JPH1010110A

JPH1010110A - 有機物質の混合物の化学成分を同定し且つ定量する方法

Info

Publication number: JPH1010110A
Application number: JP9083999A
Authority: JP
Inventors: Willem Windig; ウィンディグウィレム; Alan W Payne; ダブリュ．ペインアラン
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 1998-01-16
Also published as: EP0805351A3; EP0805351A2; CA2200403A1; US5672869A

Abstract

(57)【要約】【課題】適切な解釈が容易にできる十分に分割された
クロマトグラフィーを可能とする変数選択法を提供する
こと。【解決手段】有機物質の混合物の化学成分を同定し且
つ定量する方法であって、有機物質の混合物をクロマト
グラフィーに附して前記混合物の成分を分離し、分離し
た物質を分光法に附して前記成分を検出及び同定する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、物質の組成を分析
するのに使用されるクロマトグラフィーと分光分析法と
の組み合わせた方法から得られる総イオンクロマトグラ
ムのノイズ及びバックグランドを減少する方法に関す
る。この方法によれば、物質中の成分の検出の効率が大
きく向上する。

【０００２】

【従来の技術】物質中の成分の検出及び同定において、
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）等のクロマトグラフィ
ーと質量分光分析法（ＭＳ）等の分光分析法とを組み合
わせることにより、バックグランドとノイズを高レベル
で有するクロマトグラムが得られる。Ｊ．Ｅ．Ｂｉｌｌ
ｅｒ、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎ、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ、１９７４、７、５１５〜５２８；及びＲ．Ｇ．Ｄｒ
ｏｍｅｒｙ、Ｊ．Ｊ．Ｓｔｅｆｉｋ、Ｔ．Ｃ．Ｒｅｉｎ
ｄｆｌｅｉｓｃｈ、Ａ．Ｍ．Ｄｕｆｆｉｅｌｄ、Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、４８、１３６８〜１３７５
に記載されているＢｉｌｌｅｒＢｉｅｍａｎｎアルゴ
リズム等の従来技術のバックグランド減法を使用して
も、低ノイズ及び低バックグランドを達成するには限り
がある。

【０００３】最も頻繁に直面する問題は、液体クロマト
グラフィーと質量分光分析法とを組み合わせた方法につ
いてであるが（例えば、Ａｒｐｉｎｏ、Ｐ．（１９９
２）、ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｕｍ．Ｒｅｖ．、１１、
３；Ｂｌａｋｌｅｙ、Ｃ．Ｒ．、及びＶｅｓｔａｌ、
Ｍ．Ｌ．（１９８３）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、５５、
７５０；Ｊ．Ｂ．Ｆｅｎｎ、．Ｍ．Ｍａｎｎ、．Ｃ．
Ｋ．Ｍｅｎｇ、Ｓ．Ｆ．Ｗｏｎｇ、Ｃ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ
ｈｏｕｓｅ（１９９０）、ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ
Ｒｅｖ．、９、３７参照）、これは、他の組み合わせ
法についても言える。ＬＣを使用して混合物を個々の成
分に分離し、分離された成分を次にＭＳに通し、そこで
各成分について質量スペクトル情報を得る。この質量ス
ペクトル情報を成分検出系として使用し、また成分の分
子構造を特徴付けるのにも使用することがある。

【０００４】液体クロマトグラフィー自体は、クロマト
グラフィーの一種である。クロマトグラフィーは、混合
物を分離する方法である。クロマトグラフ法を最も単純
に適用する場合、垂直管に固定相として知られている微
粉固体を充填する。被分離物質の混合物を管の上部に配
置し、移動相として知られている適当な液体、即ち、溶
離液でゆっくりと洗い流す。

【０００５】混合物がまず溶解し、各分子が流動してい
る液体で輸送された後、固定相に結合、即ち吸着する。
分子は、種類ごとに、吸着されやすさに応じて異なる長
さの時間を液相で費やし、したがって、各成分は異なる
速度で管を通って降下し、他の全ての化合物から分離す
る。被分離混合物の分子は、移動相と固定相との間を何
回も通過する。この場合の速度は、関与する分子の移動
度、温度及び結合力に依存する。これは、各種類の分子
が移動相で費やす時間の差であり、これにより輸送速度
の差及び物質の分離が生じる（図１参照）。

【０００６】液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、標準
カラムクロマトグラフィーの改良法である。ここで、固
定液相を担持する粒子は極めて小さく（０．０１ｍｍ／
０．０００４インチ）且つ大きさが極めて均一である。
したがって、固定相は、移動液相中の試料分子に対して
大きな表面積を提供する。このような小粒子を充填した
カラムで生じる大きな圧力降下は、高圧ポンプを用いて
移動液体相を適当な時間でカラムを通すことにより克服
される。

【０００７】クロマトグラフィーは、主に分離法として
使用される。上記した異なる種について分析時間が異な
るにもかかわらず、一般的に成分を同定するには特異性
が不十分である。このため、一般的に、クロマトグラフ
法は同定法（最も適当且つ最もよく使用されているのは
質量分光分析法である）と直列に使用される。一つの成
分の質量スペクトルから、一般的にその成分の分子量の
尺度及び特徴的な「指紋」フラグメンテーションパター
ンが得られる。質量分析計において、成分分子がイオン
化し、一連のエネルギーで励起される。最小のエネルギ
ーを有する分子は一般的にもとのままであり、この場
合、検出されたときに、成分の分子量の目安が得られ
る。より高いエネルギーでイオン化された分子は、断片
化して分子構造特有のより小さい生成物イオンを形成す
る。分子構造を得るために、生成した断片イオンをつな
ぎ合わせて最初の分子構造を作成する。質量スペクトル
から分子構造を得る別の方法に、成分のスペクトルと基
準質量スペクトルの大きなライブラリーとを比較するこ
とがある。成分の質量スペクトルは特有の性質を有する
ので、一般的に、その成分の質量スペクトルの例が基準
ライブラリーにあるならば、容易且つ明確に同定でき
る。

【０００８】ＬＣＭＳの場合、クロマトグラフィー用装
置を、分離した成分がクロマトグラフから溶離するとき
に繰り返し（例えば、１〜５秒毎）スキャンする質量分
析計に直接接続する。このように、多数の質量スペクト
ルが分析ごとに記録される。スペクトルの多くは、「バ
ックグランド」のみ、即ち、成分が何もクロマトグラフ
から溶離しないときには、「バックグランド」のみを記
録する。各成分がクロマトグラフから溶離するにつれ
て、質量スペクトルは質量分析計に入る成分の性質に依
存して変化する。得られた各質量スペクトルは一定数の
イオンを含有し、これがイオン電流を生じ、時間に対し
てプロットされて総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）が
得られる。これは、一般的に、成分検出装置の基礎をな
すＬＣＭＳ法の最初の出力である。別のプロットは、個
々の質量の時間に対するプロットであって、特定の質量
が分析中にどこで検出されるかを示すだけの質量クロマ
トグラムが得られる。

【０００９】ＵＶ発色団を有する試料の場合、インライ
ンＵＶ検出器を使用してピークを検出できる。ピークの
保持時間を知れば、対応の質量スペクトルを得ることが
できる。この間接ピーク検出法は、明らかに発色団を有
する成分に限られ、これは大きな制限となる。液体クロ
マトグラフィー／質量分析法（ＬＣＭＳ）では、質量分
析計は高真空下で操作する必要があるので、ほとんどの
液体移動相は質量分析計に入る前に界面領域において除
去しなければならない（図２参照）。しかしながら、液
体移動相は、界面を通過しても移動相が検体種に対して
まだ過剰に存在するような程度に過剰に存在する。成分
を良好に分離し且つ成分をＬＣカラムを完全に通過させ
るために、一般的に、緩衝剤を移動相に添加することも
必要である。したがって、関連した緩衝剤を有する移動
相は絶えずＬＣカラムを通過して質量分析計に至り、イ
オン化され、上記で言及した「バックグランド」スペク
トルの主要種となる。残念なことに、特に、普及してい
る「スプレー」ＬＣＭＳインターフェース及びイオン化
法（例えば、エレクトロスプレー、サーモスプレー）の
場合、このバックグランドは、経時的に相当変化し、検
体スペクトルから全く減じることはできない。

【００１０】ＬＣ−ＭＳ実験のフローダイヤグラムを、
図３に示す。ＬＣ−ＭＳデータには、存在する成分の同
定に関して目視分析を困難にするいくつかの特徴があ
る。これらの特徴を、エレクトロスプレーＬＣＭＳ実験
に関して、図４に示す。図４に示すＴＩＣでは、バック
グランド及びノイズレベルが大きく、その結果、明瞭な
ピークは観察できるとしても少ない。総イオン電流トレ
ース（ＴＩＣ）のノイズが多い（図４参照）にもかかわ
らず、成分がカラムから溶離し、通過してエレクトロス
プレーイオン源に至ったときに得られる個々の質量スペ
クトルは、一般的に質が高い。問題は、イオン電流レベ
ルが、成分がカラムから溶離するときにしばしばほぼ一
定のままとなることである。多くの検体の場合、ＬＣ−
ＭＳ試験から得られる質量スペクトルの全てを手動で調
べ、「真正」であると思われる成分の質量のリストを抽
出し、これらの抽出された質量の質量クロマトグラムを
組み合わせたプロットを作成することが必要であること
が判明した。このように、質のよい（即ち、低ノイズ及
び低バックグランド）減少した総イオンクロマトグラム
を得ることができるが（図５参照）、この方法は時間が
かかり（１日以下又はそれ以上）、長たらしい。さら
に、オペレータが高度に重なり合った少量成分を見逃す
ことがあることが分かった。

【００１１】このいわゆる「化学的ノイズ」の問題の一
部に対処するいくつかの従来技術があるが、上記した複
雑なクロマトグラフィーのデータの解析には適当でな
い。ＢｉｌｌｅｒＢｉｅｍａｎｎアルゴリズム（Ｊ．
Ｅ．Ｂｉｌｌｅｒ、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎ、Ａｎａｌ．Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ、１９７４、７、５１５〜５２８；及び
．Ｇ．Ｄｒｏｍｅｒｙ、Ｍ．Ｊ．Ｓｔｅｆｉｋ、Ｔ．
Ｃ．Ｒｅｉｎｄｆｌｅｉｓｃｈ、Ａ．Ｍ．Ｄｕｆｆｉｅ
ｌｄ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、４８、１３６
８〜１３７５）は、主に解像度強化法であり、重なり合
ったピークを分離できる。この方法は、質の高いデー
タ、即ち、ピークがバックグランドシグナルから明瞭に
識別できる場合によい。ＢｉｌｌｅｒＢｉｅｍａｎｎ
アルゴリズムは、ＬＣＭＳデータ等の化学的ノイズの量
が多いデータについてはうまく行かない。

【００１２】バックグランド減法は行うことができるが
（Ｇｏｏｄｌｅｙ、Ｐ．、Ｉｍｉｔａｎｉ、Ｋ．、Ａ
ｍ．Ｌａｂ、１９９３、２５、３６Ｂ〜３６Ｄ）、複雑
なデータについては、バックグランドがクロマトグラフ
分析の継続中定量的又は定性的に一定しないので、使用
するのに制限がある。組み合わせ法によるデータの結果
を向上させるための最近の研究の大半は、曲線分離につ
いてである（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｐ．
Ｊ．Ｇｅｍｐｅｒｌｉｎｅ、Ｊ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉ
ｃｓ、１９９０、４、１〜１３）。曲線分離法では、Ｇ
Ｃ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析法）及び
ＬＣ−ＵＶ（液体クロマトグラフィー−紫外分光法）等
の組み合わせ法の重なり合ったピークを分離できる。こ
れらの手法はうまくいくが、バックグランド及びノイズ
レベルが高いクロマトグラム全体に対処するのには適し
ていない。さらに、これらの手法は、一般的に単一変数
（例えば、質量）のクロマトグラムにおいて一つのピー
クを前提としている。異性体及び共通フラグメントを有
する成分が存在するので、複数のピークを有する質量ク
ロマトグラムが一般的である。

【００１３】最近、ノイズ及びバックグランドが大きい
ＧＣ−ＭＳデータから関連ピークを抽出するための自動
化法が報告された（Ｂ．Ｅ．Ａｂｂａｓｓｉ、Ｈ．Ｍｅ
ｓｔｄａｇｈ、Ｃ．Ｒｏｌａｎｄｏ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａ
ｓｓＳｐｅｃｔｒｕｍ．ＩｏｎＰｒｏｃ．、１９９
５、１４１、１７１〜１８６）。この手法は、ピークが
一又は二スキャン幅であることができることを前提とし
ている。したがって、実際のピークは、単純な手段によ
ってはノイズピークから分離できない。この問題に対処
するために複雑で時間がかかる手法が開発され、それが
うまくいくことが分かった。この手法の欠点は、非常に
時間がかかり（最長１０分）、且つシグナルの質を高め
るために最初のデータを変換することである。

【００１４】ＬＣ−ＭＳデータでは、質の高い質量クロ
マトグラムが存在し、ノイズシグナルを変換するにはこ
れらの質の高いクロマトグラムを選択するのが好まし
い。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
複雑な混合物の化学成分を同定し且つ定量するための改
良された定性・定量法を提供することである。本発明の
別の目的は、高バックグランド・ノイズレベルを有する
データが得られる方法にとりわけ適しているような方法
を提供することである。

【００１６】本発明のさらなる目的は、検出可能なスペ
クトルを生じる全ての成分が検出されるように分光検出
を用いたクロマトグラフ法から得られるデータセットの
解析法を提供することである。本発明のさらなる目的
は、非常に効率的な平滑化法を提供することである。本
発明のさらなる目的は、最初のクロマトグラフ分析デー
タを変換せずに質の高いクロマトグラフ分析データを選
択する方法を提供することである。

【００１７】本発明のさらなる目的は、混合物中の全て
の成分についての情報を維持しながら選択されるクロマ
トグラムの数を最小限度に減少することである。本発明
のさらなる目的は、複数のピークを有する質量クロマト
グラムを選択して異性体や共通フラグメントを有する成
分でも可能とすることである。本発明のさらなる目的
は、迅速な方法、即ち、５分未満で処理できる方法を提
供することである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、有機物
質をクロマトグラフィーに附して混合物の成分を分離す
る第一工程と、分離した物質を分光測定して成分を検出
及び同定する第二工程とを含んでなる有機物質の混合物
の化学成分を同定し且つ定量する方法であって、前記ク
ロマトグラフィーと分光測定を、ａ）試料をカラムに注入し；ｂ）カラム中種々の速度で分配することにより成分を分
離し；ｃ）分離した成分を分光計に通し；ｄ）一連のスペクトルを得て存在する全ての種を検出
し；そしてｅ）前記スペクトルをコンピュータファイルに記憶させ
る、ことにより行う方法において；ｉ）分光変数を平滑化する工程と；ｉｉ）分光変数の強度の平均値を得る工程と；ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた平均値を工程ｉで得られた
平滑化変数から減じる工程と；ｉｖ）工程ｉｉｉの出力と最初の分光変数を正規化する
工程と；ｖ）工程ｉｖの値を比較して各分光変数についての類似
度の測定値を得る工程と；ｖｉ）類似度測定値の閾値を決定して不要信号を棄却す
る工程と；ｖｉｉ）類似度測定値が前記閾値を超える分光変数のみ
を選択する工程と；ｖｉｉｉ）選択された変数の合計を時間に対してプロッ
トして強化クロマトグラムを得る工程と、を用いた変数
選択により分光データを強化することを特徴とする方法
が提供される。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明によれば、複雑な混合物の
化学成分を同定し且つ定量するための定性・定量分析の
改良法が提供される。本発明の方法は、有機物質をクロ
マトグラフィーに附して混合物の成分を分離する第一工
程と、分離した物質を分光測定して成分を検出及び同定
する第二工程とを含んでなる有機物質の混合物の化学成
分を同定し且つ定量する方法であって、前記クロマトグ
ラフィーと分光測定を、ａ）試料をカラムに注入し；ｂ）カラム中種々の速度で分配することにより成分を分
離し；ｃ）分離した成分を分光計に通し；ｄ）一連のスペクトルを得て存在する全ての種を検出
し；そしてｅ）前記スペクトルをコンピュータファイルに記憶させ
る、ことにより行う方法において；ｉ）分光変数を平滑化する工程と；ｉｉ）分光変数の強度の平均値を得る工程と；ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた平均値を工程ｉで得られた
平滑化変数から減じる工程と；ｉｖ）工程ｉｉｉの出力と最初の分光変数を正規化する
工程と；ｖ）工程ｉｖの値を比較して各分光変数についての類似
度の測定値を得る工程と；ｖｉ）類似度測定値の閾値を決定して不要信号を棄却す
る工程と；ｖｉｉ）類似度測定値が前記閾値を超える分光変数のみ
を選択する工程と；ｖｉｉｉ）選択された変数の合計を時間に対してプロッ
トして強化クロマトグラムを得る工程と、を用いた変数
選択により分光データを強化することを特徴とする方法
である。

【００２０】測定データから、データ中のノイズ量及び
バックグランド強度と逆関係のあるクオリティー指数を
計算する。オペレータが定めたレベルよりも上のクオリ
ティー指数を有する変数（質量クロマトグラム）を選択
する。選択された変数は、はるかに質が高くなった（低
ノイズレベル及び低バックグランド）クロマトグラフ分
析データの新しいデータセットを構成する。これによ
り、変数の数が一桁以上減少するので、化学的な解釈が
容易となる。その結果、より迅速で且つより高い質の解
析ができる。選択される変数の数は、成分ごとに最も強
度の大きい変数を選択することによりさらに減少でき
る。この選択数の減少により、データの質をさらに向上
できる。

【００２１】ここでは液体クロマトグラフィーを例とし
てあげているが、ガスクロマトグラフィー等の他のクロ
マトグラフィー、並びに直接プローブレーザ分析及び高
速原子衝撃等の時間分解直接分析法並びに直接プローブ
レーザ分析及び高速原子衝撃等の半分離法を使用しても
よい。さらに、本発明に使用できる種々の分光法には、
質量分析、ＵＶ分光法、ＮＭＲ分光法、ラマン法、赤外
法などがある。

【００２２】ＬＣ−ＭＳの問題を説明するために、以下
で説明する例の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を、
図４に示す。図４に示すＴＩＣは、バックグランド及び
ノイズレベルが高い。その結果、明瞭なピークは観察で
きるとしても少ない。ピーク検出上の問題の原因を示す
典型的な質量クロマトグラムを、図８〜１１に示す。図
８の質量クロマトグラムは、主要な特徴としてスパイク
（１スキャン幅ピーク）を示しているが、これはノイズ
の一例である。移動相により大きく支配されている質量
クロマトグラムを、図９に示す。このようなクロマトグ
ラムは、ＴＩＣにおける大きなバックグランドシグナル
の源である。図１０の質量クロマトグラムでは、単一ス
キャンよりもブロードなピークがあるが、顕著な量のノ
イズもある。良好な質の質量クロマトグラムを、図１１
に示す。このクロマトグラムは、低バックグランドであ
り、実質的にノイズがない。アルゴリズムの目的は、図
１１に示すような質量クロマトグラムを選択することで
ある。これは、各質量クロマトグラムと対応の平滑化質
量クロマトグラムとの間の類似度指数を計算することに
より行われる。これが達成される方法を以下に説明する
とともに、図１２及び図１３のフローダイヤグラムに示
す。

【００２３】クロマトグラフ分析データは、ＣＯＤＡプ
ログラムを実行できるコンピュータのファイルとして利
用できる。ＣＯＤＡは、成分検出アルゴリズム（Ｃｏｍ
ｐｏｎｅｎｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｌｇｏｒｉｔｈ
ｍ）を意味する。計器コンピュータからデータを得るの
は、十分に確立された方法及び市販のソフトウエアによ
り行われる。

【００２４】データは、マトリックスＡにより表され、
ｒ列とｃ欄を含んでなる。ここで、ｒはスペクトルの数
であり、ｃは変数（質量）の数である。後で、いわゆる
「質量クロマトグラムクオリティー（ＭＣＱ）指数」を
計算（平滑化はこの方法の一部である）する。計算に使
用される値をここに示す。ＭＣＱ指数を、平滑化ウイン
ドウにより定義されるいくつかの平滑度について計算す
る。最大平滑化ウインドウＷＭＡＸは、この方法に使用
される長方形平滑化ウインドウの上限として定義され
る。ＷＭＡＸは奇数であり、平滑化法は以下のウインド
ウについて適用される：１，３，５，・・・・ＷＭＡ
Ｘ。

【００２５】Ｎは、質量クロマトグラムのカウンターで
ある。Ｎは、実験のスキャン範囲の最低質量で開始す
る。質量クロマトグラムは、以下の方法により等しい長
さにスケール化される：

【００２６】

【数１】

【００２７】（式中、λ_jは変数j の長さであり、a _ij
（但し、ｉはスペクトル指数であり、ｊは変数指数であ
る）は最初のデータマトリックスＡの要素である。次
に、長さスケールマトリックスΑ（λ）を、全ての変数
をそれらの長さにより割ることにより得る：

【００２８】

【数２】

【００２９】平滑化について、単純長方形ウインドウを
選択する。これにより計算が大きく簡略化される。この
ことは、大きなデータマトリックス（使用されるデータ
セットは３００スペクトル（各々１３４５質量単位を有
する）を有することがある）の場合重要である。データ
を、ウインドウサイズＷについて、１からＷＭＡＸまで
平滑化する（１ウインドウは、平滑化なしとなる）。一
例として、ウインドウサイズ５の場合の平滑化について
説明する。長方形ウインドウ幅ｗの平滑化の場合、マト
リックスＷ₅は、以下の通りである。

【００３０】

【数３】

【００３１】サイズＷ_wは（ｒ−ｗ＋１）＊ｒであり、
単位スキャンを有する下添字ｗはウインドウ幅を表し、
ここでの例では５である。対称ピークを有するために
は、長方形ピークの幅についての奇数値のみを使用す
る。マトリックスは、１を有する幅ｗの対角バンドを有
し、他の要素は０である。平滑化質量クロマトグラムを
計算するための式を以下に示す：

【００３２】

【数４】

【００３３】平滑化操作により、得られるマトリックス
（Α（ｗ）^R _ij）の大きさをｒ＊ｃから（ｒ−ｗ＋１）
＊ｃに制限する。したがって、上添字Ｒを使用してこの
データ減少を示す。これは、基本的には長方形ウインド
ウを有する質量クロマトグラムの畳込みである。通常、
このために、迅速Ｆｏｕｒｉｅｒ変換を使用する。マト
リックスＷ_wの特性が単純なので、以下のようにΑ
（ｗ）^R _ijを計算するのがより効率的である：

【００３４】

【数５】

【００３５】この計算のさらなる利点は、ウインドウ幅
３についての結果をウインドウ幅５についての計算等に
使用できることである。平滑化質量クロマトグラムの標
準化は、下式により説明される：

【００３６】

【数６】

【００３７】（式中、ａ（ｗ，ｓ）^R _ijはマトリックス
Αの要素を意味し、これをまず平滑化した後標準化し
た）。但し、平均μ（ｗ）_jは、

【００３８】

【数７】

【００３９】として定義され、標準偏差σ（ｗ）_jは、

【００４０】

【数８】

【００４１】として定義される。ＭＣＱ（質量クロマト
グラムクオリティー指数）は、本質的に、以下の内積を
使用する長さスケール化質量クロマトグラムと平滑化標
準化質量クロマトグラムとの間の類似度指数ｃ_jの計算
値である：

【００４２】

【数９】

【００４３】ａ（ｗ，ｓ）^R _ijは、減少したサイズであ
る。したがって、長さスケール化マトリックスΑ（λ）
は、大きさを減少できる（第一（ｗ−１）／２スペクト
ルと最後の（ｗ−１）／２スペクトルを最初のマトリッ
クスＡ（但し、ｗはウインドウのサイズである）から削
除することにより）。このようにして計算される内積の
最大値は、１である。

【００４４】長さスケールと標準化データの内積は、一
般的ではない。この類似度指数の影響を明らかにするた
めに、２つの態様が考えられる（長さスケール化質量ク
ロマトグラムと平滑化長さスケール化質量クロマトグラ
ムの内積）。質量クロマトグラムがスパイク（ノイズ）
を有すると、平滑化クロマトグラムは最初のクロマトグ
ラムとは異なり、低い内積となる。また、ノイズのない
（平滑な）質量クロマトグラムでは、内積値は大きくな
る。したがって、長さスケール質量クロマトグラムとそ
の平滑化長さスケール化質量クロマトグラムとの間の内
積は、スパイク検出手段となり、内積が小さいときには
スパイクが存在することを示す。

【００４５】高バックグランドを有する質量クロマトグ
ラムは、比較的高い平均値を有する。その結果、内積に
よって表すと、長さスケール化質量クロマトグラムと標
準化質量クロマトグラムとの間に有意の差がある。クロ
マトグラムが良好であると、ベースライン強度が低く且
つシグナル面積が比較的小さい。その結果、平均強度値
が比較的小さく、したがって、長さスケール化質量クロ
マトグラムと標準化質量クロマトグラムとの間の差がほ
とんどない。その結果、最初の長さスケール化質量クロ
マトグラムと標準化質量クロマトグラム（即ち、平均減
算及び標準化）の内積は、ＴＩＣにおけるバックグラン
ドの一因となる信号を検出するための手段となり、内積
が小さいとバックグランドの一因となるシグナルが存在
することを示す。

【００４６】式９で示される最初の質量クロマトグラム
と標準化平滑化質量クロマトグラムの内積は、スパイク
とバックグランド感度の両方を合わせたものである。最
初の長さスケール質量クロマトグラムと平滑化・標準化
シグナルについてのプロットを、図４に示す。図４から
明らかなように、平滑化・標準化シグナルは、ノイズ及
びバックグランドの量に対して差があることは明白であ
る。この内積は質量クロマトグラムの質に反映すること
から、質量クロマトグラムクオリティー（ＭＣＱ）指数
と称される。ＭＣＱ指数は、いくつかの平滑化ウインド
ウサイズについて計算する。計算値を、全ての規定した
ウインドウサイズについて確認する。平滑化ウインドウ
は、２だけ増加できる。この増分は、対称平滑化ウイン
ドウを得るために２である。全ての質量クロマトグラム
について、処理されたかどうかを確認する。次に、質量
クロマトグラムのカウンターを、１だけ増加できる。こ
の時点で、計算は完了する：１〜ＷＭＡＸまでの平滑化
ウインドウＷについてのＭＣＱレベルが得られる。質量
クロマトグラムについて、上記で定義したＭＣＱレベル
と平滑化ウインドウを計算する。最初にプログラムがこ
のボックスに到達したとき、ＭＣＱレベルは上記した通
りであり、平滑化ウインドウは最大平滑化ウインドウで
ある。選択された質量クロマトグラムとそれらの総イオ
ンクロマトグラムは、図８〜１１のように示される。こ
の時点で、オペレータは、別のＭＣＱレベル及び平滑化
ウインドウについてのデータを表示させることができ
る。平滑化ウインドウの最小値は１であり、最大値はＷ
ＭＡＸである。もし別の表示が必要ならば，ＭＣＱレベ
ルと平滑化ウインドウを再規定し、その後、プログラム
により結果を表示する。同じ成分について、いくつかの
質量クロマトグラムを選択することがある。これらの質
量クロマトグラムは、同じスキャン位置で最大値を有す
る。したがって、選択された質量クロマトグラムについ
てスキャン位置が決定される。スキャン位置により規定
される全ての成分について、質量クロマトグラムを、最
大強度によって位置づける。成分毎に最高最大強度を有
する質量クロマトグラムのみを選択することにより、選
択質量クロマトグラムの数を減少できる。次に、減少し
た選択質量クロマトグラムを表示する。選択した全ての
質量クロマトグラムの一覧を示す（表１）。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【実施例】以下、実施例により、ＬＣ−ＭＳクロマトグ
ラムのバックグランドとノイズの減少方法を説明する。実施例１質量スペクトル分析ＦｉｓｏｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製エレクトロス
プレーインターフェースを介してＨｅｗｌｅｔｔＰａ
ｃｋａｒｄ製１０９０液体クロマトグラフに接続された
ＦｉｓｏｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製Ｑｕａｔｔｒ
ｏｍａｓｓ質量分光計により、ＬＣ−ＭＳ分析を行っ
た。ＬＣ−ＭＳクロマトグラムは、メタノール（６５
％）／水（０．１Ｍ酢酸アンモニウム）から９５％メタ
ノールに０．３ｍｌ．ｍｉｎ^-1で濃度勾配をつけた勾配
系を用いて、ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ製Ｈｙｐ
ｅｒｓｉｌＯＤＳ５μカラム（１００ｍｍｘ２．１
ｍｍ）により界面活性剤混合物を分離したものである。
質量分析計は、０．２秒のインタースキャンディレイで
５秒毎に５０から１５００ダルトンまでスキャンした。
エレクトロスプレーのコーン電圧を１０Ｖにセットして
フラグメンテーションを最小限とした。データ解析この研究用のプログラムは、開発ソフトＭＡＴＬＡＢ
４．２ｃ．ｌ（ＴｈｅＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．
製ＣｏｃｈｉｔｕａｔｅＰｌａｃｅ、２４Ｐｒｉｍｅ
ＰａｒｋＷａｙ、Ｎａｔｉｃｈ、Ｍａｓｓ．０１７
６０）に書き込んだ。コンピュータ機器構成は、ＰＥＮ
ＴＩＵＭ、９０ＭＨＺ、ＲＡＭ２４ＭＢである。結果方法を説明するために、上記で説明した内積を、図８〜
図１１に示した質量クロマトグラムについて表２に示
す。

【００４９】ａ）ノイズ（スパイクなし）シグナルが低
いほど高い値となるカラムＡ（λ) ^RとカラムＡ（ｗ＝
５、λ) ^Rの内積（質量７２及び１８６）。ｂ）バックグランドシグナルが低いほど高い値となるカ
ラムＡ（λ) とカラムＡ（ｓ) の内積（質量５８７及び
１８６）。ｃ）シグナルのノイズとバックグランドの両方が低いほ
ど高い値となるカラムＡ（λ) ^RとカラムＡ（ｗ＝５、
ｓ) ^R（ＭＣＱ指数）の内積（質量１８６）。

【００５０】これらの表記において、平滑化ウインドウ
は５である。図８〜図１１に示す点線で表した分布は、
平滑化・標準化質量クロマトグラム（式９）である。図
８は、主にスパイクにより特徴付けられ且つバックグラ
ンドが低い質量５８７の質量クロマトグラムである。そ
の結果、表２から確認されるように、平滑化・標準化質
量クロマトグラムは、スパイクの大きさを顕著に変える
が、オフセットは顕著には存在しない。

【００５１】

【表２】

【００５２】図９に示すような質量クロマトグラムは、
高いバックグランドシグナル源である。ノイズ様のパタ
ーンは、一般に幅が数スキャンであり、このことが表２
中のアルゴリズムのスパイク検出部が大きな影響を受け
ない理由である。この質量クロマトグラムの総強度は比
較的大きいので、長さスケール質量クロマトグラムと標
準化質量クロマトグラムとの間には顕著な差がある。こ
の差は図９に示した標準化・平滑化質量クロマトグラム
に反映され、その結果、表２のＭＣＱ指数に反映され
る。

【００５３】図１０に示す質量クロマトグラムでは、識
別できるピークはあるが、ノイズの量が比較的大きい。
内積はまだ比較的大きいが、アルゴリズムのスパイク検
出部とバックグランドの検出部の両方において、質量ク
ロマトグラムは完全ではない。スパイク検出とバックグ
ランド検出との組み合わせから、表２に示すように、こ
れは難点のある質量クロマトグラムであることが明白で
ある。

【００５４】図１１に示す質量クロマトグラムは高品質
であり、アルゴリズムのスパイク検出部について高い値
によって表される（スパイク不存在を示す）だけでなく
バックグランド検出部についても高い値によって表さ
れ、その結果、式９によって定義されるＭＣＱ指数にお
いても高い値を示す（表２）。ＣＯＤＡは速く展開する
はずである。ＣＯＤＡはインタープリタであるＭＡＴＬ
ＡＢコードである。検討したデータセット（Ｃ３４５ス
キャン，１４５１質量）に関しては全ての質量クロマト
グラムのＭＣＱ指数の計算値は４８ｓｅｃｓである。開
発中のＣＯＤＡのコンパイルドＣ＋＋バージョンは少な
くとも１桁から２桁速いに違いない。この方法はコンパ
イルドパスカルコードで６〜１０分かかるＡｂｂａｓｓ
ｉの方法（Ｂ．Ｅ．Ａｂｂａｓｉ、Ｈ．Ｍｅｓｔｄａｇ
ｈ、Ｃ．Ｒｏｌａｎｄｏ、Ｉｎｔ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐ
ｅｃｔｒｕｍＩｏｎＰｒｏｃ．、１９９５、第１４
１巻第１７１〜１８６頁）に優るとも劣らない。

【００５５】これらの計算の変数は、平滑化ウインドウ
の幅とＭＣＱレベルである。種々の平滑化とＭＣＱレベ
ルについて、アルゴリズムが上手くいったかどうかの目
安を得るために、データの減少を以下のように行う：

【００５６】

【数１０】

【００５７】（式中、ｎｖａｒ（選択）はＣＯＤＡによ
り選択される変数の数であり、ｎｖａｒ（合計）はデー
タセットにおける変数の総数である。図１４に、データ
減少Ｒの値とＭＣＱレベルとの関係を、平滑化ウインド
ウの幅の幾つかの異なる値について示す。Ｒの最小値
は、熟練したオペレータにより検出されるすべての質量
クロマトグラムが、選択した質量クロマトグラムに含ま
れる場合に必要とされる。オペレータは、図４〜図７に
おいて水平線で示した、Ｒ値が０．０１０３である１５
個の質量クロマトグラムを選択した。熟練したオペレー
タにより定義される全ての情報が保存されるデータ減少
算指数Ｒの最小値をグラフに示す。最良の結果（すなわ
ち、全てのオペレータが選択した質量クロマトグラムを
保存したときのＲの最小値）は、平滑化ウインドウ幅が
３及び５ときに得られることが分かる。ＣＯＤＡにより
得られるＲ値は、オペレータのＲ値よりも常に高い。こ
れは、オペレータが各成分につき一つの質量クロマトグ
ラムを選択するのに対して、ある特定の成分がいくつか
の高度に相関した質量クロマトグラムを生じることがあ
るためである。

【００５８】平滑化ウインドウ幅が３のときのＲ値が平
滑化ウインドウ幅が５のときのＲ値よりやや小さい
（０．０３５１（平滑化ウインドウ幅３）対０．０３５
８（平滑化ウインドウ幅５）、質量クロマトグラム５１
対５２に相当）けれども、ここでは平滑化ウインドウ５
についての結果を用いた。その理由は、平滑化ウインド
ウ１についての結果ではＲ値が著しく大きくなるのに対
して、平滑化ウインドウ７では、Ｒ値が平滑化ウインド
ウ５の場合に似ているからである。その結果、平滑化ウ
インドウ５の選択が、よりよい選択と言える。

【００５９】平滑化ウインドウ５及び相関レベル（熟練
したオペレータにより選択されたすべての質量クロマト
グラムを保存したときのこの平滑化ウインドウについて
のＲの最小値を生じるレベル）０．８９を用いて選択し
た質量クロマトグラムから得られるＴＩＣを図６に、オ
ペレータが選択した質量クロマトグラムに基づくＴＩＣ
を図５に示す。明らかに、これらの二つの曲線は形が似
ているが、図５と図６における、相対強度は異なる。こ
れは、オペレータが一般的に各成分につき一つの代表的
な質量クロマトグラムを選択することによる。上記のよ
うに、ＣＯＤＡでは、フラグメンテーションの量、クラ
スタピーク等に応じて、各成分についていくつかの相関
のある質量クロマトグラムを検出する。最終的なデータ
減少として、各スキャン位置での最も高い最大強度を有
する質量クロマトグラムのみをプロットすることができ
る。これにより、質量クロマトグラムの選択数が５２個
から２８個に減少する。選択数を減少してもオペレータ
により選択されたものよりも多くのクロマトグラムを含
む（質量クロマトグラム２８：１５）理由は、以下の通
りである。

【００６０】ａ）アルゴリズムは、オペレータが観測で
きなかった（又は重要と考えなかったかもしれない）い
くつかの少量成分を検出した。ｂ）ブロードなＬＣピークは、わずかに異なるスキャン
位置で極大点を有する別個の質量クロマトグラム（ＣＯ
ＤＡでは別個のピークとして検出される）を有すること
がある。

【００６１】これらの質量クロマトグラムを用いて構成
したＴＩＣを、図７に示す。予測されるように、図５と
図７とはよく整合している。ＣＯＤＡにおいて全ての選
択された質量クロマトグラムをプロットし且つ表示する
こともできる。これは、全ての選択された変数について
行ってもよいし、減少した変数セットのみについて行っ
てもよい。これは、特に重なり合った成分について有効
なプロットであることが分かったが、色を使用しないと
適当な形を示すことができないので、ここでは示さな
い。

【００６２】得られた結果を見る別の方法は、変数の数
を減少させることにによる。最初のデータセットでは質
量値は１４５１であるが、ＣＯＤＡにより選択された質
量値の数は５２であった。さらに減少したデータセット
（フローダイヤグラム１７〜１９に記載）では、質量値
が２８にすぎない。最後に、ＣＯＤＡを、異性体が存在
し、２つ以上のピークを有する質量クロマトグラムが得
られるＬＣ−ＭＳデータセットについても試験した。こ
のデータセットについても、同等の結果が得られた。

【００６３】ＬＣ−ＭＳデータにおけるノイズやバック
グランドを顕著に減少させる変数選択法が提供されたこ
とが分かる。変数の数を、重要な情報を失わずに１４５
１から２８に減少させることができた。これにより、Ｌ
Ｃ−ＭＳデータにおけるＴＩＣトレース特性が顕著に向
上し、且つＬＣ−ＭＳデータセットを解析するのにかか
る時間が大幅に減少する。類似度指数を求めるために、
変数と平滑化標準化変数とを用いてもよいし、標準化変
数と平滑化変数とを用いてもよい。

【００６４】これは、主に成分検出装置について言え
る。最適に使用するには、減少ＴＩＣ（図７）は典型的
な質量分析法のベンダーのデータシステムにおけるプロ
ットとして入手できるので、検出されたＬＣピークに相
当する質量スペクトルは現代のシステムの典型的なポイ
ント・アンド・クリック（ｐｏｉｎｔａｎｄｃｌｉ
ｃｋ）モードで行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】三成分混合物のクロマトグラフィー分離の概略
図である。

【図２】エレクトロスプレイＬＣ−ＭＳインターフェー
スの概略図である。

【図３】分光検出器を用いたクロマトグラフィーのフロ
ーダイヤグラムである。

【図４】総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）である。

【図５】熟練したオペレータによる総抽出イオンクロマ
トグラム（ＴＥＩＣ）である。

【図６】ＣＯＤＡのＴＥＩＣである。

【図７】減少選択ＣＯＤＡのＴＥＩＣである。

【図８】質量クロマトグラム及び平滑化・標準化したも
のの一例である。

【図９】質量クロマトグラム及び平滑化・標準化したも
のの一例である。

【図１０】質量クロマトグラム及び平滑化・標準化した
ものの一例である。

【図１１】質量クロマトグラム及び平滑化・標準化した
ものの一例である。

【図１２】ＣＯＤＡのフローダイヤグラムの前半部であ
る。

【図１３】ＣＯＤＡのフローダイヤグラムの後半部であ
る。

【図１４】データの減少と、ＭＣＱレベル及び平滑化ウ
インドウ幅との関係を示すプロットである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有機物質をクロマトグラフィーに附して
混合物の成分を分離する第一工程と、分離した物質を分
光測定して成分を検出及び同定する第二工程とを含んで
なる有機物質の混合物の化学成分を同定し且つ定量する
方法であって、前記クロマトグラフィーと分光測定を、ａ）試料をカラムに注入し；ｂ）カラム中種々の速度で分配することにより成分を分
離し；ｃ）分離した成分を分光計に通し；ｄ）一連のスペクトルを得て存在する全ての種を検出
し；そしてｅ）前記スペクトルをコンピュータファイルに記憶させ
る、ことにより行う方法において；ｉ）分光変数を平滑化する工程と；ｉｉ）分光変数の強度の平均値を得る工程と；ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた平均値を工程ｉで得られた
平滑化変数から減じる工程と；ｉｖ）工程ｉｉｉの出力と最初の分光変数を正規化する
工程と；ｖ）工程ｉｖの値を比較して各分光変数についての類似
度の測定値を得る工程と；ｖｉ）類似度測定値の閾値を決定して不要信号を棄却す
る工程と；ｖｉｉ）類似度測定値が前記閾値を超える分光変数のみ
を選択する工程と；ｖｉｉｉ）選択された変数の合計を時間に対してプロッ
トして強化クロマトグラムを得る工程と、を用いた変数
選択により分光データを強化することを特徴とする方
法。