JPH10136992A - α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 Ｌ-イソアスパラギンとＬ-フェニルアラニン
メチルエステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルあるいはα−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンを安価かつ簡便に製造する方
法を開発する。 【解決手段】 セデセア属、エンテロバクター属、エシ
ェリシア属、ハフニア属、クレブシエラ属、モルガネラ
属、ラネラ属、セラチア属、エルシニア属に属する微生
物の菌体または菌体処理物を、Ｌ-イソアスパラギンと
Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルに作用せしめ、α
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルあるいはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンを採取することを特徴とするα−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルあるいはα−Ｌ
−アスパルチル−Ｌフェニルアラニンの製造方法に関す
るものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α−L−アスパルチル
−L−フェニルアラニンメチルエステルあるいはα−L−
アスパルチル−L−フェニルアラニンの製造方法に関す
る。α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチル
エステルは低カロリー甘味料として、世界中で用いられ
ている。

【０００２】

【従来の技術】従来、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルの製造方法としては、保護
基を導入した基質を用いる方法と無保護の基質を用いる
方法が知られている。保護基を導入した基質を用いる方
法としては、Ｎ−保護のＬ−アスパラギン酸無水物とＬ
−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ−保
護のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルとし、その後、保護基を除去する化学合成法
とＮ−保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステルにプロテアーゼを作用させてＮ−保護
のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルとし、その後、保護基を除去する酵素合成法が
知られている（特公昭５７−４５４２７）が、いずれの
方法においても、保護基の導入脱離が必要であるため行
程が繁雑となる。一方、無保護の基質を用いる方法とし
ては、Ｎ−フマリル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルにアンモニアを付加する方法が知られているが、収
率が極めて低い（特開昭６３−１８５３９５）。本発明
の Ｌ−イソアスパラギンとＬ−フェニルアラニンメチ
ルエステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルあるいはα−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンを生成する反応は従来全く知られ
ていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
かつ簡便にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステルあるいはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フェニルアラニンを製造する方法を提供することにあ
る。

【０００４】

【問題を解決するための手段】本発明者らは、安価かつ
簡便な α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンの製造方法を開発するために鋭意検討を重
ねた結果、セデセア属、エンテロバクター属、エシェリ
シア属、ハフニア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、
ラネラ属、セラチア属またはエルシニア属に属する微生
物が Ｌ-イソアスパラギンとＬ-フェニルアラニンメチ
ルエステルから α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンを生成することを新たに見出し、
本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、Ｌ-イソアスパラギ
ンとＬ-フェニルアラニンメチルエステルからα−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルま
たはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製
造する方法を提供するものである。尚、本発明でいうＬ
−イソアスパラギンは、Ｌ−α−アスパラギンのことで
ある。

【０００６】本発明に使用する微生物としては、Ｌ-イ
ソアスパラギンとＬ-フェニルアラニンメチルエステル
からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンを生成する能力を有するセデセア属、エンテロ
バクター属、エシェリシア属、ハフニア属、クレブシエ
ラ属、モルガネラ属、ラネラ属、セラチア属またはエル
シニア属に属する微生物であればいずれを用いてもよい
が、具体的には以下のものを例示することができる。 セデセア・ラパギ（Cedecea lapagei) JCM1684 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerog
enes)IFO13534 エシェリシア・コリ（Escherichia coli）IAM1268 ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei) IFO3731 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticol
a）IFO14939 モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii) IFO38
48 ラネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis) IFO13544 セラチア・マルセンス（Serratia marcescens) IAM1214
3 エルシニア・アルドバエ（Yersinia aldovae) JCM5892

【０００７】これらの微生物としては、野生株または変
異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしく
は遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される組み換
え株等も用いることができる。

【０００８】このような微生物の菌体を得るには、当該
微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このた
めの培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制
限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じ勇気栄養源を含む通常の培地でよい。

【０００９】例えば、炭素源としては、上記微生物が利
用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコ
ース、フラクトース、シュークロース、マルトース、ア
ミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセ
ロール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、酢
酸、プロピオン酸等の有機酸類及びこれらの塩類、パラ
フィン等の炭化水素類あるいはこれらの混合物を使用す
ることができる。

【００１０】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フマル酸ア
ンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモ
ニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、
ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリ
カー等の有機窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使
用することができる。

【００１１】他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、
通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いる
ことができる。

【００１２】培地には、更にＬ−イソアスパラギンを添
加することによりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性の高い菌体が得ら
れる場合がある。

【００１３】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下にて、pH５ないし８、温度２５ないし４０
℃の範囲内でpH及び温度を適当に制限しつつ１２〜４８
時間程度培養を行えばよい。

【００１４】上記微生物をＬ−イソアスパラギンとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルに作用せしめる方法と
しては、かくして得られる微生物培養物にＬ−イソアス
パラギンとＬ−フェニルアラニンメチルエステルを添加
して反応させる方法、微生物培養物から遠心分離等によ
り菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、
緩衝液に再懸濁したものにＬ−アスパラギンとＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステル体を添加して反応させる方
法等がある。また、微生物菌体の処理物として、菌体破
砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体、あるいはポリ
アクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲ
ル法等の公知の方法で固定化した菌体も用いることもで
きる。更に、微生物菌体処理物としては、菌体抽出物も
しくは菌体から公知の方法を組み合わせて精製取得した
酵素等も使用できる。

【００１５】菌体または菌体処理物の使用量は、目的と
する効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有
効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求め
られるが、例えば洗浄菌体の場合は反応液１リットル当
たり１ないし５００ｇである。

【００１６】Ｌ−イソアスパラギンおよびＬ−フェニル
アラニンメチルエステルの濃度は、１mMから10M、好ま
しくは0.1Mないし2Mであるが、Ｌ−イソアスパラギンに
対してＬ−フェニルアラニンメチルエステルを当量以上
添加した方が好ましい場合がある。また、必要ならば、
例えば高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応
の間、これらを反応を阻害しない濃度にして逐次添加す
る事ができる。

【００１７】反応温度は10ないし70℃、好ましくは20な
いし50℃であり、反応pHは2ないし12好ましくは3ないし
11である。かくして2ないし48時間程度反応を行うこと
により、反応混合物中にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンが著量生成蓄積する。

【００１８】このようにして生成蓄積したα−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルまたは
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンは、従来
より知られている方法、即ち合成吸着樹脂、イオン交換
樹脂を用いる方法等によって反応終了混合物より分離採
取することができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する。
なお、実施例におけるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンの定量は高速液体クロマトグ
ラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製In
ertsil ODS-2、溶離液：リン酸水溶液（pH3.0）/メタノ
ール＝4/1、流量：0.6ml、検出：254nm）により行っ
た。

【００２０】実施例１ 酵母エキス1.0%、ペプトン1.0%、グリセロール0.5%、
（NH₄)₂SO₄ 0.5%、 KH₂PO₄ 0.1%、K₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄7H₂O 0.05%、FeSO₄7H
₂O 0.001%、MnSO₄4H₂O0.001%,Ｌ−イソアスパラギン0.2
%からなる培地（pH7.0）を500ml容坂口フラスコに50ml
入れ、120℃で15分間加熱殺菌した。これに予めブイヨ
ン寒天培地で30℃にて20時間培養して得た表1に示す微
生物を一白菌耳接種し、30℃にて18時間振とう培養を行
った。培養後、菌体を遠心分離し、培養液と同量の生理
食塩水にて二回洗浄し、再び遠心分離して菌体を集め、
0.2M炭酸ナトリウム−炭酸水ナトリウム緩衝液（pH10）
に懸濁し5mlとした。菌体懸濁液1mlをＬ−イソアスパラ
ギン62.5mM及びＬ−フェニルアラニンメチルエステル62
5mMを含む上記緩衝液4mlに添加し、全量を5mlとした
後、30℃にて2時間反応を行った。結果を表1に示した。

【００２１】

【表１】

【００２２】実施例２ エシェリシア・コリIAM1268とモルガネラ・モルガニーI
FO3848の洗浄菌体を実施例１と同様に調製し、得られた
洗浄菌体を超音波破砕した。超音波破砕後、菌体破砕物
を遠心分離し、cell-free extractを調製した。cell-fr
ee extract（タンパク量：20mg/ml）1mlをＬ−イソアス
パラギン62.5mMおよびＬ−フェニルアラニンメチルエス
テル625mMを含む0.2M炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム緩衝（pH 10）4mlに添加し、全量を5mlとした後、3
0℃にて2時間反応を行った。その結果を表2に示した。

【００２３】

【表２】

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、Ｌ-イソアスパラギン
とＬ−フェニルアラニンメチルエステルから、α−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルま
たはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを安
価かつ簡便に製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｌ−イソアスパラギンとＬ−フェニルアラ
   ニンメチルエステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
   ェニルアラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アスパル
   チル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する、
   セデセア属、エンテロバクター属、エシェリシア属、ハ
   フニア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、ラネラ属、
   セラチア属、エルシニア属に属する微生物の培養物、該
   培養物より分離した微生物菌体または該微生物の菌体の
   処理物をＬ−イソアスパラギンとＬ−フェニルアラニン
   メチルエステルに作用せしめ、α−L−アスパルチル−L
   −フェニルアラニンメチルエステルまたはα−Ｌ−アス
   パルチル−Ｌ−フェニルアラニンを採取することを特徴
   とするα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
   チルエステルまたはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
   ルアラニンの製造方法。