JPH1014581A - ウサギ型マクロファージ・コロニー刺激因子及びこれをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、遺伝子工学の手法を用いてウサギ
型Ｍ−ＣＳＦを生産するためのＤＮＡ断片及びそのＤＮ
Ａ断片により生産されるウサギ型Ｍ−ＣＳＦを提供す
る。 【解決手段】 配列番号２に記載したアミノ酸配列を含
むウサギ由来のウサギ型マクロファージ・コロニー刺激
因子、及び配列番号１に記載した塩基配列を含むウサギ
由来のウサギ型マクロファージ・コロニー刺激因子をコ
ードするＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なウサギ型マ
クロファージ・コロニー刺激因子及びこれをコードする
ＤＮＡ断片に関する。ウサギ型マクロファージ・コロニ
ー刺激因子は、ウサギの病気の予防、治療、医薬品開発
等に応用することができる。

【０００２】

【従来の技術】ヒト・マクロファージ・コロニー刺激因
子（以下、マクロファージ・コロニー刺激因子を「Ｍ−
ＣＳＦ」と記載することがある）は、単球、マクロファ
ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を有するタン
パク質であり、単球、マクロファージの増殖及び活性化
を介した免疫賦活効果を有することが知られている。ヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦは、既にアミノ酸配列が決定され［サイ
エンス(Science)、第２３５巻、第４７９５号、第１５
０４〜１５０８ページ、１９８７年］、ヒト尿から精製
されたヒト型Ｍ−ＣＳＦは、白血球増殖を目的とする医
薬品として平成３年から市販されており、その他の多様
な薬理効果、特に前述したように単球、マクロファージ
を介した免疫賦活活性を有することが解明されつつあ
る。

【０００３】リコンビナント・ヒト型Ｍ−ＣＳＦは、大
腸菌、動物細胞等で生産されて研究用に使用され、その
立体構造も解明されつつある［ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biolog
ical Chemistry) 、第２６９巻、第４９号、第３１１７
１〜３１１７７ページ、１９９４年］。

【０００４】また、マウスのＭ−ＣＳＦも、既にアミノ
酸配列が決定され［ヌクレイック・アシッド・リサーチ
(Nucleic Acid Research) 、第１５巻、第５号、第２３
８９〜２３９０ページ、１９８７年］、この組換えマウ
ス型Ｍ−ＣＳＦが、組換えヒト型Ｍ−ＣＳＦと共に試薬
として販売されている（フナコシ株式会社、総合カタロ
グ１９９５−１９９６、第１０〜１４ページ）。

【０００５】ラット型Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列も、既
に決定されている［ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・
アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 、第１１７４
巻、第１４３〜１５２ページ、１９９３年）］が、その
配列は、マウスと全く同一とされている。ウサギ型Ｍ−
ＣＳＦはその存在は推定されているが、適当な細胞株等
を用いて大量に調製された実績はなく、従来そのアミノ
酸配列は、解明されていなかった。

【０００６】一方、ウサギは、毛皮、肉等を採取するた
めの家畜として、また、重要な実験動物として特に抗体
の調製に多用され、更にペットとしても広く飼育されて
いるが、高温多湿の我が国では、梅雨時、春秋の長雨時
等に体調不良となり、生後数日にして死亡することが多
く、飼育しやすい丈夫な品種が求められていると共に、
幼時、多湿の時期に免疫能を高め、病気に罹患し難くす
るための、薬剤及び技術が求められていた。

【０００７】例えば、実験動物として飼育されているウ
サギは、我が国では１９８６年度で１７万羽（正田陽一
編、「ものをつくる動物たち」、第１１５ページ、東京
書籍、昭和６３年）、米国では５０万羽が飼育されてい
る（John E. Harkness and Joseph E. Wagner 著、今道
友則監訳、「ウサギとげっ歯類の生物学と臨床医学」、
第１２ページ、養賢堂、１９８５年）。ウサギは多産で
あり、１羽の雌が１年に約８０羽の仔ウサギを産出する
が、仔ウサギは消化器疾患等の感染症のためにその内約
３０〜５０羽が成育するに過ぎず、ウサギの疾病予防
は、実験動物、ペット用仔ウサギの供給上大きな課題で
あり、適当な予防、治療薬が待望されている（Lieve Ok
erman 著、斎藤久美子訳、「うさぎの臨床」、６ペー
ジ、インターズー社、１９９４年）。

【０００８】実験動物としてのウサギは、前臨床試験、
特に奇形学的実験、組織培養、毒性試験、眼科学実験、
抗体の産生等で重要であり、病弱になりがちな純系ウサ
ギを経済的に確保するために、特に幼時において生存率
の向上できる薬剤が待望されてきた。また、家庭、動物
公園等でもペットとして広く飼育されているイエウサギ
及びパンダウサギ（白黒まだらのウサギ）は比較的病弱
で、梅雨時の高温多湿、晩秋の冷雨の季節に感染症、消
化不良等により死亡することが多く、適当な免疫増強
剤、特に副作用の少ない天然物由来の薬剤が待望されて
いた。

【０００９】このような状況において、ヒトに対するヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦの臨床的使用経験における有用性から、
ウサギの場合にも感染症予防及び治療に効果が期待でき
るウサギ型Ｍ−ＣＳＦの実用化が望まれていた。

【００１０】しかしながら、ウサギではＭ−ＣＳＦを産
生している細胞株が、従来特定されておらず、従ってウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦの解明、利用も不可能であった。その
理由は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの生体成分からの精製は、
ヒト型Ｍ−ＣＳＦが精製された材料である人尿のような
適当な材料が採取困難であることによるものであった。
例えば、ウサギの尿は、不純物を大量に含有し、タンパ
ク質の精製が困難であり、更に、ウサギの細胞株のうち
Ｍ−ＣＳＦを発現している細胞株は、従来明らかにされ
ておらず、組換えＤＮＡ技術により生産するために必要
なｃＤＮＡ配列は、解明されていなかった。

【００１１】このように、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの取得が
容易でないので、ウサギの病気の治療又は予防の目的
で、例えばヒト型Ｍ−ＣＳＦをウサギに投与しても、種
の相違から有効性が低く、その効果は期待できない。ま
た、長期又は反復投与により生じるヒト型Ｍ−ＣＳＦに
対する抗体に由来する副作用が不可避であった。

【００１２】また、医薬品開発の重要な１段階である薬
理試験において、ヒト型Ｍ−ＣＳＦの用途拡大の目的で
ヒト型Ｍ−ＣＳＦをウサギに投与し、このモデル実験系
で種々の解明を実施した場合、種の相違により抗体を生
じ、その効果の解明が困難であるのみならず、ウサギの
ショック死等も惹起することから、適切な薬理試験を行
うことが不可能であった（造血因子、第５巻、第１号、
第１９ページ、１９９４年）。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、上述したように、その存在は推定されているが実用
的な量として調製された実績はない。本発明は、ウサギ
型Ｍ−ＣＳＦ及びこれをコードするＤＮＡ断片を提供す
ることを課題とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを取得すること
を企図し、その生産手段として、天然物からの精製は可
能性が低いことから、組換えＤＮＡ技術による生産につ
いて鋭意研究を行った。組換えＤＮＡ技術によるタンパ
ク質の生産においては、そのタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの取得が必須となるが、従来、このｃＤＮＡの取
得に適した細胞材料が知られていなかったので、本発明
者らは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（以下ＡＴＣＣと記載する）保存細胞株、理化学研究
所保存細胞株等について鋭意探索し、ウサギ型Ｍ−ＣＳ
ＦのｃＤＮＡ断片を取得するための材料として、ウサギ
細胞株約５０種の培養液をマウス骨髄細胞を用いたコロ
ニー形成アッセイ法によりＣＳＦ活性を指標にスクリー
ニングした結果、高いＭ−ＣＳＦ活性を有するタンパク
質を産生するウサギ株化細胞株のうち、特に角膜細胞株
ＳＩＲＣ（大日本製薬社製）が、比活性が高く、増殖特
性も良好であり、材料として望ましいことを見い出し
た。

【００１５】更に、本発明者らは、この細胞株からＭ−
ＣＳＦをコードするｃＤＮＡ断片を単離することに成功
し、その塩基配列を決定し、これを用いて細菌及び細胞
株での生産系を構築し、このタンパク質を大量生産する
ことに成功し、本発明を完成した。

【００１６】すなわち、本願の第一の発明は、配列番号
２においてアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸
配列を含み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分
化を促進する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸
残基の置換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよいウ
サギ型マクロファージ・コロニー刺激因子である。

【００１７】また、本願の第二の発明は、配列番号２に
おいてアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸配列
を含み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分化を
促進する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸残基
の置換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよいウサギ
型マクロファージ・コロニー刺激因子をコードするＤＮ
Ａ断片である。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明について詳述する
が、説明を容易にするために、先ず本願の第二の発明か
ら詳述する。

【００１９】本発明のＤＮＡ断片は、後述するように、
Ｍ−ＣＳＦを産生するウサギ株化細胞株から調製したｃ
ＤＮＡから、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）により増幅することによって得られる。ま
た、本発明により、Ｍ−ＣＳＦのｃＤＮＡの塩基配列が
明らかになったので、化学合成することによっても本発
明のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ウサギ染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、Ｍ−ＣＳＦ
をコードする染色体遺伝子が得られる。染色体由来のＭ
−ＣＳＦ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むこと
が予想されるが、そのようなイントロンで分断されてい
るＤＮＡ断片であっても、Ｍ−ＣＳＦをコードする限
り、本発明のＤＮＡ断片に含まれる。

【００２０】ヒト型Ｍ−ＣＳＦの遺伝子を公知の方法
（特開平７−１４７９８９号公報）によりクローニング
した場合、約４ｋｂｐ以上の大きさのＤＮＡ断片が得ら
れる。生物活性を有する天然に存在する成熟型のヒト型
Ｍ−ＣＳＦは、２２３個のアミノ酸残基からなり、これ
をコードするＤＮＡの大きさは約７００ｂｐに相当す
る。

【００２１】Ｍ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを取得す
るための材料としては、Ｍ−ＣＳＦを産生するウサギ由
来の臓器、又は株化した細胞であればすべて利用できる
が、その中でも特に角膜細胞が望ましい。角膜細胞から
常法［J. Sambrookら著、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor LaboratoryPress) 、１９８９年］によりメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製し、このｍＲＮ
Ａを鋳型として逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調
製する。

【００２２】Ｍ−ＣＳＦの５´側プライマーと３´側プ
ライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成し
て、これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガ
ロースゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を
調製する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定
することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとして
は、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。

【００２３】また、この断片を適当な市販のプラスミド
ベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、又はｐ
ＣＲII（インビトロゲン社製）に挿入し、大腸菌、例え
ばＨＢ１０１（宝酒造社製）、ＩＮＶＦ´α（インビト
ロゲン社製）を形質転換し、プラスミドを精製し、のち
塩基配列を決定することもできる。

【００２４】本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を、常法に
より決定した結果を、配列番号１に示し、これがコード
しているアミノ酸配列を配列番号２に示した。本発明の
ＤＮＡ断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断片である。配
列番号２において、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦのアミノ
酸配列は、アミノ酸番号１〜２２１で表され、シグナル
配列を含むウサギ型Ｍ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列
は、アミノ酸番号−３２〜２２１で表される。成熟型ウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦは、上記アミノ酸配列のＮ末端にメチ
オニン残基が付加されていてもよい。また、本発明にお
いて、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、Ｍ−ＣＳＦとしての活
性、すなわち単球、マクロファージの生存、増殖及び分
化を促進する機能を実質的に損なわない限り、１又は２
以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を含ん
でいてもよい。これらのいずれのＭ−ＣＳＦをコードす
るＤＮＡ断片も本発明に含まれる。このようなＤＮＡ断
片として具体的には、配列番号１において塩基番号１０
１〜７６３で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片、及び
配列番号１において塩基番号５〜７６３で表される塩基
配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸
に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明
に含まれる。

【００２５】次に、本願の第一の発明について詳述す
る。本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、配列番号２におい
てアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸配列を含
み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分化を促進
する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸残基の置
換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよい。

【００２６】活性型Ｍ−ＣＳＦはホモ２量体からなる
が、単量体の成熟タンパク質を大腸菌で発現させた場
合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）で分子量約２５，０００を示し、これを２量体化し
たものは分子量約５０，０００を示す。また、本願の第
二の発明のＤＮＡ断片を細胞株で発現させた場合には、
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは糖タンパク質として産生し、細胞
株としてＣＨＯ細胞由来のＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を用い
た場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約９０，０００
の糖蛋白質として産生される。このような糖鎖を有する
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦも本発明に含まれる。

【００２７】ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、例えば、本願の第
二の発明であるウサギ型Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡ断片の全
部、又は一部を通常の方法により、プロモーター配列、
マーカー遺伝子、複製起点等を有する適当な発現ベクタ
ーに挿入して、微生物、培養細胞及び動植物に導入して
発現させることにより、大量に調製することが可能であ
る。例えば、Ｔ７ファージプロモーター、アンピシリン
耐性遺伝子、及び複製起点を有するプラスミドｐＥＴの
キット（宝酒造社製）を用い、このベクターのＴ７プロ
モーターの下流にあるクローニングサイトに本発明のウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断片を挿入し、キ
ットに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する
大腸菌を形質転換し、宿主大腸菌により産生されるＴ７
ＲＮＡポリメラーゼによりウサギ型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子が
転写され、ｍＲＮＡが産生され、大腸菌によりウサギ型
Ｍ−ＣＳＦが発現される。成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを
発現させる場合には、配列番号２においてアミノ酸番号
１〜２２１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に
終始コドンを、これらの外側に制限酵素認識配列を付加
したものを用いればよい。これらのコドン及び制限酵素
認識配列を本発明のＤＮＡ断片に付加するには、このＤ
ＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する際に用いるオリゴヌ
クレオチドプライマーに上記コドン及び制限酵素認識配
列を含ませればよい。発現されたウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、顆粒体として菌体内に蓄積されているので、これを
８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸溶液等で可溶化し、
カラムクロマトグラフィーにより精製し、リフォールデ
ィングして天然と同一又は近似の構造を有するウサギ型
Ｍ−ＣＳＦを製造することができる。

【００２８】また、例えば、アデノウイルスプロモータ
ー、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４
０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、本願
の第一の発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ
断片を結合して挿入し、これをリン酸カルシウム法等に
よりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細胞（チャイニーズ
・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入し、ＭＴＸ（メト
トレキセート）培地中で細胞培養することにより、糖鎖
を有するウサギ型Ｍ−ＣＳＦが発現される［メソッズ・
イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、第
１８５巻、第５３７ページ、アカデミック・プレス社、
１９９０年］。その際、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを直
接発現させてもよいが、シグナル配列を有するウサギ型
Ｍ−ＣＳＦ前駆体をコードするＤＮＡ断片を細胞に導入
し、前駆体タンパク質を発現させてもよい。発現された
タンパク質は、細胞培養液中に可溶性タンパク質として
蓄積しているので、これを常法により限外濾過膜により
濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦを取得することができる。

【００２９】組換えＤＮＡ技術により調製し、カラムク
ロマトグラムグラフィー等により精製したウサギ型Ｍ−
ＣＳＦの活性は、後記する試験例３のメトカーフらによ
る方法から、骨髄細胞の増殖試験により測定することが
可能であり、ヒト型Ｍ−ＣＳＦのコロニー形成のタンパ
ク質重量当たりの比活性が、ヒト骨髄細胞を用いたアッ
セイで約１０⁸ Ｕ（単位）／ｍｇであり、本発明のウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦのコロニー形成のタンパク質重量当たり
の比活性が、ウサギ骨髄細胞を用いたアッセイで約１０
⁸ Ｕ（単位）／ｍｇ以上であることから、本願の第一の
発明で得られる物質は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦであること
が明らかである。

【００３０】以上のとおり、本発明のＤＮＡ断片は、ウ
サギ由来のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードしており、配列
番号１に示したＤＮＡ配列は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ前駆
体をコードするＤＮＡ配列であると同定され、この前駆
体は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードすることが
確認された。

【００３１】上記の方法により製造したウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦは、そのまま、又は適当な賦型剤とともに混合し、
安定な薬剤としてウサギの治療等に用いることができ
る。例えば、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム、グリシン、ショ糖及びポリソルベー
トと混合して溶解し、そのまま、又はこれを凍結乾燥
し、注射用蒸留水により生理食塩濃度に近い浸透圧に調
整して注射剤となし、１日１乃至数回、数日間から数か
月間随時皮下、静脈、筋肉等に注射することができる。

【００３２】投与量は、体重１ｋｇ１日あたり０．１乃
至１００μｇが適当であるが、本発明のウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦは、ウサギに対して用いるウサギ由来のタンパク質
であり、抗原性が弱いので投与量はこの範囲に限定され
るものではない。状況によっては、ブドウ糖溶液等の栄
養剤と混合して用いることもできる。また安定剤として
添加する薬剤は、前記のものに限定されるものではな
く、アルブミン（望ましくは、ウサギアルブミン）等の
タンパク質、マンニトール、リン酸塩等通常の注射薬に
用いられる安定剤を用いることができる。

【００３３】次に試験例を示して本発明を詳述する。

【００３４】＜試験例１＞この試験は、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦの感染予防効果を調べるために行った。 １）試料の調製 後述の実施例５と同一の方法によりウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
を調製した。 ２）試験方法 生後１か月、平均体重１５０ｇの仔パンダウサギ（日本
医科学動物研究所から入手）４５羽を、無作為に５羽ず
つ９群に分け、１〜３群の各５羽には３日に１回ずつ４
２日間ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ５μｇ（１群）、１０μｇ
（２群）及び２０μｇ（３群）を含む生理食塩水０．２
ｍｌを背中の皮下に投与した。４〜６群の各５羽には３
日に１回ずつ４２日間にわたりヒト型Ｍ−ＣＳＦ（フナ
コシ社製）５μｇ（４群）、１０μｇ（５群）及び２０
μｇ（６群）を含む生理食塩水０．２ｍｌを背中の皮下
に投与した。更に７〜９群の各５羽には対照としてウサ
ギ血清アルブミン・フラクションＶ（シグマ社製）５μ
ｇ（７群）、１０μｇ（８群）及び２０μｇ（９群）を
含む生理食塩水０．２ｍｌを同様に４２日間にわたり背
中に皮下投与した。

【００３５】各群の仔ウサギを屋外飼育舎で４か月間飼
育し、１か月毎に生存数を調査して試験した。 ３）試験結果 ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを投与した第１群〜第３群では４か
月間の死亡数が、それぞれ１、０及び０羽、これら３群
の合計が１羽であった。ヒト型Ｍ−ＣＳＦを投与した第
４群〜第６群では４か月間の死亡数が、それぞれ２、２
及び２羽、これら３群の合計が６羽であり、第６群（２
０μｇ投与）の死亡１羽は、注射後短時間の死亡であ
り、抗体生成によるショック死の疑いがあった。第７群
〜第９群では４か月間の死亡数が、それぞれ２、２及び
３羽、これら３群の合計が７羽であり、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦ投与により生存率の向上効果が得られることが認め
られた。尚、実施例７と同一の方法により調製したウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦを使用して試験したが、ほぼ同様の結果
が得られた。

【００３６】＜試験例２＞この試験は、高脂血症モデル
ウサギに対するウサギ型Ｍ−ＣＳＦの効果を調べるため
に行った。 １）試料の調製及び試験動物 注射用蒸留水（大塚製薬社製）２ｍｌ当たり実施例７と
同一の方法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦ０．２７
ｍｇ、塩化ナトリウム（和光純薬社製）１．８５ｍｇ、
クエン酸ナトリウム（和光純薬社製）４．５ｍｇ、グリ
シン（和光純薬社製）８３ｍｇ、ショ糖（和光純薬社
製）２２ｍｇ及びポリソルベート（シグマ社製）０．１
１ｍｇの割合で溶解し、試料を調製した。また、ウサギ
血清アルブミン・フラクションＶ（シグマ社製）及びヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦ（フナコシ社販売）を使用したことを除
き、前記試料と同一の組成の注射液を調製し、対照試料
１及び対照試料２とした。

【００３７】高脂血症モデルウサギとして動物実験に多
用されているＷＨＨＬウサギ［アテロスクレロージス
（Atheroscrerosis)、第３６巻、第２６１〜２６８ペー
ジ、１９８０年。日本医科学動物研究所から入手］を使
用した。 ２）試験方法 ＷＨＨＬウサギは、ＬＤＬレセプター異常に起因するヒ
トの家族性高コレステロール血症のモデル動物として使
用され、２．５月齢から動脈硬化症が発症し、１２月齢
までに動脈硬化巣形成がほぼ完成することが知られてい
る。２．５月齢のＷＨＨＬウサギ２羽に、前記試料をウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦとして５０μｇ／ｋｇの割合で毎日１
回（１週間では５回）１１月齢まで静脈注射し、対照群
の２羽には対照試料１をウサギ血清アルブミン・フラク
ションとして５０μｇ／ｋｇの割合で同様に投与した。
更に他の２羽には対照試料２をヒト型Ｍ−ＣＳＦとして
し５０μｇ／ｋｇの割合で同様に投与した。各群のウサ
ギを１２月齢まで飼育し、飼育期間終了後、各個体を解
剖し、頸動脈の動脈硬化病巣を検討した。 ３）試験結果 試料（ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを含む）投与群の病巣面積
は、対照試料１投与群のそれの５０％、対照試料２投与
群では対照試料１投与群の７０％であったが、対照試料
２投与群では血中の抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を生じている
ことが、免疫沈降法により確認された。以上の結果から
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦにはＷＨＨＬウサギの動脈硬化阻止
効果があり、抗体を生じないため、ヒト型Ｍ−ＣＳＦよ
りもさらに有効であることが判明した。尚、実施例５と
同一の方法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦを使用し
て試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００３８】＜試験例３＞この試験は、ヒト型、マウス
型及びウサギ型Ｍ−ＣＳＦのインビトロ（in vitro）に
おける活性を比較するために行った。 １）試料の調製等 実施例５（試料１）又は実施例７（試料２）と同一の方
法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦ、ヒト型Ｍ−ＣＳ
Ｆ（フナコシ社製。試料３）及びマウス型Ｍ−ＣＳＦ
（フナコシ社製。試料４）の４試料を使用した。 ２）試験方法 メトカーフらの方法［エクスペリメンタル・ヘマトロジ
ー(Experimental Hematology) 、第１巻、第１８５〜２
０１ページ、１９７３年］により、各試料についてマウ
ス及びウサギの骨髄細胞に対するインビトロでのコロニ
ー形成活性を測定した。

【００３９】骨髄細胞は、以下のようにして調製した。
７週齢Ｃ５７ＢＬマウス（日本チャールスリバーから入
手）及び８か月齢ニュージーランドホワイトウサギ（日
本医科学動物研究所から入手）からそれぞれ大腿骨を取
り、５ｍｌシリンジにマッコイ５Ａ培地（フロー社製）
を満たし、この培地により骨髄細胞を押出し、次にピペ
ッティングにより骨髄細胞をマッコイ５Ａ培地に１０ｍ
ｌスピッツ中で分散した。スピッツを低速遠心機（日立
製作所製。ＣＲ５Ｂ型）により１０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、この沈殿物を再度同培地に分散し、３０秒
間粗大物を沈降させた上清を骨髄細胞として使用した。

【００４０】この細胞１０⁵ 個を１ｍｌの０．３％寒天
（ディフコ社製）、２０％牛胎児血清（フロー社製）を
含むマッコイ５Ａ培地に懸濁し、この懸濁液に０．１ｍ
ｌの各試料を混合し、３５ｍｍのディッシュに採取し
た。寒天が固化した後、３７℃、５％二酸化炭素ガスの
細胞培養装置（サンヨー社製）に入れ、７日間培養す
る。次にこのディッシュを倒立顕微鏡（オリンパス社
製。ＣＫ−１）により検鏡し、５０個以上の細胞からな
るコロニー数を測定し、サンプル１ｍｌ当たりに換算
し、コロニー形成単位（Ｕ）とし、この値にサンプルの
希釈倍率を乗じ、タンパク質１ｍｇ当たりのコロニー形
成単位を算出した。 ３）試験結果 マウスの骨髄を用いた試料１、試料２、試料３及び試料
４のコロニー形成単位数は、それぞれ０．５×１０⁸、
０．６×１０⁸、１．８×１０⁸及び２．０×１０⁸ Ｕ／
ｍｇであり、本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦでは低値であ
った。一方、ウサギ骨髄を用いた試料１、試料２、試料
３及び試料４のコロニー形成単位数は、それぞれ２．０
×１０⁸、２．０×１０⁸、１．０×１０⁸及び１．０×
１０⁸ Ｕ／ｍｇであり、本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦの
活性はヒト及びマウスのＭ−ＣＳＦのそれを上回った。

【００４１】以上のように、ウサギ由来のＭ−ＣＳＦ
は、マウス骨髄細胞に対するよりもウサギ骨髄細胞に対
して高い活性を示すことが明らかであり、Ｍ−ＣＳＦの
種特異性が確認され、ウサギの治療に用いる場合ウサギ
型Ｍ−ＣＳＦが有効であることが判明した。

【００４２】

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるも
のではない。

【００４３】実施例１（メッセンジャーＲＮＡ及び一本
鎖ｃＤＮＡの調製） 株化したウサギ角膜細胞ＳＩＲＣ（大日本製薬社製）を
１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地（大日本製薬社製）で培
養した。回収した細胞をフェノール及びクロロホルムに
より抽出してタンパク質等を除去し、イソプロパノール
を添加して全ＲＮＡを沈殿させて回収し、オリゴｄＴセ
ルロースカラム（クローンテック社製）に通してポリＡ
−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。この操作により約１
０⁷細胞から約５μｇのｍＲＮＡが得られた。

【００４４】次に、このｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵
素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。この操作は、ｃ
ＤＮＡ合成キット（First strand cDNA Synthesis Ki
t：宝酒造社製）を使用して添付のプロトコールに従っ
て実施した。操作手順は、マイクロ遠心管内で鋳型ｍＲ
ＮＡ５μｇ、ｄＮＴＰ混合物（最終濃度各２ｍＭ）、オ
リゴ（ｄＴ）₁₈プライマー（最終濃度０．１μｇ／μ
ｌ）、逆転写酵素ＲＡＶ−２（最終濃度２μｇ／μ
ｌ）、ＲＮａｓｅインヒビター（最終濃度２μｇ／μ
ｌ）、及び定容量の１／５容量の緩衝液（５倍first st
rand synthesis buffer）を添加し、ＤＥＰＣ（ジエチ
ルピロカーボネイト）処理水で５０μｌの定容量とする
（以上の試薬は、いずれも前記キットに含まれてい
る）。この液を撹拌装置（サイエンンテフィック・イン
ターナショナル社製）により混合し、室温で１０分間放
置し、のち４２℃の恒温槽で１時間保温し、一本鎖ｃＤ
ＮＡ溶液を得た。

【００４５】実施例２（Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡ断片の調製
及びこれを用いた形質転換大腸菌株の調製） ＰＣＲ法に用いる５´側プライマーとして配列番号３に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＲＮＦ、及び
３´側プライマーとして配列番号４に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドＲＮＲを、３９４型ＤＮＡシン
セサイザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て合成した。実施例１で調製した一本鎖ｃＤＮＡとプラ
イマーＲＮＦ及びＲＮＲを用いて、ＰＣＲ反応装置（DN
A Thermal Cycler：パーキン・エルマー社製）及びＤＮ
Ａポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq：宝酒造社製）により
ＰＣＲ増幅を行った。増幅産物を１％アガロースゲル電
気泳動により分離し、目的とする約７００ｂｐのＤＮＡ
断片を切り出し、ＤＮＡ抽出キット（ファルマシア社
製）によりＤＮＡ断片を精製した。

【００４６】精製したＤＮＡ断片をクローニングベクタ
ーｐＣＲII（アンピシリン耐性マーカーを有する）に挿
入し、得られた組換えベクターで大腸菌ＩＮＶＦ´αを
形質転換した。この操作は、ＤＮＡクローニング用キッ
ト（Original TA Cloning Kit：インビトロゲン社製）
を使用し、添付のプロトコールに従って実施した。操作
手順は、マイクロチューブ内に精製したＤＮＡ断片、ク
ローニングベクターｐＣＲII、Ｔ４ＤＮＡライゲース及
び１０倍濃度のライゲーション・バッファーを添加し、
滅菌水で１０μｌの定容量とし、１２℃の恒温槽で終夜
反応させた。

【００４７】ライゲーション反応物とキット中の大腸菌
ＩＮＶＦ´αのコンピテントセルをマイクロチューブ中
で混和し、氷上で３０分間放置し、これを４２℃の恒温
槽で３０秒間加温し、のち速やかに氷中に移して２分間
放置した。これに４５０μｌのＳＯＣ培地［組成は、２
％バクトトリプトン（ディフコ社製）、０．５％バクト
イーストエクストラクト（ディフコ社製）、１０ｍＭ塩
化ナトリウム（和光純薬社製）、２．５ｍＭ塩化カリウ
ム（和光純薬社製）、１０ｍＭ硫酸マグネシウム（和光
純薬社製）、１０ｍＭ塩化マグネシウム（和光純薬社
製）及び２０ｍＭグルコース（和光純薬社製）］を添加
し、ロータリーシェーカー（ハイテック社製、ダブルシ
ェーカーＮＲ３００）で３７℃で１時間培養し、選択薬
剤であるアンピシリン（シグマ社製）１００μｇ／ｍｌ
を含む選択培地プレートにまき、目的のＭ−ＣＳＦ遺伝
子を保持した形質転換大腸菌株を選択し、保存した。

【００４８】実施例３（Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡの塩基配列
決定） 実施例２により得られた形質転換大腸菌株を５ｍｌの２
×ＹＴ培地（１．６％バクトトリプトン、１．０％酵母
エキス及び０．５％塩化ナトリウムを含む）で振とう培
養機（タイヨー化学社製。恒温培養機）により終夜振と
う培養し、遠心分離して菌体を回収した。この菌体をＲ
Ｎａｓｅを含む懸濁用バッファー（ＲＮａｓｅ １００
μｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸及び１０ｍＭＥＤＴ
Ａを含み、ｐＨ８．０）０．３ｍｌに懸濁し、０．３ｍ
ｌのアルカリ処理バッファー（２００ｍＭ水酸化ナトリ
ウム及び１％ＳＤＳを含む）を添加し、室温で５分放置
し、のち中和用バッファー（２．５５Ｍ 酢酸カリウ
ム、ｐＨ４．８）０．３ｍｌを添加して氷上で１０分保
持し、微量高速遠心機により１０，０００ｒｐｍで１５
分間遠心し、遠心上清をＤＮＡ精製用カラム（ＱＩＡＧ
ＥＮカラム：フナコシ社製）に通してプラスミドを精製
し、得られたプラスミドＤＮＡを塩基配列の決定に使用
した。

【００４９】このプラスミドＤＮＡに挿入されているＤ
ＮＡ断片の塩基配列を３７３Ａ型ＤＮＡシーケンサー及
びシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ
社製）により分析した結果、配列番号１に示した塩基配
列を有することが確認された。

【００５０】実施例４（形質転換大腸菌株によるウサギ
型Ｍ−ＣＳＦの調製） 配列番号１に示した塩基配列のコード領域のうち、最初
のメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）から９６個の
塩基配列は、３２個のアミノ酸をコードするが、ヒト型
Ｍ−ＣＳＦとのホモロジー（宝酒造社製ＤＮＡデータベ
ースであるＤＮＡＳＩＳによる）からこの３２個のアミ
ノ酸よりなるペプチドは、シグナル配列として成熟タン
パク質からは除去されると考えられるのでこの部分を除
去し、大腸菌によるＭ−ＣＳＦ成熟タンパク質の直接発
現に使用した。

【００５１】実施例３より得られるプラスミドＤＮＡを
鋳型とし、５´側と３´側のプライマーにそれぞれ配列
番号５及び配列番号６に示す塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応（１サイクル９４℃
で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で６０秒を３０サ
イクル）を行い、得られるＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製。以下制限酵素は全て
同じメーカーのものである）で切断し、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦをコードするＤＮＡ断片（約６８０ｂｐ）を得た。

【００５２】尚、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド
は、ＮｃｏＩ認識配列（塩基番号３〜８）を有し、塩基
番号５〜７は開始コドン（ＡＴＧ）であり、塩基番号８
〜１６は、配列番号１における塩基番号１０１〜１０９
と同一のアミノ酸配列をコードし、塩基番号１７〜３２
の配列は、配列番号１における塩基番号１１０〜１２５
と同一の塩基配列を有する。また、配列番号６に示すオ
リゴヌクレオチドは、ＨｉｎｄIII認識配列（塩基番号
３〜８）を有し、塩基番号１０〜３４は、配列番号１に
おける塩基番号７３９〜７６３に相補性を有し、塩基番
号７〜９は終始コドン（ＴＡＡ）に相補性を有する。

【００５３】したがって、上記のプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行なうと、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦのアミ
ノ酸配列（配列番号２において塩基番号１〜２２１。但
し、Ｎ−末端にメチオニン残基が付加される）をコード
し、５’末端にＮｃｏＩ認識配列を、３’末端にＨｉｎ
ｄIII認識配列を有するＤＮＡ断片が増幅される。

【００５４】一方、市販のプラスミドから、プロモータ
ーとＳＤ配列を含むＤＮＡ断片、ターミネーターを含む
ＤＮＡ断片、及び複製起点を含むＤＮＡ断片を調製し
た。市販のプラスミドｐＥＴ−３ａ（ノバゲン社製）を
ＢｇｌII及びＮｃｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動で断片を分離し、Ｔ７プロモーターとＳＤ配列を含む
９８ｂｐの断片をゲルから抽出した。市販のプラスミド
ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社製）をＨｉｎｄIII
及びＳｃａＩで切断し、前記と同様にターミネーター配
列を含む８２７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐ
ＧＥＭＥＸ−２（プロメガ社製）をＳｃａＩ及びＢｇｌ
IIで切断し、前記と同様に複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒ
ｉ）及びアンピシリン耐性マーカーを含む１５５６ｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。

【００５５】得られた４つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ースで連結し、得られたＤＮＡで大腸菌ＮＭ５２２（ノ
バゲン社製）を形質転換してアンピシリン耐性株を選択
し、目的のプラスミドｐＵＳＡ４８（３１５０ｂｐ）を
保持する大腸菌株を得た。このプラスミドは、Ｔ７プロ
モーターの制御下で、配列番号２においてアミノ酸番号
１〜２２１で表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端にメ
チオニン残基が付加される）をコードするタンパク質を
発現する。この大腸菌株を培養し、菌体からプラスミド
を抽出し、得られたプラスミドでタンパク質生産用大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバゲン社製）を形質転換
し、アンピシリン耐性株を選択し、プラスミドｐＵＳＡ
４８を保有するウサギ型Ｍ−ＣＳＦ生産菌株を得た。
尚、ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ｌａｃプロモーター制御下
でＴ７ポリメラーゼを産生する。

【００５６】この大腸菌株を３Ｌジャーファーメンター
により３８．５℃で約１乃至２時間通気培養し、菌体濃
度がＯＤ６００ｎｍにより０．５〜１．０となった時点
で、０．４ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、３８．５℃
で更に４〜６時間培養し、次に、培養混合液を取り出
し、高速遠心機（日立製作所製。ＳＣＲ２０Ｂ）により
６０００ｒｐｍで１０分間室温で遠心し、湿重量約１０
ｇの菌体を得た。

【００５７】得られた菌体を菌体容量の６〜１０倍の１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷冷
し、卓上型超高圧細胞破砕装置（ミニラボ：レイニー社
製）により８×１０⁷Ｐａの圧力で破砕し、前記と同一
の遠心機により８０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心
し、沈殿物（顆粒体）を収集し、前記と同一の緩衝液に
懸濁し、粗ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを得た。

【００５８】実施例５（タンパク質のリフォールディン
グ及び精製） 実施例４で得た顆粒体湿重量１ｇに、尿素、ＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）及びＤＴＴ（ジ
チオスレイトール）をそれぞれ８Ｍ、１ｍＭ及び１０ｍ
Ｍの最終濃度で添加し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）を添加して容量を１０ｍｌに調整し、こ
の懸濁液を４℃で一夜振とうして顆粒体を可溶化し、得
られたタンパク質溶液を超遠心機（ベックマン社製。Ｔ
Ｌ１００）により５０，０００ｒｐｍで３０分超遠心し
て上清を採取した。

【００５９】得られた上清３ｍｌをゲルろ過カラム（ト
ーソー社製。Ｇ３０００ＳＷ、２１．５ｍｍ×６００ｍ
ｍ）にかけ、２８０ｎｍのＵＶ吸収によりモニターし、
８Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭＤＴＴを含む還元
変性条件下でゲル濾過ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分を
チェックし、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦに相当する画分（２５
ｋＤａ近辺）を回収し、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの単量体を
得た。

【００６０】回収した溶液５０ｍｌを限外濾過装置（ア
ミコン社製。セントリプレップ１０、分画分子量１０，
０００）を用いて１０ｍｌに遠心濃縮し、これを４℃に
冷却した緩衝液（２ｍＭＧＳＨ、１ｍＭＧＳＳＧ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ及び０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液。ｐＨ８．５）２００ｍｌに徐
々に滴下し、そのまま４℃で７２時間連続撹拌し、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦのリフォールディング及び２量体化を行
った。リフォールディング及び２量体化終了後の溶液２
１０ｍｌを透析チューブ（三光純薬社製）に入れ、外液
を交換しながら５Ｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に対して１夜透析し、のちチューブ内の液を取り出
し、硫酸アンモニウム粉末を１．５Ｍの最終濃度で添加
して沈殿させ、前記と同一の遠心機で１２，０００ｒｐ
ｍで３０分遠心して沈殿を回収した。

【００６１】沈殿を少量の水に溶解し、硫酸アンモニウ
ム粉末を１．２Ｍの最終濃度で添加し、同様に遠心分離
し、１．２Ｍ硫酸アンモニウム濃度に可溶な上清を得
た。この上清４ｍｌ（タンパク質として１８ｍｇ相当）
を疎水相互作用クロマトカラムＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ
（トーソー社製。２１．５ｍｍ×１５０ｍｍ）にかけ、
１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）と０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
との直線濃度勾配により、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを溶出し
て分離した。

【００６２】得られた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分子量を測定し、分子量５０，０００のＭ−ＣＳＦのバ
ンドを主とする画分２５ｍｌを集め、限外濾過装置（ア
ミコン社製。８０５０型）により濃縮し、緩衝液を交換
して０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を溶媒とする溶液として全量を１．
８ｍｌに濃縮し、精製した組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦを
得た。

【００６３】得られたウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、純度が９５％以上であり、その溶液は
パイロジェントテスト・キット（第一製薬社製）を用い
たエンドトキシン・テストにより、タンパク質１ｍｇ当
たり０．０１エンドトキシン・ユニット以下であり、細
菌による汚染がなく、注射用に用い得る良好なタンパク
質であることを確認した。

【００６４】尚、得られた精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳ
Ｆ １２μｇを用い、Ｎ端アミノ酸配列をペプチドシー
ケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）により分
析した結果、Ｎ端から１８個まで、配列番号２において
アミノ酸番号１〜１７と一致した（Ｎ末端はメチオニン
残基であった）。また、この精製組換えウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦをトリプシン処理し、ペプチドフラグメントを逆相
ＨＰＬＣにより分離精製し、そのペプチド配列をペプチ
ドシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より分析した結果、Ｎ末端のメチオニン残基以外は、配
列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２１と一致した。

【００６５】実施例６（形質転換細胞株によるウサギ型
Ｍ−ＣＳＦの調製） 実施例３と同一の方法により得られたプラスミドＤＮＡ
を鋳型とし、５´側と３´側のプライマーにそれぞれ配
列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応（１サイクル９４
℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で６０秒を３０
サイクル）を行い、得られるＤＮＡ断片を制限酵素Ｘｈ
ｏＩ及びＥｃｏＲＩ（いずれも宝酒造社製）で切断し、
シグナルペプチドを含むウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードす
るＤＮＡ断片（約７７０ｂｐ）を調製した。

【００６６】尚、配列番号７に示すオリゴヌクレオチド
は、ＸｈｏＩ認識配列（塩基番号３〜８）を有し、塩基
番号９〜３７は、配列番号１における塩基番号５〜３３
と同一の塩基配列を有する。また、配列番号８に示すオ
リゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ認識配列（塩基番号３
〜８）を有し、塩基番号１２〜３５は、配列番号１にお
いて塩基番号７４０〜７６３に相補性を有し、塩基番号
９〜１１は、終始コドン（ＡＴＧ）に相補性を有する。

【００６７】したがって、上記のプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行なうと、シグナルペプチドを含むウサギ型
Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号２において塩基番
号１〜２２１）をコードし、５’末端にＸｈｏＩ認識配
列を、３’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を有するＤＮＡ断
片が増幅される。

【００６８】市販のプラスミドｐ３ＡＣＳＦ６９（ＡＴ
ＣＣから入手）を同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動で断片を分離し、
５．１ｋｂｐ断片をゲルから抽出して精製した。

【００６９】得られた２つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ースで連結し、大腸菌ＮＭ５２２（宝酒造社製）を形質
転換してアンピシリン耐性株を選択し、目的プラスミド
ｐＵＳＡ６８（７０００ｂｐ）を保持する大腸菌株を得
た。この大腸菌株を培養し、プラスミドを抽出して、Ｄ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株であるＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞
（ＡＴＣＣから入手）を形質転換し、メトトレキセート
耐性株を選択し、プラスミドｐＵＳＡ４８を保持する細
胞株をウサギ型Ｍ−ＣＳＦ生産細胞株を得た。

【００７０】この細胞株を２０Ｌの細胞培養装置（ケマ
ップ社製。ラボラトリー・パイロット・ファーメンター
ＣＦ３０００）によりメチオニンを除いたＤＭＥ培地と
Ｆ１０培地を１：１に含む培地（いずれも日水製薬社
製）計１５Ｌを用い、メトトレキセート（シグマ社製）
０．２ｍｇ／ｌを添加し、３７℃で空気及び二酸化炭素
ガスを通気しながら培養し、ｐＨ７．０〜７．５に調整
しながら細胞濃度を２×１０⁵〜１０⁶個／ｍｌに保持す
るために細胞培養液を１０Ｌずつ３〜４日に１回ハーベ
ストし、同量の新鮮培地を補って２０日間バッチリフィ
ード式による培養を継続した。

【００７１】凍結保存した培養混合液計６０Ｌを取り出
し、融解して高速遠心機（日立製作所製。ＳＣＲ２０
Ｂ）により３０００ｒｐｍで２０分間、５℃で遠心し、
上清液を限外濾過装置（旭化成製、ＡＩＬ1010、分画分
子量10000 ）により濃縮し、脱イオン水を添加して再度
濃縮し、高速遠心機（日立製作所製。ＳＣ２０Ｂ）によ
り５℃で１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を
得た。

【００７２】実施例７（細胞由来組換えウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦの精製） 実施例６で得た上清３ｍｌをゲルろ過ＨＰＬＣカラム
（トーソー社製。Ｇ３０００ＳＷ、２１．５ｍｍ×６０
０ｍｍ）にかけ、２８０ｎｍのＵＶ吸収によりモニター
し、１５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分をチェックし、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦに相当する画分（９０ｋＤａ近辺）を回
収した。

【００７３】回収した溶液５０ｍｌを限外濾過装置（ア
ミコン社製。セントリプレップ１０、分画分子量１０，
０００）を用いて５ｍｌに濃縮し、この濃縮上清５ｍｌ
（タンパク質として５０ｍｇ相当）に１．２Ｍの濃度で
硫酸アンモニウム粉末を添加し、疎水相互作用クロマト
カラムＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（トーソー社製。２１．５
ｍｍ×１５０ｍｍ）にかけ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）との直線濃度勾配によ
り、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを溶出分離した。

【００７４】得られた分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、
９０ｋＤａのウサギ型Ｍ−ＣＳＦのバンドを主とする画
分２５ｍｌを集め、限外濾過装置（アミコン社製。８０
５０型）により、濃縮をすると共に緩衝液の交換をし、
０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を溶媒とする溶液として１．８ｍｌに濃
縮し、精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦを得た。

【００７５】得られた精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるチェックにより純度が９５
％以上であり、この溶液はパイロジェントテストキット
（第一製薬社製）によるエンドトキシン・テストの結
果、１ｍｇタンパク質当たり０．０１エンドトキシン・
ユニット以下であり、細菌による汚染がなく、注射用に
用い得る良好な製品であることを確認した。

【００７６】尚、精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦ１０μ
ｇを用い、Ｎ端アミノ酸配列をペプチドシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社製）により分析した結
果、Ｎ端から１４個まで、配列番号２においてアミノ酸
番号１〜１４と一致していた。また、精製組換えウサギ
型Ｍ−ＣＳＦをトリプシン処理し、ペプチドフラグメン
トを逆相ＨＰＬＣにより分離精製し、そのペプチド配列
をペプチドシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社製）により分析した結果、配列番号２に記載のアミノ
酸配列（アミノ酸番号１〜２２１）と一致した。

【００７７】

【発明の効果】本発明により、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ、及
びこれをコードするＤＮＡ断片が提供される。本発明に
より奏せられる効果は、次のとおりである。 １）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦを幼弱なウサギ、飼育
に適さない環境下で飼育されるウサギに投与することに
より、ウサギの免疫能が賦活され、飼育効率、特に幼弱
ウサギの生存率の向上、病気の予防及び治療効果が得ら
れる。 ２）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、ウサギを用いたＭ
−ＣＳＦモデル動物実験の材料として最適であり、デー
タ検討の障害となる抗体を生じ難いので、高度な医薬品
開発に応用可能である。 ３）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断
片を、Ｍ−ＣＳＦの欠落又は欠損のあるウサギに遺伝子
導入し、遺伝子治療に用いることも可能である。 ４）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断
片は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの大量生産に使用できる。

【００７８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：776 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ウサギ 株名：ＳＩＲＣ 組織の種類：角膜細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：5..763 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig_peptide 存在位置：5..100 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：101..763 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CCGT ATG ACC GCG CGG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG 49 Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp -32 -30 -25 -20 CTG GGC CCC TGG ATG CTG CTG GCC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT GTC 97 Leu Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val -15 -10 -5 GCC GAG GTG GTG TCT GAG CAC TGC AGC CAC ATC ATC GGG AAC GGG CAC 145 Ala Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His 1 5 10 15 CTG CAG TCC CTA CAG CAG CTG ATT GAC AGT CAA ATG GAG ACC TCA TGC 193 Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys 20 25 30 CAC ATT GCC TTT GAG TTT GTG GAC CAG GAG CAG TTG AAG GAT CCC GTG 241 His Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val 35 40 45 TGC TAC TTG AAG AAG GGC TTC TTC CTG GTG GAA GAC ATC ATG GAG GAC 289 Cys Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp 50 55 60 ACC CTG CGC TTC AAG CAC AGC ACG CCC AAC GCC AAG GCC ATC CTG CAG 337 Thr Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln 65 70 75 CTC CAG GAA CTC TCG CTC AGG CTC AGG GCC TGC TTC ACC AAG GAT CAT 385 Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His 80 85 90 95 GAA GAG GAC AAC AAG ACC TGT GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACT CCA CTC 433 Glu Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu 100 105 110 CAG TTG CTG GAG AAG ATC AAG AAT GTC TTT AAC GAA ACA AAG AAT CTC 481 Gln Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu 115 120 125 CTT AAA GAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC AAC AGC TTT 529 Leu Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe 130 135 140 GTT AAA TGC TCC AGC CAA GAT GTG GTG ACC AAG CCT GAT TGC AAC TGT 577 Val Lys Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys 145 150 155 CTG TAC CCC AAA GCC ACC CCT AAC AGT GAC CTG GCC TCC CCT CGC CAG 625 Leu Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln 160 165 170 175 CCC CTT GAC CCC TCT ACA GCC CCC ATG GCT GGC TTG GCC TGG GCC GAC 673 Pro Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp 180 185 190 GCT GAG GGG ACA CAG GGC AAC CCC CTC TTG CCC AGT GAG CAG GCC CCT 721 Ala Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro 195 200 205 GGC ACA GTG GAC CCA GGC AGC GCC AAG CAG CGA CCA CCC AGG 763 Gly Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220 ACCTGCCAGA GCT 776

【００７９】配列番号：２ 配列の長さ：221 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu -32 -30 -25 -20 Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val Ala -15 -10 -5 Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys His 20 25 30 Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His Glu 85 90 95 Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Val 130 135 140 Lys Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln Pro 165 170 175 Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro Gly 195 200 205 Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220

【００８０】配列番号：３ 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CCCGTATGAC CGC 13

【００８１】配列番号：４ 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ AGCTCTGGCA GGT 13

【００８２】配列番号：５ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：5..32 特徴を決定した方法： GGCC ATG GAA GTA GTA TCT GAG CAC TGC AGC C 32 Met Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser 1 5

【００８３】配列番号：６ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ GGAAGCTTAC CTGGGTGGTC GCTGCTTGGC GCTG 34

【００８４】配列番号：７ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CCCTCGAGAT GACCGCGCGG GGCGCCGCCG GGCGCTG 37

【００８５】配列番号：８ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CGGAATTCCT ACCTGGGTGG TCGCTGCTTG GCGCT 35

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 島村 誠一 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜２
   ２１で表されるアミノ酸配列を含み、単球、マクロファ
   ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を損なわない
   １又は２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は転
   位を含んでいてもよいウサギ型マクロファージ・コロニ
   ー刺激因子。
2. 【請求項２】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜２
   ２１で表されるアミノ酸配列を含み、単球、マクロファ
   ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を損なわない
   １又は２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は転
   位を含んでいてもよいウサギ型マクロファージ・コロニ
   ー刺激因子をコードするＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号１において塩基番号１０１〜７
   ６３で表される塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ断
   片。
4. 【請求項４】 配列番号２においてアミノ酸番号−３２
   〜２２１で表されるアミノ酸配列を有するウサギ型マク
   ロファージ・コロニー刺激因子前駆体をコードするＤＮ
   Ａ断片。
5. 【請求項５】 配列番号１において塩基番号５〜７６３
   で表される塩基配列を含む請求項４記載のＤＮＡ断片。