JPH10127281A

JPH10127281A - Ｐｅｇ修飾アルギン酸リアーゼおよびその用途

Info

Publication number: JPH10127281A
Application number: JP30725096A
Authority: JP
Inventors: Kosaku Murata; 幸作村田; Takehiko Suzuki; 健彦鈴木; Hiroyuki Sakakibara; 裕幸榊原; Shiro Abe; 士朗阿部; Toshihiro Kuno; 智弘久野; Minoru Nishimura; 稔西村
Original assignee: Gunze Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Gunze Ltd; Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 1998-05-19

Abstract

(57)【要約】【課題】生体内で安定であり、高活性を維持しながら
抗原性の低いアルギン酸リアーゼを提供することを目的
とする。また、バイオフィルム溶解剤、バイオフィルム
に起因した難治性感染症の治療・予防剤を提供すること
も目的とする。【解決手段】ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼおよびＰ
ＥＧ修飾アルギン酸リアーゼを有効成分とするバイオフ
ィルム溶解剤、前記アルギン酸リアーゼを有効成分とす
るバイオフィルム溶解剤とバイオフィルム産生性微生物
に対して有効な抗生物質を配合してなる難治性感染症の
治療・予防剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリエチレングリ
コール（以下、ＰＥＧという）で修飾されたアルギン酸
リアーゼおよび前記ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼを有
効成分とするバイオフィルム溶解剤に関する。

【０００２】また、本発明は、ＰＥＧ修飾アルギン酸リ
アーゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤と抗菌剤
とを配合してなる、難治性感染症の治療・予防剤に関す
る。

【０００３】

【従来の技術】難治性感染症の原因の１つとして、細菌
によるバイオフィルム形成が注目されている。バイオフ
ィルムとは、細菌が産生する菌体外多糖（グライコカリ
ックス）と生体成分（フィブリン、血小板、細菌結合タ
ンパク質など）とからなる粘液状の膜のことである。こ
のバイオフィルムは、細菌にとっての外界からの防御機
構と考えられている。このようなバイオフィルム形成を
伴う疾患においては、菌体表面からの情報を得ることに
より成立する宿主の免疫機構が活性化されず、細菌は生
体防御反応に抵抗性を示すうえに、バイオフィルムによ
り抗菌剤が細菌に充分に到達できなくなる。従って、バ
イオフィルム形成を伴う疾患は難治性になるものと考え
られている。中でもムコイド型のシュードモナス・アエ
ルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ、以下、緑膿菌という）が生体組織において形成
する緑膿菌バイオフィルムは、その頻度、難治性、急性
増悪時における重症度という観点から、深刻な問題とな
っており、多数の検討が行われている。現在のところ、
緑膿菌バイオフィルムの主成分はアルギン酸であること
が明らかとなっている。

【０００４】緑膿菌バイオフィルムが関与する感染症と
しては、嚢胞性線維症に付随した呼吸器感染症、びまん
性汎細気管支炎などの慢性呼吸器感染症、プラスチッ
ク、金属などから製造される人工医用材料、例えば人工
骨または人工関節などへの緑膿菌の付着に起因する感染
症、心内膜炎、骨髄炎および難治性の創部感染症などが
知られている。また、泌尿器科領域においては、カテー
テル留置複雑性尿路感染症を代表例として、感染結石、
尿路上皮粘膜の瘢痕および壊死ならびに高度の尿流障害
を伴う場合の複雑性尿路感染症が知られており、歯科領
域においては、プラークの形成および菌の定着化により
生じる歯周病などが知られている。

【０００５】嚢胞性線維症は、呼吸器に感染した緑膿菌
の産生するアルギン酸を含む粘稠物が肺に蓄積し、気管
支閉塞を引き起こし、死に至らしめる疾患である。特開
平６−１９７７６０号公報および特開平６−３１９５６
９号公報には、その粘稠物中のアルギン酸を分解、低分
子化することにより、粘稠物の粘度を減少させて嚢胞性
線維症の症状を改善することを目的とし、前者ではアル
ギン酸分解活性が高いアルギン酸リアーゼおよびその精
製法、後者ではアルギン酸リアーゼ発現遺伝子およびア
ルギン酸リアーゼの製造法について開示している。

【０００６】特開平６−１９７７６０号公報およびジャ
ーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオ
エンジニアリング（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＦＥＲＭＥ
ＮＴＡＴＩＯＮＡＮＤＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮ
Ｇ、第７６巻、第５号、４２７〜４３７頁、１９９３
年）には、緑膿菌が産生するアセチル化アルギン酸に対
して高い分解活性を有するアルギン酸リアーゼＡＬ−II
I（分子量３８，０００）が開示されている。

【０００７】さらに、尾崎勉らは、緑膿菌バイオフィル
ムにアルギン酸分解酵素を適用し、アルギン酸を分解す
ることによる呼吸器感染症の症状の改善を目的として前
記酵素の精製法およびキャラクタリゼーションの結果を
報告している（１９９６年日本薬学会第１１６年会講演
要旨集３２２３頁、左上欄、１９９６年日本防菌防黴
学会第２３回年次大会要旨集、９５頁および日本農芸化
学誌１９９５年７月６９巻臨時増刊号（１９９５年度大
会講演要旨集）２５３頁、右上欄）。

【０００８】インビボにおいては、インフェクション・
アンド・イムニティ（ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＡＮＤＩ
ＭＭＵＮＩＴＹ、第６０巻、第１０号、３９７９〜３９
８５頁、１９９２年）に、ウサギ心内膜炎モデルに対し
て、アルギン酸リアーゼおよび抗菌剤（アミカシン）を
併用投与すると、ムコイド型緑膿菌の除菌効果および菌
体外多糖の除去が認められたことが記載されている。し
かしながら、酵素製剤としてアルギン酸リアーゼを投与
すると、生体内で酵素が不安定になり、酵素の消失半減
期が短くなる。それゆえ、酵素製剤を大量かつ頻繁に投
与しなければならず、酵素の抗原性がかえって問題とな
る。

【０００９】このように、バイオフィルム感染症に対し
てアルギン酸リアーゼ酵素を適用しようとする試みが多
数行われている。しかし、酵素の体内での不安定性、活
性の消失、抗原性などの課題を解決したアルギン酸リア
ーゼの酵素製剤は現在のところ存在せず、バイオフィル
ム感染症に有用なアルギン酸リアーゼ製剤の開発が望ま
れている。

【００１０】一方、酵素を高分子修飾することにより、
酵素の安定性の改善、消失半減期の延長、抗原性の低下
が可能となることが報告されている。中でもＰＥＧを修
飾剤として用いる場合の有効性が多数報告され、すでに
ＰＥＧ修飾酵素製剤として発売されている実績がある。
それらのＰＥＧ修飾酵素製剤としては、例えばＰＥＧ−
アデノシンデアミナーゼ（アダージェン（ＡＤＡＧＥ
Ｎ、登録商標）としてエンゾン（Ｅｎｚｏｎ）社（米
国）より市販）およびＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ
（オンカスパー（ＯＮＣＡＳＰＡＲ、登録商標）として
エンゾン社より市販）などがあげられる。

【００１１】しかしながら、酵素製剤では、修飾剤の選
択、修飾剤とタンパク質との結合様式、修飾条件、修飾
程度などの条件が、酵素活性の保持、安定性の維持、抗
原性などに大きく影響を及ぼすために、有用な酵素製剤
を創製することは一般的には困難なことである。現在の
ところ、ＰＥＧで修飾されたアルギン酸リアーゼは知ら
れていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体内で安
定であり、消失半減期がより長く、抗原性のより低いア
ルギン酸リアーゼを提供することを目的とする。

【００１３】また、本発明は前記アルギン酸リアーゼを
有効成分とするバイオフィルム溶解剤を提供することも
目的とする。

【００１４】さらに、本発明は、ＰＥＧ修飾アルギン酸
リアーゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤と抗菌
剤とを配合した、バイオフィルムに起因した難治性感染
症の治療・予防剤を提供することも目的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは鋭
意検討した結果、アルギン酸リアーゼに対してＰＥＧを
修飾剤として選択するとすぐれた効果が得られることを
見出し、本発明を完成するに至った。

【００１６】本発明は、ＰＥＧ修飾アルギン酸リアー
ゼ、ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼを有効成分とするバ
イオフィルム溶解剤およびＰＥＧ修飾アルギン酸リアー
ゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤とバイオフィ
ルム産生性微生物に対して有効な抗生物質を配合してな
る難治性感染症の治療・予防剤に関する。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明において、アルギン酸リア
ーゼを修飾するＰＥＧとしては、通常、製剤技術、医薬
品製造技術、口腔衛生技術などにおいて使用され得るも
のであれば、特に限定されず、とりわけ常温において半
固体状ないし固体のものが好適である。かかるＰＥＧと
しては、例えば、平均分子量が約１，０００〜約１０
０，０００程度のもの、好ましくは約２，０００〜約２
０，０００程度のもの、最も好ましくは約５，０００〜
約１２，０００程度のものがあげられる。これらのＰＥ
Ｇは、一定の分子量を有するものであってもよく、また
種々の分子量のものが混合したものであってよい。更に
ＰＥＧは市販のものを好適に使用することができる。か
かる市販のＰＥＧを非限定的に例示するとすれば、例え
ばマクロゴール１，０００、同１，５００、同１，５４
０、同４，０００、同６，０００、同２０，０００（い
ずれも商品名、三洋化成工業製）があげられる。これら
は比較的低分子量のものであるが、高分子量の市販品
も、何ら問題なく使用することができる。

【００１８】また、上記ＰＥＧに修飾されるアルギン酸
リアーゼとしては、アルギン酸分解能を有する酵素であ
れば好適に使用することができ、とりわけシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が産生
するアルギン酸を分解するものが好ましい。

【００１９】かかるアルギン酸リアーゼの具体例として
は、グラム陰性好気性桿菌、例えばシュードモナス属、
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、フラボ
バクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビ
ブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ）属およびエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）属などから分離されるアルギン酸リアー
ゼがあげられ、好ましくはフラボバクテリウム属に属す
る菌株から分離されるアルギン酸リアーゼがあげられ
る。特に好ましくは、土壌中から分離されたフラボバク
テリウム・スピーシーズＯＴＣ−６（ＦＥＲＭＢＰ
−４１８９、工業技術院生命工学技術研究所に寄託）か
ら分離されるアルギン酸リアーゼＡＬ−ＩおよびＡＬ−
III（特開平５−１５３８７号公報、特開平６−１９７
７６０号公報、ＷＯ９４／１９００６号パンフレット参
照）があげられる。また、かかるアルギン酸リアーゼ
は、野生株のみならず、変異株から分離されるものであ
ってもよく、さらには、アルギン酸リアーゼの遺伝子を
導入して形質転換させた遺伝子組換変異株から分離され
るものであってもよい。具体的には、上記フラボバクテ
リウム・スピーシーズＯＴＣ−６のアルギン酸リアーゼ
発現遺伝子を導入して形質転換させた大腸菌より分離さ
れるアルギン酸リアーゼＡＬ−ＩおよびＡＬ−III（特
開平６−３１９５６９号公報参照）があげられる。

【００２０】以下に、前記土壌中から分離されたフラボ
バクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−６から分離され
るアルギン酸リアーゼＡＬ−ＩおよびＡＬ−IIIの理化
学的性質を示す。

【００２１】アルギン酸リアーゼＡＬ−Ｉの理化学的性
質；（１）作用：アルギン酸を非還元末端のＣ₄−Ｃ₅間に二
重結合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−５
−ケトウロン酸に分解する（２）分子量：６０，０００（３）至適ｐＨ：８．０（４）安定ｐＨ：６．０〜８．０（５）至適温度：７０℃ （６）基質特異性：細菌由来のアルギン酸に対して高分
解活性を有する。

【００２２】アルギン酸リアーゼＡＬ−IIIの理化学的
性質；（１）作用：アルギン酸を非還元末端のＣ₄−Ｃ₅間に二
重結合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−５
−ケトウロン酸に分解する（２）分子量：３８，０００（３）至適ｐＨ：８．０（４）安定ｐＨ：６．０〜８．０（５）至適温度：７０℃ （６）基質特異性：細菌由来のアルギン酸に対して特に
高分解活性を有する。

【００２３】アルギン酸リアーゼは、高活性のものが勿
論好ましいが、若干活性の低いものでも好適に使用する
ことができる。例えば、該アルギン酸リアーゼがアルギ
ン酸を分解することにより生成する非還元末端のＣ−Ｃ
間の二重結合による特異的吸光度（２３５ｎｍ）の変化
を酵素活性の指標とし、同吸光度を１分間に１上昇させ
る酵素量を１単位（Ｕ）とした場合、酵素１ｍｇあたり
約２０単位前後のものを好適に使用することができ、さ
らには約３０単位以上のものが好ましい。

【００２４】上記アルギン酸リアーゼとＰＥＧからなる
本発明のＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼは、アルギン酸
リアーゼが有するリジン残基のアミノ基の一部をＰＥＧ
と結合させることにより、抗原性の低下とアルギン酸リ
アーゼの酵素活性の維持を両立させたものである。本発
明において、アルギン酸リアーゼが有するリジン残基の
アミノ基とＰＥＧとの結合率、すなわち修飾率は、バイ
オフィルム溶解に必要な酵素活性を維持し、かつ抗原性
を低下させるような範囲であればよく、特に限定されな
いが、例えば、約２０〜８０％、好ましくは約２５〜７
０％、さらに好ましくは約３５〜６０％があげられる。
これにより、抗原性は未修飾アルギン酸リアーゼを１０
０とした場合に較べて、約３０％以下、好ましくは約１
０％以下、とりわけ好ましくは約１％以下に低下させ、
かつ酵素活性は未修飾アルギン酸リアーゼを１００とし
た場合に較べて、約４０％以上、好ましくは約５０％以
上、とりわけ好ましくは９０％以上の活性を維持するこ
とができる。

【００２５】上記ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼは、い
ずれのＰＥＧ、いずれのアルギン酸リアーゼの組合わせ
であっても得ることができるが、強いてあげるとすれ
ば、ＰＥＧとして高分子量のものが、より抗原性の低下
と酵素活性の維持の上からは好ましく、例えば分子量１
２，０００のＰＥＧとアルギン酸リアーゼの組合わせに
おいては、修飾率約２５％のもので、酵素活性は約９１
％維持され、かつ抗原性はわずか約６％にすぎず、ま
た、同じ組合わせで修飾率約５０％のものは、酵素活性
が約４０％維持され、抗原性は約０．６％とほとんど消
失している。一見すると、後者は酵素活性が低いように
見えるが、ＰＥＧ修飾体は、必ずしも高い酵素活性が未
修飾体と比較して維持されている必要はない。というの
は、ＰＥＧ修飾により、多少酵素活性が低下していて
も、生体内での消失半減期が未修飾体よりも長くなり、
血中滞留性が大きく改善されているので、長時間活性を
維持でき、抗原性が極めて低いものであれば生体に対す
る安全性が非常に高いという使用上のメリットがあるか
らである。

【００２６】本発明のＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼ
は、ＰＥＧとアルギン酸リアーゼの結合反応中における
酵素活性の低下を生じない方法であれば、どのような方
法によっても製造することができる。

【００２７】かかる方法としては、例えばペプチド合成
の分野で汎用される縮合剤を使用してもよく、またＰＥ
Ｇをエステル化して反応性をあげた修飾ＰＥＧを使用す
る、いわゆる活性エステル法と称される方法を採用して
もよい。

【００２８】活性エステル法による場合には、例えばス
クシンイミジルスクシネートＰＥＧ（商品名：ＳＳ
−ＰＥＧ、日本油脂製）とアルギン酸リアーゼを溶媒中
で反応させることにより、容易に目的物を得ることがで
きる。

【００２９】修飾ＰＥＧとしては、例えばＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド、トリクロロホルメートなどに活性化
されたＰＥＧがあげられ、具体的にはＰＥＧスクシンイ
ミドスクシネート、ＰＥＧスクシンイミドプロピオネー
ト、二本鎖ＰＥＧスクシンイミドなどがあげられる。さ
らには無水マレイン酸とＰＥＧの共重合体などがあげら
れ、とりわけＰＥＧスクシンイミドスクシネートが好ま
しい。

【００３０】反応は、例えば冷却下〜加熱下に好適に進
行するが、酵素の活性の維持の面からは低温で、かつ緩
衝剤液中で実施するのが好ましく、４〜１０℃程度がと
りわけ好ましい。反応に際しては、アルギン酸リアーゼ
のリジン残基のアミノ基に対してモル比で約１〜１０倍
量の修飾ＰＥＧを適宜使用するのが好ましく、また緩衝
液としては、ｐＨが中性ないし弱アルカリ性のものを好
適に使用できるが、例えばホウ酸−水酸化ナトリウム緩
衝液が好ましいものとしてあげられる。

【００３１】ついで、ε−アミノカプロン酸などの反応
停止剤を添加したのち、反応液から目的物を分離するこ
とにより、目的物を得ることができる。

【００３２】目的物の分離は、常法により実施できる
が、酵素活性の低下を防ぐ意味からはゲルろ過や限外ろ
過を、適宜組合わせて実施することが好ましい。

【００３３】本発明のバイオフィルム溶解剤は各種剤形
で使用することができ、剤形としては例えば錠剤、カプ
セル剤、口腔付着剤、噴霧製剤、注射剤、輸液、点眼
剤、軟膏剤などがあげられる。これら各種剤形の製剤
は、常法に従い治療目的に応じて、賦形剤、結合剤、溶
解剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤などの製剤技術分
野において通常使用することができる担体を用いて調製
することができる。

【００３４】このような担体としては、例えば乳糖、白
糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、アラビアゴム、ゼラチン、メタケイ酸アルミン酸マ
グネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン
酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソル
ビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリビニルピロ
リドン、植物油（落花生油、オリーブ油など）、ベンジ
ルアルコール、プロピレングリコール、水などがあげら
れる。

【００３５】本発明のバイオフィルム溶解剤の投与経路
は特に制限されず、治療目的に応じて適宜選択すればよ
く、経口投与、非経口投与（例えば経皮投与、経肺投
与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与）が可能であ
る。例えば、呼吸器感染症に対しては噴霧製剤として経
肺投与による適用を、尿路感染症や心内膜炎などに対し
ては注射剤として静脈内投与による適用を、創部感染症
に対しては軟膏剤としての適用を、人工医用材料に対し
ては液剤を表面に塗布して適用する方法を、歯周病に対
しては口腔付着剤として適用するなどがあげられる。

【００３６】投与量は、ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼ
の活性と投与部位におけるバイオフィルムの生成状況に
応じて、患者の疾患、体重、年齢等に配慮した量を容易
に決定することができる。

【００３７】本発明のバイオフィルム溶解剤は、バイオ
フィルムが関与する感染症、例えば嚢胞性線維症、びま
ん性汎細気管支炎などの慢性呼吸器感染症、プラスチッ
ク、金属などから製造される人工医用材料、例えばカテ
ーテル、人工骨または人工関節などへの緑膿菌の付着に
起因する感染症、心内膜炎、骨髄炎および難治性の創部
感染症などにおいて生ずるバイオフィルム溶解に有用で
ある。また、複雑性尿路感染症、歯周病などにも有用で
ある。

【００３８】さらに、本発明のＰＥＧ修飾アルギン酸リ
アーゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤を抗生物
質と組合わせて投与すると、バイオフィルムの溶解に加
えて抗生物質による除菌が行われ、難治性であったバイ
オフィルム感染症、特に緑膿菌によるバイオフィルム感
染症の治療が可能になる。しかも、バイオフィルムが溶
解されると、従来の問題点である抗生物質の長期間にわ
たる多量投与の必要がなくなり、抗生物質の短期間かつ
低投与量化が期待されることになる。

【００３９】前記抗生物質の具体例としては、例えばク
ラリスロマイシン、エリスロマイシンなどのマクロライ
ド系抗生物質、前記マクロライド系抗生物質とキノロン
系抗生物質とを組合わせたもの、セフスロジンナトリウ
ム、セフォペラゾンナトリウム、セフタジム、硫酸セク
プロム、塩酸セフォゾプランなどの第三世代セフェム系
抗生物質、硫酸アミカシンなどのアミノグリコシド系抗
生物質などがあげられる。

【００４０】本発明において、ＰＥＧ修飾アルギン酸リ
アーゼと抗生物質を配合して製剤とする場合、抗生物質
はその種類に応じた投与量を用い、またＰＥＧ修飾アル
ギン酸リアーゼはその活性と投与部位におけるバイオフ
ィルムの生成状況に応じて、患者の疾患、体重、年齢等
に配慮した量を組み合わせることによって、容易に決定
することができる。また、その剤形は特に制限されず、
前記バイオフィルム溶解剤で述べた種々の添加剤を使用
でき、種々の剤形を採用することができる。また配合と
はいっても単一製剤中に両成分を存在させる形態のほ
か、ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼと抗生物質を別々に
製剤化し、これをカプセル等に共存させた形態でもよ
く、さらにはカプセルに入れず、同時ないし順次投与す
るような形態であってもよい。

【００４１】以下に、実施例をあげて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はもとよりこれらに限定される
ものではない。

【００４２】

【実施例】

実施例１分子量２，０００のＰＥＧによる修飾３．０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸リアーゼＡＬ−III（グ
ンゼ（株）社製、緑膿菌由来のアルギン酸に対して高分
解活性を有する）溶液（５．０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５）０．４ｍｌ
と０．５Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５）０．４ｍｌを混合して反応溶液とした。アルギ
ン酸リアーゼのリジン残基のアミノ基に対してモル比で
５倍量の活性化ＰＥＧ修飾試薬（分子量２，０００のＳ
Ｓ−ＰＥＧ、日本油脂（株）製）を添加し、４℃で３０
分間撹拌することによりアミノ基をＰＥＧで修飾した。
ＳＳ−ＰＥＧに対してモル比で２０倍量のε−アミノカ
プロン酸（生化学工業（株）製）を添加することにより
反応を停止させた。得られた反応混合物をゲル濾過クロ
マトグラフィー（ＦＰＬＣシステム、カラム：スーパー
デックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ、商標）２００ＨＲ１０／
３０、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）によ
り分離し、高分子画分に溶出するＰＥＧ修飾体を分取し
た。さらに限外濾過（限外濾過膜：ＵＰ−２０、分子量
カット２０，０００、アドバンテック（Ａｄｖａｎｔｅ
ｃｈ）社製）により濃縮してＰＥＧ修飾体を得た。

【００４３】実施例２分子量５，０００のＰＥＧによる修飾実施例１で用いた分子量２，０００の代わりに、分子量
５，０００のＳＳ−ＰＥＧ修飾試薬（日本油脂（株）
製）を用いた。反応、分取および濃縮は実施例１と同様
に行い、ＰＥＧ修飾体を得た。

【００４４】実施例３分子量１２，０００のＰＥＧによる修飾実施例１で用いた分子量２，０００の代わりに、分子量
１２，０００のＳＳ−ＰＥＧ修飾試薬（日本油脂（株）
製）を用い、アルギン酸リアーゼのリジン残基のアミノ
基に対してモル比１倍でＰＥＧ修飾体を作成した。実施
例１と同様に分取を行い、限外濾過膜をＵＰ−２０の代
わりにＵＫ−５０（分子量カット２０，０００、アドバ
ンテック（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ）社製）を用いて濃縮し
てＰＥＧ修飾体を得た。

【００４５】実施例４分子量１２，０００のＰＥＧによる修飾実施例３で用いた、アルギン酸リアーゼのリジン残基の
アミノ基に対してモル比１倍の代わりに２．５倍でＰＥ
Ｇ修飾体を作成した。実施例３と同様に分取、濃縮して
ＰＥＧ修飾体を得た。

【００４６】実施例５分子量１２，０００のＰＥＧによる修飾実施例３で用いた、アルギン酸リアーゼのリジン残基の
アミノ基に対してモル比１倍の代わりに５倍でＰＥＧ修
飾体を作成した。実施例３と同様に分取、濃縮してＰＥ
Ｇ修飾体を得た。

【００４７】実施例６分子量５，０００のＰＥＧによる修飾３．０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸リアーゼＡＬ−III（グ
ンゼ（株）社製、緑膿菌由来のアルギン酸に対して高分
解活性を有する）溶液（５．０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５）１５ｍｌと
０．５Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
５）１５ｍｌを混合して反応溶液として、ＳＳ−ＰＥＧ
（分子量５，０００）のモル比を１０倍として反応を行
った。実施例１と同様に反応を停止させたのち、限外濾
過（限外濾過膜：ＵＰ−２０、分子量カット２０，００
０、アドバンテック（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ）社製）によ
り過剰のＳＳ−ＰＥＧを除去した。さらに、カラムをハ
イロード（ＨｉＬｏａｄ）１６／６０、スーパーデック
ス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ｐｇ（ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）社製）を用いて分取を行い、実施例
１と同様に濃縮して修飾率５６％、活性残存率２９％の
ＰＥＧ修飾体を得た。

【００４８】実施例７分子量２，０００のＰＥＧによる修飾３．０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸リアーゼＡＬ−III（グ
ンゼ（株）社製、緑膿菌由来のアルギン酸に対して高分
解活性を有する）溶液（５．０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５）５．５ｍｌ
と０．５Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５）５．５ｍｌを混合して反応溶液とした。ＳＳ−
ＰＥＧ（分子量２，０００）のモル比を５倍として反応
を行った。実施例１と同様に反応を停止させたのち、実
施例６と同様に分取を行い、濃縮して修飾率５７％、活
性残存率４３％のＰＥＧ修飾体を得た。

【００４９】実施例８分子量５，０００のＰＥＧによる修飾実施例７の分子量２，０００の代わりに、分子量５，０
００のＳＳ−ＰＥＧを用い、修飾率４３％、活性残存率
６４％のＰＥＧ修飾体を得た。

【００５０】実施例９分子量１２，０００のＰＥＧによる修飾実施例７の分子量２，０００の代わりに、分子量１２，
０００のＳＳ−ＰＥＧを用いて行い、修飾率５４％、活
性残存率５１％のＰＥＧ修飾体を得た。

【００５１】上記実施例で作製したＰＥＧ修飾体につい
て酵素濃度、修飾率、活性残存率、免疫反応性を以下に
示す方法で評価した。

【００５２】酵素濃度分光光度計ＵＶ−３６５（（株）島津製作所製）を用い
て２８０ｎｍの吸光度を測定し、アルギン酸リアーゼＡ
Ｌ−III（以下、未修飾体という）を用いて作成した検
量線より酵素濃度を算出した。

【００５３】修飾率０〜２５μｇのＰＥＧ修飾体または未修飾体を含む溶液
０．５ｍｌ、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）１．０ｍｌおよび０．３ｍｇ／ｍｌフルオレスカミ
ン（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）社製）
／１，４−ジオキサン溶液０．５ｍｌを混和することに
より、遊離のアミノ基とフルオレスカミンを室温で１０
分間反応させた。蛍光光度計Ｆ−４０１０（（株）日立
製作所製、蛍光波長３９０ｎｍ、励起波長４８０ｎｍ）
を用いて蛍光強度を測定することにより遊離アミノ基の
定量を行い、未修飾体のそれとの比較より、蛍光強度、
すなわちアミノ基の減少から修飾率を算出した。

【００５４】活性残存率エイセニア・ビサイクリス（Ｅｉｓｅｎｉａｂｉｃｙ
ｃｌｉｓ）由来のアルギン酸ナトリウム（ナカライテス
ク（株）製）を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に０．１％の濃度になるように溶解し、基質溶
液とした。０〜５μｇのＰＥＧ修飾体または未修飾体を
含む溶液０．１ｍｌを前記基質溶液０．９ｍｌと混合し
た後、アルギン酸の分解に由来する２３５ｎｍの吸光度
の上昇を２５℃にて３分間測定した。活性残存率は、１
分間当たりの吸光度の上昇値を酵素量で除すことにより
酵素１ｍｇ当たりの比活性（ΔＡ２３５ｎｍ／分／ｍｇ
タンパク質）を求め、未修飾体との比較から活性残存率
（％）を算出した。

【００５５】抗原性抗体との結合能（免疫反応性）をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙ
ｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓ
ｓａｙ）法により測定し、抗原性の指標とした。

【００５６】５０μｇ／ｍｌのＰＥＧ修飾体または未修
飾体を９６ウェルマイクロプレート（日本インターメッ
ド社製）にそれぞれ５０μｌずつ、９ウェルに添加し、
４℃で１晩放置して酵素を吸着させた。上清を除去した
後、０．０５％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳ
（以下、Ｔ２０／ＰＢＳという）２５０μｌで１回洗浄
した。５０％ブロックエース（商品名、雪印乳業（株）
製）２５０μｌを加え室温で２時間放置して固定化した
後、Ｔ２０／ＰＢＳで３回洗浄した。

【００５７】未修飾体を免疫原とし、通常の方法に従っ
てウサギで作製したアルギン酸リアーゼ抗血清を、１０
％ブロックエース含有Ｔ２０／ＰＢＳを用いて１，００
０〜６，５５３，６００倍の９段階の４倍希釈系列とし
た。前記希釈血清１００μｌを各ウェルに順次添加し、
室温で２時間反応させて、固定化された酵素とアルギン
酸リアーゼ抗体を結合させた。過剰の抗体をＴ２０／Ｐ
ＢＳで洗浄、分離した後、原液をＴ２０／ＰＢＳを用い
て３，０００倍希釈したホースラディッシュ・ペルオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰという）標識抗ウサギＩｇＧ
（ザイメット社製）５０μｌを添加して、酵素に結合し
た抗体と結合させた。過剰の標識抗体をＴ２０／ＰＢＳ
で洗浄、分離した後、ＨＲＰに対する基質溶液（２，
２′−アジノジ（３−エチルベンゾズチアゾリン）−
６′−スルホン酸、和光純薬工業（株）製）１００μｌ
を添加し、室温で１５分間反応させた。１．５％シュウ
酸１００μｌを加えて反応を停止した後、プレートリー
ダーＭｏｄｅｌ３５５０（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。

【００５８】ＰＥＧ修飾体および未修飾体の各々に対し
て抗原−抗体反応曲線を作成した。５０％の結合を示す
抗血清の希釈率を抗原力価の指標とし、両者の比から免
疫反応性の低下度合いを算出した。

【００５９】アルギン酸リアーゼＡＬ−IIIの未修飾体
および実施例１〜５で得られたＰＥＧ修飾体の特性を表
１に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】試験例１ＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼの活性の消失推移日本白色雄性ウサギに未修飾体および実施例６で得たＰ
ＥＧ修飾体の生理食塩水溶液を５ｍｇ酵素／匹の投与量
で（５ｍｇ／ｍｌ溶液、１ｍｌ）耳静脈より静脈内投与
した（各１例）。投与後３０分、１、３、５、７、２
４、４８、７２、９６時間に耳静脈より０．５ｍｌ採血
した。血液は室温で２時間放置した後、遠心分離（１
２，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清を分取し
た。

【００６２】血清中のアルギン酸リアーゼ活性は、エイ
セニア・ビサイクリス由来の０．１％アルギン酸ナトリ
ウム（ナカライテスク（株）製）／５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を基質溶液として用い、以下
に示すチオバルビツール酸法（以下、ＴＢＡ法という、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）第２３４巻、第４号、７０５〜７０９頁、
１９５９年参照）にて測定した。すなわち、血清１０μ
ｌを基質溶液１ｍｌに添加し、３７℃で酵素反応を行っ
た。反応開始３０分後に０．０３Ｎ過ヨウ素酸（和光
純薬工業（株）製）／０．１２５Ｎ硫酸１００μｌ
を添加し、反応を停止させた。室温で１時間放置した
後、０．３％チオバルビツール酸（和光純薬工業
（株）製）／ｐＨ２．０塩酸（水に塩酸を加えてｐＨ
２．０に調整した）２ｍｌを加え、１００℃で１０分間
加熱処理することによりアルギン酸の酵素反応分解物
（β−フォルミルピルベート（β−ｆｏｒｍｙｌｐｙ
ｒｕｖａｔｅ））を呈色させた。遠心分離（２，０００
ｒｐｍ、５分間）により得られた上清をさらに０．４５
μｍのフィルター（ＫＣプレップオムニ、片山化学工
業（株）製）でろ過し、分光光度計Ｕ−２０００
（（株）日立製作所製）を用いてろ液の５４８ｎｍにお
ける吸光度を測定した。

【００６３】ＴＢＡ法におけるアルギン酸リアーゼの活
性は、前記条件にて１μｍｏｌのβ−フォルミルピルベ
ートを生成するのに必要な酵素量を１ユニット（ｕｎｉ
ｔ）と定めた。なお、β−フォルミルピルベートの５４
８ｎｍにおける吸光度は文献値より、０．０１μｍｏｌ
で０．２９０を示すとして計算した（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー）第２３７巻、第２
号、３０９〜３１６頁、１９６２年参照）。

【００６４】未修飾体および実施例６で得たＰＥＧ修飾
体をウサギに静脈内投与した後の各血清中のアルギン酸
リアーゼ活性の消失推移を図２に示す。未修飾体の静脈
内投与後の血清中活性は２相性の速やかな消失推移を示
し、その消失半減期はα相（分布相）で約３５分、β相
（消失相）で約５．６時間となった。一方、ＰＥＧ修飾
体は血清中の活性が持続する傾向を示し、投与９６時間
後においても高い活性が検出された。その半減期は約１
４２時間となり、ＰＥＧ修飾により血中での滞留性が大
きく改善されることがわかった。

【００６５】試験例２インビトロにて形成したバイオフィルムに実施例７〜９
で作製したＰＥＧ修飾体を適用し、バイオフィルムに対
するＰＥＧ修飾体の効果に関する基礎的検討を行った。

【００６６】（１）インビトロバイオフィルムモデルの
作製嚢胞性線維症の患者の肺気道から分離されたムコイド型
緑膿菌（アリースプリンス博士（Ｄｒ．Ａ．Ｐｒｉｎ
ｃｅ：コロンビア大学、微生物学部門、ニューヨーク）
から分与された）をトリプトソイ寒天培地（以下、ＴＳ
Ａ培地という、栄研化学（株）製）に塗布し、３７℃で
４０時間前培養を行った。ＴＳＡ培地上に出現したコロ
ニーを生理食塩水に懸濁し、吸光光度計ＳＰＥＣＴＲＯ
ＮＩＣ２１（ボッシュ・アンド・ローム（ＢＡＵＳＨ
＆ＬＯＭＢ）社製）を用いて６６０ｎｍの吸光度を測
定しながら菌濃度を約１０⁸ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
つぎにメンブランフィルター（ＭＦ−ミリポア、商品
名、孔径０．４５μｍ、直径２５ｍｍ、日本ミリポア
（株）製）をブレイン・ハート・インフュージョン寒天
培地（以下、ＢＨＩ寒天培地という、栄研化学（株）
製）の表面におき、菌液１００μｌをメンブランフィル
ター上に滴下して、メンブランフィルター１枚当たり１
０⁷ＣＦＵの緑膿菌を付着させた。３７℃で４〜１０日
間静置培養することによりメンブランフィルター上にバ
イオフィルムを形成させた（ケモセラピー（Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒａｐｙ）第４１巻、第１０号、１０６４〜１０
７０頁、１９９３年参照）。

【００６７】（２）バイオフィルムの評価法走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという）による形態
観察法（イ）サンプルの前処理バイオフィルムが付着したメンブランフィルターを生理
食塩水で洗浄した後、０．１５％ルテニウムレッド（片
山化学工業（株）製）を含む２．５ｗ／ｖ％グルタルア
ルデヒド（片山化学工業（株）製）／ＰＢＳ溶液に３０
分間浸し、続いて１％四酸化オスミウム（メルク（ＭＥ
ＲＫ）社製）／ＰＢＳ溶液に３０分間浸して固定化し
た。つぎに、上昇エタノール系列（５０、７０および９
０ｖ／ｖ％）で各々３０分間さらに脱水エタノールで１
晩脱水処理をした。臨界点乾燥器ＣＰＤ−７５０（盟和
商事製）を用いて炭酸ガスによる臨界点乾燥をした後、
イオンスパッターＥ−１０２（（株）日立製作所製）を
用いて白金−パラジウムでスパッタコーティングを行
い、ＳＥＭ観察用試料とした。

【００６８】（ロ）ＳＥＭ観察条件ＳＥＭ装置Ｓ−２２５０Ｎ（（株）日立製作所製、加速
電圧２５ｋＶ、観察倍率３，０００倍）およびイメージ
プロセッサーＥＰ−３０００（（株）日立製作所製）を
用いて形態観察を行った。

【００６９】バイオフィルムのメンブランフィルターへ
の（ａ）付着直後、（ｂ）培養４日目、（ｃ）７日目お
よび（ｄ）１０日目のバイオフィルム形成の経時的変化
を図３に示す。

【００７０】バイオフィルム中アルギン酸の定量法（イ）アルギン酸の回収法バイオフィルムが形成されたメンブランフィルターを生
理食塩水３ｍｌ中に入れ、激しくボルテックス処理する
ことによりバイオフィルムをメンブランフィルターから
剥離した。９９．５％エタノール５ｍｌを加え、再度ボ
ルテックス処理した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、
１０分間）することによりバイオフィルム成分を沈殿さ
せた。さらに、９９．５％エタノール５ｍｌで１回洗浄
した後、生理食塩水５ｍｌを加えアルギン酸を溶解し
た。菌体および不溶性成分を遠心分離（１２，０００ｒ
ｐｍ、１０分間）で除去した後、その１ｍｌに１０％硫
酸銅溶液５０μｌを加えアルギン酸を再度沈殿させた。
ｐＨ３．０に調整した塩酸で沈殿物を２回洗浄した後、
１Ｎアンモニア水１ｍｌに溶解した。不溶性成分を遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）で除去することに
よりアルギン酸溶液を得た。

【００７１】（ロ）アルギン酸の定量法適宜希釈したアルギン酸溶液５００μｌを０．１Ｍホ
ウ酸含有濃硫酸試液３ｍｌと混和した。０．１％カルバ
ゾール（東京化成工業（株）製）／エタノール溶液１０
０μｌを添加し、５５℃で３０分間反応することにより
アルギン酸を呈色させた。分光光度計ＵＶ−１２０
（（株）島津製作所製）を用いて５３０ｎｍにおける呈
色物由来の吸光度を測定し、アルギン酸ナトリウム標準
溶液の結果からアルギン酸量を算出した（アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）第２４巻、４７０〜４８１頁、１９６８年参
照）。

【００７２】バイオフィルム中アルギン酸産生量の経時
的変化（培養４、７および１０日目）を図４に示す。

【００７３】図３および図４に示すように、メンブラン
フィルターに付着させた緑膿菌を寒天培地上で４〜１０
日間培養することにより、繊維状ならびに平板状物質が
産生し、バイオフィルムの形成を認めた。バイオフィル
ム中のアルギン酸産生量は経時的に増加した。

【００７４】（３）バイオフィルムに対するＰＥＧ修飾
体の効果に関する検討前記（１）で形成されたバイオフィルムに対するＰＥＧ
修飾体のバイオフィルム破壊効果をアルギン酸含有量の
変化から検討した。ＰＥＧ修飾体は、実施例７〜９にお
いて作製したものを用いた。

【００７５】適用バイオフィルム：培養開始後７日目の
バイオフィルム適用酵素：（ａ）生理食塩水（コントロール）（ｂ）未修飾体（ｃ）実施例７で得たＰＥＧ修飾体（ｄ）実施例８で得たＰＥＧ修飾体（ｅ）実施例９で得たＰＥＧ修飾体適用量：生理食塩水で５０μｇ／ｍｌに希釈した酵素溶
液１００μｌ（酵素量５μｇ）を用いた。

【００７６】適用方法：前記（１）で作製したバイオフ
ィルムを新鮮なＢＨＩ寒天培地に移しかえ、バイオフィ
ルムの上から直接酵素溶液を滴下した（各群５例）。３
７℃で培養を再度開始し、１日後にバイオフィルムを取
り出した。生理食塩水で洗浄した後、前記（２）の方法
に従い、ＳＥＭによる形態観察およびアルギン酸を定量
した。

【００７７】７日間形成したバイオフィルムに酵素溶液
を適用した後１日目のＳＥＭによる形態観察を図５に示
す。

【００７８】７日間形成したバイオフィルムに酵素溶液
を適用した後１日目のアルギン酸量の変化を図６に示
す。

【００７９】図５および図６に示すように、７日間形成
したバイオフィルムに対するＰＥＧ修飾体のバイオフィ
ルム破壊効果を検討した。未修飾体および分子量の異な
るＰＥＧで修飾した３種の修飾体ともに、酵素適用１日
後の残存アルギン酸量は、コントロール群（生理食塩
水）に比べて有意に減少した。

【００８０】

【発明の効果】本発明のＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼ
は、安定性が向上し、酵素活性を高く維持しながらも抗
原性の低いものであり、バイオフィルム溶解剤およびバ
イオフィルムに起因する難治性感染症の治療・予防剤の
開発に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＰＥＧ修飾アルギン酸リアーゼにおけ
るＳＳ−ＰＥＧとアミノ基との反応様式を示す模式図で
ある。

【図２】試験例１において、実施例６で得たＰＥＧ修飾
体をウサギに静脈内投与した後の血清中アルギン酸リア
ーゼ活性の推移を示すグラフである。

【図３】試験例２（２）で観察した、バイオフィルム
形成の経時的変化を示すＳＥＭ写真である。

【図４】試験例２（２）で算出したバイオフィルム中
アルギン酸産生量の経時的変化を示すグラフである。

【図５】試験例２（３）で観察したバイオフィルムの
形態を示すＳＥＭ写真である。

【図６】試験例２（３）で算出した、７日間形成した
バイオフィルムに酵素溶液を適用した後１日目のアルギ
ン酸量の変化を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者榊原裕幸滋賀県大津市逢坂一丁目７番19号 (72)発明者阿部士朗京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者久野智弘京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者西村稔京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ株式会社京都研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリエチレングリコール修飾アルギン酸
リアーゼ。
【請求項２】ポリエチレングリコールによる修飾率が
２０〜８０％である請求項１記載のポリエチレングリコ
ール修飾アルギン酸リアーゼ。
【請求項３】ポリエチレングリコール修飾アルギン酸
リアーゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤。
【請求項４】ポリエチレングリコール修飾アルギン酸
リアーゼを有効成分とするバイオフィルム溶解剤とバイ
オフィルム産生性微生物に対して有効な抗生物質とを配
合してなる、難治性感染症の治療・予防剤。