタンフェタミンを用いて行った。すなわち
６ｍｇのＮ−メチル−Ｎ−（４−アミノブチル）メタン
フェタミンを１ｍｌの脱イオン水に溶解後、６ｍｇのウ
シ血清アルブミンを添加し、更に２０ｍｇの１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
を添加し、ＨＣｌにて反応液のｐＨを８に合わせた。反
応は室温で１６時間撹拌しながら行った。反応終了後、
全反応液を生理食塩水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に対して透析し、未反応の１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとＮ−メチル
−Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフェタミンを除き、
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフェタミ
ン−ウシ血清アルブミン複合体を得た。このＮ−メチル
−Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン−ウシ血
清アルブミン複合体をマウスの免疫用抗原として用い
た。

【００３７】実施例１−２：メタンフェタミンに特異的
に反応するモノクロナール抗体の検索 実施例１−１で合成したＮ−メチル−Ｎ−（４−アミノ
ブチル）メタンフェタミン−ウシ血清アルブミン複合体
を免疫用抗原として、６カ月間にわたりマウスに接種し
た。定法にしたがってマウス脾臓細胞を取りだし、ミエ
ローマ細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４株）と細胞融合して
ハイブリドーマ細胞を得た。クローニングを行った後、
各細胞の培養上清液を用いてメタンフェタミンに特異的
に反応するモノクローナル抗体の検索を行った。

【００３８】メタンフェタミンに特異的に反応するモノ
クローナル抗体の検索は、免疫用抗原を固定化した９６
ウエルマイクロプレートを用いて、メタンフェタミン、
エフェドリン、メチルエフェドリン等による競争阻害を
指標として行った。メタンフェタミンでのみ強く阻害さ
れる抗体としてハイブリドーマ細胞８Ｃｌ株の生産する
抗体を選択した。この点については本発明者らの出願に
かかる特願平６−２３２３１４号明細書に記述されてい
る。

【００３９】実施例１−３：ハイブリドーマ細胞８Ｃｌ
株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１４８）の生産するモ
ノクローナル抗体の精製 ８Ｃｌ株の培養上清液４００ｍｌに４５％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、抗体を含むタンパク質画
分を不溶体として得た。１５０００ｒｐｍ、３０分の遠
心分離にて抗体を含むタンパク質画分を培養上清液から
分離した。抗体を含むタンパク質画分はｐＨ８のリン酸
緩衝液に再溶解し、プロテインＧをリガンドとしたアフ
ィニティークロマトに供した。一連の操作によりモノク
ローナル抗体を２６ｍｇ得た。

【００４０】実施例１−４：ハイブリドーマ細胞８Ｃｌ
株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１４８）の生産するモ
ノクローナル抗体の反応特異性の検討 メタンフェタミン−ウシ血清アルブミン複合体を担持さ
せた担体（酵素免疫測定法用９６穴プレート）の各ウェ
ルに実施例１−３で得た８Ｃｌ株の生産するモノクロー
ナル抗体２６ｍｇ／ｍｌと各種アミン類０．１ｍｇ／ｍ
ｌの混合物を０．１ｍｌ分注し、３０分間室温で静置し
た。次に各ウエルの内容物を捨て脱イオン水で１回洗浄
し、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグ
ロブリンＧ抗体溶液をウエル当り０．１ｍｌ分注し、さ
らに３０分間室温で静置した。３０分後各ウエルの内容
物を捨て脱イオン水で１回洗浄し、西洋ワサビパーオキ
シダーゼ用の発色基質溶液（ＡＢＴＳ溶液）をウエル当
り０．１ｍｌ分注し、室温で２分間反応させた。２分後
１Ｎの硫酸をウエル当り１０ｍｌ添加することにより反
応を停止し、マイクロプレートリーダーで４１５ｎｍの
吸収を測定した。

【００４１】結果は図１に示した。アミン類を添加して
いないウエルの値を１として１／３以下の発色しか与え
なかったアミン類としてメタンフェタミンとＮ−メチル
フェネチルアミンが選択され、メタンフェタミンに特異
的に反応するモノクローナル抗体がＮ−メチルフェネチ
ルアミンをも認識できることが明らかとなった。

【００４２】実施例１−５：抗メタンフェタミン抗体８
Ｃｌを用いた抗体固定化電極（櫛形）の作成 （１）電極表面へのアミノ基の導入 図２に示すように縦５０ｍｍ、横４０ｍｍのガラスエポ
キシ（ガラス繊維にエポキシ樹脂を含浸して作ったＦＲ
Ｐ）基板上に、銅めっきをし、ついで金めっきをした
後、エッチングにより極幅１ｍｍの金メッキ銅箔電極を
縦に２０本形成し電極基板を作成した〔図３（ａ）参
照〕。電極基板はアセトン、クロロホルムおよびテトラ
ヒドロフランにより表面の脂溶性の汚れを洗浄し、乾燥
後０．１ＮのＨＣｌに５分間浸漬して表面を酸化させ
た。表面を酸化させた電極は、δ−アミノプロピルトリ
エトキシシランの２ｗｔ％アセトン溶液に浸漬後、１２
０℃、１８時間の加熱処理をして表面にアミノ基を導入
した〔図３（ｂ）参照〕。

【００４３】（２）電極表面および電極と電極間のＦＲ
Ｐ表面 実施例１−３で精製したモノクローナル抗体８Ｃｌを１
００ｍｇ／ｍｌになるように調整した。この溶液にグル
タルアルデヒドを０．１ｍｇ／ｍｌになるように添加
し、実施例１−５の（１）で作成した電極（アミノ基導
入済み）基板を浸漬し、３０℃で時々緩く撹拌させなが
ら４時間反応させて、前記抗体を電極表面およびＦＲＰ
表面へ固定化した〔図３（ｃ）参照〕。

【００４４】（３）ブロッキング処理 電極表面へのタンパク質等の非特異的吸着を防ぐため、
前項（２）で処理されたＦＲＰ基板を１ｗｔ％の牛血清
アルブミン溶液に１８時間浸漬し、電極間のＦＲＰ表面
に固着しているモノクローナル抗体８Ｃｌ間に牛血清ア
ルブミンを固着させた。これにより電極と電極の間に抗
体含有タンパク質層が形成できた〔図３（ｄ）参照〕。

【００４５】実施例１−６：感度に及ぼす対となる２枚
の抗体固定化電極の面積比の検討 実施例１−５で製作した櫛形抗体固定化電極を用いて、
感度に及ぼす極面積の影響を検討した。まず、前記櫛
形抗体固定化電極と同型の抗体固定化処理を全く行って
いない電極部（アミノ基導入、モノクローナル抗体処
理、ブロッキング処理のいずれをも行っていないもの）
を用いて、純水の導電率（バックグランド値）を測定し
た。２０本の各電極間は電気的に導通していることを
確認後、櫛形抗体固定化電極を用いて、２０本の各電極
の隣り合う２本の電極間の純水の導電率をそれぞれ測定
し、抗体抗原反応前の導電率を求めた。次に抗原とし
てＮ−メチルフェネチルアミン１０μｇ／ｍｌを用いて
抗体抗原反応を行わせ、再度２０本の各電極の隣り合う
２本の電極間の純水の導電率をそれぞれ測定し、抗体抗
原反応後の導電率を求めた。そして、変化率を下記式
により算出した

【数１】変化率（％）＝｛（ｃ／ａ−ｂ／ａ）÷ｂ／
ａ｝×１００ ａ：バックグランド値（ｍＶ） ｂ：抗原抗体反応前の導電率（ｍＶ） ｃ：抗原抗体反応後の導電率（ｍＶ）

【００４６】１０Ｖ、８０Ｈｚでの測定結果を図４に示
した。抗体抗原反応の前後での純水の導電率の変化率
は、基板の端の電極間で測定するほど高い値を示し、基
板の真ん中に位置する電極間では、相対的に低い値を示
した。

【００４７】すなわち、本発明においては図２のＮｏ．
１の電極からＮｏ．２の電極までのすべての電極間に
は、図３（ｄ）にみられようにモノクローナル抗体８Ｃ
ｌと牛血清アルブミンよりなる抗体含有タンパク質層が
形成されており、この層は電極間を短絡させるほどの導
電性は示さないが、例えば、Ｎｏ．１の電極とＮｏ．２
の電極との間に電圧を印加すると、図４のデータに示す
とおり、最大の感度（変化率％）を示す。この理由は、
Ｎｏ．２の電極より右の部分すなわち、Ｎｏ．２電極、
Ｎｏ．２とＮｏ．３の電極間の抗体含有タンパク質層、
Ｎｏ．３電極、Ｎｏ．３電極とＮｏ．４電極間の抗体含
有タンパク質層、…………、Ｎｏ．１９とＮｏ．２０の
電極間の抗体含有タンパク質層、Ｎｏ．２０の電極が一
体化された形に近い現象があらわれ、あたかもＮｏ．２
の電極〜Ｎｏ．２０の電極部分が一枚の電極であるかの
ように働ているためと考えられる。このケースの場合Ｎ
ｏ．１電極の面積を１とするとＮｏ．２電極サイドの面
積は３７倍の面積をもった電極と似た状態ということが
できる。

【００４８】これに対して、Ｎｏ．９とＮｏ．１０の電
極に電圧を印加した場合は、Ｎｏ．９の電極側は、Ｎ
ｏ．１の電極からＮｏ．９の電極までの部分が１つの電
極的な働きを示し、Ｎｏ．１０の電極側は、Ｎｏ．１０
の電極からＮｏ．２０の電極までの部分が１つの電極的
な働きを示すもので、両者の面積比はかなり１に近いも
のになる。そのためＮｏ．１とＮｏ．２の電極に電圧を
印加した場合に較べて検出感度が低下するのは図４のデ
ータが示すとおりである。

【００４９】図５には、図２におけるＮｏ．１〜Ｎｏ．
２０の電極を、抗体を固定化していない電極に代えたほ
かは図２と同様の装置を用いた場合の測定結果を示し
た。抗体を固定化していない電極と抗体を固定化した電
極での測定値との比較すなわち、図４と図５との比較か
ら抗体抗原反応の前後での純水の導電率の変化が、抗体
抗原反応に起因するものであることを証明している。

【００５０】実施例１−７：参照用電極およびガード電
極を有する抗体固定化電極部の作成 （１）抗体固定化電極、参照用電極およびガード電極を
有する抗体固定化電極部表面へのアミノ基の導入 図６に示したように、縦６６ｍｍ、横２１ｍｍのガラス
エポキシ基板１０上の中央に、実施例１−５（１）と同
様にしてエッチングにより極幅１ｍｍの金メッキ銅箔電
極１、２、３を縦に３本形成し、さらにガード電極４と
して極幅１ｍｍの金メッキ銅箔電極を周囲に配置し、つ
いで図６において左下り斜線で表示した部分にエポキシ
樹脂よりなるレジスト層５を印刷して電極基板を作成し
た。電極基板はアセトン、クロロホルムおよびテトラヒ
ドロフランにより表面の脂溶性の汚れを洗浄し、乾燥後
０．１ＮのＨＣｌに５分間浸漬して表面を酸化させた。
ついで、図６において右下り斜線で表示した部分にテフ
ロン（商品名）テープを張ってマスキングした後、前記
表面を酸化させた電極を、δ−アミノプロピルトリエト
キシシランの２％アセトン溶液に浸漬後、１２０℃、１
８時間の加熱処理をして電極表面にアミノ基を導入し
た。

【００５１】（２）電極表面への抗体の固定化 実施例１−３で精製したモノクローナル抗体８Ｃｌを１
００ｍｇ／ｍｌになるように調整した。この溶液にグル
タルアルデヒドを０．１ｍｇ／ｍｌになるように添加
し、実施例１−７の（１）で作成した電極（アミノ基導
入済み）基板を浸漬し、３０℃で時々緩く撹拌させなが
ら４時間反応させて、前記抗体を電極表面およびレジス
トされていないＦＲＰ表面すなわち領域６へ固定化し
た。

【００５２】（３）ブロッキング処理 電極表面へのタンパク質等の非特異的吸着を防ぐため、
前項（１）で処理されたＦＲＰ基板を１ｗｔ％の牛血清
アルブミン溶液に１８時間浸漬し、電極間のＦＲＰ表面
に固着しているモノクローナル抗体８Ｃｌ間に牛血清ア
ルブミンを固着させた。これにより電極１と電極２およ
びその間の所定個所すなわち領域６に抗体含有タンパク
質層が形成できた。これにより電極１および２は抗体固
定化電極となった。前記右下り斜線で表示した部分が本
実施例における電極部として作用する。この部分の電極
１と電極２は抗体固定化電極１および２となり、そのう
ち抗体固定化電極２は基準電極２として使用する。基準
電極２（すなわち抗体固定化電極２）と抗体固定化電極
１との間は抗体含有タンパク質層が形成されている。

【００５３】実施例１−８：感度に及ぼす２枚の抗体固
定化電極間に存在する抗体含有層の影響の検討 実施例１−７で製作した抗体固定化電極１および２、参
照用電極３、ガード電極４を有する抗体固定化電極部を
用いて、感度を得るために必要な抗体固定化電極の構造
について検討を行った。抗体固定化電極の各電極上の固
定化抗体あるいは各電極間の抗体含有層をそれぞれヘラ
を用いて物理的に削除し、１０Ｖ、８０Ｈｚでの純水中
で基準電極（抗体固定化電極２を基準電極とした）と抗
体固定化電極１との間の電気伝導度をセル定数を１と仮
定した場合の電位として測定した。

【００５４】結果は図７に示した。基準電極２と抗体固
定化電極１との間の抗体含有タンパク質層を削除すると
電位は極端に小さい値となり、感度を得るためには、基
準電極２と抗体固定化電極１間の抗体含有タンパク質層
が不可欠であることが明らかとなった。

【００５５】実施例２：電極部に参照用電極およびガー
ド電極を有するイムノセンサを用いたＮ−メチルフェネ
チルアミンの検出 実施例１−７で製作した抗体固定化電極１および２、参
照用電極３、ガード電極４を有する抗体固定化電極部を
用いて、モノクローナル抗体８Ｃｌがメタンフェタミン
と同様に反応するＮ−メチルフェネチルアミンの検出を
行った。最初に基準電極２と抗体固定化電極１との電極
間の純水の導電率をそれぞれ測定した。次にＮ−メチル
フェネチルアミン１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌを
用いて抗体抗原反応を５分間行わせ、基準電極２と抗体
固定化電極１との電極間の純水の導電率をそれぞれ測定
した。各値は表面処理をしていない同じデザインの電極
を用いて測定した純水の導電率（バックグランド値）に
対する比率とし、さらに抗体抗原反応の前後での純水の
導電率の変化率として算出した。

【００５６】１０Ｖ、８０Ｈｚでの測定結果を図８に示
した。なお、Ｎ−メチルフェネチルアミンの同一濃度で
黒点が２つあるのは同じ実験を２度行ったためである。
本発明のイムノセンサは、Ｎ−メチルフェネチルアミン
を１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌといった低濃度で
も正確に検出することが可能であり、変化率はＮ−メチ
ルフェネチルアミンの濃度に依存して高い値を示した。

【００５７】

【効果】抗体抗原反応に伴う抗体固定化電極間のあるい
は抗原固定化電極間の電気的変化を、汎用の計測器を利
用して測定することにより、抗体抗原反応を検出する安
価で単純な方法を提供することができる。また本発明
は、放射活性や酵素活性を測定する手段を用いないため
測定時間の短縮が図れるばかりではなく、競合法を用い
ずに分子量の小さい抗原（ハプテン）の測定が可能であ
り、高感度測定が実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ハイブリドーマ細胞８Ｃｌの生産するモノクロ
ーナル抗体を用いた場合の各種表示試薬の反応特異性
（反応選択性）をそれぞれ反応液の４１５ｎｍ吸光度の
相対比較により示すグラフである。

【図２】実施例１で用いる櫛形抗体固定化電極を設けた
ＦＲＰ基板の平面図である。

【図３】ＦＲＰ基板の所定個所に銅−金層を形成してな
る電極と、ＦＲＰ基板上に、抗体を固定化する工程を説
明するための部分断面図であり、（ａ）はＦＲＰ基板上
に銅−金よりなる電極が形成されている状態を示し、
（ｂ）は電極面上にアミノ基が導入された状態を示し、
（ｃ）は前記アミノ基にはグルタルアルデヒドを介して
モノクローナル抗体が結合し、ＦＲＰ基板表面にはモノ
クローナル抗体が結合している状態を示し、（ｄ）はＦ
ＲＰ基板表面のモノクローナル抗体間に牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）が固着している状態を、それぞれモデル的
に示す。

【図４】実施例１−６で行った対となる抗体固定化電極
の面積のちがい（面積比）が、測定感度にどのような影
響を与えたかを示すグラフである。

【図５】図４の場合の抗体固定化電極の代りに抗体を固
定化していないただの電極を用いた場合の測定感度を示
すグラフである。

【図６】実施例１−７にかかる電極部の構造を示す平面
図である。

【図７】抗体を含有する導電体層の有無による測定感度
への影響を示すグラフである。

【図８】実施例２において、Ｎ−メチルフェネチルアミ
ンの各濃度における検知のしやすさを示すグラフであ
る。

【符号の説明】

１ 電極（右下り斜線部分のみが抗体固定化電極） ２ 電極（右下り斜線部分のみが抗体固定化電極）（基
準電極） ３ 参照用電極 ４ ガード電極 ５ レジスト層 ６ 抗体固定化処理を施された領域 １０ ＦＲＰ基板

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（Ａ）表面に抗体あるいは抗原を固定した
   １対の抗体固定化電極あるいは抗原固定化電極を有し、
   該抗体固定化電極あいるは抗原固定化電極の間には抗体
   あるいは抗原を含むタンパク質層によって電気的に結合
   している電極部および（Ｂ）これら電極間の電気的性質
   を測定する計測器から構成されていることを特徴とする
   イムノセンサ。
2. 【請求項２】 前記抗体あるいは抗原を含むタンパク質
   層が１０^-4Ｓ／ｃｍ以下の導電率を示すものである請求
   項１記載のイムノセンサ。
3. 【請求項３】 前記１対の抗体固定化電極あるいは抗原
   固定化電極の面積が互いに異なるものである請求項１ま
   たは２記載のイムノセンサ。
4. 【請求項４】 さらに（Ｃ）参照用電極を付設した請求
   項１、２または３記載のイムノセンサ。
5. 【請求項５】 さらに（Ｄ）ガード電極を付設した請求
   項１，２、３または４記載のイムノセンサ。