JPH10136815A - インビトロで多量の生育可能な綿植物を生産するための組織培養法 - Google Patents

インビトロで多量の生育可能な綿植物を生産するための組織培養法

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JPH10136815A
JPH10136815A JP9065265A JP6526597A JPH10136815A JP H10136815 A JPH10136815 A JP H10136815A JP 9065265 A JP9065265 A JP 9065265A JP 6526597 A JP6526597 A JP 6526597A JP H10136815 A JPH10136815 A JP H10136815A
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medium
shoots
plant
cotton
vitamins
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JP9065265A
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English (en)
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Tsuri Rakesh
ツリ ラケシュ
Kumar Suribasutaba Arok
クマル スリバスタバ アロク
Kumar Gupta Sib
クマル グプタ シブ
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Council of Scientific and Industrial Research CSIR
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Council of Scientific and Industrial Research CSIR
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、綿植物の特定の組織からインビト
ロで多量の生育可能な綿植物を生産するための組織培養
法に関する。 【解決手段】 本発明の方法は、綿苗木の子葉の１つま
たは一部が有りまたは無しで子葉節（子葉葉腋または軸
とも呼ぶ）から出発して組織培養法により多量の生育可
能な受精能力のある綿植物を再生することよりなる。本
発明の方法は、遺伝子型非依存性で、直接、複数の苗条
増殖を提供し、農業バイオテクノロジーや遺伝子工学の
現代的方法により、微細繁殖、突然変異体の選択の可能
性、および遺伝的に改良した綿植物を生産する可能性を
切り開く。本方法は、組織培養法を用いる綿改良計画の
成功に重要な一歩を与える。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、綿植物の特定の組
織からインビトロで多量の生育可能な綿植物を生産する
ための組織培養法に関する。本発明の方法は、遺伝子型
非依存性で、直接、複数の苗条増殖を提供し、農業バイ
オテクノロジーや遺伝子工学の現代的方法により、微細
繁殖、突然変異体の選択の可能性、および遺伝的に改良
した綿植物を生産する可能性を切り開く。本方法は、組
織培養法を用いる綿改良計画の成功に重要な一歩を与え
る。
【０００２】
【従来の技術】綿は、主に繊維を目的として栽培される
世界的に重要な作物である。その種子は、家畜の餌の重
要な供給源である。綿は、世界中の国の経済的発展に影
響を与えてきた。従って、現代の農業バイオテクノロジ
ーの方法による綿改良計画は世界的に大きな関心を集め
ている。これは、綿植物の遺伝子工学の現代的方法の応
用を促進する組織培養法の開発の重要性を増加させた。
【０００３】綿の組織培養に関していくつかの報告が公
表されている。それらは、懸濁培養やカルス培養を用い
る、直接の苗条分化や体細胞性胚形成に関する。参考の
ため、そのリストを以下に示す。
【０００４】組織培養法による微細繁殖に結びつく器官
形成と再生は、いくつかの植物種、例えばインゲン豆
（Phaseolus ）種で成功している（ルブルオ，エーとカ
ルタ，ケー・ケー（Rubluo A & Kartha KK）、1985、種
々のインゲン豆（Phaseolus ）種と品種の頂端分裂組織
のインビトロ培養、J. of Plant physiol 119:425-43
3）。グリシンマックス（Glycine max ）（シェティ，
ケー、アサノ，ワイ、およびオオサワ，ケー（Shetty
K., Asano Y and Oosawa K ）1992、アラントインとア
ミドによるグリシンマックスメリル（Glycine max Merr
ill ）のインビトロの苗条器官形成の刺激。Plant Sei.
81:245-252 ）、カジャヌス・カジャン（Cajanus caja
n ）（シブ・プラカシュ，エヌ、ペンタール，ディーお
よびバーラ−サリン，エヌ（Shiv Prakash N, Pental D
& Bhalla-Sarin N ）1994、複数の苗条形成を介する子
葉節からのキマメ（pigeonpea ）（カジャヌス・カジャ
ン（Cajanus cajan ））の再生、Plant Cell Rep. 13:6
23-622）、カーネーション（クレア−アネブ，エー、ヤ
ンチェバ，エス、およびドンス，エイチ（Claire-Annev
A. Yancheva S and Dons H ）1995、カーネーション苗
条の節領域を有する細胞は不定苗条形成の高い可能性を
示す、Plant Cell tiss. Org Cult. 40:154-157 ）な
ど。
【０００５】組織培養法による植物の再生は充分確立さ
れている。器官形成（organogenesis ）または体細胞性
胚形成（somatic embryogenesis ）により、インビトロ
で広範な植物種の再生が成功している。器官形成により
器官、すなわち、苗条（または根）が形成され、これを
単離して根（または苗条）の成長を誘導して植物全体を
生産することができ、一方体細胞性胚形成では、苗条と
根の両方を有する体細胞性胚（遺伝的受精なしで成長す
る胚）が成長し、植物全体になる。植物の各部分や細胞
が再生して完全な植物になる能力（全能性（totipotenc
y ）と呼ぶ）は周知の現象であるが、このような再生を
可能にする条件を発明するために各植物または植物の部
分を研究する必要がある。このような培養物の成長と分
化を支配するいくつかの因子が決定されている。異なる
群の植物ホルモンの間の相互作用の確立、増殖制御物質
単独または組合せが、細胞、組織および器官の間に存在
するいくつかの関係に関与している。従って、分化の成
功は、外植片の型、外植片の生理学的条件および培養中
の外植片の物理的および化学的環境に依存する。このた
め、組織培養の科学は、起源植物の生理学的条件、外植
片の型、培養条件、および組織培養を開始するために使
用される植物ホルモンの最適化に向けられてきた。これ
は、組織培養による植物の増殖のための新しい方法の開
発は決して自明ではないことを実証している。
【０００６】ケースバイケースで検討すべき大きな側面
は、再生を誘導する植物増殖制御物質の型と植物増殖制
御物質の量である。さらに、培地の化学的組成、増殖温
度、および他の培養条件が、器官形成や体細胞性胚形成
の誘導、および苗条や根の成熟および健康な受精能力の
ある植物の形成において重要な役割を果たす。培地、ホ
ルモンおよび増殖条件への応答は、植物の種毎および変
種毎に異なる。従って、植物の効率的な再生、器官形
成、および体細胞性胚形成の条件を発明するには、特定
の植物についての専門知識を開発することが必要であ
る。
【０００７】組織培養において革新が必要な他の主要な
領域は、培養条件に有効に応答して豊富に再生される植
物の部分を同定することである。ある種の植物のすべて
の部分が、効率的に再生されるわけではない。植物の組
織培養を成功させるものは、全能性のために同定された
植物の部分（外植片と呼ぶ）、外植片の生理学的状態、
および増殖条件、特に組織培養の植物の成功を決定する
増殖制御物質の複雑な組合せである。ある植物の異なる
外植片は、増殖のために条件に対して、普通非常に異な
る応答を示す。再生のために一般的な原理を応用するこ
とはできない。各場合で、外植片の同定と培養条件の同
定が、１つの植物を多くの植物または体細胞性胚に再生
するための組織培養方法の開発のための革新的工程であ
る。
【０００８】現在、綿の培養した変種の組織外植片から
の複数の苗条の形成に関する詳細な文献はない。本発明
は、組織培養により綿植物の複数の苗条を得るための綿
苗木の小部分（外植片と呼ぶ）からの器官形成の詳細な
方法を、初めて記載するものである。本方法は、本発明
者が試験したすべての品種への広い応用を示し、苗条を
効率的に成熟させることができるため、微細繁殖および
遺伝的形質転換のために農業バイオテクノロジーにおい
て非常に有用である。本方法は、現代の農業バイオテク
ノロジー法による綿改良計画において大きな可能性を有
する。
【０００９】体細胞性胚形成（受精を経ることなく正常
の植物を生み出す構造）を引き起こす組織培養条件を扱
ういくつかの報告（ダビドニス，ジー・エイチ、および
ハミルトン，アール・エイチ（Davidonis GH and Hamil
ton RH）1983、ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossyp
ium hirsutum L）のカルス組織からの植物再生、Plant
Sci. Lett. 32:89-93 ；シューメーカー，アール・シ
ー、コウチェ，エル・ジェイおよびガルブレイス，ディ
ー・ダブリュー（Shoemaker RC, Couche LJ & Galbrait
h DW）1986、綿（ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Goss
ypium hirsutum L）の体細胞性胚形成と植物再生の性状
解析、Plant Cell Rep. 3:178-181 ；トロリンダー，エ
ヌ・エルおよびグージン，ジェイ・アール（Trolinder
NL and Goodin JR）1987；綿ゴシピウム・ヒルスツム・
エル（Gossypium hirsutum L）の体細胞性胚形成と植物
再生、Plant Cell Rep. 6:231-234 、ファイナー，ジェ
イ（Finer J.）1988。ゴシピウム・ヒルスツム（Gossyp
ium hirsutum）の体細胞性胚形成懸濁培養からの植物再
生、Plant Cell Rep. 7:399-402 ）が報告されている。
体細胞性胚形成の開始と成熟には数ヶ月が必要である。
本方法は遺伝子型への依存性が高く（トロリンダー，エ
ヌ・エルおよびジジアン，シー（Trolinder NLand Xhix
ian C. ）1989、綿の体細胞性胚形成応答の遺伝子型特
異性、Plant Cell Rep. 8:133-136 ）、従って変種の限
定された群に応用される。体細胞性胚形成の開始と成熟
には数ヶ月が必要であり、体細胞性胚形成を介して再生
される植物は、細胞学的および形態学的に異常であると
しばしば報告されている（ステリー，ディー・エム、ア
ルトマン，ディー・ダブリュー、コーヘル，アール・ゼ
ット、ランガン，ティー・エス、およびコメスキー，イ
ー（Stelly DM, Altman DW, Kohel Rz, Rangan TS, & c
ommeskey E）1989、カルス培養物からの綿体細胞クロー
ンの細胞学的異常、Genome 32:762-770 ）。体細胞性胚
形成を介して成長した植物は、繁殖不能であるとしばし
ば報告された（トロリンダー，エヌ・エルおよびグージ
ン，ジェイ・アール（Trolinder NL and Goodin JR）19
87、綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirs
utum L）の体細胞性胚形成と植物再生、Plant Cell Re
p. 6:231-234 ）。
【００１０】これらの再生方法は、綿のアグロバクテリ
ウム（Agrobacterium ）媒介遺伝的移動での使用が成功
している（ウンベック，ピー、ジョンソン，ジー、バー
トン，ケー、スワイン，ダブリュー（Umbeck P, Johnso
n G, Barton K. Swain W）1987、遺伝的に形質転換した
綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum
L）、Plant Bio./Technology 5:263-266 ；フィロオザ
バジー，イー、デボアー，エル・ディー、メルロ，ジェ
イ・ディー、ハルク，エル・イー、アマーソン，エヌ・
エル、ラシュカ，ケー・イー、およびムレイ，イー・イ
ー（Firoozabady E., DeBoer LD, Merlo JD, Halk LE,
Amerson, NL, Rashka KE and Murrey EE）1987、アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）による綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gos
sypium hirsutum L）の形質転換とトランスジェニック
植物の再生、Plant Mol. Biol. 10:105116）、および粒
子衝撃法（ファイナー，ジェイ・ジェイ、およびマクム
レン，エム（Finer JJ andMcMullen M ）1990、粒子衝
撃法を介する綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossyp
ium hirsutum L）の形質転換、Plant Cel-I Rep. 8:586
-589）。いくつかの細菌遺伝的、例えば除草剤耐性をコ
ードする遺伝子（ベイレイ，シー、トロリンダー，エヌ
・エル、レイ，シー、モルガン，エム、キセンベリー，
ジェイ・イー、およびオーダブリュー・ディーダブリュ
ー（Bayley C, Trolinder NL, Ray C,Morgan M, Quisen
berry JE and OW DW ）1992、２，４−Ｄ耐性の綿への
付与、Theo, Appl. Genet. 83:45-649）およびバシルス
・スリンギエンシス（Bacillusthuringiensis）エンド
トキシン遺伝子（パーラック，エフ・ジェイ、ディート
ン，アール・ダブリュー、アームストロング，ティー・
エー、フックス，アール・エル、シムス，エス・アー
ル、グリーンプレート，ジェイ・ティー、およびフィッ
シュホフ，ディー・エー（Perlak FJ, Deaton RW, Arms
trong TA, Fuchs RL, Sims SR, Greenplate JT & Fisch
hoff DA ）1990、昆虫耐性綿、plants. Bio/Technology
8:939-943）が、トランスジェニック綿植物においてう
まく発現されている。しかし、他の品種は、上記組織培
養、すなわち体細胞性胚形成法に応答しなかったため、
これらの進歩は現在、綿のコーカー（Coker ）品種にの
み限定されている。
【００１１】無菌組織培養条件下で綿植物の増殖してい
る茎頂組織から１つの苗条をインビトロで成長させる方
法が発表されている（ゴウルド，ジェイ、バニスター，
エス、ハセガワ，オー、ファヒマ，エム、スミス，アー
ル・エイチ（Gould J, Banister S, Hassegawa O, Fahi
ma M., Smith RH ）1991、形質転換のための茎頂組織か
らのゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）と
ゴシピウム・バーバデンセ（G. barbadense ）の再生、
Plant Cell Rep. 10:12-16）。綿植物の頂端分裂組織と
苗条先端が不定芽と複数の苗条を得るための培養に使用
されている（バジャジ，ワイ・ピー・エス、およびマン
ジート・ジル（Bajaj YPS and ManjeetGill）1986；苗
条先端と分裂組織培養による綿ゴシピウム（Gossypium
）種の保存、Indian J of Exp. Biol. 24:581-583
）。これらの報告において、培養物の応答は遺伝子型
依存性であり、根がでることはまれであった。この問題
のため、これらの方法の再原子性はあまり良くない。
【００１２】最近、（マクカベ，ディー・イー、および
マルチネリ，ビー・ジェイ（McCabeDE and Martinelli
BJ ）1993、分裂組織の粒子衝撃による優秀な綿品種の
形質転換、Bio/Technology 11:596-598 ；クラン，シー
・エー、リン，ジェイ、ケアリー，ジェイ・ダブリュ
ー、およびクリーブランド，ティー・イー（Chlan CA,L
in J, Cary JW & Cleveland TE ）1995、分裂組織から
のトランスジェニック綿の衝撃形質転換と再生法、Plan
t Mol. Bio. Rep. 13:31-37 ）衝撃形質転換法により遺
伝子を導入するのに綿胚軸が使用された。これらの報告
において、１つの頂端分裂組織が１つの苗条に増殖し
た。次に再生した苗条は適当な培地で根を出し、綿の成
熟植物を得た。そのようなすべての報告においては、１
つの頂端分裂組織が１つの成熟植物になり、多くの形質
転換体は形質転換遺伝子の発現に関してキメラであった
ため、形質転換と再生は非効率的であった。このような
方法は、本発明に開示されるように１つの外植片から多
くの植物が成長するような方法を開発することにより大
幅に改良される。
【００１３】表１は、特許でカバーされるかまたは文献
記載の綿植物に関連した組織培養法の現状の技術を要約
する。次に、公知の現状技術と比較した我々の方法を記
載する。
【００１４】培地に使用した植物増殖制御物質（ホルモ
ン）の本文中で使用した略語は、以下の通りである：Ｂ
ＡＰ（６−ベンジルアミノプリンまたは６−ベンジルア
デニン）、２ｉＰ（γ，γジメチルアリルアミノプリ
ン）、Ｋｉｎ（キネチン）、１ＡＡ（インドール酢
酸）、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、１ＢＡ（インドール
酪酸）、ＴＤＺ（１−フェニル−３，１，２，３チジア
ゾール−５−イル尿素）、ＤＵ（ジフェニル尿素）、Ｐ
Ｕ（Ｕ−１−フェニルＮ４ピリジル）尿素）および２，
４−Ｄ（２，４−ジフェノキシ酢酸）。
【００１５】
【表１】 表１ 報告 再生の様式 植物ホルモン 外植片 備考 ──────────────────────────────────── １．ダビドニス，ジー・エイチ、およびハミルトン，アール・エイチ（Davidoni s GH and Hamilton RH）1983、ゴシピウム・ヒルスツム・エル（G. hirsutum L ）のカルス組織からの植物再生、Plant Sci. Lett. 32:89-93 体細胞性胚形成 ＮＡＡおよびＫｉｎｅ 子葉 ＮＡＡとｋｉｎの非存在下で３０gm/lを含有するＬＳ培地で増殖させたゴシピウ ム・ヒルスツム・エル・コーカー（G. hirsutum L Coker ）310 の２才のカルス を使用した。３０％の培養物が体細胞性胚形成を与えた。 ２． ダビドニス，ジー・エイチ、ムンマ，アール・オー、およびハミルトン， アール・エイチ（Davidonis GH, Mumma RO, Hamilton RH ）1987、組織培養から の綿植物の調節再生、米国特許第4672035 号 同上 同上 同上 同上
【００１６】 ３．シューメーカー，アール・シー、コウチェ，エル・エスおよびガルブレイス ，ディー・ダブリュー（Shoemaker RC, Couche LS & Galbraith DW）1986、綿（ ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum L）の体細胞性胚形成と植 物再生の性状解析、Plant Cell Rep. 3:178-181 体細胞性胚形成 ＮＡＡ、Ｋｉｎｅ 胚軸 綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum L）の１７つの品種を体 細胞性胚形成について評価した。ＭＳ塩、ＮＡＡおよびｋｉｎを含有する培地で のカルスの一連の形態後。数週間後、体細胞性胚形成の存在についてカルスを観 察した。品種コーカー（coker ）２１０とコーカー（coker ）３１５が、胚形成 性であると同定された。胚を単離し、植物に成長させた。 ４．トロリンダー，エヌ・エルおよびグージン，ジェイ・アール（Trolinder NL and Goodin JR）1987；綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum L）の体細胞性胚形成と植物再生、Plant Cell Rep. 6:231-234 ２，４−Ｄ、Ｋｉｎ 胚軸 ６週令のカルス培養物で球状胚を観察した。この段階でカルスを、増殖制御物質 を含まない培地にサブ培養した。３〜４週間後、懸濁液をふるいにかけて、球状 で心臓型段階の胚を集めた。集めた胚を固化培地上で成熟するまで成長させた。 成熟した胚を発芽させて植物とした。この方法で成長した多くの植物は繁殖不能 であった（１５％のみが受精能力があった）。 ５．トロリンダー，エヌ・エルおよびジジアン，シー（Trolinder NL and Xhixi an C. ）1989、綿の体細胞性胚形成応答の遺伝子型特異性、Plant Cell Rep. 8: 1 ２，４−Ｄ、Ｋｉｎ 胚軸 ゴシピウム（Gossypium ）の３８の品種（cultivar）、株および品種（race）を 、コーカー（Coker ）３１２について開発された方法で体細胞性胚形成について スクリーニングした。スクリーニングは、胚形成に遺伝子型変化が存在すること を示した。コーカー（Coker ）３１２について開発されたモデルには、わずかの 遺伝子型のみが応用できる。
【００１７】 ６．ステリー，ディー・エム、アルトマン，ディー・ダブリュー、コーヘル，ア ール・ゼット、ランガン，ティー・エス、およびコメスキー，イー（Stelly DM, Altman SW, Kohel RZ, Rangan TS, & Commeskey E）1989、綿培養物の細胞学的 異常、Genome 32:762-770 体細胞性胚形成により再生した植物では高頻度の染色体異常が観察され、体細胞 性胚形成で再生した多くの植物は繁殖不能であった。 ７．ファイナー，ジェイ（Finer J.）1988。ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypiu m hirsutum）の体細胞性胚形成懸濁培養からの植物再生、Plant Cell Rep. 7:39 9-402 体細胞性胚形成 ＮＡＡ、Ｋｉｎ、ピクロラム（Picloram）、２，４−Ｄ 子葉 維持可能な胚形成性懸濁培養物を開発した。胚形成性組織をオーキシンを含まな い培地に移して胚を観察した。得られた植物は繁殖不能であった。 ８．ファイナー，ジェイ・ジェイ（Finer J ）、1990、培養細胞から綿を再生す るための効率的な方法、特許第ＺＡ／Ｚ８８０８５９９号 同上 同上 同上 同上
【００１８】 ９．ランガン，ティー・エス（Rangan TS ）1993、綿の再生、特許第５２４４８ ０２号 体細胞性胚形成 ＮＡＡ、Ｋｉｎ 胚軸、子葉、未成熟な胚 ＮＡＡとＫｉｎを含有するＭＳ培地でカルスを開始させ、増殖のための３週間目 毎にサブ培養した。組織をカルス開始培地に入れて４〜６週間後に体細胞性胚が 見られた。インビトロで多くの変種が胚形成であることが見いだされた。ＳＪ２ 、ＳＪ４、ＳＪ５、ＳＪ２Ｃ、ＧＣ５１０、Ｂ１６４４、Ｂ２７１０。 １０．ガウェル，エヌ・ジェイおよびロバッカー，シー・ディー（Gawel NJ and Robacker CD）1990、半固体対液体増殖培地上での２つのゴシピウム・ヒルスツ ム（Gossypium hirsutum）遺伝子型の体細胞性胚形成、Plant Cell Tissue Orga n Culture 23:201-204 体細胞性胚形成 ２，４Ｄ、Ｋｉｎ 成熟顕花植物からの葉柄 液体培地対固体培地で体細胞性胚形成について比較試験を行い、コーカー（Coke r ）３１２とＴ−２５と命名した両方で液体培地での培養の方が胚形成性であっ た。 １１．バジャジ，ワイ・ピー・エス、およびジル，エム（Bajaj YPS and Gil M. ）1986；苗条先端と分裂組織培養による綿ゴシピウム（Gossypium ）種の保存、 Indian J. of Exp. Biol. 24:581-583 カルス培養物、不定芽培養物、および複数の苗条 ＮＡＡ、ＩＡＡ、Ｋｉｎ 苗条先端 培養物の応答は遺伝子型依存性であり、数個の培養物のみが複数の苗条を与え、 根付きも非常にまれであった。
【００１９】 １２．ゴウルド，ジェイ、バニスター，エス、ハセガワ，オー、ファヒマ，エム 、スミス，アール・エイチ（Gould J, Banister S, Hassegawa O, Fahima M., S mith RH ）1991、形質転換のための茎頂組織からのゴシピウム・ヒルスツム（Go ssypium hirsutum）とゴシピウム・バーバデンセ（G. barbadense ）の再生、Pl ant Cell Rep. 10:12-16 あらかじめ存在する分裂組織からの器官形成 無し 頂端苗条分裂組織 この方法を用いて、ゴシピウム・バーバデンセ・ピマＳ−６（G. barbadense Pi ma S-6）とゴシピウム・ヒルスツム（G. hirsutum ）の１９品種の正常の繁殖能 力のある植物が再生されたが、１つの外植片から１つの苗条のみが形成され、根 付きは最適化できなかった。 １３．ウンバック，ピー、ジョンソン，ジー、バートン，ケー、スワイン，ダブ リュー（Umback P, Johnson G, Barton K. Swain W）1987、遺伝的に形質転換し た綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum L）、Plant Bio./Tec hnology 5:263-266 １４．ウンバック，ピー 1991 、組織培養により形質転換した綿細胞を生産する 方法、特許番号 INA 168950 綿の形質転換と植物の再生 ２，４−Ｄ、Ｋｉｎ 胚軸 綿の遺伝的形質転換が開示された。綿の未成熟組織を、アグロバクテリウム・ツ メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）媒介遺伝的形質転換法によりイ ンビトロで形質転換した。得られた綿組織を、薬剤で選択して形質転換について スクリーニングした。次に形質転換した培養物を誘導して体細胞性胚を得た。体 細胞性胚を成熟植物に成長させた。コーカー（Coker ）３１０、３１２、および ５１１０をこの方法で形質転換した。
【００２０】 １５．フィロオザバジー，イー、デボアー，エル・ディー、メルロ，ジェイ・デ ィー、ハルク，エル・イー、アマーソン，エヌ・エル、ラシュカ，ケー・イー、 およびムレイ，イー・イー（Firoozabady E., DeBoer LD, Merlo JD, Halk LE, Amerson, NL, Rashka KE and Murrey EE）1987、アグロバクテリウム・ツメファ シエンス（Agrobacterium tumefaciens ）による綿ゴシピウム・ヒルスツム・エ ル（Gossypium hirsutum L）の形質転換とトランスジェニック植物の再生、Plan t Mol. Biol. 10:105-116 綿の形質転換と植物の再生 ２ｉＰ、ＮＡＡ 子葉 １２日令の苗木から子葉外植片を形質転換し、植物を再生した。再生のために、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）で処理 した外植片を、静菌剤および選択剤を含有する培地に移し、形質転換した細胞の みがカルスを生成するようにした。カルスをホルモンを含まない培地にサブ培養 すると、トランスジェニック植物を与えた。この方法を用いて、ゴシピウム・ヒ ルスツム・コーカー（G. hirsutum Coker ）２０１を形質転換した。 １６．パーラック，エフ・ジェイ、ディートン，アール・ダブリュー、アームス トロング，ティー・エー、フックス，アール・エル、シムス，エス・アール、グ リーンプレート、およびフィッシュホフ，ディー・エー（Perlak FJ, Deaton RW , Armstrong TA, Fuchs RK, Sims SR, Greenplate & Fischhoff DA）1990、昆虫 耐性綿、plants. Bio/Technology 8:939-943 ２，４−Ｄ、Ｋｉｎ 胚軸 バシルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）クルスタキ（Kurstaki ）変種ＨＤ−１［cry 1A(b) とHD73 Cry1A(c) ］の昆虫制御タンパク質遺伝子の 端を切り取った型を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）を介して綿胚軸部分に形質転換し、形質転換した細胞から体細胞 性胚を得て、最後にゴシピウム・ヒルスツム・コーカー（G. hirsutum Coker ） ３１２の昆虫耐性綿植物を得た。
【００２１】 １７．ベイレイ，シー、トロリンダー，エヌ・エル、レイ，シー、モルガン，エ ム、キセンベリー，ジェイ・イー、およびオーダブリュー・ディーダブリュー（ Bayley C, Trolinder NL, Ray C, Morgan M, Quisenberry JE and OW DW ）1992 、２，４−Ｄ耐性の綿への付与、Theo, Appl. Genet. 83:645-649 ２，４−Ｄ、Ｋｉｎ 胚軸 アルカリゲヌス・ユートロフス（Alcaligenus eutrophus ）からの２，４−Ｄモ ノオキシゲネース遺伝子ｔｆｄ Ａを単離し、修飾し、タバコで発現し、アグロ バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）により綿植物 の形質転換を行い、２，４−Ｄ耐性植物のコーカー（Coker ）３１２株を得た。 １８．ランガン，ティー、ラジュセクラン、フヅスペスおよびエノフスキー（Ra ngan T, Rajsekran, Hudspeth and Yenofsky）（1989）綿の再生と形質転換、特 許ＥＰ３４４３０２号 トランスジェニック植物の形質転換と再生（体細胞性胚形成を介して） ＮＡＡ、Ｋｉｎ 胚軸、子葉、未成熟胚 綿（ＳＪ２、ＳＪ４、ＳＪ５、ＳＪ２−１、ＧＣ５１０、Ｂ１６４４、Ｂ２７１ ０、Ｂ１８１０、シオクラのピッカー変種（Picker Variety of Siokra）および スチッパー（stipper ）ＦＣ２０１７変種）の再生と形質転換。ビースレイとチ ング培地（Beasley and Ting's medium ）で発芽させたカルスから得たアグロバ クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）体細胞性胚によ り、形質転換を行なった。
【００２２】 １９．ファイナー，ジェイ・ジェイ、およびマクムレン（Finer JJ and McMulle n ）1990、粒子衝撃法を介する綿ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hi rsutum L）の形質転換、Plant Cel-I Rep. 8:586-589 トランスジェニック植物の形質転換と再生（体細胞性胚形成を介して） ＮＡＡ、Ｋｉｎ、２，４−Ｄ、ピクロラム（picloram） 子葉の葉のディスク プラスミドＤＮＡを有する高密度粒子が胚形成性植物細胞に向かって加速する粒 子衝撃法を、綿の胚形成性懸濁培養について行なった。次にこれらの細胞を、選 択物質（ヒグロマイシ）の存在下で体細胞性胚成長をさせた。この方法でコーカ ー（Coker ）３１０変種を形質転換した。 ２０．マクカベ，ディー・イー、およびマルチネリ，ビー・ジェイ（McCabe DE and Martinelli BJ ）1993、分裂組織の粒子衝撃による優秀な綿品種の形質転換 、Bio/Technology 11:596-598 あらかじめ存在する分裂組織からの器官形成 ＢＡ（１５時間の短い処理） 胚軸 この方法は、発芽している種子から胚軸を切り出し、外来遺伝子を有する粒子を 胚軸に噴射させる。処理した胚軸から、植物が成長し、形質転換した植物につい てスクリーニングを行なった。１つの軸から１つの植物のみが成長した。この方 法を用いて、以下の綿品種を形質転換した。ピマ（pima）、海島綿（sea island cotton ）、新世界綿（upland）品種。 ２１．マクカベ，ディー・イー、およびマルチネリ，ビー・ジェイ（McCabe DE and Martinelli BJ ）1992、綿の粒子媒介形質転換、特許ＰＣＴ／ＵＳ９０／０ １７２号 同上 同上 同上 同上
【００２３】 ２２．クラン，シー・エー、リン，ジェイ、ケアリイ，ジェイ・ダブリュー、お よびクリーブランド，ティー・イー（Chlan CA, Lin J, Cary JW & Cleveland T E ）1995、分裂組織からのトランスジェニック綿の衝撃形質転換と再生法、Plan t Mol. Bio. Rep. 13:31-37 あらかじめ存在する分裂組織からの器官形成 ＢＡ、ＩＡＡ 胚軸 胚軸を無菌的に除去し、ＤＮＡコーティング１．６Ａ°金粒子を破裂圧９０〜１ １０kg/cm2で衝撃させた。衝撃後これらの組織はカナマイシン選択の存在下で増 殖して全植物となった。１つの軸は１つの植物のみを与えた。 ────────────────────────────────────
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、綿苗木から
の頂端外植片で新しい分裂組織帯を成長させ、多量の苗
条を与える、効率的な方法を初めて提供するものであ
る。さらに外植片は基底部に器官形成塊を形成し、これ
は小さい部分に分割されて、複数の苗条の再生が再現性
良く繰り返されるサイクルが維持される。本発明の方法
は、非常に簡単であり、ゴシピウム（Gossypium ）種の
広範囲の変種や種に応用できる。本方法は大体、遺伝子
型非依存性であり、迅速であり、微細繁殖や遺伝的形質
転換への応用に便利である。
【００２５】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、以前の
報告とは異なる出発物質（外植片）を用い、直接の器官
形成に基づくため元々の植物と同じものを与え、時間が
短く、簡便であり、多量の受精能力のある正常の植物を
与える。表１の報告と特許は、品種（遺伝子型）により
大きく変動する。本出願人が記載した方法は、異なる種
の多くの変種に応用可能である。表１の報告２０と２２
は、表１の特許化された請求項２１は、外植片として胚
軸を用い、この方法では、本出願人が記載するように、
数個の苗条ではなく１つの苗条が形成される。表１の報
告４と６は、繁殖不可能な植物を与えるが、本発明の方
法は受精能力のある腱湖媼植物を与える。
【００２６】本発明の方法の成否は、苗木の年齢と、本
発明の方法により培養するために外植片を苗木から除去
する方法に依存する。本発明の方法において、子葉節
（子葉葉腋または苗木の頂端分裂組織とも呼ぶ）を、２
〜２０日令の苗木から取る。このような苗木から取った
外植片を培養すると、品種により種々の数の苗条が得ら
れる。子葉を無しでまたは子葉を１つまたは一部および
０．５cmの胚軸とともに取った頂端分裂組織は、複数の
苗条を与えた。この方法は、子葉無しで取った頂端分裂
組織から１工程で多量の苗条を与えた。増殖制御物質の
必要条件は、外植片に依存して異なっていた。頂端分裂
組織を子葉無しで取った時、複数の苗条が増殖するには
ＢＡＰとキネチンの両方が必要であった。一方、１つの
子葉の１つまたは一部を含めると、複数の苗条の再生に
はＢＡＰのみが必要であった。我々が使用したホルモン
の組合せと外植片は、表１に記載したいずれの報告のも
のとも異なる。我々の方法中の複数の苗条の再生は、あ
る範囲のホルモンレベルで成功した。例えばＢＡＰは１
０〜１００μＭの濃度で効率的に機能し、１つまたは一
部の子葉の存在下で頂端葉腋から苗条を与える。子葉葉
腋のみは、キネチン２〜２０μＭとともにＢＡＰ ４〜
２０μＭで効率的に作用する。表１に記載のように、キ
ネチンと一緒の増殖制御物質すなわちＢＡＰは、以前は
綿の複数の苗条再生のために方法の開発のためには使用
されてこなかった。表１の報告１１と１２では、その方
法は、貧弱な根を与え、一方本発明の方法はこの点で優
れている。
【００２７】複数の苗条の成長を誘導する方法は、自然
に１つの植物に成長する元々の分裂組織以外の細胞が関
与する。我々は、適当な濃度の通常使用される増殖制御
物質を補足した培地で培養すると複数の苗条になる、新
しい分裂組織を与える外植片（子葉節または苗木の葉腋
とも呼ぶ）を同定した。この方法は、綿の任意の変種、
品種（cultivar）、株または品種（race）に応用するこ
とができ、従ってこの方法は新規の方法であり、遺伝子
型の制限がなく、先行技術で深刻な問題である再生に必
要な時間が短縮される。
【００２８】本発明は、綿苗木からの頂端外植片で新し
い分裂組織帯を成長させ、いくつかの苗条を与える、効
率的な方法を初めて提供するものである。さらに外植片
は基底部に器官形成塊を形成し、これは小さい部分に分
割されて、複数の苗条の再生が再現性良く繰り返される
サイクルが維持される。
【００２９】綿に関連する領域の以前の特許には、ＵＳ
Ａ４６７２０３５およびＵＳ−５２４４８０２（ここ
で、発明者らは、体細胞性胚形成を介してゴシピウム・
ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum L）コーカー
（Coker ）３１０品種の綿カルスから植物を再生する方
法を開示した）；ＵＳ−Ａ８６９３７３８４およびＣＡ
Ａ１、１３３５７９９（ここで、再生法に基づく体細胞
性胚形成が関与する綿の再生と形質転換法を開示した）
およびＷＯＡ１ ９２１５６７５（ここで、発明者は、
綿胚の衝撃媒介形質転換法を開示し、ここからトランス
ジェニック植物が成長した）がある。
【００３０】本発明に記載した方法は、体細胞性胚形成
を目的としていない。本発明の方法は商業的に採用する
ことが非常に簡単であり、ゴシピウム（Gossypium ）の
広範囲の変種や種に応用される。これは大体遺伝子型非
依存性であり、微細繁殖や遺伝的形質転換への応用に便
利である。現状の方法と異なり、本発明の方法は形態学
的および細胞遺伝学的異常のある植物が形成されない。
【００３１】本発明の方法は、以前の報告で使用された
ものとは異なる出発物質（外植片）を用い、直接の器官
形成に基づくため、時間が短く、簡便であり、受精能力
のある正常の植物を与える。
【００３２】発明の目的本発明の主たる目的は、特定の
植物組織から多量の植物の再生維持を目的とする、綿品
種の効率的な器官形成のための改良法を提供することで
ある。
【００３３】本発明の別の目的は、苗条が増殖し容易か
つ効率的に根を生成して、成熟した受精能力のある綿植
物を形成するような、綿植物の苗条の再生法を提供する
ことである。
【００３４】本発明のさらに別の方法は、アグロバクテ
リウム（Agrobacterium ）を用いる遺伝的形質転換、ま
たは植物細胞へのＤＮＡの送達のためのＤＮＡコーティ
ングした微小推進体（microprojectiles）に適用できる
綿植物の器官形成性組織培養の改良法を提供することで
ある。
【００３５】本発明のさらに別の方法は、病気のない生
殖質の交換と保存のための病気のない綿植物の成長法を
提供することである。
【００３６】前記目的を達成するために、本出願人は、
綿苗木の子葉の１つまたは一部が有りまたは無しで子葉
節（子葉葉腋または子葉軸とも呼ぶ）から出発して組織
培養法により多量の生育可能な受精能力のある綿植物を
再生する方法を提供し、該方法は、 ｉ）常法により綿植物の種子を処理して常法により細菌
／カビ（汚染物質）を除去し、 ii）工程（ｉ）の処理した種子を第１の培地中で培養
し、ここで第１の培地は、 ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、および ｄ．ゲル化剤 よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であって、
オートクレーブで滅菌したものであり、培養は２０〜４
０℃の温度で１６時間の明期（光周期）の光（少なくと
も４０μモル／m2s ）の存在下で３日〜数週間行い、 iii ．工程（ii）で得られた苗木からの、一部または完
全な子葉有りまたは無しで子葉節（外植片）を切り、 iv．工程（iii)で得られた外植片を、苗条増殖のため
に、第２の培地中で培養し、ここで第２の培地は、 ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、 ｄ．植物ホルモン（植物増殖制御物質）単独、０．１〜
１００μＭの６−ベンジルアミノプリン、６−ベンジル
アデニン、γ，γジメチルアリルアミノプリン、キネチ
ン、１−フェニル−３，１，２，３チジアゾール−５−
イル尿素のようなサイトキニンと組合せた植物ホルモ
ン、 ｅ．ゲル化剤 よりなる、ｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であっ
て、オートクレーブで滅菌したものであり、培養は２０
〜４０℃の温度で１６時間の明期の光（４０μモル／m2
s ）で行い； （ｖ）多くの苗条が形成するまで少なくとも４週間培養
を続け； （vi）形成した苗条を採集し； （vii)採集した苗条を根誘導性培地（第３の培地）に移
し、ここで、この第３の培地は： ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、 ｄ．インドール酢酸、インドール酪酸およびナフタレン
酢酸から選択されるオーキシンよりなる、５０μＭ以下
の植物ホルモン（植物増殖制御物質）、 ｅ．ゲル化剤 よりなる、ｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であっ
て、オートクレーブで滅菌したものであり、そして （viii）２０〜４０℃の温度で１６時間の明期の光（４
０μモル／m2s ）で根が生成するまで培養する、ことよ
りなる。
【００３７】本発明の好適な特徴は、ＭＳ培地の塩、Ｂ
５培地のビタミン、炭素源およびゲル化剤よりなる、第
１、第２、および第３の培地を用いる。しかし、第２お
よび第３の培地は、さらに植物ホルモン（植物増殖制御
物質）とゲル化剤を含有してもよい。第１、第２、およ
び第３の培地に使用される最も好適なＭＳ培地の塩は、
以下の組成を有する： 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） ＭＳ培地の塩： ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ ＫＮＯ3 １９００ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ １６９ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ ＫＩ ８３ ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８５ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ ミオイノシトール １００
【００３８】第１、第２および第３の培地で使用される
好適なビタミンは、以下のものから選択される： 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） ニコチン酸 １．０ 塩酸ピリドキシン １．０ 塩酸チアミン １０．０
【００３９】第１、第２および第３の培地で使用される
炭素源は、ショ糖またはグルコースから選択され、使用
されるこのような炭素源は、１〜６％ｗ／ｖの範囲であ
る。
【００４０】第２の培地で使用される植物ホルモンは、
サイトキニン、サイトキニン活性尿素またはこれらの組
合せから選択した。好ましくは、第２の培地で使用され
る植物ホルモンは、６−ベンジルアミノプリン、６−ベ
ンジルアデニン、ゼアチン、（γ，γジメチルアリルア
ミノプリン）、キネチンのようなサイトキニン；１−フ
ェニル−３−１，２，３チジアゾール−５−イル尿素お
よびジフェニル尿素、４−１−フェニルＮ（ピリジル）
尿素のようなサイトキニン活性尿素から選択される。第
３の培地で使用される増殖制御物質は、インドール酢
酸、ナフタレン酢酸およびインドール酪酸のようなオー
キシンである。
【００４１】子葉節（外植片）は、２日令〜数週間令の
発芽した苗木から単離し、使用する外植片は、フィール
ドで増殖したかまたは組織培養で増殖した綿植物から取
る。基底部再生組織（第１のサイクルで苗条を採集した
後に残る）は、苗木の再生の維持のために工程（iv）〜
（viii）で繰り返し培養する。使用するＭＳ培地の塩の
濃度は、重量／容量ベースで既に記載した全量または半
分のレベルである。使用されるゲル化剤は、０．２〜
１．２％ｗ／ｖの寒天、ゲルライト（gelrite ）（フィ
タゲル（phytagel））または任意のゲル化剤から選択さ
れる。
【００４２】さらに、本発明の組織培養法で再生される
苗条は、綿植物の微細繁殖のために使用することができ
る。さらに、本発明の方法により生産される子葉節また
は基底部再生組織は、アグロバクテリウム（Agrobacter
ium ）に基づくかまたはＤＮＡコーティングされた粒子
の衝撃を介する遺伝的形質転換のために使用することが
できる。さらに、該組織培養法により再生される苗条
は、病気のない綿植物の生産に使用されるか、またはそ
のような苗条は病気のない綿生殖質の交換と保存のため
に使用することができる。
【００４３】本発明の最も好適な方法は： （ｉ）綿植物の種子を処理して細菌／カビのような汚染
物質を除去し； （ii）発芽のために処理した種子を、表２に示す培地中
で培養し、ここで培地は
【００４４】
【表２】 表２ 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） Ａ．ＭＳ培地の塩： ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ ＫＮＯ3 １９００ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ １６９ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ ＫＩ ８３ ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８５ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ ミオイノシトール １００ Ｂ．Ｂ５培地のビタミン ニコチン酸 １．０ 塩酸ピリドキシン １．０ 塩酸チアミン １０．０ Ｃ．炭素源： ショ糖／グルコース ３００００．０ Ｄ．ゲル化剤 ０．２〜１．２％ｗ／ｖ
【００４５】よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培
地であってオートクレーブで滅菌したものであり、 （iii) 工程（ii）で得られる子葉葉腋とともに子葉節
を切り、 （iv）工程（iii ）で得られた外植片を表３に示す培地
中で培養し、ここで培地は
【００４６】
【表３】 表３ 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） Ａ．ＭＳ培地の塩： ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ ＫＮＯ3 １９００ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ １６９ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ ＫＩ ８３ ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８５ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ ミオイノシトール １００ Ｂ．Ｂ５培地のビタミン ニコチン酸 １．０ 塩酸ピリドキシン １．０ 塩酸チアミン １０．０ Ｃ．炭素源： ショ糖／グルコース ３００００．０ Ｄ．ホルモン（増殖制御物質） サイトキニン ０．１〜１００μＭ Ｅ．ゲル化剤 ０．２〜１．２％ｗ／ｖ
【００４７】よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培
地であってオートクレーブで滅菌したものであり、 （ｖ）２０〜４０℃の温度で行う、１６時間の明期の光
（４０μモル／m2s ）で４〜６週間または多くの苗条が
生成するまで培養し、 （vi）形成した苗条を採集し； （vii ）採集した苗条を表４に示す根形成用の培地に移
し、ここでこの培地は
【００４８】
【表４】 表４ 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） Ａ．ＭＳ培地の塩： ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ ＫＮＯ3 １９００ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ １６９ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ ＫＩ ８３ ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８５ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ ミオイノシトール １００ Ｂ．Ｂ５培地のビタミン ニコチン酸 １．０ 塩酸ピリドキシン １．０ 塩酸チアミン １０．０ Ｃ．炭素源： ショ糖／グルコース ３００００．０ Ｄ．ホルモン（増殖制御物質） オーキシン ５０μＭ以下 Ｅ．ゲル化剤 ０．２〜１．２
【００４９】よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培
地であってオートクレーブで滅菌したものであり、 （viii）苗条を２０〜４０℃の温度で根が形成されるま
で培養する、ことよりなる。
【００５０】こうして形成された苗木は、必要であれ
ば、土壌に移して綿植物を生育させることができる。
【００５１】本発明において、本発明の成否は、苗木の
年齢と、本発明の方法により培養するために外植片を苗
木から除去する方法に依存する。最適な結果を得るため
に、２〜２０日令の苗木から、葉腋とともに子葉節を取
ってもよい。しかし、使用する変種と植物ホルモンの組
合せに依存して、最大数の苗条は特定の年齢の苗木から
取った外植片から得られる。
【００５２】本発明の方法のさらに別の態様において、
工程（vi）に記載のように苗条を採集した後に残る基底
塊を用いて繰り返すことができる。基底塊を２〜６片に
切り、工程（iv）のように培養し、工程（viii）までの
残りの工程を続けて第２のサイクルの苗条増殖を得る。
【００５３】本発明の方法の詳細を以下に示す：細菌／
カビの汚染物質がない種子を作成するために、これらは
使用前に表面滅菌する。表面滅菌のために、多くの滅菌
法が知られている。そのような方法には、少なくとも１
つの滅菌剤を含有する溶液に種子を浸す方法がある。そ
のような滅菌剤には、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素
酸カルシウム、塩化第二水銀、アルコール、硫酸などが
ある。種子の表面滅菌は、種子を０．０５〜０．５％ｗ
／ｖの塩化第二水銀の水溶液に１〜１５分攪拌を続けて
浸し、次に脱イオン化無菌水で完全に（３〜１０回）洗
浄し、続いて種子をエタノールまたは精留酒精（５０〜
１００％ｗ／ｖ）に３０秒間〜１０分浸し燃やす。
【００５４】表面滅菌した種子は、発芽させるために、
発芽ビン中に０．６〜１．２％ｗ／ｖの寒天のようなゲ
ル化剤を含有する水の上、湿らせたペーパータオルの
上、またはムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog
）塩または他の任意の通常の培地、Ｂ５培地のビタミ
ンまたは他のビタミン混合物、および１〜６％ｗ／ｖの
ショ糖またはグルコースのような任意の炭素源、および
０．６〜１．２％ｗ／ｖの寒天または０．２〜０．５％
ｗ／ｖのゲルライト（gelrite ）（フィタゲル（phytag
el））のようなゲル化剤を含有する培地の上に置き、培
地のｐＨを５．６〜６．２に調整した後１２１℃、１５
ポンド／cmで２０分間オートクレーブする。
【００５５】１〜２個の種子を、１０〜１５mlの発芽用
培地を含有する５０mlのガラス製培養管に入れるか、ま
たは５０mlの培地を含有する大きな（２５０ml）プラス
チックまたはガラスのジャーに入れることができる。発
芽のために、種子を２０〜４０℃の温度で１６時間の明
期の光（少なくとも４０μモル／m2s ）でインキュベー
トしても良い。種子が発芽して根や幼芽が出て充分広が
った子葉を与えるまでインキュベートを続ける。
【００５６】子葉節（外植片）は好ましくは、発芽後の
２〜２０日令の苗木から、当該分野で公知の汚染物質の
ない環境、すなわち層流中で、無菌の鋭いメスやナイフ
で切断して得られる。葉腋に沿った子葉節を、節の組織
が傷害されないように切り出す。
【００５７】子葉節（外植片）は、重量／容量ベースで
表２に示す濃度のムラシゲとスクーグ（Murashige and
Skoog ）塩またはその半分の濃度、Ｂ５培地のビタミン
または他の任意のビタミン組成、１〜６％ｗ／ｖのショ
糖またはグルコースの任意の炭素源、通常使用される増
殖制御物質、例えば、サイトキニン−ＢＡＰ（６−ベン
ジルアミノプリン）、６−ベンジルアデニン、キネチ
ン、ゼアチン（zeatin）、および２ｉＰ（γ，γジメチ
ルアリルアミノプリン）など、およびゲル化剤である
０．６〜１．２％ｗ／ｖの寒天または０．２〜０．５％
ｗ／ｖのゲルライト（gelrite ）（フィタゲル（phytag
el））を含有する培地に入れる。培地のｐＨを５．４〜
６．２に調整した後１２１℃、１５ポンド／cmで２０分
間オートクレーブする。苗条増殖のための培地の組成
は、表３に示す。
【００５８】培養物を２０〜４０℃の温度で１６時間の
明期（４０〜１００μモル／m2s ）の白色の蛍光灯で、
複数の苗条が形成されるまでインキュベートする。これ
は、外植片の基底部分が膨らむことで達成される。この
段階で苗条を集め、重量／容量ベースで表３に示す濃度
のムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog ）塩また
はその半分の濃度、Ｂ５培地のビタミンまたは他の当該
分野で公知の任意のビタミン組成、１〜６％ｗ／ｖのシ
ョ糖またはグルコースの任意の炭素源、根の誘導のため
のオーキシン型の増殖制御物質、例えばインドール酢
酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸（５０μＭ以
下）、ゲル化剤である０．６〜１．２％ｗ／ｖの寒天ま
たは０．２〜０．５％ｗ／ｖのゲルライト（gelrite ）
を含有する培地に移し、培地のｐＨを５．６〜６．２に
調整した後１２１℃、１５ポンド／cmで２０分間オート
クレーブする。根を誘導するこの培地の組成は、表４に
示す。根が発達し、苗条が成長して２〜４個のうずまき
の葉を与えるまで培養する。
【００５９】残りの基底組織（苗条を採集した後）は、
いくつかの部分に分割され、再び表３に示す培地で培養
して第２のサイクルの苗条増殖をさせる。
【００６０】複数の苗条が形成されるまで培養を続け
る。この段階で再び苗条を採集し、表４に示す根形成用
の培地に移す。残りの基底塊は再び、次のサイクルの苗
条成長のために培養する。こうして１つの外植片から出
発して、３サイクルの培養で最大３０個の苗条が採集で
きる。
【００６１】充分発達した根を有するこのような苗条を
培養物から取り出し、無菌脱イオン水で洗浄して、根の
表面に存在する微量の栄養物質を除去し、次に苗木を栄
養増殖のための栄養溶液、例えばホアグランド（Hoagla
nd）溶液（糖を含まない）中で維持する。栄養増殖が開
始したら、これらをバーミキュライトに移し、最後に種
子を有する成熟した植物を成長させるために土壌に移
す。
【００６２】高頻度の苗条を誘導する本発明の方法によ
り、植物全体が成長する。子葉節から複数の苗条を得る
ための増殖の基礎は、自然に増殖および成長して１つの
植物になる元々の分裂組織以外の細胞が関与する。我々
は、適当な濃度の適当な増殖制御物質を補足した培地で
培養すると、複数の苗条になる新しい分裂組織を与える
外植片を同定した。本発明の方法は、任意の変種の綿に
応用できる。この方法は、新しいアプローチであり、遺
伝子型に制限されず、先行技術において深刻な問題であ
る、苗条の再生に必要な時間を低下させる。
【００６３】本発明の方法は、発芽した種子のあらかじ
め存在する分裂組織以外の細胞からの苗条の分化に関す
る。従って、適当な濃度の増殖制御物質の存在下で外植
片を培養すると、複数の苗条を産生するように細胞のプ
ログラムを変更させることができると考えられる。本発
明に記載の方法により生成される新しい分裂組織は、い
くつかの苗条を生成する。
【００６４】現在、綿の任意の品種の任意の組織の外植
片から複数の苗条を形成させる詳細な方法は無い。微細
繁殖に至る組織培養法を扱う報告は、体細胞性胚形成を
介する植物再生に限定されている。わずかの品種のみ、
すなわちコーカー（Coker ）株が、体細胞性胚形成のす
でに使用されている方法にうまく応答する。体細胞性胚
形成を介する植物再生の成長工程は、数ヶ月を要する。
さらに、体細胞性胚形成により得られる植物は、形態学
的および細胞遺伝学的に異常であり受精能力がない。本
発明は、綿で複数の苗条を与える外植片の器官形成の詳
細な方法を初めて与える。本発明の方法により、適当な
濃度の増殖制御物質を補足した培地で外植片を繰り返し
サブ培養して、３〜３０の範囲（その数は重要である）
の複数の苗条の再生できる。これは先行の刊行物には示
唆されておらず、１つの外植片から複数の苗木を成長さ
せるのに非常に重要である。
【００６５】以下の例は本発明を例示するためであり、
決して本発明の範囲を限定するものと見なしてはならな
い。
【００６６】
【発明の実施の形態】
例１ 外植片と遺伝子型の供給源 綿（ゴシピウム・ヒルスツム（G. hirsutum ）品種カン
ドワ−２（Khandwa-2））の種子を０．１％塩化第二水
銀で７分間処理することにより表面滅菌した。次に種子
を滅菌蒸留水で５回洗浄し、アルコール（９０％ｖ／
ｖ）に３０秒間浸して燃やした。この滅菌した種子を、
ムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５
のビタミン、３％ｗ／ｖのショ糖およびゲル化剤として
０．８％ｗ／ｖの寒天を含有する培地に蒔いて、オート
クレーブにかける前に培地のｐＨを５．８に調整した。
２個の種子を各々１５mlの培地を含有する５０mlのガラ
ス管に入れた。種子は、滅菌したピンセットにより微生
物を含まない環境（すなわち層流）に置いた。培地上の
種子を、種子が発芽して、よく伸びた子葉とともに根と
幼芽が生成するまで、白色蛍光灯（６０μmol/m2s ）で
１６時間の明期で２５±２℃でインキュベートした。
【００６７】６日令の苗木を使用して外植片（出発物質
として再生実験に使用される苗条の小片）を切り出し
た。異なる型の外植片（例えば、子葉の一つまたは一部
が無しまたは有りで取った、胚軸切片、子葉からのディ
スク、種子から単離した成熟胚、未成熟種子から単離し
た未成熟胚、子葉節（葉腋）、および約０．５cmの胚
軸）を切り出した。
【００６８】これらの異なる外植片を、ムラシゲとスク
ーグ（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタミン、３
％ｗ／ｖのグルコース、２２．１９μＭの６−ベンジル
アデニンおよび０．６％ｗ／ｖのゲル化剤寒天よりなる
培地に蒔いて、オートクレーブにかける前に培地のｐＨ
を５．８に調整した。複数の苗条が再生されるまで培養
を続けた。両方の子葉と一緒になった頂端分裂組織が複
数の苗条を生成できない場合が観察された。胚軸の切
片、子葉および成熟胚さらには未成熟胚が複数の苗条を
生成できなかった。０．５cmの胚軸および１つの子葉ま
たは子葉の一部とともにとった子葉節は、上記培地で複
数の苗条を生成させる。子葉とは別にとった子葉節もま
た、６−ベンジル−アデニン８．８７μM およびキネチ
ン９．２９μM を含有する培地では多数の苗条を生成さ
せた。
【００６９】子葉節の外植片の型およびこれらが応答す
る増殖制御物質の組合せの同定は本発明の重要な面であ
る。
【００７０】例２ 外植片の培地依存性応答 ０．１％ｗ／ｖ塩化第二水銀で７分間処理し、滅菌蒸留
水で６回洗浄し、続いて種子をアルコール（９０％ｗ／
ｖ）に３０秒間浸し、燃やした、綿（ゴシピウム・ヒル
スツム・エル（G.hirsutum・L. Khandwa-2））の種子を
とった。この滅菌した種子を、ムラシゲとスクーグ（Mu
rashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタミン、３％ｗ／ｖ
のショ糖および０．８％ｗ／ｖの寒天を含有する培地に
蒔いた（オートクレーブにかける前に培地のｐＨを５．
８に調整した）。発芽のため、２つの種子を各々１５ml
の培地を含有するガラス管で保存した。培地上の種子
を、白色蛍光灯（６０μmolm-2ｓ-1）で１６時間の明期
で２５±２℃でインキュベートした。種子は、滅菌した
ピンセットにより汚染物質を含まない環境（層流）で培
地に蒔いた。種子が発芽して、よく伸びた子葉とともに
根と幼芽が生成するまで、培養を続けた。
【００７１】６日令の苗木を使用して子葉節を有する種
子の葉腋（外植片）を切り出した。外植片は、鋭いメス
により切り出した。この外植片を、ムラシゲとスクーグ
（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタミン、３％ｗ
／ｖのグルコースおよび／またはショ糖、２２．１９μ
M の６−ベンジルアデニンおよび０．６％ｗ／ｖのゲル
化剤を含有する培地に蒔いた（オートクレーブにかける
前に培地のｐＨを５．８に調整した）。
【００７２】培養は複数の苗条が形成されるまで続け
た。複数の苗条は、３０gl-1のショ糖またはグルコース
の存在下で観察された。しかし、複数の苗条の分化にグ
ルコース、ショ糖およびグルコース＋ショ糖を使用した
比較検討に基づき、グルコースが、培地中の好適な炭素
源として選択された。ショ糖単独またはグルコースとの
組合せを含有する培地で、フェノール類が大量に浸出し
て、培地を褐色にした。唯一の炭素源としてグルコース
が与えられたとき、フェノール類の浸出は最少であっ
た。培地にフェノール類が多くなると、苗条の成長が低
下し、外植片は最終的に死滅した。綿に（ショ糖ではな
く）グルコースを使用することは、本発明の重要な面で
ある。これは、フェノール類の浸出を防止する。このプ
ロトコールは、成長する外植片の頻度高い継代培養を必
要としない。以前の報告では、このことは綿の組織培養
の重要な問題であった。
【００７３】子葉節（外植片）の培養も行った。ムラシ
ゲとスクーグ（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタ
ミン、３％ｗ／ｖのグルコース、異なる濃度の増殖制御
物質［例えば２．２２μM 〜４４．３８μM のＢＡＰ
（６−ベンジルアデニン）、２．３２μM 〜４４．４７
μM のＫＩＮ（キネチン）および２．４６μM 〜４９．
２１μM の２ｉＰ（γ，γジメチルアリルアミノプリ
ン）、並びにジメチルアリルアミノプリンおよびキネチ
ンとの６−ベンジルアデニンの組合せ］、および０．６
％ｗ／ｖのゲル化剤寒天（オートクレーブにかける前に
培地のｐＨを５．８に調整した）を含有する培地で、子
葉節（外植片）の培養も行った。
【００７４】培養物は、複数の苗条が形成されるまで、
白色蛍光灯（６０μmolm-2ｓ-1）で１６時間の明期で２
５±２℃でインキュベートした。得られた結果は表５お
よび６に要約する。
【００７５】
【表５】 表５ 再生の第１周期における品種「カンドワ−２（Khandwa-2 ）」の外植片（１つの 子葉と一緒の子葉節）からの苗条の発生に及ぼすサイトキニンの作用 サイトキニン 外植片形成性 外植片当たりに 備考 濃度（μM ） 苗条（％） 形成される苗条の 平均数、±ＳＥ （第１周期）* ＢＡＰ（2.22） 66 0.8 ±0.17（ａ） ＢＡＰ（4.44） 73 1.23±0.27（ａ） ＢＡＰ（8.87） 70 2.90±0.57（ｂ） ＢＡＰ（13.31 ） 66 3.28±0.60（ｂ） ＢＡＰ（22.19 ） 80 4.46±0.68（ｂ） ＢＡＰ（33.09 ） 66 3.07±0.65（ｂ） 苗条成長少ない ＢＡＰ（44.38 ） 60 3.33±0.49（ｂ） 苗条成長少ない ＫＩＮ（2.32） 26 0.8 ±0.2 （ａ） ＫＩＮ（4.65） 33 0.8 ±0.2 （ａ） ＫＩＮ（9.29） 26 2.00±0.54（ｂ） ＫＩＮ（13.94 ） 53 2.20±0.41（ｂ） ＫＩＮ（23.23 ） 60 3.10±0.43（ｂ） 根形成 ＫＩＮ（34.85 ） 60 2.00±0.31（ｂ） 根形成 ＫＩＮ（46.47 ） 60 2.80±0.48（ｂ） 根形成 ２ｉＰ（2.46） 20 0.6 ±0.24（ａ） ２ｉＰ（4.92） 26 0.4 ±0.16（ａ） ２ｉＰ（9.84） 40 0.46±0.16（ａ） ２ｉＰ（14.76 ） 53 0.73±0.52（ａ） ２ｉＰ（24.61 ） 60 1.261 ±0.53（ａ） カルス形成 ２ｉＰ（36.91 ） 30 1.25±0.41（ａ） カルス形成 ２ｉＰ（49.21 ） 30 1.09±0.42（ａ） カルス形成 注：示されるデータは、３回の独立した実験の結果から計算した平均値±ＳＥ（ 標準誤差）である。ａおよびｂと分類した処理は、スチューデントｔ検定により 解析するとき、Ｐ＞０．０５で処理間では有意な差があるが、処理内では有意差 がない。ＢＡＰ（６−ベンジルアデニン）、Ｋｉｎ（キネチン）および２ｉＰ（ γ，γジメチルアリルアミノプリン）。
【００７６】
【表６】 表６ 改変培地の品種「カンドワ−２（Khandwa-2 ）」の外植片（１つの子葉と一緒の 子葉節）からの第１周期の苗条の発生に及ぼすサイトキニンの複合作用 異なるサイトキニンの濃度 外植片 外植片当たりに （μM ） 形成性 形成される苗条の 苗条（％） 平均数±ＳＥ* ＢＡＰ ＫＩＮ ２ｉＰ 4.44 4.65 -- 50 0.75±0.21（ａ） 8.87 9.29 -- 33 1.00±0.36（ａ） 13.31 13.94 -- 66 2.13±0.19（ｂ） 22.19 23.23 -- 86 3.86±0.48（ｃ） 4.44 4.65 2.46 60 0.73±0.18（ａ） 4.44 9.29 4.92 40 1.19±0.34（ａ） 4.44 13.94 9.84 50 1.28±0.38（ａ） 4.44 23.23 24.61 66 2.20±0.45（ｂ） 4.44 46.47 49.21 66 2.16±0.27（ｂ） 注：示されるデータは、３回の独立した実験の結果から計算した平均値±ＳＥ（ 標準誤差）である。ａ、ｂおよびｃと分類した処理は、スチューデントｔ検定に より解析するとき、Ｐ＞０．０５で処理間では有意差があるが、処理内では差が ない。ＢＡＰ（６−ベンジルアデニン）、Ｋｉｎ（キネチン）および２ｉＰ（γ ，γジメチルアリルアミノプリン）。
【００７７】増殖制御物質の濃度の変化は、複数の苗条
の発生に関して異なる応答を与えることは、この結果か
ら明らかである。この点は、変種の再生のための最適な
条件を開発するために使用することができる。
【００７８】例３ 品種／種依存性応答 ゴシピウム・ヒルスツム・エル（Gossypium hirsutum
L）およびシー・アルボレウム（C. arboreum ）の１３
の異なる品種の種子を０１％ｗ／ｖ第二塩化水銀で７分
間処理し、滅菌蒸留水で６回洗浄し、続いて種子をアル
コール（９０％ｖ／ｖ）に３０秒間浸して燃やした。
【００７９】異なる品種の滅菌した種子を、ムラシゲと
スクーグ（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタミ
ン、３％ｗ／ｖのショ糖および０．８％ｗ／ｖの寒天を
含有する培地に蒔いた（オートクレーブにかける前に培
地のｐＨを５．８に調整した）。発芽のため、２つの種
子を各々１５mlの培地を含有するガラス管で保存した。
培地上の種子を、白色蛍光灯（６０μmolm-2ｓ-1）で１
６時間の明期で２５±２℃でインキュベートした。種子
は、滅菌したピンセットにより汚染物質を含まない環境
（層流）で培地に蒔いた。種子が発芽して、よく伸びた
子葉とともに根と幼芽が生成するまで、培養を続けた。
【００８０】６日令の苗木を使用して子葉節（外植片）
を切り出した。外植片は、鋭いメスにより切り出した。
外植片は、ムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog
）塩、Ｂ５のビタミン、３％ｗ／ｖのグルコース、２
２．１９μM の６−ベンジルアデニンおよび０．６％ｗ
／ｖのゲル化剤寒天を含有する培地に蒔いた（１２１℃
１５ポンド/cm2で２０分間オートクレーブにかける前に
培地のｐＨを５．８に調整した）。培養物を、白色蛍光
灯（６０μmolm-2ｓ-1）で１６時間の明期で２５±２℃
でインキュベートした。培養は、複数の苗条が形成され
るまで続けた。
【００８１】この工程で、苗条を回収して、ムラシゲと
スクーグ（Murashige and Skoog ）塩、Ｂ５のビタミ
ン、３％ｗ／ｖのショ糖、２．６９μM 濃度の増殖制御
物質（ナフタレン酢酸）ＮＡＡ６−ベンジルアデニンお
よび０．８％ｗ／ｖのゲル化剤寒天を含有する培地に移
した（オートクレーブにかける前に培地のｐＨを５．３
に調整した）。得られた結果を表７に要約する。
【００８２】
【表７】 表７ ２２．１９μM の６−ベンジルアデニンを含有する改変培地の綿品種の器官形成 能力 品種 外植片形成性 外植片当たりの１次 外植片当たりの２次 苗条（％） 苗条（第１周期）数 苗条（第２周期）数 ±ＳＥ ±ＳＥ Gossypium 80 4.46±0.70（ａ） 5.80±0.91（ａ） hirsutum cv. Khandwa-2 G.hirsutum 66 2.10±0.56（ｂ） 7.08±0.13（ａ） cv. PKV081 G.hirsutum 73 1.90±0.44（ｂ） 4.66±0.86（ａ） cv. RS810 G.hirsutum 90 2.70±0.42（ｂ） 4.30±0.73（ａ） cv. Pusa37 G.hirsutum 80 1.60±0.45（ｂ） 3.10±0.70（ｂ） cv. pusa G.hirsutum 70 1.40±0.40（ｂ） 2.80±0.57（ｂ） cv. Stoneville G.hirsutum 70 2.40±0.63（ｂ） 3.50±0.87（ａ） G.hirsutum 60 2.10±0.56（ｂ） 2.50±0.63（ｂ） cv. CA-1193 G.hirsutum 70 1.50±0.44（ｂ） ND3 cv. Jurhat G.hirsutum 90 1.90±0.44（ｂ） ND cv. Sima G.hirsutum 87 2.37±0.37（ｂ） ND cv. LH1343 G.arboreum 50 1.00±0.39（ｂ） 2.20±1.00（ｂ） cv. Shyamly G.arboreum 40 0.50±0.16（ｃ） 0.90±0.34（ａ） cv. Lohit １．データは、「方法」に記載されるように、各々１０
〜１５回繰り返した３回の独立の実験の結果から計算し
た平均値±ＳＥ（標準誤差）を表す。 ２．ａ、ｂおよびｃと分類した処理は、統計検定により
解析するとき、Ｐ＞０．０５で処理間では有意な差があ
るが、処理内では差がない。 ３．実施しなかった。
【００８３】この表の結果から、綿の全１３品種につい
てこの方法が十分に働くことは非常に明瞭である。しか
し、２２．１９μM の６−ベンジルアデニンを含有する
培地で培養するとき、ゴシピウム・ヒルスツム（G. hir
sutum ）の品種は応答性が高く、一方ジー・アルボレウ
ム（G. arboreum ）は応答が弱く、器官形成性において
種に関連した差が観察された。
【００８４】さらに、再生の第１の周期では、苗条は根
の発生のために除去され、残りの外植片の基底塊を再生
の次の周期のために再度培地中で培養した。再生物を再
度回収し、根の発生のための適切な濃度の増殖制御物質
を含有する培地に移して、残りの基底塊を再生の次の周
期のために培地中で再度培養した。こうして３周期の培
養で、単一の外植片から出発して、３０苗条まで回収で
きた。
【００８５】
【発明の効果】本発明の種々の面により、再生物の直接
分化および綿のいくつかの品種からの植物再生を高頻度
で誘導するための、容易で、効率がよく、かつ再現性あ
る方法が提供される。本発明の方法は、苗条の直接分化
を提供し、前述の多くの利点を与える。本方法による培
養で日常的に得ることのできる直接の苗条の形態形成の
迅速性および高頻度性は、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）による綿の
品種の遺伝子形質転換および／または衝撃形質転換法を
容易にすることが期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アロク クマル スリバスタバ インド国 226001 ユー．ピー．ルックノ ウ，ラナ プラタップ マーグ，ナショナ ル ボタニカル リサーチ インスチチュ ート (72)発明者 シブ クマル グプタ インド国 226015 ユー．ピー．ルックノ ウ，セントラル インスチチュート オブ メディシナル アンド アロマティック プランツ，ピー．オー．シマップ

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 綿苗木の子葉の１つまたは一部が有りま
    たは無しで子葉節（子葉軸または子葉葉腋とも呼ぶ）か
    ら出発して組織培養法により多量の生育可能な受精能力
    のある綿植物を再生する方法であって、（ｉ）綿植物の
    種子を処理して常法により細菌／カビ（汚染物質）を除
    去し、（ii）工程（ｉ）の処理した種子を第１の培地中
    で培養し、ここで第１の培地は、 ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、および ｄ．ゲル化剤 よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であって、
    オートクレーブで滅菌したものであり、培養は２０〜４
    ０℃の温度で１６時間の明期（光周期）の光（少なくと
    も４０μモル／m2s ）の存在下で３日〜数週間行い、
    （iii)工程（ii）で得られた苗木からの、一部または完
    全な子葉有りまたは無しで子葉節（外植片）を切り、
    （iv) 工程（iii)で得られた外植片を、苗条増殖のため
    に、第２の培地中で培養し、ここで第２の培地は、 ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、 ｄ．植物ホルモン（植物増殖制御物質）として、０．１
    〜１００μＭの６−ベンジルアミノプリン、６−ベンジ
    ルアデニン、γ，γジメチルアリルアミノプリン、キネ
    チン、及びサイトキニン活性尿素誘導体のようなサイト
    キニンの任意の組合せ、 ｅ．ゲル化剤 よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であって、
    オートクレーブで滅菌したものであり、培養は２０〜４
    ０℃の温度で１６時間の明期の光（４０μモル／m2/
    s2 ）で行い； （ｖ）多くの苗条が形成するまで少なくとも４週間培養
    を続け； （vi）形成した苗条を採集し； （vii ）採集した苗条を根誘導性培地（第３の培地）に
    移し、ここで、この第３の培地は： ａ．任意の従来の培地の塩、 ｂ．任意の従来の培地のビタミン、 ｃ．炭素源、 ｄ．インドール酢酸、インドール酪酸およびナフタレン
    酢酸から選択されるオーキシンよりなる、５０μＭ以下
    の植物ホルモン（植物増殖制御物質）、 ｅ．ゲル化剤 よりなるｐＨが５．４〜６．２の範囲の培地であって、
    オートクレーブで滅菌したものであり、そして（viii）
    ２０〜４０℃の温度で１６時間の明期の光（４０μモル
    ／m2s ）で根が生成するまで培養する、ことよりなる上
    記方法。
  2. 【請求項２】 第１、第２および第３の培地は、ＭＳ培
    地の塩、Ｂ５培地のビタミン、炭素源、およびゲル化剤
    よりなる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 第２および第３の培地は、ＭＳ培地の
    塩、Ｂ５培地のビタミン、炭素源、植物ホルモン（植物
    増殖制御物質）およびゲル化剤よりなる、請求項１に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 第１、第２、および第３の培地は以下の
    ＭＳ培地の塩を含んでなる、請求項１に記載の方法： 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） ＭＳ培地の塩： ＮＨ4 ＮＯ3 １６５０ ＫＮＯ3 １９００ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３７０ ＭｎＳＯ4 Ｈ2 Ｏ １６９ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ８．６ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ４４０ ＫＩ ８３ ＣｏＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０２５ ＫＨ2 ＰＯ4 １７０ Ｈ3 ＢＯ3 ６．２ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２７．８５ Ｎａ2 ＥＤＴＡ ３７．３ ミオイノシトール １００
  5. 【請求項５】 第１、第２および第３の培地のビタミン
    は、以下のものから選択される、請求項１に記載の方
    法： 成分 濃度（ｍｇ／Ｌ） ニコチン酸 １．０ 塩酸ピリドキシン １．０ 塩酸チアミン １０．０
  6. 【請求項６】 第１、第２および第３の培地で使用され
    る炭素源は、ショ糖またはグルコースから選択される、
    請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 使用される炭素源は１〜６％ｗ／ｖの範
    囲である、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 第２の培地で使用される植物ホルモン
    は、使用される外植片に依存して、単独または組合せで
    使用されるサイトキニンまたはサイトキニン活性尿素の
    任意のものから選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 第２の培地で使用される植物ホルモン
    は、６−ベンジルアミノプリン、６−ベンジルアデニ
    ン、ゼアチン、（γ，γジメチルアリルアミノプリ
    ン）、キネチンのようなサイトキニン、１−フェニル−
    ３−１，２，３チジアゾール−５−イル尿素、フェニル
    尿素及び４−１−フェニルＮ（４ピリジル）尿素のよう
    なサイトキニン活性尿素から選択される、請求項８に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 子葉節（外植片）は、２日令〜数週間
    令の発芽した苗木から単離される、請求項１に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 使用される外植片は、フィールドで増
    殖したかまたは組織培養で増殖した綿植物の苗木から取
    られる、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 基底部再生組織（第１のサイクルで苗
    条を採集した後に残る）は、苗木の再生の維持のために
    請求項１の工程（iv）〜（viii）で繰り返し培養され
    る、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 使用されるＭＳ培地の塩の濃度は、重
    量／容量ベースで第１、第２、または第３の培地の全量
    または半分のレベルである、請求項１、４、５、１１お
    よび１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 使用されるゲル化剤は、０．２〜１．
    ２％ｗ／ｖの濃度の寒天、ゲルライト（gelrite ）（フ
    ィタゲル（phytagel））または任意のゲル化剤から選択
    される、請求項１、４、５、１１〜１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 第３の培地で使用される植物ホルモン
    （増殖制御物質）は、インドール酢酸、インドール酪酸
    およびナフタレン酢酸のようなオーキシンから選択され
    る、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 組織培養法で再生される苗条は、綿植
    物の微細繁殖のために使用することができる、請求項１
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 子葉節（苗木葉腋）または基底部再生
    組織は、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）に基づ
    くかまたはＤＮＡコーティングされた粒子の衝撃を介す
    る遺伝的形質転換のために使用することができる、請求
    項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 組織培養法により再生される苗条は、
    病気のない綿植物の生産に使用される、請求項１に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 組織培養法により再生される苗条は、
    病気のない綿生殖質の交換と保存のために使用すること
    ができる、請求項１に記載の方法。
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