JPH1014564A - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質の製造方法Info
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- JPH1014564A JPH1014564A JP17257796A JP17257796A JPH1014564A JP H1014564 A JPH1014564 A JP H1014564A JP 17257796 A JP17257796 A JP 17257796A JP 17257796 A JP17257796 A JP 17257796A JP H1014564 A JPH1014564 A JP H1014564A
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- Japan
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- heterologous protein
- producing
- medium
- culture
- fatty acid
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 遺伝子操作により調製された異種蛋白質
産生性宿主を、脂肪酸のアルキルエステルを含有する培
地で培養し、培養物から異種蛋白質を採取することを特
徴とする異種蛋白質の製造方法。 【効果】 異種蛋白質産生性宿主が産生する異種蛋白質
の産生量を増大できる。異種蛋白質が宿主由来の酵素に
よって分解されることを抑制することが可能であり、異
種蛋白質をさらに大量に生産し得る。
産生性宿主を、脂肪酸のアルキルエステルを含有する培
地で培養し、培養物から異種蛋白質を採取することを特
徴とする異種蛋白質の製造方法。 【効果】 異種蛋白質産生性宿主が産生する異種蛋白質
の産生量を増大できる。異種蛋白質が宿主由来の酵素に
よって分解されることを抑制することが可能であり、異
種蛋白質をさらに大量に生産し得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子操作により
形質転換された宿主を培養することによる異種蛋白質の
製造方法の改良に関する。
形質転換された宿主を培養することによる異種蛋白質の
製造方法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば、血漿の主要な蛋白構成成分であ
るヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという）等、医薬
として有用な多種多様の蛋白質は、体液からの分画によ
って製造されているが、この方法においては、原材料の
確保が難しく、また、製造された製剤は、ウイルス等に
よる汚染の危険が大きい。近年、組換ＤＮＡ技術の出現
によって、このような蛋白質の、微生物や細胞による生
産が可能となり、遺伝子組換技術による大量生産の研究
開発が活発に行われている。しかしながら、その収量は
いまだ低く、大量生産することは困難である。
るヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという）等、医薬
として有用な多種多様の蛋白質は、体液からの分画によ
って製造されているが、この方法においては、原材料の
確保が難しく、また、製造された製剤は、ウイルス等に
よる汚染の危険が大きい。近年、組換ＤＮＡ技術の出現
によって、このような蛋白質の、微生物や細胞による生
産が可能となり、遺伝子組換技術による大量生産の研究
開発が活発に行われている。しかしながら、その収量は
いまだ低く、大量生産することは困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる技術的
背景の下に、特に培養条件の改良によって異種蛋白質の
生産量をより増大させることを課題とする。
背景の下に、特に培養条件の改良によって異種蛋白質の
生産量をより増大させることを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、遺伝子操作により調製
された異種蛋白質産生性宿主を、脂肪酸アルキルエステ
ルを含有する培地で培養することにより、異種蛋白質の
産生量を増大できることを見出し、本発明を完成するに
到った。
を解決すべく研究を重ねた結果、遺伝子操作により調製
された異種蛋白質産生性宿主を、脂肪酸アルキルエステ
ルを含有する培地で培養することにより、異種蛋白質の
産生量を増大できることを見出し、本発明を完成するに
到った。
【０００５】すなわち、本発明は、遺伝子操作により調
製された異種蛋白質産生性宿主を、脂肪酸アルキルエス
テルを含有する培地で培養し、培養物から異種蛋白質を
採取することを特徴とする。前記脂肪酸アルキルエステ
ルとしては、その脂肪酸は炭素数１０〜２６である化合
物が挙げられる。具体的にはミリスチン酸、パルミチン
酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、
リノール酸、リノレン酸、リノレイン酸、アラキドン酸
などの飽和または不飽和脂肪酸のアルキルエステルが例
示される。より好ましいのはオレイン酸のアルキルエス
テルである。また、そのアルキル基はメチル基またはエ
チル基である化合物が好ましい。特に好ましいのはオレ
イン酸のメチルエステルである。本発明においては、異
種蛋白質産生性宿主として好ましくは酵母が用いられ、
特に好ましいのは、ピキア属酵母である。本発明におけ
る異種蛋白質とは、宿主細胞が本来産生しない蛋白質で
あって、形質転換によって産生可能となった外来の蛋白
質をいう。本発明の製造方法は、異種蛋白質としてＨＳ
Ａを製造する場合に特に好適に用いられる。
製された異種蛋白質産生性宿主を、脂肪酸アルキルエス
テルを含有する培地で培養し、培養物から異種蛋白質を
採取することを特徴とする。前記脂肪酸アルキルエステ
ルとしては、その脂肪酸は炭素数１０〜２６である化合
物が挙げられる。具体的にはミリスチン酸、パルミチン
酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、
リノール酸、リノレン酸、リノレイン酸、アラキドン酸
などの飽和または不飽和脂肪酸のアルキルエステルが例
示される。より好ましいのはオレイン酸のアルキルエス
テルである。また、そのアルキル基はメチル基またはエ
チル基である化合物が好ましい。特に好ましいのはオレ
イン酸のメチルエステルである。本発明においては、異
種蛋白質産生性宿主として好ましくは酵母が用いられ、
特に好ましいのは、ピキア属酵母である。本発明におけ
る異種蛋白質とは、宿主細胞が本来産生しない蛋白質で
あって、形質転換によって産生可能となった外来の蛋白
質をいう。本発明の製造方法は、異種蛋白質としてＨＳ
Ａを製造する場合に特に好適に用いられる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において用いられる遺伝子
操作により調製された異種蛋白質産生性宿主は、遺伝子
操作を経て調製され、かつ異種蛋白質を産生し得るもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経て異種蛋白質産生
性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動
物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿
主として、酵母、具体的にはサッカロマイセス属、ピキ
ア属を使用することが好ましい。また、当該宿主の栄養
要求性株や抗生物質感受性株をも使用できる。好適に
は、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his
4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリス（Pichia pas
toris)ＧＴＳ１１５株(his 4，ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１
５８５１）等が用いられる。
操作により調製された異種蛋白質産生性宿主は、遺伝子
操作を経て調製され、かつ異種蛋白質を産生し得るもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経て異種蛋白質産生
性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動
物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿
主として、酵母、具体的にはサッカロマイセス属、ピキ
ア属を使用することが好ましい。また、当該宿主の栄養
要求性株や抗生物質感受性株をも使用できる。好適に
は、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his
4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリス（Pichia pas
toris)ＧＴＳ１１５株(his 4，ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１
５８５１）等が用いられる。
【０００７】異種蛋白質産生性宿主によって産生される
異種蛋白質は、特に限定されず、ＨＳＡ等が挙げられ
る。
異種蛋白質は、特に限定されず、ＨＳＡ等が挙げられ
る。
【０００８】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法は公
知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実
施される。例えばＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生
株）の調製方法としては、例えば通常のＨＳＡ遺伝子を
用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０
５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規な
ＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５
号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル
配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、
ＨＳＡシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０
９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方
法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合さ
せる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール
含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プ
ロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号、特
開平４−２９９９８４号公報）、枯草菌によるＨＳＡの
発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨ
ＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９
５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵
母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公
報）などが挙げられる。
知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実
施される。例えばＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生
株）の調製方法としては、例えば通常のＨＳＡ遺伝子を
用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０
５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規な
ＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５
号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル
配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、
ＨＳＡシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０
９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方
法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合さ
せる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール
含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プ
ロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号、特
開平４−２９９９８４号公報）、枯草菌によるＨＳＡの
発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨ
ＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９
５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵
母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公
報）などが挙げられる。
【０００９】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は、具体的には以下のように行う。すな
わち、まず適当な宿主、好ましくはピキア属酵母、具体
的にはピキア・パストリス ＧＴＳ１１５株のＡＯＸ1
遺伝子領域に、常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下
にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを
導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号
公報を参照）。この形質転換体はメタノール含有培地中
での増殖能は弱い。そこで特開平４−２９９９８４号公
報に記載の方法に従い、この形質転換体をメタノール含
有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株の
みを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．
０００１％〜５％程度が例示される。培地は合成培地、
天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５℃〜
４０℃、１時間〜１０００時間程度が例示される。
起こさせる方法は、具体的には以下のように行う。すな
わち、まず適当な宿主、好ましくはピキア属酵母、具体
的にはピキア・パストリス ＧＴＳ１１５株のＡＯＸ1
遺伝子領域に、常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下
にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを
導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号
公報を参照）。この形質転換体はメタノール含有培地中
での増殖能は弱い。そこで特開平４−２９９９８４号公
報に記載の方法に従い、この形質転換体をメタノール含
有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株の
みを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．
０００１％〜５％程度が例示される。培地は合成培地、
天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５℃〜
４０℃、１時間〜１０００時間程度が例示される。
【００１０】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
脂肪酸アルキルエステルを含有していれば他の成分は特
に限定されず、通常この分野で既知の培地が使用され
る。脂肪酸アルキルエステルを含有する培地で形質転換
宿主を培養することにより、異種蛋白質の産生量を増大
させることができる。脂肪酸アルキルエステルとして
は、その脂肪酸の炭素数が１０〜２６である化合物が好
ましい。具体的にはミリスチン酸、パルミチン酸、パル
ミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、リノール
酸、リノレン酸、リノレイン酸、アラキドン酸等のアル
キルエステルがあげられ、好ましくは、そのアルキル基
がメチル基、エチル基である化合物である。特に好まし
くは、オレイン酸メチル、オレイン酸エチルである。こ
れら脂肪酸のアルキルエステルは単独でも２種以上を混
合して用いてもよい。
脂肪酸アルキルエステルを含有していれば他の成分は特
に限定されず、通常この分野で既知の培地が使用され
る。脂肪酸アルキルエステルを含有する培地で形質転換
宿主を培養することにより、異種蛋白質の産生量を増大
させることができる。脂肪酸アルキルエステルとして
は、その脂肪酸の炭素数が１０〜２６である化合物が好
ましい。具体的にはミリスチン酸、パルミチン酸、パル
ミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、リノール
酸、リノレン酸、リノレイン酸、アラキドン酸等のアル
キルエステルがあげられ、好ましくは、そのアルキル基
がメチル基、エチル基である化合物である。特に好まし
くは、オレイン酸メチル、オレイン酸エチルである。こ
れら脂肪酸のアルキルエステルは単独でも２種以上を混
合して用いてもよい。
【００１１】脂肪酸のアルキルエステルの培地中の含有
量は、好ましくは０．０１W/V%〜１０W/V%であり、さら
に好ましくは０．１W/V%〜１W/V%である。
量は、好ましくは０．０１W/V%〜１０W/V%であり、さら
に好ましくは０．１W/V%〜１W/V%である。
【００１２】培地は合成培地、天然培地のいずれでもよ
い。好ましくは合成培地である。また、固体培地であっ
ても液体培地であってもよいが好ましくは、液体培地で
ある。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として
各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩
など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドな
どの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍ
ｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地
〔０．７％イーストナイトロジェンのベース（Difco 社
製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培
地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラ
クト（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社
製）、２％グルコース〕が例示される。メタノール資化
性宿主を用いる場合は、メタノール含有培地を用いるこ
とができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％
程度である。本発明で用いられる培地は、従来公知の培
地に所定量の脂肪酸アルキルエステルを添加することに
よって簡便に調製することができる。
い。好ましくは合成培地である。また、固体培地であっ
ても液体培地であってもよいが好ましくは、液体培地で
ある。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として
各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩
など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドな
どの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍ
ｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地
〔０．７％イーストナイトロジェンのベース（Difco 社
製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培
地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラ
クト（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社
製）、２％グルコース〕が例示される。メタノール資化
性宿主を用いる場合は、メタノール含有培地を用いるこ
とができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％
程度である。本発明で用いられる培地は、従来公知の培
地に所定量の脂肪酸アルキルエステルを添加することに
よって簡便に調製することができる。
【００１３】他の培養条件としては、一般的な常法に準
じた条件が挙げられる。培養温度としては、通常２０℃
〜３７℃が例示される。宿主が酵母の場合は２０℃〜３
０℃であることが好ましく、細菌の場合は３０℃〜３７
℃であることが好ましい。培養時間は通常１時間〜１０
００時間程度が例示される。
じた条件が挙げられる。培養温度としては、通常２０℃
〜３７℃が例示される。宿主が酵母の場合は２０℃〜３
０℃であることが好ましく、細菌の場合は３０℃〜３７
℃であることが好ましい。培養時間は通常１時間〜１０
００時間程度が例示される。
【００１４】培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回
分（バッチ）培養法や半回分（フェッドバッチ）培養法
あるいは連続培養法により実施される。例えば、フェッ
ドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量
づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて
高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９
５号公報）などが挙げられる。なお、当該培養に先立っ
て前培養を行うことが好ましい。前培養の培地として
は、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用され
る。また、前培養の培養条件としては、好ましい態様と
して、培養時間は１０時間〜１００時間、温度は酵母で
は３０℃程度、細菌では３７℃程度が例示される。
分（バッチ）培養法や半回分（フェッドバッチ）培養法
あるいは連続培養法により実施される。例えば、フェッ
ドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量
づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて
高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９
５号公報）などが挙げられる。なお、当該培養に先立っ
て前培養を行うことが好ましい。前培養の培地として
は、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用され
る。また、前培養の培養条件としては、好ましい態様と
して、培養時間は１０時間〜１００時間、温度は酵母で
は３０℃程度、細菌では３７℃程度が例示される。
【００１５】かくして培養終了後、異種蛋白質は培養上
清または濾液、または菌体、細胞からそれぞれ公知の分
離、精製手段により採取される。
清または濾液、または菌体、細胞からそれぞれ公知の分
離、精製手段により採取される。
【００１６】
【実施例】以下に実施例によって、本発明を説明する。 実施例１ （１）使用菌株の調製 特開平２−１０４２９０号公報に記載のＡＯＸ1 プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプ
ラスミドｐＨＳＡ１１３から、ＨＳＡ遺伝子の５’ノン
コード領域を除去したＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１
を作成した。ｐＰＧＰ１は、正常ＨＳＡのアミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡを有する〔正常ＨＳＡのアミノ酸
配列および正常ＨＳＡをコードする染色体ＤＮＡ配列
は、J. Biol. Chem., 261, 6747-6757(1986)に記載され
ている。〕。そして、特開平２−１０４２９０号公報に
述べられている方法に従い、ピキア・パストリス（Pich
ia pastoris) ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1
遺伝子領域を、ＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１をＮｏ
ｔ１制限酵素で切断して得られる断片で置換して、形質
転換体ＰＣ４１３０を得た。この株はＡＯＸ1 遺伝子が
存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増
殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプ
ラスミドｐＨＳＡ１１３から、ＨＳＡ遺伝子の５’ノン
コード領域を除去したＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１
を作成した。ｐＰＧＰ１は、正常ＨＳＡのアミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡを有する〔正常ＨＳＡのアミノ酸
配列および正常ＨＳＡをコードする染色体ＤＮＡ配列
は、J. Biol. Chem., 261, 6747-6757(1986)に記載され
ている。〕。そして、特開平２−１０４２９０号公報に
述べられている方法に従い、ピキア・パストリス（Pich
ia pastoris) ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1
遺伝子領域を、ＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１をＮｏ
ｔ１制限酵素で切断して得られる断片で置換して、形質
転換体ＰＣ４１３０を得た。この株はＡＯＸ1 遺伝子が
存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増
殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００１７】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジェンベース
ウィズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの
有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した
２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０
個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株は
ほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジェンベース
ウィズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの
有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した
２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０
個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株は
ほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００１８】ＧＣＰ１０１株から単離した変異型ＡＯＸ
２プロモーター〔天然ＡＯＸ２プロモーター (YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, p1316-
1323(1989)) 中、開始コドン上流２５５番目の塩基がＴ
からＣに変異したもの〕を用いてＨＳＡ発現用プラスミ
ドｐＭＭ０４２を構築し、ピキア・パストリス（Pichia
pastoris)ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報）。
２プロモーター〔天然ＡＯＸ２プロモーター (YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, p1316-
1323(1989)) 中、開始コドン上流２５５番目の塩基がＴ
からＣに変異したもの〕を用いてＨＳＡ発現用プラスミ
ドｐＭＭ０４２を構築し、ピキア・パストリス（Pichia
pastoris)ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報）。
【００１９】（２）培地組成 前培養には、ＹＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％イ
ーストエキストラクト、２％グルコース) を使用した。
本培養に使用したバッチ培地の組成を表１に、フィード
培地の組成を表２に示す。さらに、表１および表２中の
＊２の溶液の組成を表３に示す。表１および表２に示す
ように、実施例１において使用したバッチ培地およびフ
ィード培地中のオレイン酸メチルの含有量は０．１W/V%
とした。
ーストエキストラクト、２％グルコース) を使用した。
本培養に使用したバッチ培地の組成を表１に、フィード
培地の組成を表２に示す。さらに、表１および表２中の
＊２の溶液の組成を表３に示す。表１および表２に示す
ように、実施例１において使用したバッチ培地およびフ
ィード培地中のオレイン酸メチルの含有量は０．１W/V%
とした。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】（３）ファーメンターを用いた培養方法 前培養 凍結ストックバイアルより、菌体懸濁液１mlをＹＰＤ培
地５０mlの入ったバッフル付きの三角フラスコに植菌
し、３０℃、２４時間振盪培養した。 本培養 バッチ培地７００mlに前培養液１４mlを植菌し、ミニジ
ャーファーメンターを用いて通気攪拌培養した。培養温
度は、培養２４時間までは３０℃とし、それ以降は２５
℃とした。通気量は槽内を０．５ｋｇｆ／ｃｍ2 に加圧
した状態で３．２Ｌ／ｍｉｎとした。攪拌速度は培養７
時間までは２００ｒｐｍとし、それ以降は１０００ｒｐ
ｍとした。ｐＨは２８％アンモニア水を用いて５．８５
とした。消泡は、必要に応じてアデカノールＬＧ−１０
９（旭電化工業製）を培地中に適宜添加することで実施
した。バッチ培養において酵母が十分高密度に増殖し、
培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培
地の添加を開始し、３６０時間培養を行った。培養終了
後、培養液を採取し、下記の参考例に記載した方法にて
菌体濃度、ＨＳＡ濃度、分解率を測定した。その結果を
表４に示す。後述の実施例２及び比較例１についてもそ
れぞれ同様に測定し、それらの結果も合わせて表４に示
す。実施例１において、ＨＳＡの産生量は後述の比較例
１と比べて増加していた。
地５０mlの入ったバッフル付きの三角フラスコに植菌
し、３０℃、２４時間振盪培養した。 本培養 バッチ培地７００mlに前培養液１４mlを植菌し、ミニジ
ャーファーメンターを用いて通気攪拌培養した。培養温
度は、培養２４時間までは３０℃とし、それ以降は２５
℃とした。通気量は槽内を０．５ｋｇｆ／ｃｍ2 に加圧
した状態で３．２Ｌ／ｍｉｎとした。攪拌速度は培養７
時間までは２００ｒｐｍとし、それ以降は１０００ｒｐ
ｍとした。ｐＨは２８％アンモニア水を用いて５．８５
とした。消泡は、必要に応じてアデカノールＬＧ−１０
９（旭電化工業製）を培地中に適宜添加することで実施
した。バッチ培養において酵母が十分高密度に増殖し、
培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培
地の添加を開始し、３６０時間培養を行った。培養終了
後、培養液を採取し、下記の参考例に記載した方法にて
菌体濃度、ＨＳＡ濃度、分解率を測定した。その結果を
表４に示す。後述の実施例２及び比較例１についてもそ
れぞれ同様に測定し、それらの結果も合わせて表４に示
す。実施例１において、ＨＳＡの産生量は後述の比較例
１と比べて増加していた。
【００２４】実施例２ フィード培地中のオレイン酸メチルの含有量を１W/V%と
したこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。表
４に示したように、実施例２においては、実施例１より
菌体濃度が高くなり、酵母によって産生されたＨＳＡ量
が増加した。さらに、ＨＳＡの分解率は低く抑えられ
た。
したこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。表
４に示したように、実施例２においては、実施例１より
菌体濃度が高くなり、酵母によって産生されたＨＳＡ量
が増加した。さらに、ＨＳＡの分解率は低く抑えられ
た。
【００２５】比較例１ フィード培地中に脂肪酸のアルキルエステルを添加しな
かったこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。
比較例１においては、実施例１、２と比較してＨＳＡ総
量が少なかった。
かったこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。
比較例１においては、実施例１、２と比較してＨＳＡ総
量が少なかった。
【００２６】
【表４】
【００２７】参考例１ 菌体濃度の測定 培養終了後、培養液をサンプリングし、蒸留水で測定時
のＯＤ540 値が０．３以下となるよう適当に希釈したの
ち分光光度計（ＵＶ１２００型、島津製作所製）を用い
て５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。本実験におい
て、吸光度から乾燥菌体量への変換はＯＤ540 値／５．
６とした。
のＯＤ540 値が０．３以下となるよう適当に希釈したの
ち分光光度計（ＵＶ１２００型、島津製作所製）を用い
て５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。本実験におい
て、吸光度から乾燥菌体量への変換はＯＤ540 値／５．
６とした。
【００２８】参考例２ ＨＳＡ濃度 培養終了後、培養液をサンプリングし、15,000ｒｐｍで
５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーＣ３Ｈ
Ｖにより清澄濾過後、ＨＰＬＣによるゲル濾過分析を行
い、ＨＳＡ濃度を測定した。 カラム ：東ソー ＴＳＫｇｅｌ Ｇ3000ＳＷX1、２本直列 移動相 ：0.3M NaCl, 50mM Na-Phosphate, 0.1% NaN3 ,pH6.5 流速 ：0.7 ml/min インジェクション量 ：50μｌ 検出 ：Ａ280 、Ａ350 （２波長）
５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーＣ３Ｈ
Ｖにより清澄濾過後、ＨＰＬＣによるゲル濾過分析を行
い、ＨＳＡ濃度を測定した。 カラム ：東ソー ＴＳＫｇｅｌ Ｇ3000ＳＷX1、２本直列 移動相 ：0.3M NaCl, 50mM Na-Phosphate, 0.1% NaN3 ,pH6.5 流速 ：0.7 ml/min インジェクション量 ：50μｌ 検出 ：Ａ280 、Ａ350 （２波長）
【００２９】参考例３ 分解率の算出 参考例２におけるＨＰＬＣ分析の結果から、次式によっ
て分解率を求めた。分解率（％）＝ＨＳＡ分解物（43k
d）ピーク高さ／ＨＳＡモノマー（67kd）ピーク高さ×
１００
て分解率を求めた。分解率（％）＝ＨＳＡ分解物（43k
d）ピーク高さ／ＨＳＡモノマー（67kd）ピーク高さ×
１００
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、異種蛋白質産生性宿主
が産生する異種蛋白質の産生量を増大させることができ
る。さらに、異種蛋白質が宿主が分泌する酵素によって
分解されることを抑制することが可能であるため、異種
蛋白質の収量を増大させることができる。本発明は、脂
肪酸のアルキルエステルを含有する培地で異種蛋白質産
生性宿主を培養すればよく、簡易な方法によって実施す
ることができる。
が産生する異種蛋白質の産生量を増大させることができ
る。さらに、異種蛋白質が宿主が分泌する酵素によって
分解されることを抑制することが可能であるため、異種
蛋白質の収量を増大させることができる。本発明は、脂
肪酸のアルキルエステルを含有する培地で異種蛋白質産
生性宿主を培養すればよく、簡易な方法によって実施す
ることができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 大屋 智資 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 應田 豊雄 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 相生 正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大山 政男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 遺伝子操作により調製された異種蛋白質
産生性宿主を、脂肪酸アルキルエステルを含有する培地
で培養し、培養物から異種蛋白質を採取することを特徴
とする異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】 前記脂肪酸アルキルエステルにおける脂
肪酸の炭素数が１０〜２６である請求項１記載の異種蛋
白質の製造方法。 - 【請求項３】 前記脂肪酸アルキルエステルがオレイン
酸アルキルエステルである請求項１に記載の異種蛋白質
の製造方法。 - 【請求項４】 前記脂肪酸アルキルエステルのアルキル
基が、メチル基またはエチル基である請求項１または２
記載の異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項５】 前記異種蛋白質産生性宿主が酵母である
請求項１〜４のいずれかに記載の異種蛋白質の製造方
法。 - 【請求項６】 前記酵母がピキア属酵母である請求項５
記載の異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項７】 前記異種蛋白質がヒト血清アルブミンで
ある請求項１〜６のいずれかに記載の異種蛋白質の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17257796A JPH1014564A (ja) | 1996-07-02 | 1996-07-02 | 蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17257796A JPH1014564A (ja) | 1996-07-02 | 1996-07-02 | 蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014564A true JPH1014564A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=15944423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17257796A Pending JPH1014564A (ja) | 1996-07-02 | 1996-07-02 | 蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1014564A (ja) |
-
1996
- 1996-07-02 JP JP17257796A patent/JPH1014564A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060704 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061031 |