JPH1014579A - モノガラクトシルジアシルグリセロール合成酵素及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 植物等に大量に含まれるガラクト脂質で
あるモノガラクトシルジアシルグリセロールを合成する
酵素、及びそれをコードする遺伝子。 【効果】 生物の脂質組成の改良、特にＭＧＤＧの量の
制御に有用な酵素、及びそれをコードする遺伝子を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物及び一部の微
生物の主要な脂質であるモノガラクトシルジアシルグリ
セロール（ＭＧＤＧ）を合成する酵素、及びそれをコー
ドする遺伝子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体膜の基本成分は、脂質とタンパク質
であり、脂質の中にはリン脂質や糖脂質等の極性脂質と
色素、ステロール等の中性脂質が有る。植物の葉緑体及
び一部の光合成を営む微生物（ラン藻）の細胞膜には、
光合成と関連すると思われる幾つかの種類の脂質が存在
する。それらの膜にある脂質は、多いものはモノガラク
トシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）とジガラクト
シルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）があり、より含
量の少ないものとしてフォスファチジルグリセロール
（ＰＧ）とスルフォキノボシルジアシルグリセロール
（ＳＱＤＧ）がある。主要な脂質であるＭＧＤＧの合成
は、植物では、葉緑体の包膜で起こる。即ち、１，２−
ジアシル−ｓｎ−グリセロールの３位へＵＤＰ−ガラク
トースからガラクトースを転移し、１，２−ジアシル−
３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−ｓｎ−グリ
セロール（ＭＧＤＧ）を生成する（ＥＣ ２．４．１．
４６）。ガラクト脂質（ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ）とＳＱＤ
Ｇはジアシルグリセロールを共通の基質として用いるの
で、ガラクト脂質とＳＱＤＧの比率がＭＧＤＧ合成酵素
によって調節されると考えられる。実際には、ガラクト
脂質は、ＳＱＤＧ分子の５〜２０倍量存在すると推定さ
れている。ＭＧＤＧは光合成をする組織に多量にあり、
１ｇ生葉重当たり０．６〜１５μｍｏｌ存在する。葉緑
体膜が細胞の膜系の中で最も多量に存在することを考慮
すると、ＭＧＤＧが細胞の中で最も多量に存在する脂質
で有ることが推測される。また、ガラクト脂質には、多
価不飽和脂肪酸が多量に存在するが、その９５％位はリ
ノレン酸である。従って、分子種としてはｓｎ−１、２
共に１８：３で占められたものが多いが、ホウレンソウ
のような、いわゆる「１６：３植物」では、ｓｎ−１
は、１８：３であるが、ｓｎ−２は、１６：３で占めら
れている。一方、両ポジション共１８：３で占められて
いる分子種は細胞質の小胞体で合成された後、葉緑体へ
移送される、いわゆる「真核型」脂質で有り、他方のｓ
ｎ−２が、１６：３に置き変わった物は、葉緑体内で全
合成される、いわゆる「原核型」脂質である。

【０００３】ＭＧＤＧ合成酵素は葉緑体の包膜に存在す
る微量酵素であるため、ＭＧＤＧの量が極めて多いにも
関わらず、その精製は極めて困難とされてきた。まず第
１に包膜は、細胞の全膜成分中では少ない成分である
し、そのタンパク質も葉緑体の全タンパク中の１〜２％
を占めるに過ぎない。第２に包膜はタンパク質に比べて
極めて脂質の量が多く、酵素の可溶化が容易でないこと
が困難な点である。ＭＧＤＧ合成酵素の含量としては、
包膜のタンパク質の０．１から０．５％と言われてい
る。この酵素の部分精製を報告しているグループが２つ
あり、いずれもホウレンソウの葉緑体包膜から酵素活性
を数百倍に濃縮することに成功しているが、完全精製に
は至っていない（C. R. Acad. Sci. Paris, 313: 521,
1991; Planta, 184,319, 1991）。また分子量は約２０
ｋＤａと報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】植物の脂質合成に関係
する突然変異体がシロイヌナズナから多数分離されてお
り、特に不飽和化反応を行なう酵素については詳細に分
析されている。ところが、ＭＧＤＧ合成酵素に関わるも
のは、ＭＧＤＧの量が前述のように極めて多く、変異の
検出も容易と思われるにも関わらず一切報告されていな
い。ＭＧＤＧは、葉緑体の膜系には広範囲に存在する脂
質であるが、チラコイド膜もさることながら、特に光化
学系ＩＩの反応中心と強く結合した複合体を形成してい
ることが知られている（Biochim. Biophys. Acta, 101
9: 261, 1990）。また、特にＭＧＤＧはチラコイド膜の
湾曲部を安定化させ、疎水タンパクを折り畳む役割を果
たしているといわれている（FEBS LETT., 150: 19,198
2）。これらのことから、ＭＧＤＧの光合成等への生理
的役割は極めて大きいものと推測される。しかしなが
ら、その量を調節することにより膜の安定化を操作する
技術は、突然変異体の利用を含めて、不可能であった。

【０００５】本発明の目的は、植物の生体内で重要な役
割を果たしているＭＧＤＧの合成に関与する酵素及びそ
れをコードする遺伝子を単離することにあり、更には、
当該遺伝子を導入してＭＧＤＧ産生能を人為的に改変し
た植物等を作出することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＭＧＤＧ合成酵素
をコードする遺伝子を単離することに成功し、さらに当
該遺伝子を大腸菌に導入しＭＧＤＧ生産能を付与するこ
とに成功し、本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明は、配列番号３で表されるア
ミノ酸配列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一なアミノ酸配列を有するモノガラクトシル
ジアシルグリセロール合成酵素、及び該酵素と別のタン
パク質とからなる融合タンパク質である。

【０００８】また、本発明は、配列番号３で表されるア
ミノ酸配列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一なアミノ酸配列をコードするモノガラクト
シルジアシルグリセロール合成酵素遺伝子である。更
に、本発明は、上記遺伝子を含む組換えベクター及び上
記遺伝子が導入された細胞である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＭＧＤＧ合成酵素は、配列番号３で表されるアミノ酸配
列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に
同一なアミノ酸配列を有する。また、本発明のＭＧＤＧ
合成酵素遺伝子は、配列番号３で表されるアミノ酸配
列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に
同一なアミノ酸配列をコードする。ここで「配列番号３
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配
列」とは、配列番号３で表されるアミノ酸配列の幾つか
のアミノ酸残基について、置換、欠失、付加等の変化が
生じた配列であって、配列番号３で表されるアミノ酸配
列と同様にＭＧＤＧ合成活性を有するアミノ酸配列をい
う。幾つかのアミノ酸残基について置換、欠失、付加等
の変化を起こさせることは、本願の出願時において常用
されている技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Nucl
eic Acid Research, Vol.10, No.20, p6487-6500）によ
り行うことができる。なお、一般に、ＤＮＡ鎖があるア
ミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする場合、一つ
のアミノ酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数個存
在するが（縮重異性体）、本発明のＭＧＤＧ合成酵素遺
伝子においても、配列番号３で表されるアミノ酸配列に
対応する任意の遺伝コードを用いることができることは
言うまでもない。

【００１０】本発明のＭＧＤＧ合成酵素は、上記「従来
の技術」等に記載したごとく本来植物及び一部の微生物
（ラン藻）に存在する酵素である。ＭＧＤＧ合成酵素の
アミノ酸配列は枯草菌及び大腸菌のMurG遺伝子のコード
するタンパク質と局所的に類似しているが全体的には大
きく異なる（第６図）。また、他の既知の脂肪酸及び脂
質の合成に関わる酵素の化学構造とは全く類似していな
い。

【００１１】ＭＧＤＧ合成酵素は、植物及びラン藻に含
まれているので、これらから単離することができる。具
体的には、以下のような方法により行うことができる。
まず、植物又はラン藻の細胞を破砕し、遠心分離により
ミクロソーム画分を得る。次に、このミクロソーム画分
に界面活性剤を加え、膜に結合したＭＧＤＧ合成酵素を
可溶化する。このとき用いる界面活性剤は特に限定され
ないが、ＬＤＡＯを用いるのが好ましい。可溶化したＭ
ＧＤＧ合成酵素は、その活性を指標として各種クロマト
グラフィーにより精製する。ＭＧＤＧ合成酵素の活性
は、Teucher とHeinz の方法（Planta 184,319,1991 ）
により測定できる。また、上記のような天然素材を原料
とするほか、ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を導入した形質転
換細胞からＭＧＤＧ合成酵素を単離することもできる。

【００１２】本発明のＭＧＤＧ合成酵素を別のタンパク
質と融合させ、融合タンパク質とすることができる。Ｍ
ＧＤＧ合成酵素と融合させるタンパク質は、特に限定さ
れず、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合性タンパク等を
使用することができる。このような融合タンパク質は、
ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子とそのプロモーターとの間に当
該別のタンパク質をコードする塩基配列を挿入し、この
融合遺伝子を発現させることにより作成できる。ＭＧＤ
Ｇ合成酵素を融合タンパク質とすることにより、発現量
が向上する、タンパク質の精製が容易になるなどの利点
がある。

【００１３】ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子は、例えば、以下
のようにして得ることができる。まず、植物又はラン藻
よりＭＧＤＧ合成酵素を単離し、これをペプチターゼに
より断片化し、その断片のアミノ酸配列を決定する。次
に、アミノ酸配列を決定した断片化ペプチドに対応する
オリゴヌクレオチドを合成する。これとは別に、植物又
はラン藻より全ＲＮＡを抽出し、それらの中からポリＡ
を有するＲＮＡを分離し、このＲＮＡに相補的なＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する。このｃＤＮＡをファージλgt
11のような適当なベクターにつなぎ、ｃＤＮＡライブラ
リーを作成する。ここで、上記で合成したオリゴヌクレ
オチドを用いてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
を行う。スクリーニングは、ヌクレオチドプローブを用
いる方法のほか、抗体を用いる免疫学的方法によっても
行い得る。また、別の頻用される方法として、公知の塩
基配列を元に、目的とする配列の両端に位置する短いＤ
ＮＡ配列に対応するプライマーを設計し、全体の配列を
決定するのに使った材料から得たＤＮＡを鋳型として、
ＰＣＲを行うことにより、目的とする配列を得ることも
できる。

【００１４】このようにして選抜したクローンにおける
本発明遺伝子の塩基配列の決定及び確認は、通常公知の
方法を用いて行なうことができる。例えば、Ｍ１３ファ
ージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Gene,
19: 269, 1982）により行なうことができる。また、上
記のような方法によらなくても、本発明の遺伝子は、配
列番号２に基づき、ホスファイト法を用いた市販のＤＮ
Ａシンセサイザーで合成する事もできる。

【００１５】ＤＮＡ鎖またはその断片を発現させてそれ
がコードするタンパク質もしくはポリペプチドを産生さ
せるためには、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列
（コーディング領域）以外に、発現調節領域が必要であ
る。本発明のＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を発現させるため
にもそのような領域が必要であるが、それらは特別なも
のである必要はなく、ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子本来の発
現調節領域をそのまま用いてもよく、他の生物由来の発
現調節領域を用いてもよい。

【００１６】本発明の「ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を含む
組換えベクター」は、ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を単独
で、又は発現調節領域と共に、ベクターにつなげること
により作成できる。ベクターとしては、プラスミド、フ
ァージ等の公知のものを使用できる。

【００１７】本発明の「ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子が導入
された細胞」は、ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を含むベクタ
ーを細胞に導入することにより作成することができる。
ここで用いるベクターは、ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を導
入細胞中で発現し得るものであることが好ましい。細胞
としては、微生物細胞、植物細胞、動物細胞のいずれで
もよく、生物の種類も問わない。細胞への導入方法は、
常法に従って行うことができ、植物細胞へ導入する場合
は、例えば「Plant Molecular Biology Manual, Second
Edition; S.G.Gelvin, and R.A. Schilperoort eds, K
luwer AcademicPublishers, 1995」記載の方法を用いて
行なうことができる。その例としては、生物的方法であ
るウイルスを用いる方法、アグロバクテリウムを用いる
方法等、物理化学的方法であるエレクトロポレーション
法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等
が挙げられる。

【００１８】また、ＭＧＤＧ合成酵素は植物体では葉緑
体の包膜に存在するタンパクであることから、葉緑体へ
の転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖をＭＧＤＧ合成酵
素の上流に付けておくことが好ましい。その例として
は、エンドウのリブロース−１、５−２リン酸カルボキ
シラーゼの小サブユニット遺伝子を当該転移ペプチドを
コードする遺伝子として用いることができる。

【００１９】

【発明の実施の形態】

【００２０】

【実施例】以下実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定さ
れるものではない。

【００２１】〔実施例１〕 キュウリ子葉からのＭＧＤ
Ｇ合成酵素の精製 キュウリ種子（Cucumis sativus L. cv. Aonagajibai／
サカタのタネより入手)を湿らせたバーミキュライトで
暗所２７℃の下で発芽させた。４日後から２９時間蛍光
燈（５Ｗ／ｍ２）で光照射し、胚軸を除いた緑化子葉を
収穫し、使用するまで−８０℃の冷凍庫で保管した。集
めた約３．２ｋｇの子葉に、等量のＴＳＰＢ緩衝液（50
mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM dithiothreitol, 0.8 M
sodium acetate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid
e, 20 ％ glycerol, 0.02 ％sodium azide, 1 μM leup
eptin）を加えてワーリングブレンダーで破砕後、ガー
ゼで濾過した。濾液を４℃、１５，０００×ｇで１５分
間遠心し、その上清を更に１６５，０００×ｇで１．５
時間遠心してミクロソーム画分を沈殿として得、これを
−３０℃で冷凍保存した。なお、ＭＧＤＧ合成酵素は葉
緑体包膜に存在する酵素であるが、包膜の大量調製は困
難なので、包膜を多く含むミクロソーム画分を出発材料
とした。

【００２２】酵素の界面活性剤による可溶化については
sodium cholate, Brij-35, TritonX-100,ＣＨＡＰＳ,
ＬＤＡＯ(lauryldimethylamine oxide), octylglucosid
e等の幾つかの薬剤を用いて比較検討したが、この中で
はＣＨＡＰＳ、ＬＤＡＯ、 octylglucosideによる可溶
化率が高かった。その３つの中から、非イオン性のため
精製の際にイオン交換クロマトグラフィーを利用できる
こと、低コストで大量精製に向いていることが利点にな
る、ＬＤＡＯを可溶化剤に選定した。先に調製したミク
ロソーム画分へ１２ｍＭのＬＤＡＯを加えた後、１６
５，０００×ｇで１．５時間遠心して、上清を可溶化酵
素とした。この可溶化酵素を亜鉛を用いた金属キレート
アフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア社
製）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（和
光純薬製）、Toyopearl HW-55によるゲル濾過（東洋ソ
ーダ社製）、陽イオン交換クロマトグラフィー(２種
類：CM-Toyopearl、東洋ソーダ社製； MonoS、ファル
マシア社製)、UDP-hexanolamine agaroseを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー（シグマ社製）を順次行
ない精製した。この結果、最終的にＭＧＤＧ合成酵素
は、可溶化直後の粗画分と比較して、11,000倍以上に精
製された。精製効果の高かったステップの１つは、陽イ
オン交換クロマトグラフィーであり、このステップをリ
ガンドの種類を変えて２度繰り返すことによって、併せ
て１０倍以上濃縮することが出来、最終的な比活性は６
００nmol/min mg タンパクになった。また、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果から、ＭＧＤＧ合成酵素の分子量は４５ｋ
Ｄａと推定された。これは、報告されているホウレンソ
ウ葉緑体包膜の酵素の分子量約２０ｋＤａ(Marechal ら
(1991)、及びTeucherとHeinz(1991))の報告とは明らか
に異なっていた。

【００２３】次に、精製酵素をプロテアーゼ消化によっ
てペプチド断片化して、岩松の方法（生化学、 63:139,
1991； Electrophoresis 13: 142、1992）によって
断片化ペプチドのアミノ酸配列を決定した。上述の方法
で精製したタンパク質の溶液に、２倍量のアセトンを加
えタンパク質をアセトン沈殿とし、沈殿を乾燥後１５０
μｌの電気泳動用バッファーに溶解した後、１２％のア
クリルアミド濃度のＳＤＳ電気泳動を行ない、タンパク
質をＰＶＤＦ膜（アプライド バイオシステム社製）へ
エレクトロブロットティング装置（アトー社製）により
転写した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜を０．１
％ Ponceau S（シグマ社製）／１％酢酸で染色し、分子
量約４５ｋＤａのバンドを切り取り、０．５ｍＭ Ｎａ
ＯＨで脱色した。これを還元Ｓ−カルボキシメチル化
し、リジルエンドペプチダーゼ（Achromobacter protea
se 1）を酵素：基質（mol:mol）比で１：１００になる
ように加え、３０℃で１６時間反応させた。生成した断
片化ペプチドを溶媒Ａ（９８％）と溶媒Ｂ（２％）で平
衡化したμ-Bondashere 5μC8-300A (2.1×150 mm,Wate
rs社製)カラムにアプライし、溶媒Ｂに関し２−５０％
のリニアグラジエントで３０分間、流速０．２５ｍｌ／
分で溶出した （溶媒A:0.05%TFA水溶液、溶媒B:2-プロ
パノール：アセトニトリル=7:3(v/v)中の0.02 % TF
A）。溶出されたペプチドを２１４ｎｍにおける吸収で
検出し、それぞれのピーク画分をマニュアルで集めた。
得られたそれぞれのピーク画分は、気相プロテインシー
ケンサー(Applied Biosystems社、 Model 470A)を用い
て分析した。総ての得られたピーク画分を分析した結
果、断片化ペプチドのアミノ酸配列が明確に決定され
た。以下はその一部を示している。

【００２４】 #1:GVSDE (N-末端; AP-10) #2:LVTRCYCPSTEVAK (AP-5) #3:GFVTK (AP-1) #4:IVFTTVVTD (AP-13) #5:RVLILMSDTGG (AP-9) なお、ＭＧＤＧ合成酵素の活性は、後に詳細に述べる
が、³HラベルしたUDP-galactoseと1, 2-dioleoyl-sn-gl
ycerolを基質とし、脂質画分への[³H]-galactoseの取り
込みを指標として測定した。

【００２５】〔実施例２〕 キュウリ子葉由来のcDNAラ
イブラリーの作製 キュウリの種子を３０℃暗黒下で湿ったバーミキュライ
トで５日間発芽させた後、蛍光灯下に６時間おいて緑化
させた子葉を材料に用いた。１０ｇの子葉よりChirgwin
らの方法（Biochemistry, 18: 5294-5299, 1979）に従
って全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡをもとにAvivらの方
法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69:1408, 1972）に
従ってポリＡを有するＲＮＡを分離した。上記のポリＡ
を有するＲＮＡにたいして相補的なＤＮＡをGublerらの
方法(Gene, 25: 263, 1983)に従って合成した。この
際、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）及びランダムオリ
ゴヌクレオチドを使用した。合成した二本鎖からなるＤ
ＮＡの両末端にEcoRI ／ NotI アダプター(ファルマシ
ア社製）を付けた後、末端をリン酸化した。次に余分な
アダプターをゲル濾過法でｃＤＮＡ画分から除き、ｃＤ
ＮＡとEcoRIであらかじめ切断し脱リン酸化したファー
ジλgt11のアームを連結した。このＤＮＡを試験管内パ
ッケイジング法(Gigapack GoldII; Stratagene社)でλ
ファージ粒子にパッケイジングし、λgt11のライブラリ
ーを得た。

【００２６】〔実施例３〕 ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子保
持株のスクリーニング 精製酵素から推定された部分ペプチド配列＃２の一部(C
YCPSTEVAK)を元にDNAプローブを合成した（Applied Bio
syste社；モデル394）。 ５’−TGYTAYTGYCCIWSIACIGARGTIGCIAAR (IUBコード)
（配列番号１）

【００２７】この５’末端を³²P-dCTPで標識した後、サ
ンブルック(Sambrook)らの著書（Molecular Cloning; S
econd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1989）に従って、ハイブリダイゼーションを行なっ
た。その条件は５×ＳＳＣ（１×SSCは0.15M NaCl、15m
M クエン酸ナトリウム),１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０×De
nhardtの液（ 50×Denhardtの液はFicoll(Type400, Pha
rmacia社), polyvinylpyrrolidone, bovine serum albu
min (fraction V, Sigma社) を各１０ｇ／ｌ），及び２
５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡから成る液中で６０℃、
１６時間とした。その後、メンブレンを５×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ液中４５℃、１５分２回洗い、オートラ
ジオグラフィーを取った。陽性クローンを純化後、ｃＤ
ＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋にサブク
ローニングし、常法に従って、塩基配列を決定した。そ
のＤＮＡ配列(1647bp）及び予想されるアミノ酸配列を
第１図〜第３図に示す（それぞれ配列番号２で表されＤ
ＮＡ配列及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含
む）。図中の矢印は葉緑体へのトランジット配列の予想
される切断点、細い下線部は精製酵素の限定分解ペプチ
ドのシーケンスから推定した配列と一致した部分を、太
い下線部は大腸菌で発現させる際にＰＣＲに用いたプラ
イマーの位置を示す。このアミノ酸配列をデータベース
中の他のタンパク質のアミノ酸配列と比較した（解析ソ
フトGENETYX ）。結果を図６に示す。図６中の*印は３
種の遺伝子で一致したアミノ酸の位置を示す。図６が示
すように、このアミノ酸配列は、Bacillus subtilis と
E. coliのMurG遺伝子（ペプチドグリカンの合成に関係
する遺伝子）と約２０％の有為な相同性を示した（クロ
ーン名；pBSMGDG1）。

【００２８】〔実施例４〕 ＭＧＤＧ合成酵素候補遺伝
子(pBSMGDG1)の大腸菌での発現による活性測定 ＭＧＤＧ合成酵素候補遺伝子がどのような酵素活性を有
しているか確認するため、この遺伝子を大腸菌で発現さ
せ、活性測定することを試みた。ＭＧＤＧ合成酵素候補
遺伝子と大腸菌での発現ベクターpGEX-3X(Pharmacia社
製)を用い、Glutathione S- transferase(GST)のＣ末端
へのフュージョンタンパクとして発現させるために、Ba
mHI及びEcoRIサイトをＭＧＤＧ合成酵素候補遺伝子の両
端にＰＣＲにより付けた。

【００２９】センスプラーマー； 5'-GGGGATCCCTGGTGTT
TCAGATGAAACCAATG（下線はBamHIサイト）（配列番号
４） アンチセンスプライマー； 5'-CCGAATTCCCGCCGGAATATTG
TGGTACAAAAC（下線はEcoRIサイト）（配列番号５）

【００３０】上記の２種のプライマーを用いてpBSMGDG1
を鋳型としたＰＣＲを行なうと約１．３ｋｂｐの産物が
得られた。なお、反応条件は、パーキンエルマー社のマ
ニュアルに従い、９４℃（１．５分）、６０℃（２
分）、７２℃（３分）を１サイクルとする反応を３０回
繰り返した。この反応産物をBamHI及びEcoRIで切断した
後、同じ制限酵素のセットで予め切断したpGEX-3Xにク
ローニングした（pGEX-GTとする）。このプラスミド
を、常法（Molecular cloning pp.1.76-1.84; 1989）に
従って調整した大腸菌XL1-Blue株のコンピテントセルに
導入し、アンピシリン耐性による選別により形質転換株
を得た（1b-2とする）。なお、元のプラスミドpGEX-3X
を導入した大腸菌株をGEX-3Xと名付けた。

【００３１】GEX-3X及び1b-2をアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含む５０ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で３時間培養
し、最終濃度０．１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシ
ド（IPTG）を加え、更に２時間培養した。３０００回転
５分間の遠心分離により集菌し、菌体を５ｍｌのＭＯＤ
緩衝液(50 mM MOPS-NaOH (pH7.9), 10mM dithiothreito
l)に懸濁し、超音波により（Output2, duty60, 30秒を
２回；トミー社製）破砕した。

【００３２】この破砕液を用いてＭＧＤＧ合成酵素の活
性をTeucherとHeinzの方法(Planta184, 319, 1991)に従
って測定した。この際、基質として４００μＭのＵＤＰ
-galactoseを加えた。３０μｌの酵素液に５０μｌの1,
2-dioleoyl-sn-glycerol (これは予め0.0１%のTween 20
を含む TSPB緩衝液に溶かし濃度４ｍｇ／ｍｌに調整済
み）と１１０μｌのＭＯＤ緩衝液を加え３０℃で５分間
プレインキュベーションした。反応は１０μｌのＵＤＰ
−[4,5-³H] galactose (92.5 Bq nmol-1)を加えて開始
し、３０℃で１０分間行なった。次に、１ｍｌの酢酸エ
チルを加えて反応を止めた。ボルテックスで良く攪拌し
た後、０．５ｍｌの０．４５％(W/V)のＮａＣｌ水溶液
を加え５００×ｇ、５分間遠心分離した。下層を捨て、
再び０．４５％のＮａＣｌ水溶液を加え攪拌し、遠心分
離した上層の放射能の値を液体シンチレーションカウン
ターで測定した（ LS６５００CE、 Beckman-RIIC社
製）。この際、４ｍｌのシンチレーションカクテル(ACS
-II)と０．５ｍｌのメタノールを加えた。

【００３３】

【表１】

【００３４】ここでタンパク量はBensadounとWeinstein
の方法（Anal. Biochem.,70, 241,1976）で測定した。
ＭＧＤＧ合成酵素候補遺伝子を発現している大腸菌株
（1b-2）でのみgalactoseの取り込みがあり、しかもそ
の量はＩＰＴＧにより大幅に誘導された。

【００３５】次に、形質転換した大腸菌でgalactoseが
取り込まれて生成する脂質がＭＧＤＧであるかどうかを
ＴＬＣにより調べた。まず、上記のようにＩＰＴＧによ
り誘導をかけた大腸菌の破砕物を調整し、酵素活性の測
定時に５０μMのＵＤＰ−[¹⁴C] galactose (４９３Bq n
mol-1)を加えた。その理由は、³H標識したgalactoseで
は、後述のＴＬＣによる分画後の反応産物をイメージア
ナライザー（BAS2000,フジフィルム社製）で検出するこ
とが困難な為である。３０℃で１０分反応を行なった
後、上記と同様の方法で１ｍｌの酢酸エチルの添加によ
り反応を止め、０、４５％NaClで２度洗浄した後、得ら
れた酢酸エチル層のうち５００μｌを乾燥し、再び１０
０μｌのクロロホルム：メタノール（１：１）混液に溶
解して、全量をＴＬＣに供し展開溶媒１（クロロホル
ム：メタノール：水=６５：１５：２、Ｖ／Ｖ）により
分画した。その際、脂質の対照として、ホウレンソウ葉
の抽出物を同時に展開し、糖脂質をアンスロン試薬を噴
霧することにより発色させて移動度を比較した。この結
果を図５に示す。図５において、レーン１は、ホウレン
ソウ葉から抽出した脂質であり、レーン２から５は大腸
菌抽出物により合成された脂質である。レーン２、３は
GEX-3X由来、レーン４、５は1b-2由来であり、その内レ
ーン２、４は、ＩＰＴＧ誘導前、レーン３、５は誘導後
の菌体からの抽出物を用いた。また、レーン６はキュウ
リ子葉から精製した酵素を用いた反応による生成物を示
す。図５が示すように、GEX-3XではＩＰＴＧによる誘導
の有無に関わらず放射性のＭＧＤＧは検出されなかった
が、1b-2では、上記の第１表に示した脂質画分への取り
込みと軌を一つにして、ＭＧＤＧの位置に明らかな放射
能によるバンドが検出され、しかもＩＰＴＧによる誘導
が有った。以上のことから、この遺伝子がＭＧＤＧ合成
酵素遺伝子をコードしていることが明らかになった。

【００３６】〔実施例５〕 ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子(p
BSUDGT1)を発現している大腸菌の脂質組成 上記の活性測定に使用した大腸菌株GEX-3X及び1b-2を用
いて、脂質組成を調べた。脂質はBlighとDyerの方法(Ca
n. J. Biochem. Physiol., 37: 911, 1959)によって、
ＩＰＴＧによる誘導をかけた菌体から抽出し、ＭＧＤＧ
の場合は展開溶媒１で、リン脂質の場合は展開溶媒２
（クロロホルム：メタノール：酢酸=６５：２０：１
０、Ｖ／Ｖ）で分離した。Phosphatidylglycerol(PG),
cardiolipin(CL), Phosphatidylethanolamine(PE)はDit
tmer試薬（J. Lipid Res., 5: 126, 1964）と反応さ
せ、また、ＭＧＤＧはアンスロン試薬と反応させて、そ
れぞれの標準脂質と比較して検出した。なお、脂質の定
量に当たっては、リン脂質は、Fiske-Subbarowの方法
（J. Biol. Chem., 66:375, 1925）でガラクト脂質はga
lactoseを標準品としてRadinらの方法（J. Biol. Che
m., 217: 789, 1955）を用いた。

【００３７】

【表２】

【００３８】脂質組成の分析結果から、本来大腸菌には
存在しないＭＧＤＧが、驚くべきことに１７％以上も生
成していることが判明した。また、相対的に他の脂質も
全般に減少した。

【００３９】

【発明の効果】本発明のＭＧＤＧ合成酵素をコードする
遺伝子は、形質転換による動物、植物、微生物の脂質組
成の改良、特にＭＧＤＧの量の制御に有用である。

【００４０】

【配列表】

配列番号１： 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGYTAYTGYC CIWSIACIGA RGTIGCIAAR

【００４１】配列番号２： 配列の長さ：１２６６ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：キュウリ (Cucumis sativus) 株名：青長地這 配列： GGT GTT TCA GAT GAA ACC AAT GGG ATT AGA GAC GAT GGA TTT GGT GTT TCG CAA GAT GGG GCA CTG CCA TTG AAT AAA ATC GAG GCT GAG AAC CCC AAA CGG GTT CTT ATT TTA ATG AGT GAC ACT GGT GGA GGT CAT CGG GCT TCT GCT GAG GCA ATC AAG GCA GCC TTT AAT GAA GAA TTT GGG AAC AAT TAT CAG GTG TTT ATA ACT GAT TTG TGG ACG GAC CAC ACT CCT TGG CCT TTC AAT CAA TTA CCA AGA AGC TAC AAC TTC TTG GTG AAA CAT GGC ACA TTG TGG AAG ATG ACT TAC TAT GTG ACT GCT CCA AAA GTG ATT CAT CAG TCA AAT TTT GCT GCA ACT TCA ACA TTC ATA GCT CGA GAA GTA GCA AAA GGA CTG ATG AAA TAT AGG CCA GAT ATT ATT ATC AGT GTT CAT CCT CTG ATG CAG CAT GTT CCC ATT CGT ATT TTG AGG TCG AAG GGC CTC TTG AAT AAG ATT GTT TTC ACC ACA GTA GTC ACA GAT TTG AGC ACC TGC CAC CCA ACA TGG TTT CAC AAG CTT GTT ACA AGA TGC TAC TGC CCA TCT ACG GAG GTA GCA AAG AGG GCT TTG AAA GCT GGA CTC CAG CCT TCC AAA CTA AAG GTT TTT GGC CTT CCT GTG CGG CCT TCC TTT GTT AAG CCT ATT CGT CCG AAG ATT GAG TTA AGA AAA GAA TTG GGC ATG GAT GAA AAT CTT CCT GCC GTG TTG CTT ATG GGA GGG GGG GAA GGC ATG GGT CCC ATT GAG GCT ACT GCA AAG GCG CTA AGT AAG GCA TTG TAT GAT GAA AAT CAT GGA GAG CCA ATA GGC CAA GTT CTT GTG ATC TGT GGC CAC AAC AAA AAA CTA GCT GGC AGG TTG CGT TCA ATT GAT TGG AAG GTT CCT GTC CAG GTG AAG GGG TTT GTC ACA AAA ATG GAG GAA TGC ATG GGA GCT TGT GAT TGC ATT ATA ACA AAG GCG GGC CCT GGA ACG ATT GCT GAA GCC ATG ATA AGA GGT CTT CCT ATA ATT CTG AAT GAC TAC ATT GCT GGA CAG GAA GCT GGA AAT GTG CCA TAT GTC GTC GAA AAC GGA TGT GGG AAG TTT TCA AAA TCT CCT AAA GAG ATA GCG AAC ATT GTA GCA AAA TGG TTT GGG CCA AAA GCA GAT GAG TTG CTG ATC ATG TCA CAG AAT GCC TTG AGG CTT GCT AGA CCT GAT GCT GTA TTT AAG ATT GTT CAT GAT CTC CAT GAG CTT GTT AAA CAA AGA AGT TTT GTA CCA CAA TAT TCC GGC

【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：４２２ 配列の型：タンパク質 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ホウレンソウ (Cucumis sativus) 株名：青長地這 配列の特徴： 特徴を現す記号：CDS 存在位置：130..1395 特徴を決定した方法：Ｐ 配列： Gly Val Ser Asp Glu Thr Asn Gly Ile Arg Asp Asp Gly Phe Gly Val 16 Ser Gln Asp Gly Ala Leu Pro Leu Asn Lys Ile Glu Ala Glu Asn Pro 32 Lys Arg Val Leu Ile Leu Met Ser Asp Thr Gly Gly Gly His Arg Ala 48 Ser Ala Glu Ala Ile Lys Ala Ala Phe Asn Glu Glu Phe Gly Asn Asn 64 Tyr Gln Val Phe Ile Thr Asp Leu Trp Thr Asp His Thr Pro Trp Pro 80 Phe Asn Gln Leu Pro Arg Ser Tyr Asn Phe Leu Val Lys His Gly Thr 96 Leu Trp Lys Met Thr Tyr Tyr Val Thr Ala Pro Lys Val Ile His Gln 112 Ser Asn Phe Ala Ala Thr Ser Thr Phe Ile Ala Arg Glu Val Ala Lys 128 Gly Leu Met Lys Tyr Arg Pro Asp Ile Ile Ile Ser Val His Pro Leu 144 Met Gln His Val Pro Ile Arg Ile Leu Arg Ser Lys Gly Leu Leu Asn 160 Lys Ile Val Phe Thr Thr Val Val Thr Asp Leu Ser Thr Cys His Pro 176 Thr Trp Phe His Lys Leu Val Thr Arg Cys Tyr Cys Pro Ser Thr Glu 192 Val Ala Lys Arg Ala Leu Lys Ala Gly Leu Gln Pro Ser Lys Leu Lys 208 Val Phe Gly Leu Pro Val Arg Pro Ser Phe Val Lys Pro Ile Arg Pro 224 Lys Ile Glu Leu Arg Lys Glu Leu Gly Met Asp Glu Asn Leu Pro Ala 240 Val Leu Leu Met Gly Gly Gly Glu Gly Met Gly Pro Ile Glu Ala Thr 256 Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ala Leu Tyr Asp Glu Asn His Gly Glu Pro 272 Ile Gly Gln Val Leu Val Ile Cys Gly His Asn Lys Lys Leu Ala Gly 288 Arg Leu Arg Ser Ile Asp Trp Lys Val Pro Val Gln Val Lys Gly Phe 304 Val Thr Lys Met Glu Glu Cys Met Gly Ala Cys Asp Cys Ile Ile Thr 320 Lys Ala Gly Pro Gly Thr Ile Ala Glu Ala Met Ile Arg Gly Leu Pro 336 Ile Ile Leu Asn Asp Tyr Ile Ala Gly Gln Glu Ala Gly Asn Val Pro 352 Tyr Val Val Glu Asn Gly Cys Gly Lys Phe Ser Lys Ser Pro Lys Glu 368 Ile Ala Asn Ile Val Ala Lys Trp Phe Gly Pro Lys Ala Asp Glu Leu 384 Leu Ile Met Ser Gln Asn Ala Leu Arg Leu Ala Arg Pro Asp Ala Val 400 Phe Lys Ile Val His Asp Leu His Glu Leu Val Lys Gln Arg Ser Phe 416 Val Pro Gln Tyr Ser Gly 422

【００４３】配列番号４： 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GGGGATCCCTGGTGTTTCAGATGAAACCAATG

【００４４】配列番号５： 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCGAATTCCCGCCGGAATATTGTGGTACAAAAC

【図面の簡単な説明】

【図１】キュウリのＭＧＤＧ合成酵素遺伝子の塩基配列
及びそれに対応するアミノ酸配列を示す（図２に続
く）。

【図２】キュウリのＭＧＤＧ合成酵素遺伝子の塩基配列
及びそれに対応するアミノ酸配列を示す（図３に続
く）。

【図３】キュウリのＭＧＤＧ合成酵素遺伝子の塩基配列
及びそれに対応するアミノ酸配列を示す。

【図４】ＭＧＤＧ合成酵素遺伝子を大腸菌で発現させる
プラスミドの作成の仕方を示す概略図である。

【図５】ＭＧＤＧ合成酵素を発現している大腸菌抽出物
での脂質合成産物のクロマトグラムを示す写真である。

【図６】ＭＧＤＧ合成酵素と枯草菌、大腸菌のＭｕｒＧ
遺伝子とのアミノ酸配列の相同性を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年７月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高宮 建一郎 神奈川県横浜市緑区長津田4259 東京工業 大学 生命理工学部内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３で表されるアミノ酸配列、又
   は配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
   アミノ酸配列を有するモノガラクトシルジアシルグリセ
   ロール合成酵素。
2. 【請求項２】 請求項１記載のモノガラクトシルジアシ
   ルグリセロール合成酵素と別のタンパク質とからなる融
   合タンパク質。
3. 【請求項３】 配列番号３で表されるアミノ酸配列、又
   は配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
   アミノ酸配列をコードするモノガラクトシルジアシルグ
   リセロール合成酵素遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３記載のモノガラクトシルジアシ
   ルグリセロール合成酵素遺伝子を含む組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項３記載のモノガラクトシルジアシ
   ルグリセロール合成酵素遺伝子が導入された細胞。