JPH10113184A - フラボノイド配糖化酵素遺伝子 - Google Patents
フラボノイド配糖化酵素遺伝子Info
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- JPH10113184A JPH10113184A JP8272253A JP27225396A JPH10113184A JP H10113184 A JPH10113184 A JP H10113184A JP 8272253 A JP8272253 A JP 8272253A JP 27225396 A JP27225396 A JP 27225396A JP H10113184 A JPH10113184 A JP H10113184A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 UDP−グルコース：フラボノイド３，５
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子
を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを有する
宿主細胞、ならびに該宿主細胞を培地に培養し、培養物
よりUDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グル
コシルトランスフェラーゼを採取することを特徴とす
る、UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グル
コシルトランスフェラーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、リンドウの花弁色素である
ゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する酵素
遺伝子であるUDP−グルコース：フラボノイド３，５−
Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供され
る。本発明の遺伝子を公知の方法に従い植物体に導入す
れば、花色の色彩の調節、特にバラ等の青色花弁をもた
ない品種においてゲンチオデルフィンを発現させること
による青色花弁の創出が期待できる。
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子
を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを有する
宿主細胞、ならびに該宿主細胞を培地に培養し、培養物
よりUDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グル
コシルトランスフェラーゼを採取することを特徴とす
る、UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グル
コシルトランスフェラーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、リンドウの花弁色素である
ゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する酵素
遺伝子であるUDP−グルコース：フラボノイド３，５−
Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供され
る。本発明の遺伝子を公知の方法に従い植物体に導入す
れば、花色の色彩の調節、特にバラ等の青色花弁をもた
ない品種においてゲンチオデルフィンを発現させること
による青色花弁の創出が期待できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フラボノイド配糖
化酵素（ＵＦＧＴ）遺伝子に関する。さらに詳しくはフ
ラボノイドの３位，５位にグルコースを転移することの
できる酵素遺伝子に関する。
化酵素（ＵＦＧＴ）遺伝子に関する。さらに詳しくはフ
ラボノイドの３位，５位にグルコースを転移することの
できる酵素遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】フラボノイドは、植物に各種の色調を与
える主要な色素化合物である。フラボノイド化合物の中
で植物の色調発現の中心となるのが、種々のアントシア
ニン化合物であり、赤から青までの広い範囲の色調を呈
することが知られている。アントシアニンは配糖体もし
くはアシル化配糖体であり、それらの配糖体を除いた部
分をアントシアニジンと呼ぶ。主なアントシアニジンは
ベラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンの３つで
ある。アントシアニン色素の色調は種々の要因によって
決まる。中でもアントシアニジン骨格のＢ環の水酸基の
数は重要であり、水酸基の数が増すに従って橙赤色から
青色に変わる傾向がある。青色を呈する花弁のアントシ
アニンについてはほとんどの場合デルフィニジンであ
る。また、アントシアニンの色調は溶液のｐＨや共存す
る金属イオン、他の化合物などによっても著しい影響を
受ける。
える主要な色素化合物である。フラボノイド化合物の中
で植物の色調発現の中心となるのが、種々のアントシア
ニン化合物であり、赤から青までの広い範囲の色調を呈
することが知られている。アントシアニンは配糖体もし
くはアシル化配糖体であり、それらの配糖体を除いた部
分をアントシアニジンと呼ぶ。主なアントシアニジンは
ベラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンの３つで
ある。アントシアニン色素の色調は種々の要因によって
決まる。中でもアントシアニジン骨格のＢ環の水酸基の
数は重要であり、水酸基の数が増すに従って橙赤色から
青色に変わる傾向がある。青色を呈する花弁のアントシ
アニンについてはほとんどの場合デルフィニジンであ
る。また、アントシアニンの色調は溶液のｐＨや共存す
る金属イオン、他の化合物などによっても著しい影響を
受ける。
【０００３】一方、アシル化配糖体において、そのアシ
ル基がｐ-クマル酸やコーヒー酸などの芳香族系有機酸
である場合、青色系の呈色を示すことが知られている。
リンドウのアントシアニンであるゲンチオデルフィン
[Goto, T. et al. Tetr. Letters 23: (36) 3695-36
98 (1982)] や、キキョウのアントシアニンであるプラ
チコニン [Goto, T. et al. Tetr. Letters 24: (2
1) 2181-2184 (1983)] に代表されるアシル化アントシ
アニンは、分子内にコーヒー酸が結合した構造を持ち、
一般的にアントシアニンが不安定であるとされるｐＨ弱
酸性から中性領域においても安定に青色を呈する。
ル基がｐ-クマル酸やコーヒー酸などの芳香族系有機酸
である場合、青色系の呈色を示すことが知られている。
リンドウのアントシアニンであるゲンチオデルフィン
[Goto, T. et al. Tetr. Letters 23: (36) 3695-36
98 (1982)] や、キキョウのアントシアニンであるプラ
チコニン [Goto, T. et al. Tetr. Letters 24: (2
1) 2181-2184 (1983)] に代表されるアシル化アントシ
アニンは、分子内にコーヒー酸が結合した構造を持ち、
一般的にアントシアニンが不安定であるとされるｐＨ弱
酸性から中性領域においても安定に青色を呈する。
【０００４】リンドウの青色アントアニンであるゲンチ
オデルフィンは、デルフィニジン骨格の３位，５位，
３’位にグルコースが結合し、３’位，５位にはグルコ
ースを介してコーヒー酸が結合した糖鎖構造を持つ。従
って、リンドウの花弁色素であるゲンチオデルフィンの
糖鎖構造の生合成に関与する酵素遺伝子を単離すること
ができれば、該遺伝子を他の植物体に導入することによ
り花色を青系に操作できる可能性が期待される。これま
でアントシアニンの３位にグルコース等の糖を転移する
酵素遺伝子が知られているが [Ralston, E.J. et al.
Genetics 119: 185-197 (1988) 、Wise, R.P. et al.
Plant Mol. Biol. 14: 277-279 (1990)]、５位に糖を
転移する酵素遺伝子は知られていない。
オデルフィンは、デルフィニジン骨格の３位，５位，
３’位にグルコースが結合し、３’位，５位にはグルコ
ースを介してコーヒー酸が結合した糖鎖構造を持つ。従
って、リンドウの花弁色素であるゲンチオデルフィンの
糖鎖構造の生合成に関与する酵素遺伝子を単離すること
ができれば、該遺伝子を他の植物体に導入することによ
り花色を青系に操作できる可能性が期待される。これま
でアントシアニンの３位にグルコース等の糖を転移する
酵素遺伝子が知られているが [Ralston, E.J. et al.
Genetics 119: 185-197 (1988) 、Wise, R.P. et al.
Plant Mol. Biol. 14: 277-279 (1990)]、５位に糖を
転移する酵素遺伝子は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ゲン
チオデルフィン生合成遺伝子のうち、３位，５位の２位
を配糖化しうる糖転移酵素遺伝子を提供することにあ
る。
チオデルフィン生合成遺伝子のうち、３位，５位の２位
を配糖化しうる糖転移酵素遺伝子を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リンドウの花弁より
UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を単離し、その配列決定を
することに成功し、本発明を完成させるに至った。すな
わち、本発明は、実質的に配列番号１で示されるアミノ
酸配列をコードするUDP−グルコース：フラボノイド
３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子であ
る。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リンドウの花弁より
UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を単離し、その配列決定を
することに成功し、本発明を完成させるに至った。すな
わち、本発明は、実質的に配列番号１で示されるアミノ
酸配列をコードするUDP−グルコース：フラボノイド
３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子であ
る。
【０００７】本発明はまた、配列番号２で示される塩基
配列を有する上記UDP−グルコース：フラボノイド３，
５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
さらに、本発明は、上記UDP−グルコース：フラボノイ
ド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを有する宿
主細胞、ならびに該宿主細胞を培地に培養し、培養物よ
りUDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコ
シルトランスフェラーゼを採取することを特徴とする、
UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼの製造方法である。
配列を有する上記UDP−グルコース：フラボノイド３，
５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
さらに、本発明は、上記UDP−グルコース：フラボノイ
ド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを有する宿
主細胞、ならびに該宿主細胞を培地に培養し、培養物よ
りUDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコ
シルトランスフェラーゼを採取することを特徴とする、
UDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼの製造方法である。
【０００８】本発明において、「実質的に」とは、フラ
ボノイドの３位，５位への糖転移酵素活性を有する限
り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もし
くは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換されていてもよ
い。以下、本発明を詳細に説明する。
ボノイドの３位，５位への糖転移酵素活性を有する限
り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もし
くは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換されていてもよ
い。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】 [1] ｍＲＮＡの抽出及び分離 リンドウ等の花弁よりｍＲＮＡを抽出する。まず該組織
より全ＲＮＡの粗抽出物を得、これよりタンパク質、多
糖類、その他の夾雑物を除去し、オリゴｄＴセルロース
クロマトグラフィー、ポリＵ−セファロースカラムなど
の吸着カラムを用いて更に精製する。ポリＡ（ポリＡ
＋）鎖画分を溶出し集め、同様の精製を２〜３回繰り返
すことによってｍＲＮＡを高度に濃縮することができ
る。
より全ＲＮＡの粗抽出物を得、これよりタンパク質、多
糖類、その他の夾雑物を除去し、オリゴｄＴセルロース
クロマトグラフィー、ポリＵ−セファロースカラムなど
の吸着カラムを用いて更に精製する。ポリＡ（ポリＡ
＋）鎖画分を溶出し集め、同様の精製を２〜３回繰り返
すことによってｍＲＮＡを高度に濃縮することができ
る。
【００１０】[2] β糖転移酵素遺伝子配列プライマー
による３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ 本発明の目的とするリンドウの花弁色素ゲンチオデルフ
ィン合成酵素遺伝子の一つであるアントシアニングルコ
ース転移酵素遺伝子は、ゲンチオデルフィンの構造よ
り、グルコースをβ位に転移する酵素の遺伝子であるこ
とが注目される。そこで、例えばトウモロコシとオオム
ギのUDP−グルコース：フラボノイド３−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼや動物のUDP−グルクロノシルト
ランスフェラーゼに代表される既知のβ−糖転移酵素遺
伝子群の遺伝子配列相同領域より、これと共通の配列を
有する遺伝子を目的遺伝子の候補とすることができる。
による３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ 本発明の目的とするリンドウの花弁色素ゲンチオデルフ
ィン合成酵素遺伝子の一つであるアントシアニングルコ
ース転移酵素遺伝子は、ゲンチオデルフィンの構造よ
り、グルコースをβ位に転移する酵素の遺伝子であるこ
とが注目される。そこで、例えばトウモロコシとオオム
ギのUDP−グルコース：フラボノイド３−Ｏ−グルコシ
ルトランスフェラーゼや動物のUDP−グルクロノシルト
ランスフェラーゼに代表される既知のβ−糖転移酵素遺
伝子群の遺伝子配列相同領域より、これと共通の配列を
有する遺伝子を目的遺伝子の候補とすることができる。
【００１１】本発明においてはまず、リンドウの花弁よ
り抽出したｍＲＮＡを試料とし、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ
にて３’末端部分の増幅を行い、その塩基配列を決定す
る。プライマーとしては、上記既知のβ糖転移酵素遺伝
子群の配列の情報を基に設計することができる。具体的
には、既知のβ糖転移酵素のアミノ酸配列において見い
だされる、高度に保存されたアミノ酸配列領域、即ち
（Phe Tyr)(Val Ile)(Thr Cys)His(Ala Gly Ser Cys)Gl
y の６アミノ酸からなる配列から導かれる代表的な１６
個のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列より合成した数
種を用いる。この場合のプライマーはデジェネレート
（ミックス）プライマーでも、そうでなくてもよい。ま
た、ＰＣＲを行う場合、プライマーの配列は必ずしも獲
得を目的とした遺伝子の塩基配列に完全に一致しなくて
も、ＰＣＲ反応による増幅が可能である。
り抽出したｍＲＮＡを試料とし、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ
にて３’末端部分の増幅を行い、その塩基配列を決定す
る。プライマーとしては、上記既知のβ糖転移酵素遺伝
子群の配列の情報を基に設計することができる。具体的
には、既知のβ糖転移酵素のアミノ酸配列において見い
だされる、高度に保存されたアミノ酸配列領域、即ち
（Phe Tyr)(Val Ile)(Thr Cys)His(Ala Gly Ser Cys)Gl
y の６アミノ酸からなる配列から導かれる代表的な１６
個のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列より合成した数
種を用いる。この場合のプライマーはデジェネレート
（ミックス）プライマーでも、そうでなくてもよい。ま
た、ＰＣＲを行う場合、プライマーの配列は必ずしも獲
得を目的とした遺伝子の塩基配列に完全に一致しなくて
も、ＰＣＲ反応による増幅が可能である。
【００１２】続いてＰＣＲ産物を常套的な手段にてクロ
ーニングし、配列決定する。得られたＤＮＡ配列はアミ
ノ酸配列に翻訳し、上記のβ転移酵素遺伝子群の配列の
共通配列を持つＤＮＡ断片であれば、候補遺伝子とす
る。
ーニングし、配列決定する。得られたＤＮＡ配列はアミ
ノ酸配列に翻訳し、上記のβ転移酵素遺伝子群の配列の
共通配列を持つＤＮＡ断片であれば、候補遺伝子とす
る。
【００１３】[3] β糖転移酵素遺伝子群の単離 候補遺伝子の単離は、一般的にはｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングによって行うことができる。[1]で得
られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、これを
プラスミドベクターに組み込み、種々の組換え体プラス
ミドを得る。プラスミドベクターとしては、宿主細胞内
で自立複製可能で該ｃＤＮＡを安定保持できるものであ
れば、いずれをも用いることができるが、具体的には、
pSPORT-1 (GIBCO BRL 社製) 等が挙げられる。
のスクリーニングによって行うことができる。[1]で得
られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、これを
プラスミドベクターに組み込み、種々の組換え体プラス
ミドを得る。プラスミドベクターとしては、宿主細胞内
で自立複製可能で該ｃＤＮＡを安定保持できるものであ
れば、いずれをも用いることができるが、具体的には、
pSPORT-1 (GIBCO BRL 社製) 等が挙げられる。
【００１４】次に、組換え体プラスミドを大腸菌に導入
してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブ
ラリーから候補遺伝子の翻訳領域を含む遺伝子をスクリ
ーニングするには、[2] で配列決定した候補遺伝子の
３’側の配列を基に数種のプローブを作成し、これとの
ハイブリダイゼーションにより行う。
してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブ
ラリーから候補遺伝子の翻訳領域を含む遺伝子をスクリ
ーニングするには、[2] で配列決定した候補遺伝子の
３’側の配列を基に数種のプローブを作成し、これとの
ハイブリダイゼーションにより行う。
【００１５】また、候補遺伝子の翻訳領域を単離するた
めに、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行ってもよい。具体的に
は、[2] で決定した候補遺伝子の配列を基に逆転写用の
プライマーを作製し、特異的なｃＤＮＡを合成する。続
いてｃＤＮＡの５’末端にアンカーを結合させ、そのア
ンカーに相補的なアンカープライマーと、逆転写プライ
マーと重ならない候補遺伝子特異的なプライマーとの間
でＰＣＲを行う。1500-2000bp のＤＮＡ断片を単離、ク
ローニングし、3'末端の配列が候補遺伝子と一致するこ
とを確認した上で5'末端の塩基配列を決定する。
めに、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行ってもよい。具体的に
は、[2] で決定した候補遺伝子の配列を基に逆転写用の
プライマーを作製し、特異的なｃＤＮＡを合成する。続
いてｃＤＮＡの５’末端にアンカーを結合させ、そのア
ンカーに相補的なアンカープライマーと、逆転写プライ
マーと重ならない候補遺伝子特異的なプライマーとの間
でＰＣＲを行う。1500-2000bp のＤＮＡ断片を単離、ク
ローニングし、3'末端の配列が候補遺伝子と一致するこ
とを確認した上で5'末端の塩基配列を決定する。
【００１６】[4] 目的遺伝子の選抜 候補遺伝子の中から目的の遺伝子を選抜するために、
[3]で単離した遺伝子断片を、PCR 又は制限酵素処理に
より翻訳領域を取り出し、大腸菌発現ベクター系にクロ
ーニングし、候補遺伝子の産物を大腸菌で発現させる。
その後、大腸菌を破砕し、得られた可溶性画分を試料と
してグルコース転移酵素活性の有無を確認する。活性の
測定はフラボノイドの３位及び５位に対する２種のグル
コース転移酵素活性を測定し、活性が検出できれば大腸
菌に導入したｃＤＮＡが目的とする遺伝子であると判断
する。本発明において塩基配列の決定は、ジデオキシ法
[Sanger. F, Science, 214,1205-1210 (1981)]等によ
り行うことができる。
[3]で単離した遺伝子断片を、PCR 又は制限酵素処理に
より翻訳領域を取り出し、大腸菌発現ベクター系にクロ
ーニングし、候補遺伝子の産物を大腸菌で発現させる。
その後、大腸菌を破砕し、得られた可溶性画分を試料と
してグルコース転移酵素活性の有無を確認する。活性の
測定はフラボノイドの３位及び５位に対する２種のグル
コース転移酵素活性を測定し、活性が検出できれば大腸
菌に導入したｃＤＮＡが目的とする遺伝子であると判断
する。本発明において塩基配列の決定は、ジデオキシ法
[Sanger. F, Science, 214,1205-1210 (1981)]等によ
り行うことができる。
【００１７】[5] 宿主細胞への遺伝子導入および発現 上記で得られたUDP−グルコース：フラボノイド３，５
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（以下、本
発明遺伝子）は、適当な宿主細胞中に導入して高発現さ
せることができる。具体的には、ベクターＤＮＡの適当
な制限酵素部位に本発明遺伝子を含むＤＮＡを挿入して
組み換え体ＤＮＡを調製し、これを宿主細胞中に導入す
る。宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる
ものであればよく、真核細胞及び原核細胞のいずれをも
用いることができる。真核細胞としては動物、植物、酵
母等の細胞が、また原核細胞としては大腸菌、枯草菌、
放線菌等が挙げられる。
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（以下、本
発明遺伝子）は、適当な宿主細胞中に導入して高発現さ
せることができる。具体的には、ベクターＤＮＡの適当
な制限酵素部位に本発明遺伝子を含むＤＮＡを挿入して
組み換え体ＤＮＡを調製し、これを宿主細胞中に導入す
る。宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる
ものであればよく、真核細胞及び原核細胞のいずれをも
用いることができる。真核細胞としては動物、植物、酵
母等の細胞が、また原核細胞としては大腸菌、枯草菌、
放線菌等が挙げられる。
【００１８】本発明遺伝子を組み込むベクターＤＮＡ
は、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるもので
もよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファー
ジＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である場合
のベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミドｐＵＣ１
８／ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、
ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＲＩＴ２（Pharmacia 社製) ；ｐＧ
ＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２（Promega 社製) ；ｐ
ＭＡＬ−ｃ，ｐＭＡＬ−ｐ（New England Biolabs 社
製), ｐＥＴ１５ｂ（Novagen 社製) 等を用いることが
できる。
は、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるもので
もよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファー
ジＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である場合
のベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミドｐＵＣ１
８／ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、
ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＲＩＴ２（Pharmacia 社製) ；ｐＧ
ＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２（Promega 社製) ；ｐ
ＭＡＬ−ｃ，ｐＭＡＬ−ｐ（New England Biolabs 社
製), ｐＥＴ１５ｂ（Novagen 社製) 等を用いることが
できる。
【００１９】組み換え体ＤＮＡを宿主細胞を形質転換す
るには、Hanahan 法 ["Molecular Cloning, A Laborato
ry Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York (1989)]、Chung らの方法 [Proc. N
atl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172 (1989)] 等を用い
て行うことができる。上記のようにして得られた形質転
換体の培養は、通常の形質転換体によるポリペプチドの
生産に用いる培養方法に従って行われる。
るには、Hanahan 法 ["Molecular Cloning, A Laborato
ry Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York (1989)]、Chung らの方法 [Proc. N
atl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172 (1989)] 等を用い
て行うことができる。上記のようにして得られた形質転
換体の培養は、通常の形質転換体によるポリペプチドの
生産に用いる培養方法に従って行われる。
【００２０】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主細胞とし
て用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し
得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体
の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培
地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微生
物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン
あるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロ
ピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどの
アルコール類が用いられる。
て用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し
得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体
の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培
地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微生
物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン
あるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロ
ピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどの
アルコール類が用いられる。
【００２１】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。 無機物としては、
りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグ
ネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用い
られる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。 無機物としては、
りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグ
ネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用い
られる。
【００２２】培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養
などの好気的条件下で行う。培養温度は通常10〜50℃、
好ましくは30〜40℃がよく、培養時間は、通常１〜１０
時間、好ましくは２〜５時間である。培養中ｐＨは、通
常７〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機
の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニ
アなどを用いて行う。
などの好気的条件下で行う。培養温度は通常10〜50℃、
好ましくは30〜40℃がよく、培養時間は、通常１〜１０
時間、好ましくは２〜５時間である。培養中ｐＨは、通
常７〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機
の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニ
アなどを用いて行う。
【００２３】培養物から目的酵素の単離精製は公知の分
離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素
などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵
素消化、塩析や溶媒沈澱法、透析、遠心分離、限外濾
過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明するが、これらにより本発明の範囲が
限定されるものではない。
離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素
などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵
素消化、塩析や溶媒沈澱法、透析、遠心分離、限外濾
過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明するが、これらにより本発明の範囲が
限定されるものではない。
【００２４】
(1) リンドウの花弁からの総ＲＮＡ抽出 リンドウ（品種：極晩）の花弁20ｇを液体窒素存在下で
乳棒乳鉢を用いて粉砕した。これにグアニジンイソチオ
シアネート溶液（25 mM クエン酸ナトリウム、0.0025%
N −ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、0.5 mM 2 −
メルカプトエタノール、4M グアニジンチオシアネー
ト）50mlを加え、室温で溶かしながら攪拌した。続い
て、フェノール抽出、エタノール沈殿、LiCl沈殿により
精製し、約5.5mgの精製全ＲＮＡを得た。次にこれをOli
go(dT)-Latexを用い、既知の手法〔実験医学Vol.7, No.
17, 2065-2068 (1989)〕により、ポリＡ（ポリＡ＋）鎖
画分を高度に濃縮した。
乳棒乳鉢を用いて粉砕した。これにグアニジンイソチオ
シアネート溶液（25 mM クエン酸ナトリウム、0.0025%
N −ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、0.5 mM 2 −
メルカプトエタノール、4M グアニジンチオシアネー
ト）50mlを加え、室温で溶かしながら攪拌した。続い
て、フェノール抽出、エタノール沈殿、LiCl沈殿により
精製し、約5.5mgの精製全ＲＮＡを得た。次にこれをOli
go(dT)-Latexを用い、既知の手法〔実験医学Vol.7, No.
17, 2065-2068 (1989)〕により、ポリＡ（ポリＡ＋）鎖
画分を高度に濃縮した。
【００２５】(2) β糖転移酵素遺伝子部分配列の増幅 (2-1) 逆転写反応 3'RACE SYSTEM (GIBCO BRL社製) を用いて行った。mRNA
溶液130 μl(10μg mRNA) に10μM のadapter primer
（GIBCO BRL 社製) 溶液 10 μl を加え、65℃10分間イ
ンキュベートし、氷上に2 分間放置した。これに10×sy
nthesis buffer 20 μl, 10mM dNTP mix 10μl, 0.1M
DTT 20 μl を加え、42℃で2 分間インキュベートし
た。次に、SuperScript RT 10 μl を加え42℃で30分間
反応を行った。その後、氷上にサンプルを移し、10μl
のRNase H を加え42℃で10分間インキュベートを行っ
た。
溶液130 μl(10μg mRNA) に10μM のadapter primer
（GIBCO BRL 社製) 溶液 10 μl を加え、65℃10分間イ
ンキュベートし、氷上に2 分間放置した。これに10×sy
nthesis buffer 20 μl, 10mM dNTP mix 10μl, 0.1M
DTT 20 μl を加え、42℃で2 分間インキュベートし
た。次に、SuperScript RT 10 μl を加え42℃で30分間
反応を行った。その後、氷上にサンプルを移し、10μl
のRNase H を加え42℃で10分間インキュベートを行っ
た。
【００２６】(2-2) ＰＣＲ反応 (2-1) の逆転写反応液１μl に、1.25unit AmpriTaq DN
A Polymerase (PERKINELMER CETUS社製) 、10×PCR buf
fer (TAKARA社製) 5 μl 、10mM dNTP mix 4μl 、10μ
M universal amplification primer(GIBCO BRL社製)1μ
l 、20μM のβ糖転移酵素特異的配列プライマー 2.5μ
l 加え、滅菌水で総量を50μl とし、PCR 反応液とし
た。これをサーマルサイクラーPJ480 を用いてＰＣＲ
（ＰＣＲプログラム : 94 ℃ 7分間を１サイクル； 94
℃ 1分間→ 42, 48, 50又は55 ℃,1 分間→ 72 ℃, 1
分間を30サイクル；72℃, 7 分間を 1サイクル) を行っ
た。
A Polymerase (PERKINELMER CETUS社製) 、10×PCR buf
fer (TAKARA社製) 5 μl 、10mM dNTP mix 4μl 、10μ
M universal amplification primer(GIBCO BRL社製)1μ
l 、20μM のβ糖転移酵素特異的配列プライマー 2.5μ
l 加え、滅菌水で総量を50μl とし、PCR 反応液とし
た。これをサーマルサイクラーPJ480 を用いてＰＣＲ
（ＰＣＲプログラム : 94 ℃ 7分間を１サイクル； 94
℃ 1分間→ 42, 48, 50又は55 ℃,1 分間→ 72 ℃, 1
分間を30サイクル；72℃, 7 分間を 1サイクル) を行っ
た。
【００２７】(2-3) ＰＣＲ産物のプラスミドＤＮＡへの
クローニングとシーケンス解析 上記のＰＣＲ産物をInvitrogen社製TAクローニングキッ
トを用い、pCRII ベクターに導入し、INV αＦ株にクロ
ーニングを行った。シークエンスの読み取りはＤＮＡシ
ークエンス装置473A(PERKIN ELMER ABI 社製) を用いて
行った。また、ＤＮＡシーケンスの解析はDNASIS（日立
ソフトエンジニアリング社製）とSeqEd ((PERKIN ELMER
ABI社製) の両ソフトで行った。
クローニングとシーケンス解析 上記のＰＣＲ産物をInvitrogen社製TAクローニングキッ
トを用い、pCRII ベクターに導入し、INV αＦ株にクロ
ーニングを行った。シークエンスの読み取りはＤＮＡシ
ークエンス装置473A(PERKIN ELMER ABI 社製) を用いて
行った。また、ＤＮＡシーケンスの解析はDNASIS（日立
ソフトエンジニアリング社製）とSeqEd ((PERKIN ELMER
ABI社製) の両ソフトで行った。
【００２８】シーケンス解析の結果得られたＤＮＡ配列
は、アミノ酸配列に翻訳し、図１に示すβ糖転移酵素遺
伝子のコンセンサスアミノ酸配列と比較し、明らかにこ
の配列に当てはまるものだけを候補遺伝子の配列とし
た。288 個のクローンについてＤＮＡ配列の一部をシー
ケンス解析した結果、53個のβ糖転移酵素遺伝子配列を
持つと推測されるクローンが得られた。得られたクロー
ンは配列より12種に分類できた。
は、アミノ酸配列に翻訳し、図１に示すβ糖転移酵素遺
伝子のコンセンサスアミノ酸配列と比較し、明らかにこ
の配列に当てはまるものだけを候補遺伝子の配列とし
た。288 個のクローンについてＤＮＡ配列の一部をシー
ケンス解析した結果、53個のβ糖転移酵素遺伝子配列を
持つと推測されるクローンが得られた。得られたクロー
ンは配列より12種に分類できた。
【００２９】(3) β糖転移酵素遺伝子の翻訳開始領域
の解析 (3-1) ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ用プライマーの作製 (2)で得られた12種の候補遺伝子の3'側の配列からスト
ップコドンを確定し、それぞれストップコドンを含む30
bpの相補配列をＰＣＲプライマーとした。また、ＰＣＲ
プライマーに対応する配列の、すぐ下流の30bpの相補配
列を逆転写プライマーとした。
の解析 (3-1) ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ用プライマーの作製 (2)で得られた12種の候補遺伝子の3'側の配列からスト
ップコドンを確定し、それぞれストップコドンを含む30
bpの相補配列をＰＣＲプライマーとした。また、ＰＣＲ
プライマーに対応する配列の、すぐ下流の30bpの相補配
列を逆転写プライマーとした。
【００３０】(3-2) ｃＤＮＡ合成 5'RACE SYSTEM (GIBCO BRL社製) を用いて行った。mRNA
溶液14μl (1μg ) に2.5 μM の逆転写プライマー溶液
1μl を加え、70℃10分間インキュベートし、氷上に1
分間放置した。これに10×synthesis buffer 2.5μl, 1
0mM dNTP mix 1μl, 0.1M DTT 2.5 μl 、25mM MgCl2 3
μl 、逆転写酵素 SuperScript RT 1 μl を加え、50℃
で30分間、続いて70℃で15分インキュベートした。その
後、1 μl のRNase H を加え55℃で10分間インキュベー
トした。合成したcDNAは 5'RACE SYSTEM (GIBCO BRL 社
製) 添付のカートリッジカラムを用い、添付のプロトコ
ールにより精製した。
溶液14μl (1μg ) に2.5 μM の逆転写プライマー溶液
1μl を加え、70℃10分間インキュベートし、氷上に1
分間放置した。これに10×synthesis buffer 2.5μl, 1
0mM dNTP mix 1μl, 0.1M DTT 2.5 μl 、25mM MgCl2 3
μl 、逆転写酵素 SuperScript RT 1 μl を加え、50℃
で30分間、続いて70℃で15分インキュベートした。その
後、1 μl のRNase H を加え55℃で10分間インキュベー
トした。合成したcDNAは 5'RACE SYSTEM (GIBCO BRL 社
製) 添付のカートリッジカラムを用い、添付のプロトコ
ールにより精製した。
【００３１】(3-3) 翻訳開始領域を含むＤＮＡ断片の
増幅 (3-2) で得たcDNAにアンカーＤＮＡ（CLONTECH社製) を
T4 Ligase を用いて常法により結合させた。アンカーＤ
ＮＡを結合させたcDNAをGENE Amp PCR System9600 (PER
KIN ELMER社製) によリ、アンカープライマー(CLONTECH
社製) 、(3-1) で設計したＰＣＲプライマーを用いて
ＰＣＲ（ＰＣＲプログラム： 94 ℃, 45秒間→55〜65
℃, 45秒間→ 72 ℃, 2 分間を35サイクル) を行った。
増幅 (3-2) で得たcDNAにアンカーＤＮＡ（CLONTECH社製) を
T4 Ligase を用いて常法により結合させた。アンカーＤ
ＮＡを結合させたcDNAをGENE Amp PCR System9600 (PER
KIN ELMER社製) によリ、アンカープライマー(CLONTECH
社製) 、(3-1) で設計したＰＣＲプライマーを用いて
ＰＣＲ（ＰＣＲプログラム： 94 ℃, 45秒間→55〜65
℃, 45秒間→ 72 ℃, 2 分間を35サイクル) を行った。
【００３２】(3-4) ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物のプラ
スミドＤＮＡへのクローニングとシーケンス解析 上記の増幅産物について、(2-3) と同様にクローニング
を行った。シークエンスは、(2-3) と同様な装置を用い
て行い、12候補遺伝子の翻訳開始領域の塩基配列を決定
した。
スミドＤＮＡへのクローニングとシーケンス解析 上記の増幅産物について、(2-3) と同様にクローニング
を行った。シークエンスは、(2-3) と同様な装置を用い
て行い、12候補遺伝子の翻訳開始領域の塩基配列を決定
した。
【００３３】(4) 候補遺伝子の翻訳領域ＤＮＡ断片の
単離 (4-1) PCR プライマーの作製 12候補遺伝子のアミノ酸配列のＮ末端の２〜９番目のア
ミノ酸残基に相当する２４塩基（または２３塩基）の
５’端にベクターに組み込む為の制限酵素認識配列と、
さらにその５’端にＧＣＧの３塩基を付けた配列を片側
プライマーとした。もう一方のプライマーは、候補遺伝
子の３’非翻訳領域の相補配列において、上記のプライ
マーとは相補構造を形成しない配列を有する２４塩基
（または２３塩基）の５’端にベクターに組み込むため
の制限酵素認識配列と、さらにその５’端にＧＣＧの３
塩基を付加した配列とした。
単離 (4-1) PCR プライマーの作製 12候補遺伝子のアミノ酸配列のＮ末端の２〜９番目のア
ミノ酸残基に相当する２４塩基（または２３塩基）の
５’端にベクターに組み込む為の制限酵素認識配列と、
さらにその５’端にＧＣＧの３塩基を付けた配列を片側
プライマーとした。もう一方のプライマーは、候補遺伝
子の３’非翻訳領域の相補配列において、上記のプライ
マーとは相補構造を形成しない配列を有する２４塩基
（または２３塩基）の５’端にベクターに組み込むため
の制限酵素認識配列と、さらにその５’端にＧＣＧの３
塩基を付加した配列とした。
【００３４】(4-2) RT-PCR による候補遺伝子ORF 領域
ＤＮＡ断片の作製 2.5mM dNTP mix 1.6μl 、20μM PCR 両プライマー各2.
0 μl を混合し、滅菌水で総量を10μl とし、Ampli Wa
x PCR Gems 100 (PERKIN ELMER社製) を加え、サーマル
サイクラーPJ9600(PERKIN ELMER 社製) で80℃、10分さ
らに25℃、5 分インキュベートした。これに、10×UlTm
a buffer(PERKIN ELMER 社製) 10μl 、25mM MgCl2 6μ
l 、UlTma DNA Polymerase (PERKIN ELMER社製) 1 μl
、(2-1)で作製した逆転写産物溶液1 μl 、滅菌水72μ
l 加え、サーマルサイクラーPJ9600(PERKIN ELMER 社
製) を用い、ＰＣＲ（ＰＣＲプログラム: 96℃, 1 分間
を 1サイクル;95 ℃, 1 分間→55℃, 1 分間→ 72 ℃,
1 分間を35サイクル;72 ℃,7 分間を1 サイクル) を行
った。
ＤＮＡ断片の作製 2.5mM dNTP mix 1.6μl 、20μM PCR 両プライマー各2.
0 μl を混合し、滅菌水で総量を10μl とし、Ampli Wa
x PCR Gems 100 (PERKIN ELMER社製) を加え、サーマル
サイクラーPJ9600(PERKIN ELMER 社製) で80℃、10分さ
らに25℃、5 分インキュベートした。これに、10×UlTm
a buffer(PERKIN ELMER 社製) 10μl 、25mM MgCl2 6μ
l 、UlTma DNA Polymerase (PERKIN ELMER社製) 1 μl
、(2-1)で作製した逆転写産物溶液1 μl 、滅菌水72μ
l 加え、サーマルサイクラーPJ9600(PERKIN ELMER 社
製) を用い、ＰＣＲ（ＰＣＲプログラム: 96℃, 1 分間
を 1サイクル;95 ℃, 1 分間→55℃, 1 分間→ 72 ℃,
1 分間を35サイクル;72 ℃,7 分間を1 サイクル) を行
った。
【００３５】反応液は、フェノール・クロロホルム処理
とエタノール沈殿処理を行い、各々のプライマーに適し
た制限酵素で処理し、フェノール・クロロホルム処理と
エタノール沈殿処理を行った。次に、1% Seakem GTG Ag
arose (FCM社製) で電気泳動し、検出されたＤＮＡバン
ドを常法に従い回収し、発現ベクターに組み込むＤＮＡ
断片とした。
とエタノール沈殿処理を行い、各々のプライマーに適し
た制限酵素で処理し、フェノール・クロロホルム処理と
エタノール沈殿処理を行った。次に、1% Seakem GTG Ag
arose (FCM社製) で電気泳動し、検出されたＤＮＡバン
ドを常法に従い回収し、発現ベクターに組み込むＤＮＡ
断片とした。
【００３６】(5) 大腸菌発現系を用いた目的遺伝子のス
クリーニング (5-1) 候補遺伝子ORF 領域の発現ベクターpET-15b への
組み込み 上記で作製した候補遺伝子ORF 領域のＤＮＡ断片を、Li
gation Kit (TAKARA社製) を用い、発現ベクターpET15b
に組み込み、大腸菌JM109 株にクローニングした。組み
換え体の確認は、ＤＮＡシークンスにより行った。
クリーニング (5-1) 候補遺伝子ORF 領域の発現ベクターpET-15b への
組み込み 上記で作製した候補遺伝子ORF 領域のＤＮＡ断片を、Li
gation Kit (TAKARA社製) を用い、発現ベクターpET15b
に組み込み、大腸菌JM109 株にクローニングした。組み
換え体の確認は、ＤＮＡシークンスにより行った。
【００３７】(5-2) 候補遺伝子発現ベクターのタンパク
質発現宿主大腸菌BL21(DE3) 株への導入 上記で作製した候補遺伝子発現プラスミドＤＮＡを単離
し、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。
質発現宿主大腸菌BL21(DE3) 株への導入 上記で作製した候補遺伝子発現プラスミドＤＮＡを単離
し、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。
【００３８】(5-3) 糖転移活性検出による目的遺伝子の
スクリーニング 形質転換した大腸菌をLB培地でO.D.=0.6まで37℃で振と
う培養後、IPTG (イソプロピルチオ−β−ガラクシド，
終濃度1mM)を加え、37℃でさらに3 時間振とう培養し
た。集菌後、菌体ペレットをバッファー [50mM Pipes-K
(pH7.0)] 1ml に懸濁し、20% Triton X-100 5μl 、10
mg/ml Lysozyme 1μl を加えて30℃で15分間放置した
後、凍結(-80℃) 、融解を3 回繰り返した。続いて超音
波処理を懸濁液が透明によるまで行い、マイクロ遠心機
で15000rpm, 15分, 4 ℃で遠心し、上清の可溶性画分を
得た。
スクリーニング 形質転換した大腸菌をLB培地でO.D.=0.6まで37℃で振と
う培養後、IPTG (イソプロピルチオ−β−ガラクシド，
終濃度1mM)を加え、37℃でさらに3 時間振とう培養し
た。集菌後、菌体ペレットをバッファー [50mM Pipes-K
(pH7.0)] 1ml に懸濁し、20% Triton X-100 5μl 、10
mg/ml Lysozyme 1μl を加えて30℃で15分間放置した
後、凍結(-80℃) 、融解を3 回繰り返した。続いて超音
波処理を懸濁液が透明によるまで行い、マイクロ遠心機
で15000rpm, 15分, 4 ℃で遠心し、上清の可溶性画分を
得た。
【００３９】続いて、可溶性画分を脱塩カラムとしてHi
-Trap desalting （ファルマシア社製）を用い、バッフ
ァー [50mM Pipes-K (pH7.0), 2% Triton X-100, 0.2m
M DTT, 1mM PMSF, 50 μg/ml leupeptin, 0.54TIU apro
tinin] 20ml をカラムの前処理として5ml/min.で流し、
続いて該画分を1ml 流すことによって脱塩した。さらに
3ml のバッファーを流し、800 μl ずつ分画し、2 番目
の流出画分を活性検出に用いた。
-Trap desalting （ファルマシア社製）を用い、バッフ
ァー [50mM Pipes-K (pH7.0), 2% Triton X-100, 0.2m
M DTT, 1mM PMSF, 50 μg/ml leupeptin, 0.54TIU apro
tinin] 20ml をカラムの前処理として5ml/min.で流し、
続いて該画分を1ml 流すことによって脱塩した。さらに
3ml のバッファーを流し、800 μl ずつ分画し、2 番目
の流出画分を活性検出に用いた。
【００４０】上記の脱塩を行った可溶性画分40μl に、
925 kBq/μl の[14C]-UDPG 5μl 、基質色素溶液 [Del
(Delphinidin), Del-3G(Delphinidin 3-O-glucoside),
Cya(Cyanidin), Cya-3G(Cyanidin 3-O-glucoside)を各
々溶解した5mM塩酸、基質色素なしのコントロールには5
mM 塩酸] 5 μl を加え、30℃で30分間インキュベート
し、クロロホルム:5% 塩酸／メタノール=2:1を50μl を
加えて水層を分取した。
925 kBq/μl の[14C]-UDPG 5μl 、基質色素溶液 [Del
(Delphinidin), Del-3G(Delphinidin 3-O-glucoside),
Cya(Cyanidin), Cya-3G(Cyanidin 3-O-glucoside)を各
々溶解した5mM塩酸、基質色素なしのコントロールには5
mM 塩酸] 5 μl を加え、30℃で30分間インキュベート
し、クロロホルム:5% 塩酸／メタノール=2:1を50μl を
加えて水層を分取した。
【００４１】水層を逆相カラム・μBondapak C18 を用
いたHPLCで分離し、280nm の吸光度をモニターした。さ
らにフラクションコレクターで30秒間づつ分取したサン
プルに液体シンチレータ2.5ml を加え液体シンチレーシ
ョンカウンターLS6000TA（ベックマン社製）で各分画の
放射能を測定した。インサートなしのpET15bを含むクロ
ーンの可溶性画分では基質色素への糖転移反応が起こら
ないことを確認したのち、候補遺伝子を含むクローンの
糖転移活性を調べたところ、候補遺伝子のうちの一つの
クローンで４種の基質への糖転移反応が認められた。基
質別の反応結果を図２に示す。
いたHPLCで分離し、280nm の吸光度をモニターした。さ
らにフラクションコレクターで30秒間づつ分取したサン
プルに液体シンチレータ2.5ml を加え液体シンチレーシ
ョンカウンターLS6000TA（ベックマン社製）で各分画の
放射能を測定した。インサートなしのpET15bを含むクロ
ーンの可溶性画分では基質色素への糖転移反応が起こら
ないことを確認したのち、候補遺伝子を含むクローンの
糖転移活性を調べたところ、候補遺伝子のうちの一つの
クローンで４種の基質への糖転移反応が認められた。基
質別の反応結果を図２に示す。
【００４２】(6) cDNA ライブラリーからの目的遺伝子
cDNAの単離 (6-1) リンドウ花弁cDNAの作製 試料となるmRNAは、リンドウ花弁よりQuick Pep （ファ
ルマシア社製）を用い精製した。cDNA合成はmRNAを1 μ
g を用い、SuperScript Plasmid System for cDNA Synt
hesis (BRL社製) で行った。
cDNAの単離 (6-1) リンドウ花弁cDNAの作製 試料となるmRNAは、リンドウ花弁よりQuick Pep （ファ
ルマシア社製）を用い精製した。cDNA合成はmRNAを1 μ
g を用い、SuperScript Plasmid System for cDNA Synt
hesis (BRL社製) で行った。
【００４３】(6-2) cDNA ライブラリーの作製 上記で作製したcDNAを、1% SeaKem GTG Agarose (FMC社
製) で電気泳動し、約1.3 〜2.5kbpの長さの領域を泳動
ゲルから回収し、SUPREC-01 (TAKARA 社製) で精製し
た。このDNA をLigation Express (CLONTECH社製) でプ
ラスミドpSPORT1にライゲーションし、ElectroMAX DH10
Bコンピテントセル(GIBCO BRL社製) にGene Pulser (Bi
o Rad社製) を用いて形質転換した。
製) で電気泳動し、約1.3 〜2.5kbpの長さの領域を泳動
ゲルから回収し、SUPREC-01 (TAKARA 社製) で精製し
た。このDNA をLigation Express (CLONTECH社製) でプ
ラスミドpSPORT1にライゲーションし、ElectroMAX DH10
Bコンピテントセル(GIBCO BRL社製) にGene Pulser (Bi
o Rad社製) を用いて形質転換した。
【００４４】(6-3) 目的遺伝子cDNAのスクリーニング GENETRAPER cDNA Positive Selection System (GIBCO B
RL社製) を用いて行った。得られたcDNAクローンの確認
は、ＤＮＡシーケンスにより行った。プローブは5'-ATG
AAGAAAGCAGAGTTGGTTATCA-3' を、複製プライマーは5'-C
ATTTCCAGGGATTAGCCATGTTGG-3' の配列をもつ合成ＤＮＡ
を用いた。
RL社製) を用いて行った。得られたcDNAクローンの確認
は、ＤＮＡシーケンスにより行った。プローブは5'-ATG
AAGAAAGCAGAGTTGGTTATCA-3' を、複製プライマーは5'-C
ATTTCCAGGGATTAGCCATGTTGG-3' の配列をもつ合成ＤＮＡ
を用いた。
【００４５】(6-4) 候補遺伝子cDNAの配列決定 上記で得られたクローンは一部分のＤＮＡ配列を決定
し、目的遺伝子の配列に一致するクローンであることを
確認した上、全塩基配列を決定した（配列番号１）。ま
たこれより予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示
す。
し、目的遺伝子の配列に一致するクローンであることを
確認した上、全塩基配列を決定した（配列番号１）。ま
たこれより予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示
す。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：473 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Lys Ala Glu Leu Val Ile Ile Pro Phe Pro Gly Ile Ser His 5 10 15 Leu Gly Ser Thr Val Glu Leu Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg Asn Glu 20 25 30 His Leu Ser Ile Ser Val Ile Ile Ile Lys Phe Pro Asn Asp Thr Lys 35 40 45 Val Ser Asn Leu Leu Lys Ser Leu Ser Thr Ala Ser Arg Ile Lys Val 50 55 60 Ile Glu Leu Lys Gln Glu Thr Ile Ser Ile Glu Thr Gly Pro Leu Phe 65 70 75 80 Ile Gln Lys Phe Ile Glu Ser His Lys Ala Gln Val Arg Asp Phe Leu 85 90 95 Ala Gly Val Ser Ala Cys Glu Ser Val Glu Leu Ser Gly Val Val Ile 100 105 110 Asp Met Phe Cys Thr Ser Met Ile Asp Val Ala Asn Glu Phe Glu Val 115 120 125 Pro Ser Tyr Val Phe Phe Thr Ser Ser Ala Ala Met Leu Gly Leu Trp 130 135 140 Phe His Phe Gln Ser Leu Arg Asp Asn Phe Gly Lys Tyr Val Asp Ile 145 150 155 160 Lys Asp Ser Glu Thr Val Leu Ser Ile Pro Ala Phe Gln Asn Leu Val 165 170 175 Pro Tyr Gly Val Leu Pro Met Phe Ile Phe Asn Thr Glu Asp Gly Cys 180 185 190 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Gly Lys Arg Phe Arg Glu Thr Lys Gly Ile 195 200 205 Ile Ile Asn Thr Phe Leu Glu Leu Glu Ser His Ala Ile Glu Ser Leu 210 215 220 Ser Thr Asp Glu Thr Ile Pro Pro Val Tyr Thr Val Gly Pro Ile Leu 225 230 235 240 Gly Pro Lys Gly Ser Ser Ile Glu Ser Leu Glu Thr Glu Lys Ile Leu 245 250 255 Lys Trp Leu Asp Met Gln Pro Glu Lys Ser Val Val Phe Leu Cys Phe 260 265 270 Gly Ser Leu Gly His Phe Gly Glu Ala Gln Val Lys Glu Ile Ala Tyr 275 280 285 Ala Leu Glu Gly Ser Gly His Arg Phe Leu Trp Ser Leu Arg Lys Pro 290 295 300 Pro Pro Leu Gly Lys Phe Glu Gly Pro Gly Glu Tyr Glu Asn Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Leu Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Ala Asn Thr Gly Met 325 330 335 Val Ile Gly Trp Ala Pro Gln Thr Ala Val Leu Ser His Ser Ala Val 340 345 350 Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Ile 355 360 365 Trp Phe Gly Val Pro Val Ala Thr Trp Pro Leu Phe Ala Glu Gln Gln 370 375 380 Met Asn Ala Phe Glu Leu Val Lys Glu Leu Gly Leu Ala Val Glu Val 385 390 395 400 Lys Met Asp Tyr Lys Lys Asp Tyr Lys Asn Pro Asp Ala Asp Glu Ile 405 410 415 Val Arg Ala Asp Val Ile Glu Glu Lys Ile Lys Ile Leu Met Asp Pro 420 425 430 Glu Asn Gly Ile Arg Lys Lys Val Lys Glu Met Lys Glu Lys Ser Arg 435 440 445 Leu Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser Ser Ala Ser Leu Lys Asp Phe 450 455 465 Ile Asn Asp Val Ile Lys Arg Leu Pro 470
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：１５９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：リンドウ 細胞の種類：花弁 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：39..1460 特徴を決定した方法：Ｅ AAGAAAGACA AAAAATTGAG CAAAAAGAAG GGGAAAAAAT GAAGAAAGCA GAGTTGGTTA 60 TCATCCCATT TCCAGGGATT AGCCATCTTG GTTCAACAGT TGAATTAGCT AAGCTTCTTG 120 CAGAGAGAAA TGAACATCTC TCCATTTCAG TCATCATCAT CAAGTTCCCA AATGATACAA 180 AGGTTTCCAA CCTCTTAAAA TCCCTATCCA CAGCTTCACG GATAAAGGTC ATTGAGCTTA 240 AACAAGAAAC CATTTCAATT GAAACCGGCC CACTTTTTAT ACAAAAATTC ATCGAATCCC 300 ATAAGGCCCA GGTGAGAGAT TTTCTTGCTG GAGTTTCTGC TTGTGAATCT GTTGAACTCT 360 CCGGGGTTGT GATAGATATG TTCTGTACCT CCATGATTGA TGTTGCCAAT GAGTTTGAGG 420 TTCCAAGCTA TGTGTTTTTC ACATCTAGTG CTGCAATGCT TGGTCTTTGG TTCCATTTTC 480 AAAGCCTTAG GGACAATTTC GGTAAATATG TAGATATTAA AGATTCTGAG ACTGTCTTAA 540 GCATCCCTGC TTTCCAAAAT CTTGTTCCTT ATGGAGTATT GCCTATGTTT ATATTCAATA 600 CGGAAGATGG ATGTGATGCA TCTTTAGATA TAGGTAAAAG ATTTAGGGAG ACAAAAGGGA 660 TCATAATCAA TACATTTCTT GAGCTTGAAT CCCATGCTAT TGAATCTTTG TCCACAGATG 720 AAACCATCCC ACCGGTTTAC ACTGTAGGGC CAATATTGGG ACCAAAAGGC AGCAGTATCG 780 AAAGCCTGGA AACCGAGAAG ATTTTGAAAT GGCTTGATAT GCAGCCTGAG AAGTCTGTAG 840 TTTTCCTTTG TTTTGGTAGC CTTGGTCATT TTGGTGAGGC CCAAGTGAAG GAAATCGCAT 900 ATGCACTAGA GGGTAGTGGC CATAGATTCT TGTGGTCATT AAGAAAGCCA CCACCTTTAG 960 GGAAATTTGA AGGCCCTGGT GAGTATGAGA ACTTGGAAGA GGTCCTCCCA GAAGGGTTTT 1020 TAGAACGCAC AGCTAACACC GGAATGGTGA TTGGATGGGC CCCACAGACG GCCGTGTTGT 1080 CTCACTCAGC TGTGGGAGGT TTCGTGTCGC ATTGTGGATG GAATTCAACA CTGGAAAGCA 1140 TTTGGTTTGG TGTCCCAGTG GCAACCTGGC CTCTGTTTGC TGAGCAGCAG ATGAATGCAT 1200 TTGAATTGGT GAAGGAATTG GGCTTGGCTG TGGAGGTTAA GATGGATTAT AAAAAAGATT 1260 ACAAGAATCC TGACGCGGAC GAAATAGTGA GAGCTGATGT TATAGAAGAG AAAATCAAGA 1320 TATTGATGGA TCCTGAAAAT GGAATCAGAA AGAAAGTGAA GGAAATGAAA GAAAAGAGCA 1380 GGCTGGCTGT TGAGGAAGGA GGATCATCTT CTGCGTCCCT CAAAGATTTT ATTAATGATG 1440 TGATCAAAAG ACTTCCATGA TTTAGCTCTT CCAAATTGGT TCAATAGATT TTATGGGCAA 1500 AACTGTTAAG TTGCTCTTTG CATTAGAGCA AATGCTCTGA TTTAATGTAA GTTTTTATTT 1560 TTATTTTTTA TTTATCTGAA ATTAAGTTTA CAAAAAA 1597
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、リンドウの花弁色素で
あるゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する
酵素遺伝子であるUDP−グルコース：フラボノイド３，
５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供さ
れる。本発明の遺伝子を公知の方法に従い植物体に導入
すれば、花色の色彩の調節、特にバラ等の青色花弁をも
たない品種においてゲンチオデルフィンを発現させるこ
とによる青色花弁の創出が期待できる。
あるゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する
酵素遺伝子であるUDP−グルコース：フラボノイド３，
５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供さ
れる。本発明の遺伝子を公知の方法に従い植物体に導入
すれば、花色の色彩の調節、特にバラ等の青色花弁をも
たない品種においてゲンチオデルフィンを発現させるこ
とによる青色花弁の創出が期待できる。
【図１】各種β糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列の比較
を示す。
を示す。
【図２】糖転移酵素活性の認められた１クローンの基質
別 [Ａ．Del(Delphinidin), Ｂ．Del-3G(Delphinidin 3
-O-glucoside), Ｃ．Cya(Cyanidin), Ｄ． Cya-3G(Cy
anidin 3-0-glucoside)]の反応結果を示す。
別 [Ａ．Del(Delphinidin), Ｂ．Del-3G(Delphinidin 3
-O-glucoside), Ｃ．Cya(Cyanidin), Ｄ． Cya-3G(Cy
anidin 3-0-glucoside)]の反応結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 実質的に配列番号１で示されるアミノ酸
配列をコードするUDP−グルコース：フラボノイド３，
５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 リンドウ花弁に由来する、請求項１記載
のUDP−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコ
シルトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 配列番号２で示される塩基配列を有する
請求項１記載のUDP−グルコース：フラボノイド３，５
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１〜３いずれかに記載のUDP−グ
ルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド。 - 【請求項５】 請求項４記載の組み換え組み換えプラス
ミドを有する宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を培地に培養
し、培養物よりUDP−グルコース：フラボノイド３，５
−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを採取することを
特徴とする、UDP−グルコース：フラボノイド３，５−
Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼの製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP27225396A JP3585329B2 (ja) | 1996-10-15 | 1996-10-15 | フラボノイド配糖化酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27225396A JP3585329B2 (ja) | 1996-10-15 | 1996-10-15 | フラボノイド配糖化酵素遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10113184A true JPH10113184A (ja) | 1998-05-06 |
| JP3585329B2 JP3585329B2 (ja) | 2004-11-04 |
Family
ID=17511277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27225396A Expired - Fee Related JP3585329B2 (ja) | 1996-10-15 | 1996-10-15 | フラボノイド配糖化酵素遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3585329B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006049315A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-11 | Suntory Limited | リグナン配糖化酵素およびその利用 |
| WO2011016260A1 (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | 国立大学法人東京農工大学 | 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 |
| CN120699932A (zh) * | 2025-08-28 | 2025-09-26 | 成都中医药大学 | 一种糖基转移酶、基因片段、重组表达载体、重组菌及其制备方法和用途，以及一种类黄酮3'-o-葡萄糖苷的制备方法 |
-
1996
- 1996-10-15 JP JP27225396A patent/JP3585329B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006049315A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-11 | Suntory Limited | リグナン配糖化酵素およびその利用 |
| US7935802B2 (en) | 2004-11-02 | 2011-05-03 | Suntory Holdings Limited | Lignan glycosidase and utilization of the same |
| WO2011016260A1 (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | 国立大学法人東京農工大学 | 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 |
| US8722868B2 (en) | 2009-08-07 | 2014-05-13 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Glycosyltransferase, novel glycosyltransferase gene, and novel sugar donor compound |
| JP5761718B2 (ja) * | 2009-08-07 | 2015-08-12 | 国立大学法人東京農工大学 | 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物 |
| CN120699932A (zh) * | 2025-08-28 | 2025-09-26 | 成都中医药大学 | 一种糖基转移酶、基因片段、重组表达载体、重组菌及其制备方法和用途，以及一种类黄酮3'-o-葡萄糖苷的制备方法 |
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| JP3585329B2 (ja) | 2004-11-04 |
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