JPH10130295A - 腫瘍細胞に細胞傷害性物質を供給するためのプロドラッグと組合わせた抗体−酵素結合体 - Google Patents

腫瘍細胞に細胞傷害性物質を供給するためのプロドラッグと組合わせた抗体−酵素結合体

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JPH10130295A
JPH10130295A JP9179582A JP17958297A JPH10130295A JP H10130295 A JPH10130295 A JP H10130295A JP 9179582 A JP9179582 A JP 9179582A JP 17958297 A JP17958297 A JP 17958297A JP H10130295 A JPH10130295 A JP H10130295A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給する新規
な医薬組成物を提供すること。 【解決手段】 貧または非細胞障害性プロドラッグをよ
り活性な細胞障害性薬物に転化できる酵素を腫瘍特異性
抗体に結合した抗体−酵素結合体およびプロドラッグを
含む医薬組成物。上記抗体−酵素結合体が腫瘍をもつ哺
乳動物宿主に投与されると、抗体特異性に基づいて抗体
が特異性である腫瘍抗原を有する腫瘍細胞の表面に結合
し、次いでプロドラッグが宿主に投与されると、腫瘍部
位で抗体結合酵素の作用により一層活性な細胞障害性薬
物に転化され、腫瘍細胞に供給される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は腫瘍細胞に細胞障害
性物質を供給するための、新規なプロドラッグおよび該
プロドラッグと抗体−酵素結合体を含む医薬組成物並び
にその製造法に関する。より詳しくは、本発明は腫瘍細
胞に結合する腫瘍特異性抗体−酵素結合体、および腫瘍
部位において抗体結合酵素の存在下に活性細胞障害性薬
物に転化される新規なプロドラッグを含む、腫瘍部位に
細胞障害性薬物を供給する医薬組成物に関する。本発明
の抗体−酵素結合体およびプロドラッグは癌および他の
腫瘍の治療に現在使用される抗体仲介薬物供給系の欠点
の多くを克服する。
【０００２】
【従来の技術】癌の治療において腫瘍細胞に細胞障害性
物質を選択的に供給するための免疫結合体の使用が知ら
れている。腫瘍細胞の部位に対する細胞障害性物質の供
給は、これらの物質に全身性投与がしばしば体内の正常
細胞および排除しようとする腫瘍細胞の死を生するので
非常に望ましい。従って、現在使用される抗腫瘍薬物供
給系によれば、細胞障害性物質を腫瘍特異性抗体に結合
させて腫瘍細胞に結合させ、それにより腫瘍部位に細胞
障害性物質を「供給する」免疫結合体を形成させる。こ
れらの標的指向系に使用される免疫結合体には抗体−薬
物結合体〔例えば、ボルドウイン (R. W. Baldwin)ほ
か、「癌治療に対する単クローン性抗体」、ランセット
(Lanset) 、ｐｐ６０３〜０５（１９８６年３月１５
日）参照〕および抗体−毒素結合体〔例えば、ソープ
(P. E. Thorpe) 、「癌療法における細胞障害性物質の
抗体担体：総説」、「モノクローナル・アンティボディ
ーズ '８４：バイオロジカル・アンド・クリニカル・ア
プリケーションズ (Monoclonal Antibodies '8４：Biol
ogical And Clinical Applications）」、ピンチエラ
（A. Pinchera)ほか編、ｐｐ４７５〜５０６）１９８
５）参照〕が含まれる。多クローン性抗体および単クロ
ーン性抗体の両方がこれらの免疫結合体に利用された
〔例えば、オーカワ (K. Ohkawa)ほか、「ヒト血清アル
ブミンによりマイトマイシンＣと結合したヒトα−フェ
トプロテインに対する精製抗体によるヒト卵黄嚢腫瘍細
胞系に対する選択的試験管内および生体内増殖阻止」、
カンサー・イムノロジー・アンド・イムノセラピー (Ca
ncer Immunol. Immunother.), ２３、ｐｐ８１〜８６
（１９８６）およびローランド (G. F. Rowland)ほか、
「ヒト腫瘍異種移植片におけるビンデシン−単クローン
性抗ＣＥＡ結合体の薬物局在化および増殖阻止研究」、
カンサー・イムノロジー・アンド・イムノセラピー (Ca
ncer Immunol. Immunother.), ２１、ｐｐ１８３〜８７
（１９８６）参照〕。これらの免疫結合体に使用された
薬物にはダウノマイシン〔例えば、ガレゴ (J. Galleg
o) ほか、「抗腫瘍活性を有する４ダウノマイシン−単
クローン性抗体７９１Ｔ／３６結合体の調製」、インタ
ナショナル・ジャーナル・オブ・カンサー (Int. J. Ca
ncer) 、３３、ｐｐ７３７〜４４（１９８４）およびア
ーノン (R. Arnon) ほか、「ダウノマイシンと抗腫瘍抗
体との結合体の試験管内および生体内効力」、イムノロ
ジカル・レビューズ (Immunological Rev.) 、６２、ｐ
ｐ５〜２７（１９８２）参照〕、メトトレキサート〔エ
ンドー (N. Endo 〕ほか、「メトトレキサートと抗ＭＭ
４６単クローン性抗体とのヒト血清アルブミン仲介結合
体の試験管内細胞毒性」、カンサー・リサーチ (Cancer
Research)、４７、ｐｐ１０７６−８０（１９８
７）〕、マイトマイシンＣ〔オーカワ (K. Ohkawa)ほ
か、前掲〕、およびビンデシン〔ローランド (G. F. Ro
wland)ほか、前掲〕が含まれる。抗体−毒素結合体に使
用された毒素には細菌毒素例えばジフテリア毒素および
植物毒素例えばリシンが含まれる〔例えば、ムールテン
(F. L. Moolten)ほか、「特異性抗腫瘍物質としての強
力細胞毒に結合した抗体」、イムノロジカル・レビュー
ズ (Immunological Rev.) 、６２、ｐｐ．４７〜７３
（１９８２）参照〕。
【０００３】治療目的に対する免疫結合体の使用を指向
する多くの研究にもかかわらず、これらの供給法に含ま
れる若干の制限が明らかになった〔例えば、エンブレト
ン(M. J. Embleton)、「単クローン性抗体による抗癌治
療剤の標的指向」、バイオケミカル・ソサイエティー・
トランスアクションズ (Biochemical Society Transact
ions) 、１４、ｐｐ３９３〜３９５（第６１５会議（６
１５th Meeting, Belfast)（１９８６）参照〕。第１
に、細胞の表面上の腫瘍関連抗原の数および所与抗体分
子に結合できる薬物分子の数により課せられる制約のた
め、細胞の殺害を行なうために標的腫瘍細胞に供給され
ることが必要である多量の薬物がしばしば得られること
ができない。この制約がこれらの結合体中の一層強力な
細胞障害性物質例えば植物毒素の使用、および非常に高
い薬物多重比を有するポリマー結合抗体−薬物結合体の
開発をもたらした〔例えば、ソープ (P. E. Thorpe) 、
前掲、ｐｐ４７５〜５０６およびボルドウイン (R. W.
Baldwin)ほか、「単クローン性抗体７９１Ｔ〜３６−メ
トトレキサート結合体の設計および治療評価」、モノク
ローナル・アンティボディーズ・アンド・カンサー・セ
ラピー (MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)
、ｐｐ２１５〜３１、アラン・Ｒ・リス社 (Alan R. L
iss Inc.)、（１９８５）参照〕。しかし、大薬物装填
比または強力毒素の使用でも、多くの免疫結合体はなお
次善的細胞障害活性を示し、すべての利用可能抗原部位
が飽和される用量で完全な殺害を行なうことができな
い。第２に、免疫結合体の細胞障害活性がしばしば結合
体の抗体成分により仲介された腫瘍細胞中へのその取込
みに依存する〔例えば、ランベルト (J. M. Lambert)ほ
か、「ヒトリンパ系細胞と反応性である精製免疫毒
素」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー (J. Biol. Chem.) 、２６０（No. ２２）ｐｐ１２０
３５〜１２０４１（１９８５）参照〕。この内在化は薬
物が細胞内作用部位を有する抗体−薬物結合体を用いる
とき、または抗体−毒素結合体を用いるときに決定的で
ある。しかし大多数の腫瘍関連抗原、従ってこれらの抗
原に結合した抗体−薬物または抗体−毒素結合体は内在
化されない。内在化される結合体はしばしば細胞のリソ
ソームに輸送され、そこで薬物または毒素が分解される
〔ビテッタ (E. S. Vitetta)ほか、サイエンス (Scienc
e)、２３８、ｐｐ１０９８〜１１０４（１９８７）参
照〕。従って、抗体−薬物または抗体−毒素結合体が優
れた腫瘍結合特性を有することができるけれども、それ
にもかかわらず結合体は細胞内のその作用部位に到達で
きないために限定された細胞障害利用性を有することが
できる。
【０００４】さらに、腫瘍細胞集団はしばしば抗原発現
に関して不均一である〔例えば、アルビノ(A. P. Albin
o)ほか、「同一患者の種々の黒色腫転移由来の細胞系の
表面抗原および糖タンパク質発現の不均一性」、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン (J. Ex
p. Med.) 、１５４、ｐｐ１７６４〜７８（１９８１）
参照〕。さらに、抗原陽性腫瘍細胞が抗原陰性後代を生
ずることができることが示された〔例えば、イエー (M.
Yeh) ほか、「単クローン性抗体により示されたヒト黒
色腫抗原の発現に対するクローン変種」、ジャーナル・
オブ・イムノロジー (J. Immunol.)、１２６（No.
４）、ｐｐ．１３１２〜１７（１９８１）参照〕。従っ
て、腫瘍細胞の任意の集団中に特定免疫結合体が特異的
である抗原を有しない一定数の細胞が存在する。従っ
て、免疫結合体はこれらの細胞に結合してそれらの殺害
を仲介することができない。これらの欠点のために、現
在利用される抗腫瘍薬物または毒素の供給系は、殊に生
体内治療に用いたときに限定量の達成を有した。前記免
疫結合体に加えて、抗体−酵素結合体が抗体仲介細胞毒
性を増幅させるためにヨウ化物またはアルスフェナミン
をそれらの毒性形態に転化する第２非標的指向酵素と組
合せて試験管内で研究された〔例えば、パーカー (C.
W. Parker) ほか「ルミノール置換ペプチドおよびタン
パク質の酵素活性化および捕捉。抗腫瘍抗体の細胞毒性
を増幅する可能な手段」、プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Pro
c. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７２（No. １）、ｐ
ｐ．３３８〜４２（１９７５）およびフィルポット (G.
W. Philpott) ほか、「抗体−グルコースオキシダーゼ
結合体、ペルオキシダーゼおよびアルスフェナミンによ
る腫瘍細胞のアフィニティー細胞毒性」、カンサー・リ
サーチ (Cancer Research)、３４、ｐｐ２１５９〜６４
（１９７４）参照〕。
【０００５】これらの試験管内研究によれば、酵素グル
コースオキシダーゼが抗体に結合され、ヨウ化物または
アルスフェナミンをそれぞれ細胞障害性ヨウ素またはヒ
素に転化する非標的指向化ペルオキシダーゼ酵素と組合
せて使用される。従って、この方法は抗体でグルコース
オキシダーゼを腫瘍細胞に標的指向させるだけでなく、
また２つの他の非標的指向化物質が腫瘍部位に存在する
ことを必要とする。これらの物質の３つすべてが生体内
に、腫瘍部位に同時に存在する可能性は小なく、従って
この方法は治療に重要であるとは思われない。ヤンセン
(F. Jansen)ほかに対し１９８７年１月２０日に発行さ
れたカナダ国特許第1,２１6,７９１号には基質からアン
モニウムイオンを遊離できる酵素の抗体に対する結合が
開示されている。次いでアンモニウムイオンが腫瘍部位
を標的した一定免疫毒素の細胞障害性作用を増強すると
いわれる。最後に、欧州特許出願第８４３０２２１8.７
号には抗体が腫瘍細胞に対する非代謝性抗原の標的指向
に使用される疾患細胞集団例えば腫瘍を治療する方法が
開示されている。抗原は少くとも一部の腫瘍細胞内に蓄
積し、次いでそれが溶解して腫瘍部位に形成された汎在
フィブロネクチン捕捉マトリックス中へ抗原を遊離す
る。発明の方法におけるこの時点で、マトリックスに結
合した抗原に特異性でそれに結合するヨウ素含有配位子
が投与される。次いで細胞障害性ヨウ素がその部位に作
用して腫瘍細胞を殺す。多くの他の態様がこの出願に開
示され、その１つは抗体−酵素結合体を腫瘍部位に対す
る酵素の標的指向に使用すること、および酵素が細胞障
害性物質に転化できる非致死基質を添加することを示唆
している〔欧州特許出願、ｐｐ．３４〜３５参照〕。し
かし、その出願のどこにもこの態様がいかに実施される
か開示していない。同様に、ヘルストロム (Hellstrom)
ほか、「薬物供給のための抗体」、コントロールド・ド
ラグ・デリベリー (Controlled Drug Delivery）（２
版）、ロビンソンほか (Robinson and Lee) 編、ｐ．６
３９（１９８７）は、「腫瘍に局在化された物質（例え
ば酵素）による「活性化」まで非毒性である薬物を他の
方法として考えることができる」ことを示唆している。
しかし今日まで、ここに提供される方法がどのように実
施できるかだれも開示または示唆しておらず、また薬物
を標的指向させるこの方法をだれも実際に試みなかっ
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明は細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給す
るための、抗体−酵素結合体およびプロドラッグを組み
合わせた新規な医薬組成物を提供することにより前記問
題を処理する。本発明によれば、貧または非細胞障害性
プロドラッグを活性細胞障害性薬物に転化できる酵素が
腫瘍特異性抗体に結合し、この抗体−酵素結合体が腫瘍
をもつ哺乳動物宿主に投与され、抗体特異性に基づいて
抗体が特異性である腫瘍抗原を有する腫瘍細胞の表面に
結合する。次いでプロドラッグが宿主に投与され、腫瘍
部位で抗体結合酵素の作用により一層活性な細胞障害性
薬物に転化される。
【０００７】本発明はまた、一連のプロドラッグを単一
抗体結合酵素により活性化させる細胞障害性薬物を腫瘍
細胞に供給する方法を包含する。さらに、一連の異なる
免疫結合体、すなわち種々の酵素を含む腫瘍特異性抗体
を本発明に従って使用し、腫瘍の治療のために多くの種
々のプロドラッグをそれらの一層細胞障害性の形態に転
化させることができる。あるいは、結合体の抗体成分の
特異性が異なる、すなわち各免疫結合体が腫瘍細胞上の
異なる抗原部位に対する抗体を含む一連の異なる免疫結
合体を本発明に従って用いて、プロドラッグまたは多く
のプロドラッグを一層活性な細胞障害性形態に転化させ
ることができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の好ましい態様によれば、
酵素、アルカリ性ホスファターゼ（「ＡＰ」）を含む抗
体−酵素結合体が腫瘍細胞の殺害を行なうために新規プ
ロドラッグ、エトポシド−４′−ホスフェートまたは７
−（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン
あるいはそれらの組合せとともに使用された。本発明の
他の態様によれば、酵素ペニシリンＶアミダーゼ（「Ｐ
ＶＡ」）を含む抗体−酵素結合体が腫瘍細胞の殺害を行
なうために新規プロドラッグ、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフ
ェノキシアセチル）アドリアマイシンとともに使用され
た。本発明のなお他の態様によれば、腫瘍細胞を殺すた
めの、酵素シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を含む抗体−
酵素結合体のプロドラッグ、５−フルオロシトシンと組
合せた使用に関する。
【０００９】本発明の免疫結合体およびプロドラッグは
抗腫瘍組成物例えば本発明の少くとも１種の免疫結合体
またはプロドラッグの薬学的に有効な量および薬学的に
許容される担体を含む組成物で使用することができる。
さらに、免疫結合体およびプロドラッグは組合せて哺乳
動物を本発明の組成物の薬学的に有効な量で処置する段
階を含む哺乳動物における腫瘍を治療する方法に使用す
ることができる。有利には、本発明の方法、免疫結合
体、プロドラッグ、薬学的組成物および組合せ、細胞障
害性薬物を腫瘍細胞に供給し、高い選択的細胞毒性を可
能にし、普通の抗体指向免疫療法技術に固有の不均一抗
原発現、抗原／抗体内在化および不十分な薬物抗力の問
題を回避する比較的簡単で直接的な方法を提供する。
【００１０】図１は抗体−酵素結合体を結合する腫瘍細
胞においてプロドラッグを活性化するために用いる方策
を示す。図２は（Ａ）９6.５−ＡＰ免疫結合体；（Ｂ）
Ｌ６−ＡＰ免疫結合体；（Ｃ）ＡＰ；（Ｄ）単クローン
性抗体９6.５；および（Ｅ）単クローン性抗体Ｌ６のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析（５〜１2.５％勾配
ゲル、非還元性）を示す。図３は本発明のエトポキシド
ホスフェートおよびエトポシドチオホスフェートプロド
ラッグの調製および加水分解を示す。図４は（Ａ）エト
ポシド−４′−ホスフェート単独すなわちＡＰまたはＡ
Ｐ−Ｌ６結合体の存在しない；（Ｂ）エトポシド単独；
（Ｃ）エトポシド−４′−ホスフェートプロドラッグと
ＡＰとの反応の５分後に生じた生成物、および（Ｄ）エ
トポシド−４′−ホスフェートプロドラッグと本発明の
Ｌ６−ＡＰ結合体との反応の５分後に生じた生成物の高
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（２５４ nｍで
モニター）を示す。図５はエトポシド−４′−ホスフェ
ートまたはエトポシド−４′−チオホスフェートのアル
カリ性ホスファターゼに対する暴露による時間に関する
エトポシド遊離の割合を示す比較図である。
【００１１】図６はＬ６および９6.５単クローン性抗体
並びに本発明のＬ６−ＡＰおよび９6.５−ＡＰ結合体の
Ｈ３３４７腫瘍細胞に対する比較結合を示す。図７はＬ
６および１Ｆ５単クローン性抗体並びに本発明のＬ６−
ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体のＨ３３４７腫瘍細胞に
対する比較結合を示す。図８はエトポシドまたはエトポ
シドホスフェートプロドラッグのモル濃度に対する殺さ
れた腫瘍細胞の割合を示す比較図である。グラフは比較
的細胞障害性でないプロドラッグと本発明のＬ６−ＡＰ
結合体または９6.５−ＡＰ結合体との反応から生ずる高
割合の殺害を示す。図９は◎：エトポシド、○：ＥＰ、
□：Ｌ６−ＡＰ＋ＥＰ、または■：１Ｆ５−ＡＰ＋ＥＰ
で処理したＨ３３４７腫瘍細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チ
ミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図である。グ
ラフはＥＰ単独で処理したときに認められる活性に比べ
て腫瘍細胞をＬ６−ＡＰおよびＥＰで処理したときに認
められた細胞障害性の増加を示す。図１０は非処置また
は本発明の結合体で処置した腫瘍中のホスファターゼ活
性の分析を示す。図１０（Ａ）は非処置マウスと比較し
た２４時間早く本発明のＬ６−ＡＰ結合体で処置したマ
ウス中の時間に関するＨ３３４７腫瘍の全ホスファター
ゼ活性を示す。図１０（Ｂ）は非処置あるいはＬ６−Ａ
Ｐまたは１Ｆ５−ＡＰ前処理マウスのヘマトキシリンお
よびエオシンまたはＡＰ基質で染色した腫瘍断面を示
す。暗黒色領域が高いホスファターゼ活性を示す。
【００１２】図１１は●：非処置あるいは○：エトポシ
ド、■：ＥＰ、□：１Ｆ５−ＡＰ＋ＥＰまたは▲：Ｌ６
−ＡＰ＋ＥＰで処置したマウス中の時間に関する腫瘍容
積を示す比較図である。矢印は薬物処置の開始を示し、
適用できる場合に結合体を１８〜２４時間早く投与し
た。グラフはＬ６−ＡＰおよびＥＰ処置で認められた顕
著な抗腫瘍効果を示す。図１２は新規プロドラッグ、７
−（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン
（「ＭＯＰ」）を含む本発明により用いたマイトマイシ
ン誘導体の化学構造を示す。図１３はＭＯＰとアルカリ
性ホスファターゼ酵素との反応を時間に関して示す。反
応の経過はＨＰＬＣによりＭＯＨ、ＭＯＰのマイトマイ
シンアルコール誘導体、の遊離についてモニターした。
図１４はＬ６および１Ｆ５単クローン性抗体並びに本発
明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体のＨ２９８１
腫瘍細胞に対する比較結合を示す。図１５は▲：エトポ
シド、■：ＥＰ、□：ＡＰ＋ＥＰ、●：Ｌ６−ＡＰ＋Ｅ
Ｐ、または○：１Ｆ５−ＡＰ＋ＥＰで処理したＨ２９８
１腫瘍細胞のＤＮＡ中への3Ｈ−チミジン取込みのパー
セント阻止を示す比較図である。グラフは腫瘍細胞を本
発明のＬ６−ＡＰ結合体で前処理したときに認められ
た、ＥＰ単独に比べた細胞障害活性の増加を示す。
【００１３】図１６は□：マイトマイシンＣ（ＭＭ
Ｃ）、▲：ＭＯＨ、■：ＭＯＰ、△：ＭＯＰ＋ＡＰ、
●：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰまたは１Ｆ５−ＡＰ＋ＭＯＰで
処理したＨ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チミ
ジン組込みのパーセント阻止を示す比較図である。グラ
フはＭＯＰ単独で処理したときに認められる活性に比べ
て腫瘍細胞を本発明のＬ６−ＡＰ結合体で前処理し次に
ＭＯＰ処理したときに認められた細胞障害性活性の増加
を示す。図１７は▲：ＭＭＣ、□：ＭＯＨ、■：ＭＯ
Ｐ、●：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰまたは○：１Ｆ５−ＡＰ＋
ＭＯＰで処理したＣＥＭ細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チミ
ジン取込みのパーセント阻止を示す比較図である。この
グラフはＬ６抗原の存在しないＣＥＭ細胞で有意な増大
が認められないので１６図に認められた増大された細胞
毒性の特異性を示す。図１８は●：非処置（対照）、あ
るいは■：ＭＯＨ、○：ＭＯＰ、▲：１Ｆ５−ＡＰ＋Ｍ
ＯＨまたは□：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰで処置したマウス中
の時間に関する腫瘍容積を示す比較図である。矢印は間
をあけた薬物処置を示し、適用できる場合に結合体は各
薬物処置より１８〜２４時間早く投与した。グラフはＬ
６−ＡＰ＋ＭＯＰによる腫瘍の処置で認められた顕著な
腫瘍効果を示す。図１９は■：非処置（対照）、あるい
は□：ＭＯＰ／ＥＰ、○：１Ｆ５−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＥＰ
または●：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＥＰで処置したマウス
中の時間に関する腫瘍容積を示す比較図である。矢印は
間をあけた薬物処置を示し、適用できる場合に結合体は
各薬物処置より１８〜２４時間早く投与した。グラフは
本発明のＬ６−ＡＰ結合体およびプロドラッグ、ＭＯＰ
およびＥＰの組合せによる腫瘍の処置で認められた顕著
な腫瘍効果を示す。図２０は本発明のアドリアマイシン
プロドラッグ（「ＡＰＯ」）の化学構造およびそのアド
リアマイシンからの調製を示す。
【００１４】図２１はＡＰＯと△：遊離ペニシリンＶア
ミダーゼ酵素または○および□：本発明のＬ６−ＰＶＡ
結合体のそれぞれ１０および１００μｇ全タンパク質／
ｍlとの反応で遊離されたアドレアマイシンの割合を時
間に関して示す比較図である。反応の経過はＨＰＬＣに
よりモニターした。図２２はＬ６単クローン性抗体並び
に本発明のＬ６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の
Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する比較結合を示す。図２３は
○：アドリアマイシン（ＡＤＭ）、●：ＡＰＯ、△：Ｌ
６−ＰＶＡ＋ＡＰＯまたは▲：１Ｆ５−ＰＶＡ＋ＡＰＯ
で処理したＨ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チ
ミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図である。グ
ラフはＡＰＯ単独で処理したときに認められた活性に比
べて腫瘍細胞をＬ６−ＰＶＡ結合体で前処理し次いでＡ
ＰＯで処理したときに認められた細胞障害活性の増加を
示す。図２４はＬ６および１Ｆ５単クローン性抗体並び
に本発明のＬ６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の
ドージ (Daudi)リンパ腫細胞に対する比較結合を示す。
図２５は●：ＡＤＭ、○：ＡＰＯ、■：Ｌ６−ＰＶＡ＋
ＡＰＯまたは□：１Ｆ５−ＰＶＡ＋ＡＰＯで処理したド
ージリンパ腫細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チミジン取込み
のパーセント阻止を示す比較図である。グラフはＡＰＯ
単独で細胞を処理して認められた細胞障害性効果に比べ
て腫瘍細胞を１Ｆ５−ＰＶＡ結合体で前処理し次いでＡ
ＰＯ処理したときに認められた細胞障害活性の増加を示
す。
【００１５】図２６は５−フルオロシトシン（「５−Ｆ
Ｃ」）および５−フルオロウラシル（「５−ＦＵ」）の
化学構造を示す。５−ＦＣは本発明の方法により５−Ｆ
Ｕに転化されるプロドラッグである。図２７はシトシン
(cyto) の●：ＣＤ、○：Ｌ６−ＣＤまたは■：１Ｆ５
−ＣＤとの反応で、あるいは５ＦＣの□：ＣＤ、▲：Ｌ
６−ＣＤまたは△：１Ｆ５−ＣＤとの反応で形成された
生成物の量を時間に関して示す比較グラフである。基質
としてシトシンを用いて形成された生成物はウラシルで
あり、基質として５−ＦＣを用いて形成された生成物は
５−ＦＵであった。反応の経過は分光測光でモニターし
た。図２８はＬ６単クローン性抗体並びに本発明のＬ６
−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞
に対する比較結合を示す。図２９は●：５−ＦＵ、□：
５−ＦＣ、○：Ｌ６−ＣＤ＋５−ＦＣまたは■：１Ｆ５
−ＣＤ＋５−ＦＣで処理したＨ２９８１腫瘍細胞のタン
パク質中への 3Ｈ−ロイシン取込みのパーセント阻止を
示す比較図である。グラフは５−ＦＣ単独で処理して認
められた活性に比べて腫瘍細胞をＬ６−ＣＤ結合体で前
処理し次に５−ＦＣ処理したときに認められた細胞障害
性活性の増加を示す。
【００１６】本発明は細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給
する新規な方法に関し、癌例えば癌腫および黒色腫、並
びに他の腫瘍の治療における腫瘍細胞の高い選択的殺害
を与える。本発明の方法によれば、抗体−酵素結合体が
腫瘍をもつ哺乳動物宿主に投与される。この抗体−酵素
結合体は、親薬物よりも腫瘍細胞に対する細胞障害性の
低いプロドラッグを一層活性な親薬物に転化できる酵素
に結合した腫瘍特異性抗体からなる。宿主中に導入され
ると腫瘍細胞上に認められる抗原と反応性である結合体
の抗体成分が結合体を腫瘍の部位に向かわせて腫瘍細胞
に結合する。従って抗体が腫瘍の部位に酵素を供給する
と考えることができる。次いで酵素に対する基質である
プロドラッグが宿主に導入され、腫瘍部位で酵素により
活性な細胞障害性薬物に転化される。従って薬物が細胞
外で活性化され、その部位ですべての腫瘍細胞、すなわ
ち結合体の抗体が特異性であり抗体が結合する特定腫瘍
抗原をもつ細胞並びにその抗原に陰性であるがしかしそ
れにもかかわらず腫瘍の部位に存在する細胞、中へ拡散
することができる（図１参照）。従って、本発明の方法
は腫瘍抗原不均一性および普通の免疫結合体薬物供給技
術に関連する抗原／結合体の内在化する必要性の現在の
問題を克服する。
【００１７】さらに、この方法は薬物が抗体に直接結合
する必要がなく、従って供給できる薬物の量が制限され
ないので腫瘍部位における薬物抗力の陳腐な問題を生じ
ない。事実この方法は、結合体の抗体結合酵素が多くの
基質の代謝回転を行なうことができプロドラッグを活性
薬物に反復転化するので、腫瘍部位に存在する活性薬物
分子の数を増幅する。さらに、この方法は他の組織にお
ける遊離と対照して腫瘍部位に特異的に活性薬物を遊離
できる。これは、腫瘍細胞が抗体−酵素結合体でコート
されるために腫瘍部位における酵素の濃度が他の組織に
おけるその濃度より高いためである。
【００１８】本発明の免疫結合体の抗体成分には腫瘍関
連抗原に特異的に結合する任意の抗体が含まれる。その
ような抗体の例には癌腫、黒色腫、リンパ腫、並びに骨
および軟組織肉腫並びに他の腫瘍上に認められる抗原に
特異的に結合するものが含まれ、しかしそれらに限定さ
れない。細胞表面に結合して長時間保持されるかまたは
非常に徐々に内在化される抗体が好ましい。これらの抗
体は多クローン性または、好ましくは単クローン性であ
ることができ、無傷抗体分子あるいは抗体の活性結合領
域を含むフラグメント例えばＦabまたはＦ(ab')2である
ことができ、よく確立された技術を用いて製造すること
ができる（例えば、デウェガー(R. A. DeWeger) ほか、
「クロラムブシル−抗体複合体によるマウスリンパ腫お
よび黒色腫細胞の根絶」、イムノロジカル・レビューズ
(Immunological Rev.) 、６２、ｐｐ．２９〜４５（１
９８２）（腫瘍特異性多クローン性抗体が生成され、結
合体に使用される）；イエー（M. Yeh) ほか、「単クロ
ーン性抗体により確認されたヒト黒色腫の細胞表面抗
原」、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）、７６、ｐ．２９２７（１９７９）；ブラウン (J.
P. Brown)ほか、「単クローン性抗体によるヒト黒色腫
関連抗原ｐ９７の構造確認」、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー (J. Immunol.)、１２７（No. ２）、ｐｐ．５
３９〜５４６（１９８１）（生成された腫瘍特異性単ク
ローン性抗体）；およびマーク (J. P. Mach) ほか、
「結腸癌映像化の改良：多クローン性抗ＣＥＡ抗体およ
び静止フォトスキャンニングから単クローン性Ｆabフラ
グメントおよびＥＣＴに」、モノクローナル・アンティ
ボディーズ・フォ・カンサー・デテクション・アンド・
セラピー (Monoclonal Antibodies for Cancer Detecti
on and Therapy) 、ボルドウィン (Baldwin)ほか編、ｐ
ｐ．５３〜６４、アカデミック・プレス (Academic Pre
ss) （１９８５）（抗体フラグメントの生成および腫瘍
細胞への局在化に対する使用）参照〕。さらに、単クロ
ーン性抗体が使用されれば、抗体はマウスまたはヒト由
来またはキメラ抗体であることができる〔例えば、オイ
(V. T. Oi) 「キメラ抗体」、バイオテクニクス (Biot
echniques)、４（No. ３）、ｐｐ．２１４〜２２１（１
９８６）参照〕。
【００１９】本発明の免疫結合体の酵素成分にはプロド
ラッグにそれをその一層活性な細胞障害性形態に転化す
るように作用することができる任意の酵素が含まれる。
本明細書に用いた「プロドラッグ」という語は親薬物に
比べて腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、一層活性な
親形態に酵素的に活性化または転化されることができる
薬学的に活性な物質の前駆物質または誘導体形態を示す
〔例えば、ウイルマン(D.E.V. Wilman, 〔癌化学療法に
おけるプロドラッグ」、バイオケミカル・ソサイエティ
ー・トランスアクションズ (Biochemical Society Tran
sactions) 、１４、ｐｐ．３７５〜３８２〔第６１５会
議（６１５th Meeting, Belfast)１９８６〕およびステ
ラ (V. J. Stella) ほか、「プロドラッグ：標的指向薬
剤供給に対する化学的方法」、ディレクテッド・ドラグ
・デリベリー (Directed Drug Derivery) 、ボルチャー
ト (R. Borchardt) ほか編、ｐｐ．２４７〜２６７、ヒ
ュマナ・プレス (Humana Press）１９８５参照〕。
【００２０】本発明の方法に有用な酵素にはホスフェー
ト含有プロドラッグの遊離薬物への転化に有用なアルカ
リ性ホスファターゼ、サルフェート含有プロドラッグの
遊離薬物への転化に有用なアリールスルファターゼ、非
毒性５−フルオロシトシンの抗癌薬５−フルオロウラシ
ルへの転化に有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含
有プロドラッグの遊離薬物への転化に有用なプロテアー
ゼ例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチ
リシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例
えばカテプシンＢおよびＬ）、Ｄ−アミノ酸置換基を含
むプロドラッグの転化に有用なＤ−アラニルカルボキシ
ペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグの遊離薬物の
転化に有用な炭水化物開裂酵素例えばβ−ガラクトシダ
ーゼおよびノイラミニダーゼ、β−ラクタムで誘導体化
した薬物の遊離薬物への転化に有用なβ−ラクタマー
ゼ、並びにペニシリンアミダーゼ例えばそれらのアミン
窒素においてフェノキシアセチルまたはフェニルアセチ
ル基でそれぞれ誘導体化した薬物の遊離薬物への転化に
有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミ
ダーゼが含まれ、しかしそれらに限定されない。あるい
はまたアブチーム (abzyme) として知られる酵素活性を
有する抗体を本発明のプロドラッグの遊離活性薬物への
転化に使用することができる〔例えば、マセイ (R. J.
Massey) 、ネーチャー (Nature) 、３２８、ｐｐ．４５
７〜４５８（１９８７）参照〕。抗体−アブチーム結合
体は腫瘍細胞集団に対するアブチームの供給のためにこ
こに記載のように調製することができる。
【００２１】同様に、本発明のプロドラッグには前記プ
ロドラッグ、例えばホスフェート含有プロドラッグ、チ
オホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プ
ロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸
変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラ
クタム含有プロドラッグ、場合により置換されているこ
とができるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグま
たは場合により置換されていることができるフェニルア
セトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンお
よび結合体の酵素により一層活性な細胞障害性遊離薬物
に転化されることができる他の５−フルオロウリジンプ
ロドラッグが含まれ、しかしそれらに限定されない。本
発明に用いるプロドラッグに誘導体化できる細胞障害性
薬物の例にはエトポシド (etoposide)、テニポシド (te
niposide) 、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カル
ミノマイシン (carminomycin) 、アミノプテリン、ダク
チノマイシン、マイトマイシン、シス−プラチン (cis-
platinum) およびシス−プラチン類似体、プレオマイシ
ン、エスペラミシン (esperamicin)〔米国特許第4,675,
187 号参照〕、５−フルオロウラシル、メルファラン並
びに他の関連ナイトロジエンマスタードが含まれ、しか
しそれらに限定されない。
【００２２】本発明の酵素は、よく知られた技術例えば
ヘテロ二官能架橋剤、ＳＰＤＰ〔３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル〕またはＳＭ
ＣＣ〔４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボン酸スクシンイミジル〕の使用により本発明
の抗体に共有的に結合させることができる〔例えば、ソ
ープ (P. E. Thorpe) ほか、「抗体−毒素結合体の調製
および細胞障害性」、イムノロジカル・レビューズ (Im
munological Rev.) 、６２、ｐｐ．１１９〜５８（１９
８２）；ランベルト (J. M. Lambert)ほか、前掲、ｐ１
２０３８；ローランド (G. F. Rowland)ほか、前掲、ｐ
ｐ１８３〜８４およびガレゴ (J. Gallego) ほか、前
掲、ｐｐ．７３７〜３８参照〕。あるいは、本発明の酵
素の少くとも機能的に活性な部分に結合した本発明の抗
体の少くとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、よ
く知られた組換えＤＮＡ技術を用いて構築することがで
きる〔例えば、ノイバーガー (M. S. Neuberger)ほか、
ネーチャー (Nature) 、３１２、ｐｐ．６０４〜６０８
（１９８４）参照〕。これらの融合タンパク質はここに
記載する抗体−酵素結合体と実質的に同様に作用する。
【００２３】本発明の好ましい態様によれば、ヒト癌抗
原に特異性の抗体が酵素、アルカリ性ホスファターゼに
結合され、本発明の方法によりエピポドフィロトキシン
グルコシドの４′−ホスフェート誘導体の活性抗癌薬へ
の転化に使用された。そのような誘導体にはエトポシド
−４′−ホスフェート、エトポシド−４′−チオホスフ
ェートおよびテニポシド−４′−ホスフェートが含まれ
る（これらの誘導体の構造には図３参照：テニポシド誘
導体は示された構造の糖部分上のメチル基の代りに２−
チエニル基を有する）。本発明の他の態様はホスフェー
ト部分がグルコシド上の他のヒドロキシル基に配置され
たグルコシドのホスフェート誘導体を含むことができ
る。しかし、より好ましい態様によれば、本発明におい
てプロドラッグとして使用されるホスフェート誘導体は
エトポシド−４′−ホスフェートまたはエトポシド−
４′−チオホスフェートである。本発明によって、アル
カリ性ホスファターゼＡＰを、単クローン性抗体Ｌ６、
ヒト肺癌細胞上の糖タンパク質抗原に結合するIgＧ２ａ
抗体〔ヘルストロム (I.Hellstrom) ほか、「多くの癌
腫と反応するIgＧ２ａ抗体、Ｌ６の抗腫瘍効果」、プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)ＵＳＡ、８
３、ｐｐ．７０５９〜６３（１９８６）〕、に共有的に
結合させた。生じた免疫結合体は非結合酵素と比べたと
きに酵素活性の低下を示さなかった。さらに、Ｌ６抗体
の結合活性の大部分が免疫結合体中に保存された。
【００２４】試験管内細胞毒性検定を用いて我々は、ヒ
ト癌腫細胞系の細胞をＬ６−ＡＰ免疫結合体で処理し、
次いで細胞をエトポシドホスフェートプロドラッグに暴
露すると、これらの癌細胞に対するエトポシド単独の使
用に匹敵する細胞毒性を生じたことを実証した。対照的
に、エトポシドホスフェート単独はわずかの細胞毒性を
示した。さらに、我々のヌードマウスにおける生体内研
究はＬ６−ＡＰ免疫結合体がＬ６陽性腫瘍異種移植片に
局在化することを示した。これらの腫瘍の組織学的評価
は、標的指向ＡＰ酵素が腫瘍塊全体に分布したことを示
した。さらに、Ｌ６−ＡＰ免疫結合体は、結合体を皮下
Ｌ６陽性腫瘍をもつヌードマウスに投与し、次いでエト
ポシドホスフェートプロドラッグで処置した治療実験に
おいて強い生体内抗腫瘍活性を示した。この処置の抗腫
瘍効果は若干の腫瘍の完全な退行を包含し、プロドラッ
グまたは親薬物単独による処置の効果より優れていた。
【００２５】本発明の他の好ましい態様によれば、Ｌ６
−ＡＰ免疫結合体を新規マイトマイシンホスフェートプ
ロドラッグの活性マイトマイシン薬物への転化に用い
た。エトポシドホスフェートプロドラッグの場合のよう
に、結合体のＡＰ酵素がプロドラッグからホスフェート
基を除去し、活性抗腫瘍物質を遊離する。本発明のマイ
トマイシンホスフェートプロドラッグはマイトマイシン
ＣまたはポリフイロマイシンのＮ7 −Ｃ1-8 アルキルホ
スフェート誘導体またはその薬学的に許容される塩であ
ることができる。Ｎ7 は親薬物のマイトサン (mitosan
e) の７位に結合した窒素原子を示す。より好ましい態
様によれば、使用される誘導体は７−（２′−アミノエ
チルホスフェート）マイトマイシン（「ＭＯＰ〕）であ
る（マイトマイシンＣおよび二ナトリウム塩形態のＭＯ
Ｐの構造には図１２参照；ＭＯＰに相当するポルフイロ
マイシン誘導体はマイトマイシンＣのアジリジン窒素上
にメチル基を有する）。あるいは、ＭＯＰ化合物は９ａ
−メトキシ−７−〔〔（ホスホノオキシ）エチル〕アミ
ノ〕マイトサン二ナトリウム塩と称することができる。
本発明の他の態様はプロドラッグとしてＮ7 −アルキル
マイトマイシンホスホロチオアート類の使用を含むこと
ができる。試験管内研究は、ヒト肺腫瘍系の細胞をＬ６
−ＡＰ免疫結合体により処理し、次に細胞をＭＯＰに暴
露すると、認められている抗腫瘍物質のマイトマイシン
単独の腫瘍細胞に対する使用に匹敵する細胞毒性を生じ
たことを示した。マイトマイシンホスフェートプロドラ
ッグ単独の腫瘍細胞に対する使用はわずかの細胞毒性を
生じた。同様に、Ｌ６−ＡＰ免疫結合体は、ヒト肺腫瘍
をもつヌードマウスに結合体を投与し、次いでマイトマ
イシンホスフェートプロドラッグで処置した治療試験に
おいて顕著な生体内抗腫瘍効果を示した。この抗腫瘍効
果はプロドラッグ単独、親薬物単独または非結合性抗体
−ＡＰ結合体とともに与えたプロドラッグの使用で認め
られたものより大きかった。
【００２６】本発明のなお他の態様において、ペニシリ
ンアミダーゼ酵素をＬ６単クローン性抗体に共有的に結
合させ、生じた免疫結合体を新規アドリアマイシンプロ
ドラッグの活性抗腫瘍薬アドリアマイシンへの転化に用
いた。用いた特定アミダーゼはフサリウム・オキシスポ
ルム (Fusarium oxysporum) から分離されたフェノキシ
アセチルアミド結合を加水分解するペニシリンＶアミダ
ーゼ（「ＰＶＡ」）であった。従って、用いた特定のプ
ロドラッグはＮ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチ
ル）アドリアマイシン（「ＡＰＯ」）であり、それはア
ミダーゼにより加水分解されて強力な抗腫瘍物質、アド
リアマイシン、を遊離した。Ｌ６−ＰＶＡ免疫結合体は
非結合酵素と比べたときに酵素活性の低下を示さず、Ｌ
６抗体の結合活性の大部分が結合体中に保存された。我
々の試験管内研究によれば、ヒト肺腫瘍細胞をＬ６−Ｐ
ＶＡ結合体で処理し、次いで細胞をＡＰＯプロドラッグ
に暴露すると細胞をアドリアマイシン単独で処理して認
められたものに匹敵する細胞毒性を生じた。重要なこと
には、ＡＰＯプロドラッグ単独が腫瘍細胞に対し非常に
少ない細胞毒性を示した。同様の試験管内研究はまた、
ＰＶＡ酵素を１Ｆ５、リンパ腫細胞に認められる抗原と
反応性の単クローン性抗体、に結合させた１Ｆ５−ＰＶ
Ａ結合体を用いて行なった。ドージリンパ腫細胞を１Ｆ
５−ＰＶＡ結合体で処理し、次いで細胞をＡＰＯに暴露
するとアドリアマイシン単独で処理して認められたもの
に匹敵する細胞毒性を生じたが、ＡＰＯ単独による細胞
の処理は非常に小さい細胞毒性を生じた。
【００２７】新規アドリアマイシンプロドラッグ、Ｎ−
（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アドリアマイシ
ンの合成および使用がここに記載されているけれども、
本発明には実質的に同様に誘導できる他の関連アドリア
マイシンプロドラッグの合成および使用が含まれること
を理解すべきである。例えばプロドラッグ、Ｎ−（フェ
ノキシアセチル）アドリアマイシンはまた、そのプロド
ラッグがここに記載したプロトコルを用い、しかし反応
物ｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸（後記実施例４参照）
をフェノキシ酢酸にかえることにより合成できるので本
発明の範囲内にある。さらに、本発明のアドリアマイシ
ンプロドラッグにはアドリアマイシンの、例えばフェニ
ル環の異なる位置で置換した他のＮ−ヒドロキシフェノ
キシアセチル誘導体、並びにここに記載したヒドロキシ
ル基以外の置換基をフェニル環上に含むＮ−フェノキシ
アセチル誘導体が含まれることを理解すべきである。
【００２８】さらに、この態様は免疫結合体の酵素成分
として他のアミダーゼ、例えばペニシリンＧアミダー
ゼ、並びに個々のアミダーゼがプロドラッグを活性抗腫
瘍形態に加水分解できるように相応する誘導体にした他
のプロドラッグを包含する。例えば、ペニシリンＧアミ
ダーゼを酵素として用いるとき、プロドラッグがフェニ
ルアセチルアミド基を（ＡＰＯのフェノキシアセチルア
ミド基とは対照的に）含むべきであり、これはペニシリ
ンＧアミダーゼがこの型のアミド結合を加水分解するか
らである〔例えば、マルゴリン (A. L. Margolin) ほ
か、ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ (Biochim.
Biophys. Acta) 、６１６、ｐｐ．２８３〜８９（１９
８０）参照〕。従って、本発明の他のプロドラッグには
Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェニルアセチル）アドリアマイ
シン、Ｎ−（フェニルアセチル）アドリアマイシンおよ
びアドリアマイシンの他の適当に置換したＮ−フェニル
アセチル誘導体が含まれる。
【００２９】本発明が親薬物のアミン基をフェノキシ酢
酸、フェニル酢酸または他の関連酸のカルボキシル基と
反応させることにより誘導される任意のプロドラッグを
含むことを理解すべきである。従って、誘導体にでき、
ここに記載したアドリアマイシンプロドラッグと実質的
に同様に作用するアドリアマイシン以外のアントラシク
リン類のプロドラッグは本発明の範囲内に属する。例え
ば、本発明に従って製造し、使用できる他のプロドラッ
グにはアントラシクリン例えばダウノマイシンおよびカ
ルミノマイシンのヒドロキシフェノキシアセチルアミド
誘導体、ヒドロキシフェニルアセチルアミド誘導体、フ
ェノキシアセチルアミド誘導体およびフェニルアセチル
アミド誘導体が含まれる。他のアミン含有薬物例えばメ
ルファラン、マイトマイシン、アミノプテリン、プレオ
マイシンおよびダクチノマイシンもまたここに記載のよ
うに変性して本発明のプロドラッグを生成させることが
できる。従って、本発明が式ＩおよびII：
【００３０】
【化５】 （式中、Ｒ1 がＨであり、Ｒ3 がＯＨまたはＯＣＨ3 で
あるか、あるいはＲ1 がＯＨであり、Ｒ3 がＯＣＨ3 で
あり、Ｒ2 はＨまたはＯＨである）
【００３１】
【化６】 （式中、Ｒ1 がＨであり、Ｒ3 がＯＨまたはＯＣＨ3 で
あるか、あるいはＲ1 がＯＨであり、Ｒ3 がＯＣＨ3 で
あり、Ｒ2 はＨまたはＯＨである）を有する化合物を包
含することが明らかである。
【００３２】本発明のなお他の好ましい態様には酵素、
シトシンデアミナーゼ（「ＣＤ）」のＬ６単クローン性
抗体に対する結合体が含まれる。そのデアミナーゼ酵素
は５−フルオロシトシン（「５−ＦＣ」）、抗腫瘍活性
のない化合物、の強力な抗腫瘍薬、５−フルオロウラシ
ル（「５−ＦＵ」）への転化を触媒する（図２６参
照）。従って、本発明のＬ６−ＣＤ免疫結合体をプロド
ラッグ５−ＦＣの５−ＦＵへの転化に用いると試験管内
で腫瘍細胞に対する有意な細胞障害効果を生じた。前記
本発明の免疫結合体に対して真実であったように、Ｌ６
−ＣＤ結合体は結合に基づく酵素または結合活性の有意
な低下を示さなかった。さらに、我々の試験管内研究
は、ヒト肺腫瘍細胞をＬ６−ＣＤ結合体で処理し、次い
で細胞をプロドラッグ５−ＦＣに暴露すると、細胞を強
力な抗腫瘍薬５−ＦＵ単独で処理して認められたものに
等しい細胞障害効果を生じたことを示した。これらの腫
瘍細胞のプロドラッグ単独による処理は有意でない細胞
障害効果を生じた。
【００３３】ここに記載した広範なデータから、本発明
の免疫結合体／プロドラッグの組合せが、細胞障害活性
の低下したプロドラッグが投与されて抗体標的指向酵素
の存在に基づきプロドラッグが腫瘍細胞の部位で高細胞
障害性状態に転化される腫瘍細胞を殺す選択的機構を与
えることが明らかである。さらに、この方法により達成
される細胞毒性は、腫瘍部位で遊離された活性薬物が前
記のように抗体−薬物結合体供給系に伴う物理的制約に
より妨げられないので普通の抗体標的指向技術に比べて
増大される。従って、本発明の方法が癌および他の腫瘍
の治療において腫瘍細胞に関する選択的細胞毒性を増大
する方法を提供することが明らかである。
【００３４】本発明の方法の他の態様によれば、若干の
プロドラッグおよび単に単一の抗体−酵素結合体を用い
る組合せ化学療法の方法が提供される。この態様によれ
ば、すべて免疫結合体中の同一酵素に対する基質である
多数のプロドラッグが使用される。従って、特定の抗体
−酵素結合体が多数のプロドラッグを細胞障害性形態に
転化し、腫瘍部位に高い高腫瘍活性を生ずる。例えば、
ヒト肺腫瘍をもつヌードマウスに本発明のＬ６−ＡＰ免
疫結合体を投与し次いで一緒に与えた新規プロドラッグ
の組合せ、すなわちエトポシドホスフェートプロドラッ
グおよびマイトマイシンホスフェートプロドラッグで処
置した生体内研究で顕著な抗腫瘍効果が得られた。同様
に、エトポシドホスフェート、アドリアマイシンホスフ
ェート（米国特許第4,185,111 号参照）および５−フル
オロウリジンモノホスフェート〔例えば、ヘイデルバー
ガー (C. Heidelberger)ほか、「フッ素化ピリミジンお
よびそれらのヌクレオシド」、アドバンシス・イン・エ
ンチモロジー・アンド・リレーテッド・エリアズ・オブ
・モレキュラー・バイオロジー (Adv. Enzymol. Relat.
Areas Mol. Biol.)、５４、ｐｐ．５７〜１１９（１９
８３）参照〕の、抗腫瘍抗体−ＡＰ結合体による処置後
の投与が腫瘍の部位に強力な抗腫瘍薬、すなわちエトポ
シド、アドリアマイシンおよび５−フルオロウリジン、
の組合せの形成を生じる。
【００３５】他の態様によれば、結合体の酵素成分が変
化する多くの異なる免疫結合体が使用される。各免疫結
合体はそのそれぞれのプロドラッグまたはプロドラッグ
類を腫瘍部位で細胞障害性形態に転化させるために使用
できる。例えば、抗腫瘍抗体をＡＰに結合させて１結合
体を形成することができ、シトシンデアミナーゼに結合
させて他の結合体を形成することができる。次いで両免
疫結合体を、腫瘍をもつ宿主に投与すると抗体特異性に
より腫瘍部位で腫瘍抗原に結合する。プロドラッグ、エ
トポシドホスフェートおよび５−フルオロシトシンを投
与するとエトポシドおよび５−フルオロウラシル（とも
に強力な抗腫瘍物質）の形成を腫瘍部位で生ずる。
【００３６】本発明のなお他の態様には結合体の抗体成
分の特異性が変動する多くの免疫結合体の使用が含ま
れ、すなわち、それぞれが問題の腫瘍上の異なる抗原に
特異的に結合する抗体を有する多くの免疫結合体が使用
される。これらの免疫結合体の酵素成分は同一であるこ
とができ、または異なることができる。この態様は、腫
瘍の表面上の種々の抗原の量が未知であり、十分な酵素
を腫瘍部位に標的指向させることを確実にすることを望
む状態において殊に有用であることができる。腫瘍に対
して異なる抗原特異性をもつ多くの結合体の使用はプロ
ドラッグまたは一連のプロドラッグの転化に十分な酵素
を腫瘍部位に得る可能性を増大する。さらにこの態様
は、正常組織が同様の腫瘍関連抗原のすべてをもつ可能
性が低い〔ヘルストロム (I. Hellstrom) ほか、「黒色
腫抗原ｐ９７の２決定基に対する単クローン性抗体の補
体依存性細胞毒性における相乗的な作用」、ジャーナル
・オブ・イムノロジー (J. Immunol.)、１２７（No.
１）、ｐｐ．１５７〜１６０（１９８１）参照〕ので腫
瘍に対する高度の特異性の達成に重要である。本発明は
また癌および他の腫瘍を治療するための薬学的組成物、
組合せおよび方法を包含する。より詳しくは、本発明は
哺乳動物宿主を薬学的に有効な量の抗体−酵素結合体ま
たは結合体類、並びに薬学的に有効な量のプロドラッグ
またはプロドラッグ類で薬学的に許容される方法で処置
する腫瘍の治療法に使用する本発明の抗体−酵素結合体
およびプロドラッグまたはプロドラッグ類を含む組合せ
を包含する。本発明の組合せおよび方法はヒト、イヌ、
ネコおよびウマを含めて任意の動物の治療に有用であ
る。
【００３７】好ましい態様によれば、抗体−酵素結合体
がプロドラッグの導入の前に宿主に投与される。結合体
およびプロドラッグの投与の間に結合体の抗体が腫瘍部
位に標的指向し、酵素を局在化させる十分な時間を許容
すべきである。そのような十分な時間は使用される結合
体により１２時間〜１週間の範囲内にあることができ
る。本発明の結合体およびプロドラッグは静脈内、腹腔
内、経口、リンパ管内または腫瘍内の直接投与を含み、
それらに限定されない普通の投与方法を用いて投与する
ことができる。静脈内投与が好ましい。免疫結合体また
はプロドラッグを含む本発明の組成物は液体溶液または
懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、座剤、ポリマーマイクロカ
プセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、および注
射可能または注入可能溶液を含み、しかしそれらに限定
されない種々の剤形であることができる。好ましい形態
は投与および治療適用の方法による。例えば、抗体−酵
素結合体の経口投与は、結合体タンパク質が経口的に、
例えば錠剤形態で摂取されれば胃中で分解する傾向であ
るので有利でないかもしれない。
【００３８】結合体またはプロドラッグ組成物はまた、
好ましくは普通の薬学的に許容される担体および公知の
佐剤例えばヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミ
ナ、レシチン、緩衝物質例えばリン酸塩、グリシン、ソ
ルビン酸、ソルビン酸カリウムおよび塩または電解質例
えば硫酸プロタミンを包含する。本発明の組成物の投与
および用法の最も有効な方法は疾患の状態および経過、
患者の健康、治療に対する応答、並びに処置医師の判断
に依存する。従って、免疫結合体およびプロドラッグの
用量は個々の患者に対し決定すべきである。それにもか
かわらず、本発明の抗体−酵素結合体の有効量は約1.０
〜約１００mg／kgの範囲内にあることができる。本発明
のプロドラッグの有効量は使用される個々のプロドラッ
グ、誘導される親薬物に依存する。プロドラッグは親薬
物より細胞障害性が少ないので、親薬物に認められる量
以上の用量を用いることができる。例えば、エトポシド
プロドラッグの有効量は約７５〜５００mg／kgの範囲内
にあることができる。マイトマイシンホスフェートプロ
ドラッグの有効量は約５０〜1,０００mg／kgの範囲内に
あることができる。アドリアマイシンプロドラッグの有
効量は約１５〜１５０mg／kgの範囲内にあることができ
る。また５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロ
ウリジンプロドラッグの有効量は約６００〜2,０００mg
／kgの範囲内にあることができる。
【００３９】
【実施例】ここに記載した本発明が一層十分に理解され
るために次の実施例が示される。これらの実施例は単に
例示目的のためであり、決して本発明の範囲を限定する
と解すべきでないことを理解すべきである。 実施例１ 次の実施例は本発明の免疫結合体および方法の抗体結合
アルカリ性ホスファターゼによるエトポシドホスフェー
トプロドラッグのエトポシドへの転化に対する使用並び
に生ずる腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性および本発
明の方法の使用による生体内抗腫瘍効果を示す。本発明の抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製 この実施例において、酵素、アルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）に結合した単クローン性抗体Ｌ６、９6.５また
は１Ｆ５を含む３免疫結合体を調製して研究した。Ｌ６
はヒト肺癌細胞上の糖タンパク質抗原に対し特異性でれ
に結合するIgＧ２ａのサブクラスの単クローン性抗体で
ある〔ヘルストロム (I. Hellstrom) ほか、（１９８
６）前掲参照〕。９6.５はｐ９７（黒色腫関連抗原）に
対し特異性である単クローン性IgＧ２ａ抗体である〔ブ
ラウン (J. P. Brown)ほか、「ヒト黒色腫関連抗原ｐ９
７の単クローン性抗体による構造確認」、ジャーナル・
オブ・イムノロジー (J. Immunol.)、１２７（No.
２）、ｐｐ．５３９〜４６（１９８１）参照〕。１Ｆ５
は正常および腫瘍Ｂ細胞上のＣＤ−２０抗原に特異性で
ある単クローン性IgＧ２ａの抗体である〔クラーク (E.
A. Clark)ほか、「ヒトＢ細胞活性化におけるＢｐ３５
細胞表面ポリペプチドの役割）、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、８２、ｐｐ．１７
６６〜７０（１９８５）参照〕。Ｌ６単クローン性抗体
を産生するＬ６ハイブリドーマは、１９８７年１月１４
日に公表さらた欧州特許出願第２０７９６３号の提出に
関連してアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ）に受託番号ＨＢ８６７７で寄託された。
１Ｆ５単クローン性抗体を産生する１Ｆ５ハイブリドー
マは１９８８年２月１２日にＡＴＣＣNo. ＨＢ９６４５
でＡＴＣＣに寄託された。９6.５単クローン性抗体は市
販されている。
【００４０】抗体−酵素結合体はランバート (J. M. La
mbert)ほか、「ヒトリンパ系細胞と反応性の精製免疫毒
素」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー (J. Biol. Chem.) 、２６０（No. ２２）、ｐｐ．１
２０３５〜１２０４１（１９８５）に記載されたものに
類似する方法を用いてチオエーテル結合によりＡＰを単
クローン性抗体Ｌ６、９6.５又は１Ｆ５に共有的に結合
させることにより調製した。１実験プロトコルによれ
ば、結合体Ｌ６−ＡＰおよび９6.５−ＡＰは次のように
調製された：我々は２−イミノチオラン（0.５Ｍトリエ
タノールアミン塩酸塩と１０ mＭ−ＥＤＴＡ、 pＨ8.０
中５０ mＭ）をＬ６または９6.５抗体の8.０mg／ｍl 溶
液（５０ mＭトリエタノールアミン塩酸塩および１ mＭ
−ＥＤＴＡ中 pＨ8.０）に２−イミノチオランの最終濃
度が1.３ mＭであるように加えた。０℃で９０分後に、
pＨ7.２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を溶離剤とし
て用いるセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５上のゲル
濾過により反応を停止させた。抗体と２−イミノチオラ
ンとの反応はスルフヒドリル基を導入し、その後はエル
マン (Ellman) の試薬〔リドレス (P. W. Riddles)ほ
か、「エルマンの試薬：５，５′−ジチオビス（２−ニ
トロ安息香酸）−再試験」、アナリティカル・バオケミ
トリー (Analytical Biochemistry ），９４，ｐｐ．７
５〜８１（１９７９）参照〕を用いて1.９〜3.５である
と測定された。
【００４１】１００ mＭリン酸塩緩衝液、 pＨ7.０中の
アルカリ性ホスファターゼ〔仔ウシ腸、ベーリンガー・
マンハイム (Boehringer Mannheim)製、１０ mｇ／ｍl
〕に４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭ
ＣＣ）〔ピアス・ケミカル社 (Pierce Chemical Co.)
製、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０ mＭ〕を、
最終スルホ−ＳＭＣＣの濃度が2.４ mＭであるように加
えた。３０℃で３０分後に、修飾された酵素をＧ−２５
セファデックス上のゲル濾過により精製し、ＰＢＳで溶
出させた。次いで修飾されたＡＰをチオール化抗体に
２：１のモル比に加えた。ＡＰとスルホＳＭＣＣとの反
応はマレイミド基を酵素中へ導入し、それが各修飾抗体
上のスルフヒドリル基と反応すると抗体とＡＰとの間に
チオエーテル結合の形成を生じた。残留未反応チオール
をブロックするために反応時間１時間後にヨードアセト
アミド（最終濃度１ mＭ）をタンパク質溶液に加えた。
結合体をセフアクリル（Sephacryl)Ｓ−３００カラム上
でＰＢＳを溶離剤として用いて精製した。フラクション
を２８０ nｍでモニターし、各フラクション（６4.００
０倍に希釈）のＡＰ活性をｐ−ニトロフェニルホスファ
ートを基質として用いて pＨ9.５で検定した〔チイセン
(P. Tijssen) 、ラボラトリー・テクニクス・イン・バ
イオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジ
ー (Laboratory Techniques In Biochemistry and Mole
cular Biology)、ｐｐ．３６６〜６７、エルセビーア・
プレス (Elsevier Press) （１９８５）〕。適当な水準
のＡＰ−抗体比を有する結合体を含むフラクションを５
〜１2.５％勾配ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定し
（図２参照）、次いでプールした。タンパク質濃度は、
抗体およびＡＰの0.１％溶液がそれぞれ1.４および0.７
６ＯＤを吸収する２８０ nｍで測定した。ゲル上の結合
体の分析はそれらが主に抗体と酵素との１：１比からな
ることを示した。ゲルに用いた変性条件下で、分子量１
４０ｋd のホモダイマーとして天然に存在するＡＰが７
０ｋd の単一バンドとして移動する。この７０ｋd タン
パク質バンドはこれらのカラム中のゲル上に観察され、
それはまた酵素のサブユニットの１つが共有的に結合し
た抗体−酵素結合体から解離したので高分子量の結合体
バンドを含有した（図２レーンＡおよびＢ参照）。Ｓ−
３００セフアクリルカラム上のゲル濾過は結合体調製物
中に遊離酵素が存在しなかったことを示した。
【００４２】我々はまた本発明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ
５−ＡＰ結合体の調製に第２の類似の実験プロトコルを
用い、抗体をイミノチオラン（0.５ mＭ）で修飾して単
一遊離チオール基を導入し、ＡＰを４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシン
イミジル（ＳＭＣＣ）（ピアス・ケミカル社 (PierceCh
emical Co., Rockford, IL)製〕でＳＭＣＣの最終濃度
が0.１ mＭであるように修飾した。次いで修飾タンパク
質を混合し、生じた結合体をＳ−３００セフアクリル上
のゲル濾過により精製した。次のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
はこれらの結合体調製物が非結合タンパク質および凝集
体を含まないことを示した。前記のように、調製物のタ
ンパク質濃度は、抗体（分子量：１６０ｋd ）およびＡ
Ｐ（分子量：１４０ｋd ）の１ mｇ／ｍl 溶液がそれぞ
れ1.４および0.７６ＯＤ単位を吸収する２８０ｎm にお
ける吸光度により測定した。
【００４３】プロドラッグ、エトポシドホスフェートお
よびエトポシドチオホスフェートの調製 本発明の方法の次の段階によれば、各抗体−酵素結合体
を新規エトポシドホスフェートまたはエトポシドチオホ
スフェートプロドラッグと反応させた。より詳しくは、
用いたプロドラッグはそれぞれ図３に示される式を有す
るエトポシドの４′−リン酸二ナトリウムエスエルおよ
びエトポシドの４′−チオリン酸二ナトリウムエステル
であった。エトポシドホスフェートおよびエトポシドチ
オホスフェートはエトポシドとそれぞれ塩化ホスホリル
または塩化チオホスホリルとを反応させ、それぞれジク
ロロホスフェートまたはジクロロチオホスフェート中間
体を生成させることにより合成した。リン酸化反応は適
当な無水有機溶媒、例えばアセトニトリル、中で好まし
くは第三級アミン塩基例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエ
チルアミンの存在下に行なわれる。反応の経過は薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターし、それに
より最適反応時間を生成物の出現または出発物質の消失
あるいはその両方により判断することができる。我々の
経験によれば、反応は用いた含リン試薬の性質により約
４〜約７２時間要することができる。ジクロロホスフェ
ートまたはジクロロチオホスフェート中間体のそれぞれ
リン酸またはチオリン酸プロドラッグへの加水分解は水
中の炭酸水素ナトリウムの溶液（２０〜５０倍過剰）を
反応混合物に直接添加し、混合物を室温でそれぞれ1.５
または３時間かくはんすることにより行なった。酢酸エ
チルおよび水で分配させ、次いで水−メタノールを用い
て水層の逆相クロマトグラフィーを行なうと、凍結乾燥
または真空中の水性媒質の蒸発後に所望のプロドラッグ
が得られる。本発明の方法に１プロドラッグとして用い
たエトポシドの４′−リン酸二ナトリウム誘導体の調製
のより詳しい説明は次のとおりである：
【００４４】エトポシド〔ブリストル・マイヤーズ社
(Bristol-Myers Co.)製、2.３０ｇ、3.９１ミリモル〕
の乾燥アセトニトリル（２１０ｍl ）中の磁気かくはん
懸濁液を温ためてほぼ完全な溶液を与え、室温に冷却
し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（2.３６ｍl
、１3.5 ミリモル) を加えた。次いで混合物を０℃に
冷却し、塩化ホスホリルＰＯＣl3（６６６mg、4.３４ミ
リモル）をシリンジにより３０秒にわたって加えた。混
合物を徐々に２〜３時間にわたって室温になし、室温で
６３時間かくはんした。この時間の終りに反応混合物に
炭酸水素ナトリウム（6.０ｇ、７1.４ミリモル）の脱イ
オンＨ2 Ｏ（１１０ｍl ）中の溶液を加え、混合物を室
温で８０分間かくはんし、次いで飽和水性炭酸水素ナト
リウム（２０ｍl ）、脱イオンＨ2 Ｏ（１２５ｍl ）お
よび酢酸エチル（３５０ｍl ）で分配させた。有機層を
さらに脱イオンＨ2 Ｏ（１×５０ｍl ）で抽出し、水層
を合わせて酢酸エチル（２５０ｍl ）で洗浄し、次いで
室温で１時間、0.５mmの真空にかけて溶解溶媒を除去し
た。次いで水性部分を、メタノール中で充填しＨ2 Ｏと
平衡させたシリカゲルに結合したオクタデシルシラン
（Ｃ−１８）１５cmを含む直径４cmのカラムを適用し
た。すべての水性部分を適用した後、カラムをＨ2 Ｏ
（１７５ｍl ）で溶離して無機塩を除き、次いで生成物
を水中の２０％メタノールで溶出させた。0.５トルで溶
媒を濃縮すると純エトポシドホスフェート化合物７４４
mg（３６％）が無色固体として得られた。あるいは、凍
結乾燥すると純化合物が非常に綿毛状の低密度固体とし
て得られる。
【００４５】他の態様によれば、本発明のエトポシドホ
スフェートプロドラッグが次のように調製された：エト
ポシド（１0.５０ｇ、１7.８４ミリモル、Ｐ2 Ｏ5 上で
８０℃／0.５トルで乾燥）の乾燥アセトニトリル（４５
０ｍl ）中の磁気かくはん懸濁液にジイソプロピルエチ
ルアミン（4.２０ｍl 、２4.１ミリモル）を加えた。次
いでクロロリン酸ジフェニル（2.００ｍl 、9.６５ミリ
モル）をシリンジにより加えた。混合物をＮ2 下に５０
℃で２時間かくはんし、その時点でエトポシドがすべて
溶解した。さらにクロロリン酸ジフェニル（1.８０ｍl
、8.６８ミリモル）を加え、反応混合物を４５℃で７
２時間保持した。さらにアミン塩基（0.７５ｍl 、4.３
ミリモル）およびクロロリン酸ジフェニル（0.８０ｍl
、3.８６ミリモル）を加えた後、混合物を４０〜４５
℃で２７時間かくはんし、さらにクロロリン酸ジフェニ
ル（0.４０ｍl ）を加え、４０〜４５℃で２２時間維持
した。次いでイソプロパノール（２０ｍl ）を加え、溶
媒を真空で蒸発させ、固体残留物をＣＨ2 Ｃl2（５００
ｍl ）に溶解し、Ｈ2 Ｏ（４００ｍl ）で分配させた。
水層をさらにＣＨ2 Ｃl2（１００ｍl ）で抽出し、有機
抽出物を合わせてブライン（２５０ｍl ）で洗浄し、乾
燥した（Ｎａ2 ＳＯ4 ／ＭｇＳＯ4 ）。回転乾燥し、Ｃ
Ｈ2 Ｃl2中の２〜３％ＣＨ3 ＯＨを用いるシリカゲル上
のフラッシュクロマトグラフィーによりエトポシド−
４′−リン酸ジフェニル１2.５ｇ（８５％）が無色固体
として得られた。
【００４６】次に、新開封びん〔アルドリッチ・ケミカ
ル社（Aldrich Chemical Co.) 製〕の酸化白金（0.１９
８ｇ、0.８７ミリモル）をエトポシド−４′−リン酸ジ
フェニル（0.７９ｇ、0.９６２ミリモル）の無水エタノ
ール９５ｍl 中の溶液に加えた。溶液をパー (Parr) 装
置で４５〜５０ＰＳＩで室温で４時間水素化した。反応
混合物を、エタノールを溶離剤として用いてセライトの
バッドに通して濾過した。真空で濃縮し、Ｐ2 Ｏ5 上で
真空で１４時間乾燥するとエトポシド−４′−リン酸が
白色固体（0.６２７ｇ、９４％）として得られた。 FAB MS m/e 669 (M+H)+ IR (KBr) 3440, 2930, 1778, 1604, 1498 cm-1 1 H NMR (DMSO-d6)δ 6.93 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 6.1
2 (s, 2H), 5.94 (m,2H), 5.17 (bs, 1H), 4.86 (d, J=
3.93Hz, 1H), 4.64 (q, J=7.5. 5.8Hz, 1H),4.51-4.42
(m, 2H), 4.20 (d, J=10.7Hz, 1H), 4.01 (dd, J=12.1,
5.3Hz, 1H),3.51 (s, 6H), 3.51-2.75 (m, 7H), 2.83
(m, 1H), 1.16 (d, J=5.1Hz, 3H).13C NMR (DMSO-d6)δ
174.5, 151.2, 151.1, 147.7, 146.2, 126.1, 132.3,
128.8, 109.8, 109.7, 107.9, 101.5, 101.2, 98.5, 8
0.0, 74.3, 72.7, 71.7, 67.6, 67.2, 65.7, 55.8, 43.
0, 37.1, 20.2, 18.5. 元素分析：計算値 (C29H33O16P):0.85％ H2O: C, 50.9
5; H, 5.11 測定値: C, 51.42; H: 4.97.
【００４７】次いでエトポシド−４′−リン酸生成物2.
９０ｇ（4.３４ミリモル）に脱イオンＨ2 Ｏ（５０ｍl
）および固体炭酸水素ナトリウム（3.００ｇ、３5.７
ミリモル）を加えることによりエトポシド−４′−リン
酸をその二ナトリウム塩に転化した。混合物を室温で0.
５時間かくはんし、その時間の間にＣＯ2 の発生が止ん
だ。次いでこの混合物を前記態様に記載したようにＣ−
１８カラムに直接適用した。カラムを初めに脱イオンＨ
2 Ｏ（３００ｍl で溶離して過剰の塩を除き、次いで
４：１のＨ2 Ｏ／ＣＨ3 ＯＨで溶出させると凍結乾燥後
に純エトポシド−４′−リン酸二ナトリウム塩1.９０ｇ
（６１％）が綿毛状の白色固体として得られた。エトポ
シドの４′−リン酸またはチオリン酸二ナトリウム誘導
体は低細胞障害活性を有するエトポシドの高水溶性プロ
ドラッグを表わす。しかし、これらの化合物とアルカリ
性ホスファターゼとの反応はホスフェートまたはチオホ
スフェート部分を除去し、それぞれ強力な抗癌薬、エト
ポシドを遊離する（図３参照）。エトポシド−４′−ホ
スフェートおよびエトポシド−４′−チオホスフェート
をそれぞれアルカリ性ホスファターゼと反応させた実験
は両プロドラッグが酵素に対する基質であることを示し
た。図５に示されるように、エトポシドホスフェートは
エトポシドチオホスフェートプロドラッグよりも速やか
に酵素によって加水分解される。しかし、エトポシドチ
オホスフェートは一定条件のもとでその加水分解に対す
る高い安定性に基づく特定の有用性を有することができ
る。
【００４８】抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体と
エトポシドホスフェートプロドラッグとの反応 本発明の結合体は、結合体および遊離酵素が基質ｐ−ニ
トロフェニルホスファート〔チイセン (P. Tijssen) 、
前掲〕またはエトポシドホスフェートに対し等しい活性
を示す事実により証明されるので酵素の抗体に対する結
合に基づく酵素活性の明らかな低下を示さなかった。例
えばＡＰ単独または前記のように製造された抗体酵素結
合体Ｌ６−ＡＰ（最終ＡＰ濃度５μｇ／ｍl ）を、Ｍｇ
Ｃl2（１ mＭ）およびＺｎＣl2（0.１ mＭ）を pＨ7.０
で含むトリス緩衝液（１００ mＭ）中のエトポシド−
４′−ホスフェート（0.１ mＭ）の溶液に加えた。反応
はＩＢＭ Ｃ−１８カラム（３μ、4.５×１００mm）お
よび５０％水性メタノールを遊離剤として用いるＨＰＬ
Ｃによりモニターした（0.５ｍl ／分、２５４ｎm でモ
ニター）。反応の開始の５分以内に、遊離酵素形態また
はＬ６抗体−酵素結合体の部分として、ＡＰがエトポシ
ド−４′−ホスフェートの少なくとも８５％をエトポシ
ドに加水分解した（図４Ｃおよび図４Ｄ参照）。図が示
すように、結合体中の抗体に対する結合に基づくＡＰ酵
素活性の低下がなかった。酵素が存在しないときにホス
フェートの加水分解が起こらなかった（図４Ａ参照）。
エトポシドホスフェートまたはエトポシドチオホスフェ
ートの水溶液は室温で少くとも８時間、および４℃で数
日間安定であった。
【００４９】抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体の
Ｈ３３４７腫瘍細胞に対する結合 図６はＬ６−ＡＰおよび９6.５−ＡＰ結合体並びにＬ６
および９6.５抗体の転移ヒト結腸癌細胞系Ｈ３３４７
〔ジュディ・アンダーソン (Judy Anderson) により提
供された、腫瘍遺伝子〕の腫瘍細胞に対し結合する能力
の試験を行なった結合体結合検定の結果を示す。結合検
定は次のように行なった：免疫結合体または遊離抗体は
不完全改変ダルベッコ培地〔ＩＭＤＭ、ギブコ（Gibc
o)〕中に系列希釈し、１００μｌ分割量を４℃で１０6
細胞とともに３０分間インキュベートした。細胞を洗浄
し、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス抗体〔タゴ (Tago) 製、
１：１2.５希釈）５０μl とともに４℃でさらに３０分
間インキュベートした。細胞を洗浄し、コールタ・エピ
ックス(Coulter Epics) −Ｃ蛍光細胞アナライザーで分
析した。死細胞を排除し、各試料の平均対数緑蛍光強度
を得た。この数を直尺に変換し、陰性対照（細胞＋ＦＩ
ＴＣ−ヤギ抗マウス抗体）と全試験試料との間の比を計
算した。図６は抗体の結合能力の大部分が結合体中に保
存されたこと、すなわち結合が抗体結合能力に影響を与
えなかったことを示す。さらに、同図は抗体の結合の特
異性、すなわち９6.５遊離抗体および９6.５−ＡＰ結合
体がともにＬ６抗体およびＬ６−ＡＰ結合体よりも腫瘍
細胞に対し非常に弱く結合したことを示す。この結果
は、Ｈ３３４７腫瘍細胞がヒト癌腫からでありＬ６抗体
が癌腫抗原に対し特異的であるが９6.５抗体が黒色腫抗
原に対し特異的であることを考慮すると予期することが
できる。
【００５０】Ｌ６、Ｌ６−ＡＰ、１Ｆ５および１Ｆ５−
ＡＰを用いた同様の結合実験もまたＬ６およびＬ６−Ａ
ＰがＨ３３４７癌腫細胞系に結合し（１０μｇ／ｍl 抗
体で飽和）、１Ｆ５または１Ｆ５−ＡＰにより非常にわ
ずかの結合が認められるかまたは検出可能な結合が認め
られなかったことを示した（図７参照）。この結果はま
た結合体の結合の特異性を示し、Ｌ６−ＡＰ結合体がＬ
６陽性腫瘍細胞系に結合し、Ｂリンパ腫細胞に対する特
異性を有する１Ｆ５−ＡＰ結合体が結合を示さなかっ
た。本発明の結合体／プロドラッグ組合せの試験管内細胞毒
性 次に本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害性
効果がクローン原性細胞毒性検定または 3Ｈ−チミジン
取込み検定を用いて試験管内で示された。用いたクロー
ン原性細胞毒性検定はヘルストロム (I. Hellstrom) ほ
か、「コロニー阻止および細胞毒性検定」、イン・ビト
ロ・メソーズ・イン・セル・メディエーテッド・イムニ
ティ (In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity)
、ブルームほか (Bloom and Glade)編、ｐｐ. ４０９
〜１４（１９７１）により記載されたコロニー阻止検定
であった。細胞毒性の検出に用いた細胞は前記Ｈ３３４
７腫瘍細胞であった。Ｌ６−ＡＰおよび９6.５−ＡＰ結
合体の両方を、それらのプロドラッグを遊離薬物の転化
する能力について試験した。簡単に記載すると、Ｈ３３
４７細胞（１０6 ／ｍl ）をＩＭＤＭ増殖培地（抗体濃
度を基にして各免疫結合体１０μｇ／ｍl を含む）中に
懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞
を２回洗浄し、再びＩＭＤＭ中に懸濁し、培地中の薬物
またはプロドラッグを加えた。３７℃でインキュベーシ
ョンを１５時間続けた。２回洗浄した後、細胞を塗布し
コロニーの数（＞８細胞／コロニー）を７〜１０日後に
計数した。
【００５１】検定の結果は図８に示される（パーセント
阻止は６試料の平均である）。図に示されるように、エ
トポシド（ＩＣ50＝0.２０μＭ）はエトポシド−４′−
ホスフェート（ＥＰ）（ＩＣ50＝5.８μＭ）よりも非常
に細胞障害性であった。プロドラッグ単独は非常に小さ
い細胞障害活性を示した。Ｈ３３４７細胞をＬ６−ＡＰ
結合体で処理し、次にエトポシドホスフェートに暴露す
るとプロドラッグ単独で認められたものに比べて細胞障
害活性の非常大きい増加を生じ、増大した細胞障害活性
はエトポシド単独で認められた細胞障害活性に匹敵し
た。細胞の９6.５−ＡＰ結合体およびエトポシドホスフ
ェートによる処理はプロドラッグ単独で認められたもの
に比し細胞障害活性の非常の小さい増加を示した。この
結果は前記のようにＨ３３４７に結合する９6.５−ＡＰ
結合体の量の少ないことに帰着させることができる（図
６参照）。結合体は細胞の結合体単独による処理が細胞
の死を生じなかったのでそれ自体細胞障害性ではない。
本発明の結合体の細胞障害効果はまた 3Ｈ−チミジン取
込み検定を用いて調べた。この検定によれば、１０％ウ
シ胎仔血清を有するＩＭＤＭ0.１ｍl 中の１０6 Ｈ３３
４７細胞の懸濁液を結合体５μｇ／ｍl の存在下に４℃
で１時間インキュベートした。細胞を１０％ウシ胎仔血
清含有培地で２回洗浄し、再懸濁し（１ｍl 中）、９６
ウェルミクロタイタープレート中へ塗布した（１0,００
０細胞／ウェル）。次いでＩＭＤＭ中の薬物またはプロ
ドラッグを加え、インキュベーションを３７℃で６時間
行なった。細胞を２回洗浄し、インキュベーションをさ
らに１２時間続け、次いで 3Ｈ−チミジン（1.０μＣｉ
／ウェル）で６時間標識した。プレートを−２０℃で凍
結して細胞を分離し、細胞をガラス繊維ディスク上に収
集した。フィルターをベックマン (Beckman)３８０１シ
ンチレーションカウンター上で計数した。
【００５２】この検定を用いて我々は腫瘍細胞のＤＮＡ
中への 3Ｈ−チミジン取込みの阻止、従ってエトポシド
あるいはプロドラッグＥＰのＬ６−ＡＰまたは１Ｆ５−
ＡＰ結合体の不在または存在下の細胞に対する細胞障害
効果を測定した。図９に示されるように、エトポシド
（ＩＣ50＝１μＭ）はＥＰ（１００μＭで３５％阻止）
より１００倍以上も毒性であった。ＥＰ暴露前の１Ｆ５
−ＡＰによる細胞の前処理は細胞毒性の増大を何ら生じ
なかった。しかし、細胞障害活性の驚くべき増加が細胞
が初めにＬ６−ＡＰに、次いでＥＰに暴露したときに認
められた。従って、試験管内細胞毒性の測定に用いた両
検定において、本発明の結合体／プロドラッグの組合せ
の細胞障害効果はエトポシド単独のそれに匹敵し、ＥＰ
細胞毒性がＨ３３４７細胞の対照結合体、９6.５−ＡＰ
および１Ｆ−５−ＡＰのそれぞれによる処理によって同
様に増大されなかった事実により示されるように、この
効果は抗原特異性であった。
【００５３】マウスの腫瘍異種移植片中の結合体の局在
化 次に生体内局在化研究を行ない本発明の結合体が腫瘍中
にいかに速やかにかつどの程度に蓄積するかを見出し
た。この情報は我々の腫瘍療法研究における抗体−酵素
結合体とプロドラッグとの投与の間の時間の適切な間隔
の決定に有用なことを証明するであろう。初めにＢalｂ
／ｃ ｎｕ／ｎｕめすマウス（４〜６週令）〔ライフ・
サイエンス (Life Science, St. Petersburg, Florida)
から入手〕に、左右の後部脇腹に１０7 Ｈ３３４７腫瘍
細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍細胞はトリプシ
ン（0.５ｇ／ｌ）およびＥＤＴＡ（0.２ｇ／ｌ）で２分
間処理することにより懸濁させた試験管内培養から得
た。細胞はＩＭＤＭで２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清
を有するＩＭＤＭ中で３７℃で１時間インキュベートし
た。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁し、注射前に４℃で
保持した。ここに記載した局在化および療法研究は腫瘍
が２２５mm3 の平均大きさに達したときに開始した。我
々の局在化研究のために、ヨードゲン (iodogen)法〔フ
レイカー (P. J. Fraker) ほか、バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.) ８０、ｐｐ．８
４９〜８５７（１９７８）参照〕を用いてＬ６およびＬ
６−ＡＰを 125Ｉで標識し、１Ｆ５および１Ｆ５−ＡＰ
を 131Ｉで標識した。局在化実験の２日前に動物を0.５
％（ｖ／ｖ）ルゴールヨウ素液上に置いた。各マウスに
次の溶液：ＰＢＳ、 pＨ7.２、0.２ｍl 中のＬ６−ＡＰ
（５μＣｉ）および１Ｆ５−ＡＰ（2.５μＣｉ）または
ＰＢＳ0.２ｍl 中のＬ６（５μＣｉ）および１Ｆ５（2.
５μＣｉ）の組合せ、のいずれかの１００μｇ（各単ク
ローン性抗体基準）をｉ．ｐ．注射した。周期的間隔
で、マウスを麻酔し、眼窩叢を経て採血し、剖検した。
組織を計量し、次いでガンマカウンターで計数した。局
在化は 125Ｉ−Ｌ６局在化と 131Ｉ−１Ｆ５のそれとの
比較により、すなわち種々の組織中のカウントの特異性
(125Ｉ）と非特異性(131Ｉ）との取込みの比の測定によ
り決定した。腫瘍および肝臓の取込みに対する結果が表
１に要約される。
【００５４】
【表１】 表 １ 投与タンパク質のパーセント注射量毎グラム組織重量 Ｌ６ Ｌ６−ＡＰ 腫瘍 肝臓 腫瘍 肝臓 2時間 1.6(8.0) 4.9(2.0) 1.5(7.5) 5.2(0.7) 24時間 3.6(12.0) 2.3(1.4) 1.0(10.0) 1.3(1.3) 48時間 4.0(8.0) 2.5(1.3) 0.5(5.0) 0.8(1.0) 括弧内の数字はＬ６〜１Ｆ５またはＬ６−ＡＰ／１Ｆ５−ＡＰ の比を示す
【００５５】表に示されるように、非結合Ｌ６は２４時
間内に腫瘍に効率よく局在し、そこに少くとも４８時間
保持された。この期間の間腫瘍中のＬ６と１Ｆ５との比
は８〜１５の範囲内にあったが肝臓中の比は全く低かっ
た（1.３〜1.４）。Ｌ６−ＡＰに対する腫瘍中の特異的
取込みの最大水準は約２４時間に起こり、その時点でＬ
６−ＡＰと１Ｆ５−ＡＰとの比は１0.０であった。これ
らの結果はＬ６−ＡＰ結合体が１Ｆ５−ＡＰよりはるか
に良好に腫瘍内に局在化したが、しかし非結合Ｌ６ほど
良好でなかったことを示す。次に我々は腫瘍中の天然ホ
スファターゼ活性の量および本発明の結合体を用いてＡ
Ｐを腫瘍に標的指向させることによりこの活性を高める
ことができる程度を測定した。Ｌ６−ＡＰ１００μｇ
（Ｌ６基準）で２４時間処置したマウスから腫瘍を切除
し、次のようにｐ−ニトロフェニルホスファートを基質
として用いて全ホスファターゼ活性を測定した：切除細
胞を洗浄し、次にＮａＣｌ（１００ mＭ）およびＭｇＣ
l2（５ mＭ）を含む pＨ9.５のトリス（１００ mＭ）中
でｐ−ニトロフェニルホスファート（１ｍｇ／ｍl ）と
ともに２３℃で穏やかに回転した。反応の経過は４１０
ｎm で遊離されたｐ−ニトロフェノールを測定すること
によりモニターし、結果を腫瘍重量に対して補正した。
Ｌ６−ＡＰ結合体を受けたマウスの腫瘍が非処置マウス
の腫瘍中に認められたホスファターゼ活性の水準の１０
倍程度を示したことが認められた（図１０Ａ参照）。腫
瘍のホスファターゼ活性のより詳細な組織学的分析を、
非処置あるいは２４時間早くＬ６−ＡＰまたは１Ｆ５−
ＡＰ３００μｇ（抗体基準）で前処置したマウスから得
た腫瘍の断面で行なった。ホスファターゼ活性は免疫組
織学により次のように酵素活性の部位における黒色沈殿
を析出したホスファターゼ基質を用いて評価した：切除
細胞を−２８℃で速やかに凍結し、８μｍ系列断面をラ
イヘルト・ユング (Reichert-Jung)ミクロトームを用い
て調製した。ホスファターゼ活性をベクター・ラボラト
リーズ (Vector Laboratory, Burlingame CA) のＡＰ基
質キットで測定し、結果をヘマトキシンおよびエオシン
（Ｈ−Ｅ、図１０Ｂ参照）で染色した断面と比較した。
【００５６】図１０Ｂに示されるように、非処置または
１Ｆ５−ＡＰで処置したマウスの腫瘍中にわずかの酵素
活性が検出された。しかし、Ｌ６−ＡＰを受けたマウス
中でホスファターゼ活性が非常に高められ、腫瘍全体に
分布したことを知見できた。顕微鏡評価はＬ６−ＡＰ処
置マウス中の腫瘍細胞の大部分がホスファターゼ活性に
対し高陽性に染められたことを示した。
【００５７】本発明の結合体／エトポシドホスフェート
プロドラッグ組合せの生体内抗腫瘍効果 療法実験はｓ．ｃ．腫瘍約２２５mm3 容積を有したヌー
ドマウスで行なった。結合体、Ｌ６−ＡＰおよび１Ｆ５
−ＡＰをＥＰ処置の１８〜２４時間前に投与（ｉ．
ｐ．）した。腫瘍増殖を非処置マウスおよびエトポシド
またはＥＰ単独の最大許容量で処置したマウス中のそれ
に比較した。より詳しくは、両側Ｈ３３４７腫瘍を有す
る８ヌードマウスの群をエトポシド（２：３のＤＭＳ
Ｏ：Ｈ2 Ｏ中のエトポシド1.２ｍｇを含有する0.２ｍl
）あるいはＥＰ（Ｈ2 Ｏ中のＥＰ２ｍｇを含有する0.
２ｍl ）単独あるいはＬ６−ＡＰ（ＰＢＳ中の３００μ
ｇ抗体を含有する0.１ｍl ）または１Ｆ５−ＡＰ（ＰＢ
Ｓ中の３００μｇ抗体を含有する0.１ｍl ）次いでＥＰ
処置、で処置した。各試験には非処置マウスの１対照群
が包含された。腫瘍容積を腫瘍移植後種々の日に次式を
用いて評価した： 〔（垂直幅2 ／２）〕×最大長さ これらの試験の結果は図１１に示される。エトポシドは
用いた用量で腫瘍増殖に対し非常に小さい効果を有し、
一層高い用量は十分に許容されなかった。プロドラッグ
ＥＰは動物に対する毒性が少なく、従って投与できた高
用量がエトポシドそのもので認められたものよりも大き
い抗腫瘍効果を生じた。同程度の抗腫瘍活性が対照結合
体１Ｆ５−ＡＰをＥＰ処置の前に受けたマウスに認めら
れた。しかし、マウスをＬ６−ＡＰ、次にＥＰで処置し
たときに一層顕著な抗腫瘍効果が認められた。Ｌ６−Ａ
Ｐ単独は腫瘍増殖に効果を有しなかった（データは示さ
れない）。
【００５８】各個々の腫瘍の療法に対する応答の概要が
表２に示される。Ｌ６−ＡＰおよびＥＰで処置した８マ
ウス中の１６腫瘍中６腫瘍が完全な退行を経験し、他の
２つが処置の開始時より大きさが小さくなった。他の処
置プロトコルのいずれも完全または部分応答が認められ
なかった。
【００５９】
【表２】 表 ２ 腫瘍増殖に対する種々の処置の結果 応 答 ──────────────────────────────── 物質 進行 不変 部分 完全 ──────────────────────────────── な し 16 0 0 0 エトポシド 12 4 0 0 ＥＰ 6 10 0 0 １Ｆ５−ＡＰ＋ＥＰ 9 7 0 0 Ｌ６−ＡＰ＋ＥＰ 3 5 2 6 ────────────────────────────────
【００６０】データは腫瘍移植２３日後の各群中の１６
腫瘍の応答を示す。 ＊応答：進行−腫瘍増殖継続；不変−追加の腫瘍増殖な
し；部分−大きさの減少；完全−見掛け上腫瘍をなくす
る退行。 この実施例は明らかに腫瘍特異性抗体−酵素結合体およ
び、酵素により比較的細胞障害性でない形態から強力な
細胞障害性形態に転化されることができるプロドラッグ
を用いて細胞障害性抗腫瘍薬を腫瘍細胞に供給する本発
明の方法の適用可能性を示す。 実施例２ この実施例は比較的細胞障害性でないマイトマイシンホ
スフェートプロドラッグを活性マイトマイシン薬物に転
化し腫瘍細胞に対して試験管内細胞毒性を生ずる本発明
の免疫結合体および方法の使用を示す。さらに、実施例
１に示したように、次の実施例は生体内腫瘍細胞に対す
る細胞障害性抗腫瘍薬の供給に対する本発明の免疫結合
体、プロドラッグおよび方法の適用可能性を示す。この
実施例は実施例１に記載したように調製したＬ６−ＡＰ
および１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体を用いる。本発明のこの
態様によれば、これらの抗体−酵素結合体のそれぞれを
新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグと反応さ
せた。より詳しくは、用いたプロドラッグはマイトマイ
シンＣのＮ7 −Ｃ1-8 アルキルリン酸の二ナトリウム塩
であった。この反応の結果遊離された抗腫瘍物質はマイ
トマイシンアルコール誘導体であった。本発明のＬ６−
ＡＰ／マイトマイシンホスフェートプロドラッグ組合せ
は試験管内で腫瘍細胞に対する細胞毒性およびマウス中
の顕著な生体内抗腫瘍効果を生じた。
【００６１】新規マイトマイシンホスフェートプロドラ
ッグの調製 新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグ、７−
（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン
（以下「ＭＯＰ」として示す）はマイトマイシンＣ（Ｍ
ＭＣ）の２−アミノエスルホスフェート誘導体であり、
次のように調製した：リン酸二水素２−アミノエチル
（５６ｍｇ、0.４ミリモル）の水（0.３５ｍl）および
トリエチルアミン（0.３ｍl 、２ミリモル）中の溶液を
メタノール（６ｍl ）中のマイトマイシンＡ（以下「Ｍ
ＭＡ」として示す）（１４０ｍｇ、0.４ミリモル）に加
え、反応を室温で一夜進行させた。次いで飽和水性炭酸
水素ナトリウム1.４ｍl を加え、溶液を水と塩化メチレ
ンとの間に分配させた。水相を濃縮乾燥し、メタノール
数部を加えて蒸発させた。残留物をメタノールに溶解
し、濾過し、２×１０cmＣ−１８（逆相）シリカカラム
に適用した。生成物を水で溶出させ、揮発性物質をすべ
て蒸発させた。前記のようにメタノールを加えて蒸発さ
せ、残留物をデシケータ中五酸化リンで高真空下に２４
時間乾燥した。マイトマイシンホスフェート誘導体ＭＯ
Ｐが微細青色粉末として得られた（１９０ｍｇ、９７
％）。
【００６２】360 MHz ; H-NMR (D2O) δ 1.94 (s, 3H,
CH3)、 2.9−3.1 (m, 4H), 3.20 (s, OCH3), 3.28 (s,
1H), 3.36 (s, 1H) 、 3.5-3.65 (m, 4H), 4.1-4.25
(m, 2H), 4.50-4.57 (dd, 1H, 10-H). 従って、ＭＯＰはＭＭＡの７−メトキシ基をリン酸２−
アミノエチルで置換することにより調製された（図１２
参照）。生成物は炭酸水素ナトリウムによる処理で水溶
性二ナトリウム塩に転化された。相当する公知マイトマ
イシンアルコール誘導体、７−〔（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ〕−９ａ−メトキシマイトサン（以下「ＭＯ
Ｈ」として示す）はイエンガー (B. S. Iyengar)ほか、
「マイトマイシンＣおよび７位に置換エチルアミンを有
するポルフイロマイシン類似体」、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー (J. Med. Chem.)、２６、
ｐｐ．１６〜２０（１９８３）の方法に従ってＭＭＡ
（１００ｍｇ、0.２８６ミリモル）とエタノールアミン
（２６ｍｇ、0.４２９ミリモル）との反応により調製し
た。生成物は微細青色粉末として得られた（５８ｍｇ、
５４％）。
【００６３】マイトマイシンホスフェートプロドラッグ
の反応性および安定性 次いでＭＯＰプロドラッグをそのＡＰとの反応性につい
て試験した。ＭＯＰ（１ mＭ）の１００ mＭトリス、 p
Ｈ7.２緩衝液中の溶液に室温で仔ウシ腸またはヒト胎盤
ＡＰを加えた（最終濃度１μｇ／ｍl ）。反応の経過は
Ｃ−１８カラム（4.６×１５０mm）および次の条件を用
いてＨＰＬＣによりモニターした：検出２８０ｎm ；８
分にわたり酢酸塩緩衝液（１００ mＭ、 pＨ5.２）中の
３０〜９５％メタノール、１５分後再平衡；流量0.８ｍ
l ／分。これらの条件下に、ＭＭＣは7.０分で溶出し、
ＭＯＨは8.５分で溶出し、ＭＯＰは4.０分で溶出した。
図１３に示されるように、ＭＯＰプロドラッグ上のリン
酸基はＡＰで速やかに開裂された。ＨＰＬＣは相当する
アルコールＭＯＨが形成されたことを確認するのに役立
った。用いた反応条件のもとでＭＯＰの加水分解に対す
る半減期は約１０分であり、反応は４０分以内に完了し
た。ＭＯＰおよびＥＰのヒト血清中の安定性は、ＨＰＬ
Ｃを用いてプロドラッグの消失の速度並びにＭＯＨおよ
びエトポシドの形成の速度の両方を測定することにより
測定した。従って、例えばＭＯＰの溶液（１００ mＭト
リス、 pＨ7.２中１mＭ）を最終薬物濃度が0.１ mＭで
あるように新ヒト血清に加えた。分割量（0.２５ｍl ）
をメタノール（0.２５ｍl ）およびＥＤＴＡ（１００ m
Ｍで５０μl）で希釈して血清タンパク質を沈殿させ、
反応を停止させた。試料を遠心分離し、前記のようにＨ
ＰＬＣにより分析した。ＥＰの５０％加水分解が１時間
後に起こったこと、しかし、ＭＯＰの単に２５％が４時
間後に加水分解したことが認められた。完全な加水分解
は血清にＡＰを加えることにより速やかに達成できた。
【００６４】Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する抗体−アルカ
リ性ホスファターゼ結合体の結合 次いで本発明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ抗体−酵
素結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に結合する能力を測定し
た。Ｈ２９８１細胞系は肺の一次ヒト腺癌から確立され
た〔ヘルストロム (I. Hellstrom) ほか、「ヒト肺癌に
対して生じた単クローン性マウス抗体」、カンサー・リ
サーチ（Cancer Res.)、４６（No. ８）、ｐｐ．３９１
７〜２３（１９８６）参照〕。Ｌ６抗体はＨ２９８１細
胞に強く結合する（１０μｇ／ｍl で飽和）ことが知ら
れているが、１Ｆ５はこれらの細胞に対し非常にわずか
の結合を示す。結合検定は実施例１に記載したように行
なった。ＦＡＣＳ分析はＬ６およびＬ６−ＡＰが細胞に
強く結合したが、１Ｆ５および１Ｆ５−ＡＰに対して非
常に弱い結合が示されたことを示した（図１４参照）。
【００６５】Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する本発明の結合
体／プロドラッグ組合せの試験管内細胞毒性 本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害効果が
実施例１に記載した 3Ｈ−チミジン取込み検定により試
験管内で示され：この場合に試験管内細胞毒性に対する
試験にＨ２９８１腫瘍細胞を用い、ＣＥＭ細胞を対照と
して用いた。Ｔ細胞全細胞系、ＣＥＭはＡＴＣＣから入
手され、Ｌ６または１Ｆ５単クローン性抗体は結合しな
い。プロドラッグＥＰおよびＭＯＰのＬ６−ＡＰまたは
１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体の不在または存在下の腫瘍細胞
に対する細胞障害効果を分析した。これらの組合せの細
胞障害効果はまた各親薬物単独の細胞障害効果と比較し
た。簡単に記載すると、１０％ウシ胎仔血清を含むＩＭ
ＤＭ0.１ｍl 中の１０6 Ｈ２９８１またはＣＥＭ細胞の
懸濁液を結合体１０μｇ／ｍl の存在下に４℃で１時間
インキュベートした。細胞を１０％ウシ胎仔血清を含む
培地で２回洗浄し、リン酸塩緩衝食塩水 pＨ7.２（ＰＢ
Ｓ）１ｍl 中に再び懸濁し、９６ウェルミクロタイター
プレートに塗布した（１0,０００細胞／ウェル）。次い
でＰＢＳ中のプロドラッグを加え、３７℃でインキュベ
ーションを１時間（ＭＯＰに対し）または５時間（ＥＰ
に対し）行なった。次いで細胞を２回洗浄し、インキュ
ベーションを合計２４時間（ 3Ｈ−チミジン1.０μＣｉ
／ウェルによる６時間標識を含む）続けた。プレートを
−７０℃で凍結して細胞を分離し、融解後細胞をガラス
繊維ディスク上に収集した。フィルターをベックマン３
８０１シンチレーションカウンターで計数し、結合体／
プロドラッグ組合せの細胞障害効果をプロドラッグまた
は親薬物単独による細胞の処理で認められた細胞毒性と
比較した。結果は図１５〜１７に示される。
【００６６】図１５に示されるように、エトポシド（２
μＭのＩＣ50) はＥＰ（３０μＭで２０％殺害）よりも
Ｈ２９８１細胞に対し有意に一層毒性であった。細胞の
プロドラッグ暴露の前の１Ｆ５−ＡＰによる前処理は細
胞毒性の非常にわずかの増大を生じた。しかし、細胞障
害活性の驚くべき増加が細胞を初めにＬ６−ＡＰに次い
でＥＰに暴露したときに認められた。細胞障害効果はエ
トポシド単独のそれに匹敵した。同様の結果がマイトマ
イシン誘導体を用いて認められた。図１６に示されるよ
うに、ＭＭＣおよびＭＯＨはＨ２９８１細胞に対して等
しく細胞障害性であり、約１μＭのＩＣ50値を有した。
ホスファターゼプロドラッグＭＯＰはおそらくそれが細
胞に浸透する能力を欠くために非常に低い細胞障害性
（１０μＭで５％細胞殺害）であった。しかし、ＭＯＰ
の活性は腫瘍細胞を本発明のＬ６−ＡＰ結合体に予め暴
露したときにＭＯＨおよびＭＭＣに匹敵した。非結合性
結合体１Ｆ５−ＡＰがプロドラッグの細胞障害活性に有
意に影響を与えなかったので、この増大は抗原特異性で
あった。Ｌ６−ＡＰも１Ｆ５−ＡＰもＣＥＭ細胞に対す
るＭＯＰの細胞障害効果を驚くほど増大せず、これらの
結合体のこの細胞系に結合しない事実と矛盾しない（図
１７参照）。従って、これらの結果は試験したプロドラ
ッグのそれぞれのホスフェート基が薬物を不活性にする
ことおよび腫瘍細胞の表面に結合した抗体−酵素結合体
によりプロドラッグ、ＥＰおよびＭＯＰのホスフェート
基が加水分解されると活性細胞障害性薬物を生ずること
を示す。
【００６７】本発明の結合体／マイトマイシンプロドラ
ッグ組合せの生体内抗腫瘍効果 本発明のＬ６−ＡＰ結合体と組合せたＭＯＰの生体内抗
腫瘍活性の調査に先立って、プロドラッグおよびその遊
離された活性誘導体ＭＯＨの相対毒性をＢal b／ｃ nｕ
／ｎｕマウスで測定した。薬物を４日離して２等用量で
投与（ｉ．ｐ．）し、ＭＯＨおよびＭＯＰに対しそれぞ
れ４５および９０ｍｇ薬物／ｋg 体重のＬＤ50値が得ら
れた。また一層少ない用量を長時間にわたり用いてかな
り多量の薬物を投与できることが認められた。ＭＯＨ４
０ｍｇ／ｋg およびＭＯＰ１００ｍｇ／ｋg までの合計
量が、４等用量で２５日の期間にわたって投与すれば十
分に許容された。これらの研究は有意に多くのマイトマ
イシンプロドラッグがその低い毒性のために許容された
ことを示した。次いで生体内源から得たＨ２９８１腫瘍
を移植した（ｓ．ｃ．、右後側腹部）ライフ・サイエン
シス (Life Sciences, St. Petersbarg, Fla.)から得た
ヌードＢal b／ｃ nｕ／ｎｕめすマウス（６マウス毎処
置群）（４〜６週令）で療法研究を行なった。試験は腫
瘍が約１００mm3 の容積に達したときに行なった。Ｌ６
−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体（ＰＢＳ中の２５０μ
ｇ抗体を含む0.１ｍl ）をＭＯＰ（Ｈ2 Ｏ中の0.６ｍｇ
ＭＯＰを含む0.２ｍl ）による処置の１８〜２４時間前
にそれぞれ投与（ｉ．ｐ．）した。腫瘍増殖は非処置マ
ウスおよび最大許容量のＭＯＰ（Ｈ2 Ｏ中の0.６ｍｇＭ
ＯＰを含む0.２ｍl ）またはＭＯＨ（Ｈ2Ｏ中の0.２ｍ
ｇＭＯＨを含む0.２ｍl ）で処置したマウス中に認めら
れたものと比較した。
【００６８】図１８に示されるように、ＭＯＨおよびＭ
ＯＰはともに生体内で有意な抗腫瘍活性を有した。７５
０mm3 の平均腫瘍容積に達するまでに要した時間はＭＯ
Ｈで処置したマウスで４５日、ＭＯＰプロドラッグで処
置したマウスで６３日、および対照群で２７日であっ
た。前記のようにＭＯＰプロドラッグは動物に対する毒
性が少なく、従って投与できた高い用量がＭＯＨ誘導体
で認められたよりも大きい抗腫瘍効果を生じた。非結合
性結合体１Ｆ５−ＡＰがＭＯＰの活性を多少増大したけ
れども、一層顕著な効果がＭＯＰ処置前にＬ６−ＡＰを
受けた群に認められた。図に示されるように、７０日
で、Ｌ６−ＡＰ結合体で前処置（次いでＭＯＰ処置）し
た腫瘍は１Ｆ５−ＡＰ結合体で前処置した腫瘍の大きさ
の約１／３であった。さらに、表３に示されるように、
移植の６３日後までにＬ６−ＡＰ＋ＭＯＰ処置マウス中
６腫瘍中３つが完全退行を経験し、残り３腫瘍は処置の
着手から大きさの増加がなかった。対照的に１Ｆ５−Ａ
Ｐ＋ＭＯＰ処置群中の５腫瘍中の３つは実際に大きさが
進行し、５腫瘍中の２つが不変であり、部分または完全
退行がなかった。
【００６９】
【表３】 表 ３ 抗体−ＡＰ結合体およびマイトマイシン誘導体による 処置に対する腫瘍の応答（第６３日まで） 腫 瘍 応 答 ───────────────────────────────── 群 進行 不変 部分退行 完全退行 対照 6/6 ＭＯＨ 6/6 ＭＯＰ 4/5 1/5 １Ｆ５−ＡＰ＋ＭＯＰ 3/5 2/5 Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰ 3/6 3/6
【００７０】これらの試験は明らかに本発明の標的指向
酵素／ＭＯＰ組合せの生体内における特異性および増大
した抗腫瘍効果を示す。 実施例３ この実施例は本発明の免疫結合体、プロドラッグおよび
方法の、腫瘍細胞に対する多くの異なる薬物の供給に対
する適用可能性を示す。抗体−アルカリ性ホスファター
ゼ結合体Ｌ６−ＡＰをプロドラッグＥＰおよびＭＯＰと
組合せた使用が高い生体内抗腫瘍活性を示した。従っ
て、本発明の腫瘍に対する組合せ化学療法に対する単一
の抗体標的指向酵素とプロドラッグの一団との使用を提
供する。プロドラッグ、ＥＰおよびＭＯＰ、はそれぞれ
実施例１および２に記載したように調製した。Ｌ６−Ａ
Ｐおよび１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体の調製は実施例１に記
載されている。ヌードマウスにおける生体内研究は実施
例１および２に記載したように行なった。従って、Ｈ２
９８１腫瘍を移植したヌードマウスをＭＯＰ／ＥＰ（Ｈ
2 Ｏ中のＥＰ１ｍｇおよびＭＯＰ0.３ｍｇを含む0.２ｍ
l ）で処置する１８〜２４時間前にＬ６−ＡＰまたは１
Ｆ５−ＡＰ結合体に前暴露した。腫瘍増殖を非処置マウ
スおよびＭＯＰ／ＥＰ組合せ単独で処置したマウス中に
認められたものと比較した。図１９に示されるように、
ＭＯＰ／ＥＰ組合せ単独およびＭＯＰ／ＥＰ組合せプラ
ス１Ｆ５−ＡＰ処置の抗腫瘍活性はおよそ等しかった。
また表４に示されるように、これらの２群中の腫瘍のす
べて並びに非処置対照マウスの腫瘍はサイズが成長し
た。しかし、腫瘍をもつマウスのＬ６−ＡＰ結合体によ
る前処置、次いでＭＯＰ／ＥＰ組合せは顕著な抗腫瘍応
答を生じた。図１９に示されるように、第７０日にＬ６
−ＡＰで前処置（次いで組合せたＭＯＰ／ＥＰ処置）し
た腫瘍は１Ｆ５−ＡＰ結合体で前処置した腫瘍の大きさ
の約１／３であった。さらに、移植６３日後までにマウ
スのＬ６−ＡＰ前処置群中の６腫瘍中の１つは完全に退
行し、６腫瘍中の３つは増殖を停止し、６腫瘍中の２つ
のみが大きさで進行した。
【００７１】
【表４】 抗体−ＡＰ結合体およびマイトマイシン／エトポシド 組合せによる処置に対する腫瘍の応答（第６３日まで） 腫 瘍 応 答 ───────────────────────────────── 群 進行 不変 部分退行 完全退行 対照 6/6 ＭＯＰ／ＥＰ 5/5 １Ｆ５−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＥＰ 6/6 Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＥＰ 2/6 3/6 1/ 6
【００７２】従って、これらの生体内研究は腫瘍に対す
る組合せ療法に対する本発明の結合体、プロドラッグお
よび方法の適用可能性を示す。あるいは、本発明の結合
体例えばＬ６−ＡＰをプロドラッグの他の組合せ、例え
ばＥＰ、アドリアマイシン−１４−ホスフェートおよび
５−フルオロウリジンモノホスフェートとともに用いて
腫瘍細胞に多くの異なる細胞障害性物質を供給すること
ができる。再び、抗体−酵素結合体Ｌ６−ＡＰおよびプ
ロドラッグ、エトポシド−４′−ホスフェートの調製は
実施例１に記載されたとおりである。アドリアマイシン
−１４−ホスフェートは、１９８０年１月２２日にドセ
ップ (J. B. Ducep)に対して発行された米国特許第4,18
5,111 号に記載されたように調製される。５−フルオロ
ウリジンモノホスフェートはロビンス (M. J. Robins)
ほか、カナジアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー
(Can. J. Chem.)、５３、ｐｐ．１３０２〜１３０６
（１９７５）に記載されたように調製される。Ｌ６−Ａ
Ｐと上記３プロドラッグとの反応は次のように行なわれ
る：ＡＰ単独またはＬ６−ＡＰ結合体（最終ＡＰ濃度５
μｇ／ｍl ）を、ＭｇＣl2（１ mＭ）およびＺｎＣl
2（0.１ mＭ）を pＨ7.０で含むトリス緩衝液（１００
mＭ）中のエトポシド−４′−ホスフェートまたはアド
リアマイシン−１４−ホスフェート（0.１ mＭ）の溶液
に加える。５−フルオロウリジンプロドラッグに対して
は反応条件はリン酸塩緩衝液（１００ mＭ）、 pＨ8.０
中の５−フルオロウリジン（３μＭ）の溶液を必要とす
る。Ｌ６−ＡＰと、エトポシドホスフェートまたは５−
フルオロウリジンプロドラッグとの反応は実施例１に記
載したようにモニターする。Ｌ６−ＡＰとアドリアマイ
シン−１４−ホスフェートとの反応はＨＰＬＣによりＩ
ＢＭ Ｃ−１８カラム（３μ、4.５×１００mm）および
溶離剤として３％酢酸アンモニウムを含む水中の６５％
メタノール（0.５ｍl ／分、４９５ｎmでモニター）を
用いてモニターする。
【００７３】抗体−ＡＰ結合体と各プロドラッグとの反
応はホスフェート部分の加水分解による除去を生じ、遊
離薬物を遊離する〔例えば、マコム (R. B. McComb) ほ
か、アルカリン・ホスファターゼ (Alkaline Phosphata
se) 、プレナム・プレス (Plenum Press, New York）、
（１９７９）参照〕。本発明のＬ６−ＡＰ結合体の存在
下の３プロドラッグのそれぞれの腫瘍細胞に対する細胞
毒性は前記実施例１に記載したコロニー阻止検定を用い
て示すことができる。結合体によりプロドラッグのそれ
ぞれからホスフェート部分が除去されるとエトポシド、
アドリアマイシンおよび５−フルオロウリジンが遊離さ
れる。３薬物のそれぞれが強力な抗腫瘍物質であること
が示された〔例えば、オドウヤー (P. J. O'Dwyer)ほ
か、「エトポシド：活性抗癌薬の現状」、ニュー・イン
グランド・ジャーナル・オブ・メディシン (New Englan
d Journal of Medicine)、３１２、ｐｐ．６９２〜７０
０（１９８３）；エンブレトン (M. J. Embleton)ほ
か、「抗癌物質の抗体標的指向」、モノクローナル・ア
ンティボディーズ・フォ・カンサー・デテクション・ア
ンド・セラピー (Monoclonal Antibodies forCancer De
tection and Therapy) 、ボルドウィンほか (R. W. Bal
dwin and V. S. Byers)編、ｐｐ．３２１〜２２、アカ
デミック・プレス (Academic Press) （１９８５）；米
国特許第4,185,111 号、前掲；クルッケ他 (S. T. Croo
ke and S. D. Reich) 編、アントラシクリンズ：カーレ
ント・ステータス・アンド・ニュー・デベロープメンツ
(Anthracyclines: Current Status And New Developme
nts)、アカデミック・プレス (Academic Press, New Yo
rk) （１９８０）：およびハイデルバーガー (C. Heide
lberger)ほか、「フッ素化ピリミジンおよびそれらのヌ
クレオシド」、アドバンシス・イン・エンチモロジー・
アンド・リレーテッド・エリアズ・オブ・モレキュラー
・バイオロジー (Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Bi
ol.)、５４、ｐｐ．５７〜１１９（１９８３）参照〕。
【００７４】従って、エトポシド、アドリアマイシンお
よび５−フルオロウリジンのプロドラッグは本発明の抗
体−アルカリ性ホスファターゼ結合体により腫瘍の部位
に相当する公知抗腫瘍物質を遊離させるために一緒にま
たは連続的に用いることができる。例えば、互いに組合
せて投与した抗腫瘍物質が相乗的に作用できることが示
された〔例えば、モンファルジニ (S. Monfardini)ほ
か、「癌化学療法のマニュアル」ＵＩＣＣテクニカル・
レポート・シリーズ（ＵＩＣＣ Technical Report Ser
ies)、５６（１９８１）参照〕。従って本発明のこの態
様は腫瘍に対する組合せ化学療法のための方法を提供す
る。
【００７５】実施例４ 次の実施例は比較的細胞障害性でないプロドラッグを腫
瘍細胞に対する細胞毒性を試験内で示す活性抗腫瘍物質
に転化する本発明のなお他の免疫結合体およびプロドラ
ッグの使用を示す。この実施例によれば、Ｌ６−ペニシ
リンＶアミダーゼ（以下「ＰＶＡ」として示す）免疫結
合体がアドリアマイシンのＮ−フェノキシアセチル誘導
体の公知抗腫瘍物質アドリアマイシンへの転化に使用さ
れる。本発明の抗体−ペニシリンＶアミダーゼ結合体の調製 この実施例において、Ｌ６−ＰＶＡ免疫結合体および１
Ｆ５−ＰＶＡ免疫結合体を調製した。抗体Ｌ６および１
Ｆ５並びにそれらの源は前に記載した。用いたアミダー
ゼ酵素は、ロウエ (D. A. Lowe) ほか、「フサリウム・
オキシスポルムによるペニシリンＶの６−アミノペニシ
ラン酸への酵素加水分解」、バイオテクノロジー・レタ
ーズ (Biotechnology Letters)、８（３）、ｐｐ．１５
１〜５６（１９８６）により開示された方法に従いフサ
リウム・オキシスポルムの真菌培養から分離したペニシ
リンＶアミダーゼであった。この酵素を分離できるフサ
リウム・オキシスポルム株はＡＴＣＣに寄託されてい
る。従って、ＰＶＡはペニシリンＶをペニシラン酸に転
化する入手の容易な酵素である。より詳しくは、ＰＶＡ
はペニシリンＶのフェノキシアセチルアミド結合を加水
分解してペニシラン酸を生ずる。従って、フェノキシア
セトアミドと反応する酵素をフェノキシ酢酸またはｐ−
ヒドロキシフェノキシ酢酸で誘導体にした公知細胞障害
性物質のプロドラッグの開裂を使用することができる。
【００７６】本発明のこの態様の抗体−ＰＶＡ結合体は
実施例１のＡＰ結合体に対して記載したと実質的に同様
の方法で調製した。抗体Ｌ６および１Ｆ５を記載のよう
にイミノチオランと反応させ、各抗体上に導入されたス
ルフヒドリル基の数が１〜２の間にあると測定された。
次いでＰＶＡ酵素をＰＢＳ中の９ｍｇ／ｍl で溶解し、
ＳＭＣＣ〔ピアス・ケミカル社 (Pierce Chemical Co.)
製、ＤＭＦ中１００ mＭ〕を最終濃度が５ mＭであるよ
うに加えた。ＳＭＣＣによる処理は酵素上のマレイミド
基を導入した。３０℃で３０分後、修飾された酵素をＧ
−２５ＰＤ−１０セファデックス〔ファルマシア (Phar
macia, Upsalla, Sweden) 製〕上のゲル濾過により精製
し、ＰＢＳで溶出させた。次いで修飾されたＰＶＡを各
チオール化抗体の溶液に３：１のモル比に加えた。各反
応混合物を窒素で飽和し、室温で３時間放置し、４℃で
さらに１８時間インキュベートした。この時点で２−ア
ミノエタンチオール（最終濃度１ mＭ）を各溶液に加
え、他の未反応マレイミドをブロックした。
【００７７】次いで各反応混合物を、５０ mＭ−ＮａＣ
ｌを有する２０ mＭトリス、 pＨ7.２を溶離剤として用
いてゲル濾過カラム（Ｇ−２５）に通した。生じた混合
物をＤＥＡＥセファデックスカラム（2.５×１０ｃｍ）
で精製した。フラクションを２８０ｎm でモニターし
た。各混合物の未反応抗体はカラムに結合せず、結合体
および未反応ＰＶＡを0.５Ｍ−ＮａＣｌを有する２０ m
Ｍトリス、 pＨ7.２で溶出させた。ＰＶＡおよび結合体
を含むフラクションを次いでアミコン (Amicon)ＹＭ−
３０現外濾過フィルターを用いて濃縮し、セフアクリル
Ｓ−３００カラム（2.５×９５ｃｍ）上でＰＢＳを溶離
剤として用いて精製した。フラクションは２８０ｎm で
モニターし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％勾配ゲル）
により測定して純結合体を含むフラクションをプールし
た。
【００７８】新規アドリアマイシンプロドラッグの調製 次いで上記調製抗体−ＰＶＡ結合体のそれぞれを新規ア
ドリアマイシンプロドラッグと反応させた。より詳しく
は、用いたプロドラッグは、アドリアマイシンが図２０
に示されるようにアミノ糖部位においてｐ−ヒドロキシ
フェノキシ酢酸でアシル化されているＮ−（ｐ−ヒドロ
キシフェノキシアセチル）アドリアマイシン（以下「Ａ
ＰＯ」として示す）であった。このアドリアマイシンプ
ロドラッグは次のように調製した：テトラヒドロフラン
１０ｍl 中へｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸８４ｍｇ
（0.５ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５７
ｍｇ（0.５ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジ
ミイド１００ｍｇ（0.４９ミリモル）を入れた。この混
合物を２時間かくはんし、その時間で溶液を濾過し、濾
液をアドリアマイシン塩酸塩２００ｍｇ（0.３５ミリモ
ル）に加えた。トリエチルアミン0.１ｍl を反応混合物
に加え、かくはんを４時間続けた。次いで反応混合物を
ガラスウールに通して濾過し、高真空下に蒸発させて残
留物を得た。生じた混合物をシリカゲル６０カラム（2.
５×２０ｃｍ）上で精製し、９５：５のジクロロメタ
ン：メタノールで溶出させた。フラクションをプール
し、再び同種のカラム上で精製すると純Ｎ−（ｐ−ヒド
ロキシフェノキシアセチル）アドリアマイシン７０ｍｇ
（0.１ミリモル、３０％収率）が得られた。
【００７９】FAB MS m/e 694.2125 (M+H)+ ．計算値
(C35H36NO14), 694.2136. 360 MHz1H NMR (CDCl3)
δ 1.06 (d, 3H, 糖 CH3), 1.5-2.2 (m, 6H, 糖 H),
3.0(q, 2H), 4.0 (s, 3H, OCH3)、 4.35 (s, 2H, COCH2
O), 4.8-5.0 (m, 3H), 5.2および5.4 (s, 1H), 6.6-6.8
(dd, 4H, フェノキシ ArH), 7.4-7.9 (m, 3H, 2,3,4-
H), 9.0 (s, 1H, Ar'OH), 11.61および12.39 (s, 1H, A
rOH). アドリアマイシンの他のフェノキシアセチルアミド誘導
体を上記と実質的に同様の操作を用いて合成できること
を理解すべきである。例えばＮ−（フェノキシ）アドリ
アマイシンを、ｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸の代りに
フェノキシ酢酸0.５ミリモル（７６ｍｇ）を用いて本節
に記載したように合成することができる。同様に、Ｎ−
（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）メルファランま
たはダウノマイシンプロドラッグあるいはＮ−（フェノ
キシアセチル）メルファランまたはダウノマイシンプロ
ドラッグを、メルファラン１００ｍｇまたはダウノマイ
シン２００ｍｇ（0.３５ミリモル）を用いてこの合成プ
ロトコルにより合成することができる。
【００８０】抗体−ペニシリンＶアミダーゼ結合体とア
ドリアマイシンプロドラッグとの反応 抗体−ＰＶＡ結合体ＬＶ−ＰＶＡの新規プロドラッグＡ
ＰＯをアドリアマイシンに転化する能力を次のように測
定した：ａ）ＰＶＡ単独（最終濃度５０μｇ／ｍl ）、
ｂ）Ｌ６−ＰＶＡ結合体１００μｇ／ｍｇ（最終ＰＶＡ
濃度２５μｇ／ｍl ）、またはＬ６−ＰＶＡ１０μｇ／
ｍl （最終ＰＶＡ濃度2.５μｇ／ｍl ）をＰＢＳ中のＡ
ＰＯ（0.１ mＭ）の溶液に加えた。各反応をＨＰＬＣに
よりフェノミネックス (Phenominex) Ｃ−１８カラム
（３μｍ、4.５×１００mm）および0.１％Ｈ3 ＰＯ4 を
有する水中の２０〜６０％テトラヒドロフランの勾配溶
離（0.１ｍl ／分、４９５mmでモニター）を用いてモニ
ターした。これらの条件のもとでアドリアマイシンは8.
９分で溶出し、ＡＰＯは１2.２分で溶出した。結果は図
２１に示される。図に示されるように、ＡＰＯのアミド
基がアドリアマイシンの発生によって示されるようにＰ
ＶＡによって実際に加水分解された。用いた条件のもと
でＰＶＡによるＡＰＯの加水分解に対する半減期は約２
０分であった。さらに、反応開始の４０分以内に酵素単
独または抗体−ＰＶＡ結合体がＡＰＯの少くとも８０％
のアドリアマイシンへの加水分解を行なうことができた
ことが認められた。結合体は１０μｇ／ｍl （ＰＶＡ2.
５μｇ／ｍl ）でこの水準の加水分解を１２０分以内に
行なうことができた。最後に、これらの研究から結合体
および遊離酵素がＡＰＯのアドリアマイシンへの加水分
解に類似する能力を示した事実により明らかなように、
本発明の抗体−ＰＶＡ結合体が抗体に対する酵素の結合
に基づく酵素活性の明らかな低下を示さなかったことが
明らかである。
【００８１】本発明の新規アドリアマイシンプロドラッ
グの血清安定性 ＡＰＯのヒト血清中の安定性を、ＨＰＬＣを用いてＡＰ
Ｏの消失の速度およびアドリアマイシンの形成の速度を
測定することにより測定した。従って、ＡＰＯの溶液
（ジメチルホルムアミド中１０ mＭ）を新鮮なヒト血清
に最終濃度が0.１mＭであるように加えた。分割量（５
０μl ）をメタノール（５０μl ）で希釈して血清タン
パク質を沈殿させた。次いでこれらの試料を遠心分離
し、すぐ前に記載したようにＨＰＬＣにより分析した。
ＡＰＯのアドリアマイシンへの加水分解は２時間以内に
起こらなかった。抗体−ＰＶＡ結合のＨ２９８１腫瘍細胞に対する結合 本発明のＬ６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のＨ
２９８１腫瘍細胞に結合する能力を実施例１および２に
記載したように測定した。結合検定の結果は図２２に示
される。ＦＡＣＳ分析はＬ６およびＬ６−ＰＶＡ結合体
がともに腫瘍細胞に強く結合し、１Ｆ５−ＰＶＡ結合体
が有意量の結合を示さなかったことを示した。この結合
研究は第１に酵素に対する結合が本発明の免疫結合体の
抗体成分の結合能力に実質的に影響を与えなかったこと
を示す。第２に、この検定はまた結合体の結合の特異性
を示し；Ｌ６−ＰＶＡ結合体がＬ６陽性Ｈ２９８１腫瘍
細胞に結合し、１Ｆ５抗体が腫瘍細胞に対する特異性を
欠くために１Ｆ５−ＰＶＡ結合体が実質的に結合を示さ
なかった。 本発明の抗体−ＰＶＡ結合体／アドリアマイシンプロド
ラッグ組合せのＨ２９
【００８２】８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性 本発明の抗体−ＰＶＡ／アドリアマイシンプロドラッグ
組合せのＨ２９８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞障害
効果を、実施例１および２に記載した 3Ｈ−チミジン取
込み検定に用いて測定した。簡単に記載すると、Ｈ２９
８１腫瘍細胞をＩＭＤＭ中で９６ウェルミクロタイター
プレート中に置き（１0,０００細胞／ウェル）、３７℃
で１８時間付着させた。次いで抗体−ＰＶＡ結合体、Ｌ
６−ＰＶＡまたは１Ｆ５−ＰＶＡ、を抗体１０μｇ／ｍ
l の濃度で加え、プレートを４℃で３０分間インキュベ
ートした。ついでウェルをＩＭＤＭで４回洗浄し、ＡＰ
ＯをＩＭＤＭ中の種々の濃度で加えた。２時間後にウェ
ルを再び洗浄し、ＩＭＤＭを加え、細胞を３７℃で１８
時間放置した。その時点で 3Ｈ−チミジンを加え（１μ
Ｃｉ毎ウェル）、６時間後にプレートを−７０℃で凍結
し、細胞を分離した。融解後細胞をガラス繊維ファイバ
ー上に収集した。 3Ｈ−チミジンをベックマン３８０１
シンチレーションカウンター中で測定し、ＡＰＯまたは
アドリアマイシン（ＡＤＭ）単独で処理した細胞と比較
した。この検定を用いて我々は腫瘍細胞のＤＮＡ中への
3Ｈ−チミジン取込みの阻止、従ってプロドラッグ、Ａ
ＰＯのＬ６−ＰＶＡまたは１Ｆ５−ＰＶＡ結合体による
細胞の前処理を有しまたは有さない細胞に対する細胞障
害効果を測定した。これらの組合せの細胞障害効果を親
薬物アドリアマイシン単独による細胞処理で認められた
細胞毒性と比較した。図２３に示されるように、結合体
による処理のない腫瘍細胞に対して３８ｎＭのＩＣ50を
有するアドリアマイシンが２μＭのＩＣ50を有するＡＰ
Ｏより有意に一層毒性であった。これはアドリアマイシ
ンアミドがアドリアマイシンよりも毒性が低いことを示
す以前の報告に基づいて予期された〔例えば、レビンほ
か (Y. Levin and B. A. Sela)、ＦＥＢＳレターズ (FE
BSLetters) 、９８、ｐ．１１９（１９７９）およびボ
ーレイン (R. Baurain) ほか、ジャーナル・オブ・メデ
ィシナル・ケミストリー (J. Med. Chem.)、２３、ｐ．
１１７１（１９８０）参照〕。
【００８３】細胞のＬ６−ＰＶＡによる前処理はＡＰＯ
の細胞毒性をアドリアマイシン単独に認められたものに
匹敵する水準に２０倍も増大した。細胞の１Ｆ５−ＰＶ
Ａによる前処理はＡＰＯの毒性に全く影響を与えなかっ
た。これらの結果はＬ６−ＰＶＡ結合体が比較的細胞障
害性のないプロドラッグＡＰＯを加水分解し、アドリア
マイシン単独の使用に匹敵する程度に腫瘍細胞を殺すこ
とができること、およびこの特定腫瘍細胞系に有意に結
合しない１Ｆ５−ＰＶＡ結合体がそのような細胞毒性を
示さなかった事実により示されるようにこの細胞毒性が
抗原特異性であることを示す。ドージリンパ腫細胞に対する抗体−ＰＶＡ結合体の結合 本発明のＬ６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の公
知ドージ細胞系に結合する能力もまた測定した。この細
胞系は、１Ｆ５抗体が結合するＣＤ−２０抗原を発現す
るＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２１３）バ
ーキット (Burkitt)リンパ腫細胞系である。結合検定は
実施例１に記載したように行なったが、しかし用いた細
胞系はドージ細胞であり、結果は図２４に示される。こ
の場合に、１Ｆ５単クローン性抗体および１Ｆ５−ＰＶ
Ａ結合体はともにリンパ腫細胞に強く結合した。従っ
て、この研究はまた結合体の結合能力が結合操作により
有意に影響されなかったことを示す。
【００８４】さらに、図に示されるように、Ｌ６抗体お
よびＬ６−ＰＶＡ結合体がドージ細胞に対して評価でき
る結合を示さなかった。これはドージ腫瘍細胞が、Ｌ６
抗体が反応する抗原を有しないので予期されたことであ
った。従って、ここに記載した前の結合研究と組合せ
て、この研究は明らかに本発明の結合体の結合の特異性
を示し、すなわち、Ｌ６含有結合体はＬ６陽性腫瘍細胞
に特異的に結合し、１Ｆ５含有結合体はＣＤ−２０陽性
腫瘍細胞に特異的に結合する。
【００８５】本発明の抗体−ＰＶＡ結合体／アドリアマ
イシンプロドラッグ組合せのドージ細胞に対する試験管
内細胞毒性 次いで我々はＡＰＯプロドラッグと組合せたＬ６−ＰＶ
Ａまたは１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のドージ細胞に対する試
験管内細胞障害効果を試験した。ドージ細胞が付着しな
い事実のため 3Ｈ−チミジン検定を多少変形して実質的
に前記実施例に記載したように行なった。従って、ＩＭ
ＤＭ中の約２５0,０００ドージ細胞を９６ウェルミクロ
タイタープレートの各ウェルに塗布し、抗体−酵素結合
体を加えた。反応混合物を４℃で３０分間インキュベー
トした。非結合抗体−酵素結合体を５００×ｇで５分間
遠心分離することにより除去し、上澄みを除去した。細
胞をＩＭＤＭ中に再び懸濁し、洗浄操作を３回繰返して
すべての非結合結合体を除去した。次いでＩＭＤＭ中の
ＡＰＯを２時間加え、前記のように１回洗浄した。検定
の残余は前記実施例に記載したように行なった。この検
定を用いて我々はドージ細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チミ
ジン取込みの阻止、従ってＬ６−ＰＶＡまたは１Ｆ５−
ＰＶＡ結合体による細胞の前処理を有しまたは有しない
細胞に対するＡＰＯプロドラッグの細胞障害効果を測定
した。これらの組合せの細胞障害効果をアドリアマイシ
ン単独による細胞の処理で認められた細胞毒性と比較し
た。図２５に示されるように、結合体による処理のない
ドージ細胞に対しアドリアマイシンはＡＰＯより有意に
一層毒性であった。１Ｆ５−ＰＶＡ結合体による細胞の
前処理はＡＰＯプロドラッグの細胞毒性をアドリアマイ
シン単独で認められたものに匹敵する水準に有意に増大
し、Ｌ６−ＰＶＡ結合体による前処理はそのような増大
を生じなかった。
【００８６】これらの結合および細胞毒性研究から得ら
れた結果が、Ｌ６−ＰＶＡプラスＡＰＯ組合せが増大し
た細胞障害効果を示し１Ｆ５−ＰＶＡプラスＡＰＯ組合
せが示さなかったＨ２９８１腫瘍細胞を用いたこの実施
例の前に記載した研究において得られた結果の逆である
ことに注意すべきである。これは結合体のＬ６および１
Ｆ５抗体の異なる特異性から予期され、明らかに本発明
の結合体／プロドラッグ組合せで得られた細胞障害効果
の特異性を示す。さらに、この研究は試験管内で腫瘍細
胞に対する細胞障害効果の生成に対するＡＰＯと組合せ
た１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の有用性を示す。従って、この
実施例の試験管内細胞毒性研究は抗体が反応する腫瘍の
処置のための腫瘍関連抗原と反応性の抗体を含む任意の
結合体に対する本発明の適用可能性を示す。
【００８７】実施例５ この実施例は抗体結合シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）酵
素によるプロドラッグ５−フルオロシトシン（以下「５
−ＦＣ」として示す）の抗腫瘍薬５−フルオロウラシル
（以下「５−ＦＵ」として示す）への転化に対する本発
明の免疫結合体および方法の使用に関する（図２６参
照）。この態様の抗体−ＣＤ結合／５−ＦＣプロドラッ
グ組合せは試験管内で試験管内で腫瘍細胞に対し有意な
細胞障害効果を示した。本発明の抗体−シトシンデアミナーゼ結合体の調製 先の実施例に示したＬ６および１Ｆ５単クローン性抗体
およびシトシンデアミナーゼ酵素を用いてＬ６−ＣＤお
よび１Ｆ５−ＣＤ免疫結合体を調製した。ＣＤ酵素は種
々の微生物から検出され、分離されたけれども〔例えば
ウェスト (West) ほか、ビオシミカ・エ・ビオフィシカ
・アクタ (Biochim. Biophys. Acta) 、７１９、ｐｐ．
２５１−５８（１９８２）参照〕、この実施例に用いた
特定のＣＤはイパタ (P. L. Ipata)ほか、「パン酵母シ
トシンデアミナーゼ。若干の酵素特性並びにヌクレオシ
ドおよびヌクレオチドによるアロステリック阻止」、バ
イオケミストリー（Biochemistry) 、１０、ｐｐ．４２
７０７６（１９７１）により報告された方法に類似する
方法で圧縮パン酵母から精製した。簡単に記載すると、
酵母細胞〔サッカロミセス・セレビシアエ (Saccharomy
ces cerevisiae) 〕（2.０kg）を酢酸エチルで原形質分
離し、硫酸アンモニウム沈降（５０〜７３％）を２回行
ない、粗酵素調製物を得た。硫酸アンモニウムペレット
を１０ mＭトリス−Ｃｌ緩衝液 pＨ8.０に対して透析
し、Ｑ−セファロース（Sepharose)アニオン交換カラム
〔ファルマシア (Pharmacia)製〕に適用し、ＫＣl 勾配
（０〜0.３Ｍ）で溶出させた。
【００８８】フラクションを、ニシヤマ (T. Nishiyam
a) ほか、「５−フルオロシトシンのシトシンデアミナ
ーゼカプセルと組合せたラットにおける抗腫瘍効果」、
カンサー・リサーチ (Cancer Research)、４５、ｐｐ．
１７５３〜６１（１９８５）の操作に従って、ＰＢＳ中
の基質としてシトシン（または５−ＦＣ）を用いて２７
℃でＣＤ活性について分析した。従ってこの操作に従っ
て、少量の酵素調製物を基質シトシン（または５−Ｆ
Ｃ）に加え、反応の過程をＵＶ分光測光により、0.１Ｎ
−ＨＣl でクエンチした分割量のウラシル（または５−
ＦＵ）の発生に対してモニターした。２５０／２８０
（シトシンに対し）および２５５／２９０（５−ＦＣに
対し）の比を形成されたウラシルまたは５−ＦＵの量の
測定に用いた。ＣＤ活性を測定するこの操作をＣＤ酵素
の精製の各段階並びに下記の本発明のＣＤ含有結合体の
精製の間に用いた。従って、ＫＣl 勾配の活性フラクシ
ョンをプールし、濃縮し、Ｇ−７５セファデックスカラ
ムで精製した。この段階で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１４
％、非還元性）はＣＤ活性を含むフラクションがＭＷ１
８ｋd の主タンパク質並びに２０および３０ｋd におけ
る少量のタンパク質からなった。このフラクションのＣ
Ｄ活性は１０Ｕ／ｍｇタンパク質であった（シトシンを
基質として使用）。他の調製物は１７Ｕ／ｍｇタンパク
質程度の高い活性を有する物質を生じた。タンパク質検
定はすべてピアス (Pierce, Rockford, IL) から入手で
きるＢＣＡタンパク質検定試薬を用いて行なった。
【００８９】次いで精製したＣＤを実施例１のＡＰ結合
体に対して記載したと実質的に同様の方法でＬ６または
１Ｆ５単クローン性抗体に結合させた。粗結合体（ヨー
ドアセトアミド未処理）をＳ−２００セファロース上の
ゲル濾過によりＰＢＳを溶離剤として用いて精製した。
フラクションは２８０ｎm でモニターし、各フラクショ
ンのＣＤの活性は直前に記載したように検定した。ＣＤ
−抗体比の適当な水準を有する結合体を含むフラクショ
ンをプールし、４〜１２％非還元性勾配ゲル上のＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析すると精製Ｌ６−ＣＤおよび１Ｆ
５−ＣＤ結合体調製物が得られた。
【００９０】抗体−シトシンデアミナーゼ結合体とプロ
ドラッグ５−フルオロシトシンとの反応 本発明のＬ６−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合体のプロド
ラッグ５−ＦＣを５−ＦＵに、または基質シトシンをウ
ラシルに転化する能力を次のように測定した：遊離ＣＤ
（最終濃度：５μｇ／ｍl ）、Ｌ６−ＣＤ結合体（最終
ＣＤ濃度：５μｇ／ｍl ）または１Ｆ５−ＣＤ結合体
（最終ＣＤ濃度：５μｇ／ｍl ）を、ａ）シトシンまた
はｂ）５−ＦＣのＰＢＳ中の３ mＭ溶液に２７℃で加
え、時間を追って形成された生成物の量を前記実施例節
に記載したように分光測光で測定した。結果は図２７に
示される。図に示されるように、５−ＦＵは遊離ＣＤ酵
素および本発明の抗体−ＣＤ結合体の両方によりプロド
ラッグ５−ＦＣから生じた。同図はまた、結合体がＣＤ
単独の活性に等しい活性を示す事実により明らかなよう
に、いずれの結合体の抗体に対する酵素の結合に基づく
ＣＤ酵素活性の有意な低下のないことを示す。遊離酵素
および結合体の比活性は約４Ｕ／ｍｇ酵素であった。比
較のため結合体の反応性を基質として５−ＦＣの代りに
シトシンを用いて試験した。図に示されるように、シト
シンを基質として、結合体はまた遊離ＣＤ酵素単独の活
性に実質的に等ＣＤ活性を示した。結合体の比活性──
１０Ｕ／ｍｇ結合酵素──はさらにＣＤの原酵素活性が
結合体中に保存されたことを示した。活性のこの水準は
結合体をＰＢＳ中に４℃で貯蔵したときに数週間維持さ
れた。
【００９１】抗体−ＣＤ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に
対する結合 本発明のＬ６−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合のＨ２９８
１腫瘍細胞に結合する能力を実施例１および２に記載し
たように測定した。結合検定の結果は図２８に示され
る。ＦＡＣＳ分析はＬ６およびＬ６−ＣＤが腫瘍細胞に
強く結合し、１Ｆ５−ＣＤ結合体が細胞に対する結合を
示さなかったことを示した。前記前の結合研究のよう
に、この検定は抗体の酵素に対する結合にもかかわらず
これらの結合体の結合活性の保存、並びに結合体の結合
の特異性を示す。 本発明の抗体−ＣＤ結合体／５−ＦＣプロドラッグ組合
せのＨ２９８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性 本発明の抗体−ＣＤ／５−ＦＣプロドラッグ組合せのＨ
２９８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性を実施例１
および２に記載した 3Ｈ−チミジン取込み検定に類似す
る 3Ｈ−ロイシン取込み検定を用いて測定した。この検
定によれば、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を有するＩ
ＭＤＭ0.１ｍl中の１０4 Ｈ２９８１細胞の懸濁液を９
６ウェルミクロタイタープレート中に置き、３７℃で一
夜付着させた。次いでプレートを洗浄し、0.１ｍl ＩＭ
ＤＭ中のＬ６−ＣＤまたは１Ｆ５−ＣＤ結合体（シトシ
ンを基質として用いて結合酵素ＣＤ活性１０Ｕ／ｍｇを
含む１０μｇ全タンパク質／ｍl ）を加えた。４℃で３
０分後に、プレートを４回洗浄し、薬物５−ＦＣまたは
５−ＦＵの種々の濃度を含むロイシン不含ＲＰＭＩ培地
0.１５ｍl をウェルに加えた。細胞を３７℃で１８時間
インキュベートし、次いでロイシン不含ＲＰＭＩ0.０５
ｍl 中の 3Ｈ−ロイシン（１μＣｉ／ウェル）で６時間
標識した。次いでこの実施例１および２に 3Ｈ−チミジ
ン取込み検定に対して記載したように処理した。
【００９２】この検定を用いて腫瘍細胞のタンパク質中
への 3Ｈ−ロイシンの阻止、従ってプロドラッグ５−Ｆ
Ｃの、Ｌ６−ＣＤまたは１Ｆ５−ＣＤ結合体による細胞
の前処理を有しまたは有しない細胞に対する細胞障害効
果を測定した。これらの組合せの細胞障害効果を親薬物
５−ＦＵ単独による細胞の処理で認められた細胞毒性と
比較した。図２９に示されるように、結合体による処理
のない腫瘍細胞に対して５−ＦＣは非常に小さい細胞障
害活性を示し、５−ＦＵは２０μＭのＩＣ50で細胞増殖
を阻止した。しかし、Ｌ６−ＣＤ結合体による細胞の前
処理は５−ＦＣの細胞毒性を５−ＦＵ単独で認められた
と等しい水準に増大した。この結果は抗原結合Ｌ６−Ｃ
Ｄが非毒性プロドラッグ５−ＦＣを５−ＦＵに転化する
ことができる事実と矛盾しない。非結合性結合体１Ｆ５
−ＣＤはそのような増大を示さず、この増大細胞毒性の
抗原特異的性質を示した。我々は本発明の多くの態様を
提供したけれども、我々の基本構成を変更し、本発明の
方法、免疫結合体およびプロドラッグを用いる他の態様
を与えることができることは明らかである。従って、本
発明の範囲が実施例として前に提供した特定態様よりは
むしろ特許請求の範囲により限定されるべきであること
が理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体−酵素結合体を結合する腫瘍細胞における
プロドラッグの活性化に用いる方策を示す図、
【図２】（Ａ）９6.５−ＡＰ免疫結合体、（Ｂ）Ｌ６−
ＡＰ免疫結合体、（Ｃ）ＡＰ、（Ｄ）単クローン性抗体
９6.５、（Ｅ）単クローン性抗体Ｌ６のＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル分析結果を示す写真、
【図３】エトポシドホスフェートおよびエトポシドチオ
ホスフェートプロドラッグの調製および加水分解を示す
図、
【図４】（Ａ）エトポシド−４′−ホスフェート単独、
（Ｂ）エトポシド単独、（Ｃ）エトポシド−４′−ホス
フェートプロドラッグとＡＰとの反応５分後の生成物、
（Ｄ）エトポシド−４′−ホスフェートプロドラッグと
Ｌ６−ＡＰ結合体との反応５分後の生成物のＨＰＬＣを
示す図、
【図５】エトポシド−４′−ホスフェートまたはエトポ
シド−４′−チオホスフェートのアルカリ性ホスファタ
ーゼ暴露による時間に関するエトポシド遊離を示すグラ
フ、
【図６】Ｈ３３４７腫瘍細胞に対する抗体および結合体
の結合を示すグラフ、
【図７】アルカリ性ホスファターゼ結合体に対する結合
検定の結果を示すグラフ、
【図８】エトポシドまたはエトポシドホスフェートプロ
ドラッグのモル濃度に対する殺される腫瘍細胞の割合を
示すグラフ、 │
【図９】薬物濃度とＨ３３４７腫瘍細胞のＤＮＡ中への
3Ｈ−チミジン取込み阻止との関係を示すグラフ、
【図１０】非処置または結合体処置腫瘍中のホスファタ
ーゼ活性を示し、図１０（Ａ）は全ホスファターゼ活性
と時間との関係を示すグラフ、図１０（Ｂ）はＨ−Ｅ染
色断面およびＡＰ基質キット測定結果を示す写真、
【図１１】非処置または処置マウスの腫瘍容積の時間に
関するグラフ、
【図１２】本発明に用いるマイトマイシン誘導体の化学
構造を示す図、
【図１３】ＭＯＰとアルカリ性ホスファターゼ酵素との
反応の時間に関するグラフ、
【図１４】Ｌ６および１Ｆ５単クローン性抗体並びにＬ
６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体のＨ２９８１腫瘍細
胞に対する結合を示すグラフ、
【図１５】Ｈ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チ
ミジン取込みの阻止を示すグラフ、
【図１６】Ｈ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チ
ミジン取込みの阻止を示すグラフ、
【図１７】ＣＥＭ細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チミジン取
込みの阻止を示すグラフ、
【図１８】マウス中の時間に関する腫瘍容積を示すグラ
フ、
【図１９】マウス中の時間に関する腫瘍容積を示すグラ
フ、
【図２０】アドリアマイシンプロドラッグの化学構造お
よび調製を示す図、
【図２１】Ｌ６−ＰＶＡ結合体およびＰＶＡ単独による
ＡＰＯの代謝を示すグラフ、
【図２２】Ｌ６単クローン性抗体並びにＬ６−ＰＶＡお
よび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に対す
る結合を示すグラフ、
【図２３】ＡＤＭ，ＡＰＯおよびＡＰＯ＋ＰＶＡ結合体
によるＨ２９８１細胞の阻止を示すグラフ、
【図２４】Ｌ６および１Ｆ５単クローン性抗体並びにＬ
６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のドージリンパ
腫細胞に対する結合を示すグラフ、
【図２５】ドージリンパ腫細胞のＤＮＡ中への 3Ｈ−チ
ミジン取込みの阻止を示すグラフ、
【図２６】５フルオロシトシン（５−ＦＣ）および５−
フルオロウラシル（５−ＦＵ）の化学構造を示す図、
【図２７】シトシンまたは５ＦＣとＣＤ、Ｌ６−ＣＤま
たは１Ｆ５−ＣＤとの反応の時間に関する生成物量を示
すグラフ、
【図２８】Ｌ６並びにＬ６−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤの
Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する結合を示すグラフ、
【図２９】Ｈ２９８１腫瘍細胞のタンパク質中への 3Ｈ
−ロイシン取込みの阻止を示すグラフ、である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵＣ 45/00 ＡＧＢ 45/00 ＡＧＢ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ 9/78 9/78 9/84 9/84 9/86 9/86 // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (72)発明者 マーク ジー ソールニア アメリカ合衆国 コネチカット州 06457 ミドルタウン ランドルフ ロード 1225 (72)発明者 ジョセフ ピー ブラウン アメリカ合衆国 ワシントン州 98109 シアトル ニュートン ストリート 409 (72)発明者 ディヴィッド イー カー アメリカ合衆国 ワシントン州 98199 シアトル トゥエンティエイス アベニュ ー ウェスト 3039

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式で表される化合物： 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、及びＲ3 はＯＨまたはＯＣＨ3 であ
    り；またはＲ1 はＯＨ、及びＲ3 はＯＣＨ3 であり；及
    びＲ2 はＨまたはＯＨである。） または以下の式で表される化合物： 【化２】 （式中、Ｒ1 はＨ、及びＲ3 はＯＨまたはＯＣＨ3 であ
    り；またはＲ1 はＯＨ、及びＲ3 はＯＣＨ3 であり；及
    びＲ2 はＨまたはＯＨである。）。
  2. 【請求項２】 Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセ
    チル）アドリアマイシンまたはＮ−（フェノキシアセチ
    ル）アドリアマイシン。
  3. 【請求項３】 相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対
    する細胞障害性が弱い、請求項（１）または（２）のい
    ずれか一項に記載の少くとも１種のプロドラッグ、及び
    該プロドラッグを一層細胞障害性の親薬物に転化できる
    酵素に結合した、前記腫瘍細胞の表面上の抗原と反応性
    の抗体を含む少くとも１種の抗体−酵素結合体を含む癌
    治療医薬組成物。
  4. 【請求項４】 該抗体がポリクローン性抗体、単クロ
    ーン性抗体、またはキメラ抗体からなる群から選ばれ
    る、請求項（３）記載の医薬組成物。
  5. 【請求項５】 該抗体が単クローン性抗体、Ｌ６、９
    6.５および１Ｆ５からなる群から選ばれる、請求項
    （３）記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】 該酵素がペニシリンアミダーゼ類から
    選択される、請求項（３）記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】 該酵素がペニシリンＶアミダーゼまた
    はペニシリンＧアミダーゼである、請求項（３）記載の
    医薬組成物。
  8. 【請求項８】 該プロドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキ
    シフェノキシアセチル）アドリアマイシン、Ｎ−（フェ
    ノキシアセチル）アドリアマイシン、Ｎ−（ｐ−ヒドロ
    キシフェニルアセチル）アドリアマイシン及びＮ−（フ
    ェニルアセチル）アドリアマイシンからなる群から選ば
    れる、請求項（３）記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】 該抗体−酵素結合体がＬ６−ペニシリ
    ンＶアミダーゼまたは１Ｆ５−ペニシリンＶアミダーゼ
    である、請求項（３）記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 該抗体−酵素結合体がＬ６−ペニシ
    リンＶアミダーゼであり、該プロドラッグがＮ−（ｐ−
    ヒドロキシフェノキシアセチル）アドリアマイシン及び
    Ｎ−（フェノキシアセチル）アドリアマイシンからなる
    群から選択される、請求項（３）記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 該腫瘍細胞が癌腫、黒色腫、リンパ
    腫、骨および軟組織肉腫並びに他の腫瘍からなる群から
    選ばれる起源である、請求項（３）記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に
    対する細胞障害性が弱いプロドラッグを１種以上使用す
    る、請求項（３）〜（11）のいずれか一項に記載の医薬
    組成物。
  13. 【請求項１３】 該プロドラッグが、アドリアマイシ
    ンのＮ−フェノキシアセチル誘導体類及びＮ−フェニル
    アセチル誘導体類からなる群から選択される、請求項
    （12）記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 一種以上の抗体−酵素結合体を使用
    し、前記各結合体の抗体は該腫瘍細胞の表面上に存在す
    る同一または異なる抗原と反応性であり、前記各結合体
    の酵素は同一または異なり、かつ相当する親薬物より腫
    瘍細胞に対して弱い細胞傷害性を有する少なくとも一種
    のプロドラッグを、より一層細胞傷害性の親薬物に転化
    することができる、請求項（３）記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 二つの分離した成分からなるキット
    であって、一つの成分は少なくとも一種の抗体−酵素結
    合体を含み、及び他の成分は少なくとも一種の、請求項
    1 〜14のいずれか一項に記載の、相当する親薬物より腫
    瘍細胞に対して弱い細胞傷害性のプロドラッグを含む、
    上記キット。
  16. 【請求項１６】 該抗体−酵素結合体がＬ６−ペニシ
    リンＶアミダーゼである、請求項(15)記載のキット。
  17. 【請求項１７】 該プロドラッグが、アドリアマイシ
    ンのＮ−フェノキシアセチル誘導体類及びＮ−フェニル
    アセチル誘導体類からなる群から選択される、請求項
    （15）記載のキット。
  18. 【請求項１８】 該抗体−酵素結合体が、少なくとも
    一種の弱い細胞傷害性を有するプロドラッグをより一層
    細胞傷害性の親薬物に転化することができる酵素の少な
    くとも機能的に活性部分に結合した腫瘍関連抗原と反応
    性である抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タン
    パクである、請求項（３）記載の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項（１）及び（２）のいずれか
    一項に記載の化合物を製造する方法であって、以下の一
    般式で表される化合物(III) を一般式(IV)で表される化
    合物の活性誘導体と反応を行い、一般式（Ｉ）または
    （II）で表される化合物を形成することを特徴とする上
    記方法。 【化３】 【化４】 （式中、Ｒ2 はＨまたはＯＨを表し、Ｘは単結合または
    Ｏを表す。）
  20. 【請求項２０】 請求項（１）または（２）に記載の
    少なくとも一種のプロドラッグを適する投与形態で提供
    することを含む請求項（１）または（２）に記載の医薬
    組成物を製造する方法。
  21. 【請求項２１】 該抗体−酵素結合体及び該プロドラ
    ッグを組み合わせる工程を含む、請求項（15）〜（17）
    のいずれか一項に記載のキットを作成する方法。
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