JPH1014582A - リボヌクレオチドリダクターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換え型リボヌクレオチドリダクターゼ及び
リボヌクレオチドリダクターゼをコードする遺伝子の提
供。 【解決手段】 配列番号１及び／又は２で表されるアミ
ノ酸配列を実質的に含み、リボヌクレオチドリダクター
ゼ酵素活性を有するポリペプチド、該アミノ酸配列を実
質的にコードするＤＮＡを含むリボヌクレオチドリダク
ターゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体並びにリ
ボヌクレオチドリダクターゼの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リボヌクレオチド
リダクターゼ及びその製造方法、リボヌクレオチドリダ
クターゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ並びに
該ＤＮＡを含む形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】リボヌクレオチドリダクターゼはＭ１及
びＭ２の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーの
酵素で、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチド
に還元的に転換するものである。この酵素は、細胞増殖
に必須であるＤＮＡの生合成にとって律速酵素である。
この酵素活性は細胞の増殖に密接に関係し、特に腫瘍細
胞においては活性が高いことが報告されている（ハワー
ド・エル・エルフォード(Haward L. Elford)等, J.Bio
l.Chem. vol.245, No.20,5228-5233(1970) ）。このこ
とから、リボヌクレオチドリダクターゼ活性の阻害物質
を開発することにより、該阻害物質が抗癌剤、又は細胞
の異常増殖を抑制する薬剤として利用され得るものと考
えられる（特開平2-264796号公報）。しかし、上記阻害
物質を開発するには、大量のリボヌクレオチドリダクタ
ーゼを生産する必要があるが、リボヌクレオチドリダク
ターゼは細胞分裂が行われている細胞にしか多く存在し
ないため、動物細胞から大量に得ることは今まで困難で
あった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、リボヌクレ
オチドリダクターゼ及びその製造方法、リボヌクレオチ
ドリダクターゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
並びに該ＤＮＡを含む形質転換体を提供することを目的
とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、リボヌクレオチドリダ
クターゼを大腸菌を用いて大量に発現できることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
配列番号１及び／又は２で表されるアミノ酸配列を実質
的に含み、リボヌクレオチドリダクターゼ酵素活性を有
するポリペプチドである。

【０００５】さらに、本発明は、配列番号１及び／又は
２で表されるアミノ酸配列を実質的にコードするＤＮＡ
を含むリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子である。該
遺伝子としては、例えば配列番号３及び又は４で表され
る塩基配列を実質的に含むものが挙げられる。ここで、
「実質的に」とは、本発明のポリペプチドがリボヌクレ
オチドリダクターゼ活性を有する限り、また、本発明の
リボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子がリボヌクレオチ
ドリダクターゼを発現させる機能を有する限り、当該ポ
リペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は当該遺伝子の
塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいこ
とを意味する。

【０００６】従って、例えば本発明のポリペプチドに含
まれる第１番目のメチオニン（Met)が欠失しているもの
なども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含
まれる。また、本発明のポリペプチドに含まれるアミノ
酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいての
み異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も
本発明の遺伝子に含まれる。

【０００７】さらに、本発明は、前記リボヌクレオチド
リダクターゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡである。さら
に、本発明は、前記組換え体ＤＮＡによって形質転換さ
れた形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転
換体を培地に培養し、得られる培養物からリボヌクレオ
チドリダクターゼを採取することを特徴とするリボヌク
レオチドリダクターゼの製造方法である。以下、本発明
を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】

(1) リボヌクレオチドリダクターゼｃＤＮＡの調製 リボヌクレオチドリダクターゼ（以下「ＲＮＲ」とい
う）遺伝子をクローニングするには、公知のいずれの方
法をも使用することができる。本発明では、種々の癌細
胞を原料とする。例えば、ハイドロキシウレア耐性ヒト
白血病細胞（K562/HU)、ヒト子宮癌（HeLa）等が挙げら
れる。上記細胞を通常の培養培地（RPMI-1640、DMEM
等）中で培養し、対数増殖期の細胞を遠心分離により回
収する。

【０００９】回収された細胞をホモジナイザーにより破
壊した後クロロフォルムを添加して遠心し、上清液を回
収する。次にイソプロパノールを添加した後、遠心によ
り沈殿物を得、ＴＥバッファー（10mM Tris-HCl-1mM ED
TA(pH8.5) ）に溶解することによりＲＮＡ溶液を調製す
る。このＲＮＡ溶液にはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が混在す
るため、「Oligotex-dT30 」（宝酒造製）などを用いる
ことによりｍＲＮＡを選別する。次に、市販のｃＤＮＡ
合成キット（ファルマシア社製）を用い、マニュアルに
従ってｃＤＮＡを調製する。

【００１０】(2) ＲＮＲ遺伝子のクローニング (1) で得たｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Polymerase C
hain Reaction)を行う。ｃＤＮＡ中には、ＲＮＲ遺伝子
のうちサブユニットＭ１をコードする領域及びＭ２をコ
ードする領域が含まれている。そこで、Ｍ１用のプライ
マー（例えば配列番号５及び６）及びＭ２用のプライマ
ー（例えば配列番号７及び８）を調製し、所定の条件下
で反応を行う。ＰＣＲ反応は、例えば宝酒造製のLA-PCR
Kitを用いて行うことができる。

【００１１】ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってア
ガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を
切り出した後、Bio-Rad 社製の「Prep-A-Gene 」を用い
てＤＮＡの回収を行い、Ｍ１又はＭ２をコードするＤＮ
Ａ断片を得る。次に、回収したＤＮＡ断片の制限酵素処
理を行う。例えば、Ｍ１をコードするＤＮＡ（以下「Ｍ
１ＤＮＡ」という）については制限酵素XhoI及びPstIを
用いることができ、Ｍ２をコードするＤＮＡ（以下「Ｍ
２ＤＮＡ」という）については制限酵素BamHI及びHind
IIIを用いることができる。

【００１２】一方、上記ＤＮＡ断片を保持するためのプ
ラスミドＤＮＡには公知のプラスミドベクター（例えば
インビトロジェン社製のpTrcHis 等) を用いることがで
きる。プラスミドＤＮＡは、Ｍ１ＤＮＡ又はＭ２ＤＮＡ
を消化した制限酵素と同一の制限酵素で消化しておく。

【００１３】上記Ｍ１ＤＮＡ又はＭ２ＤＮＡと、上記プ
ラスミドＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝
酒造製）を用いて連結させ、組換え体ＤＮＡを得る。次
に、得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌JM109 等に導入し
た後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基
づいてプラスミドＤＮＡを調製する（J.Sambrook, eta
l.,“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Labor
atory Press, 1989)。目的とするＤＮＡの塩基配列は、
上記プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方
法（例えばジデオキシ法）により決定する（J.Sambroo
k, et al.,“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1989) 。

【００１４】このようにして決定されるＲＮＲをコード
するＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３又は４
で表される塩基配列が挙げられる。これらの塩基配列が
一旦確定されると、その後は、化学合成、ＰＣＲ又は該
塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることが
できる。

【００１５】(3) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組み換え体ＤＮＡを、
該組み換え体ＤＮＡを作製する際に用いた発現ベクター
に適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主
としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば
特に限定されず、例えば、大腸菌（Escherichia coli)
、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 、等の
細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cer
evisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe)等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の
動物細胞などが挙げられる。

【００１６】大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合
は、本発明の組換え体ＤＮＡが該宿主中で自立複製可能
であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクタ
ーとしては、例えばpBTrp2、pBtac1（ベーリンガー社）
等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿
主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
例えば、trp プロモーター、lac プロモーター、Ｐ_L プ
ロモーター、Ｐ_R プロモーターなどの大腸菌やファージ
等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み
換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイ
オンを用いる方法等が挙げられる。

【００１７】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えばYEp13 、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮ
Ａの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法（Methods. Enzymol.,194,182-187(1990))、スフェロ
プラスト法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1929-1933(19
78))、酢酸リチウム法（J.Bacteriol.,153,163-168(198
3)) 等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合
は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（イ
ンヒトロジェン社) 等が用いられる。動物細胞への組換
え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポ
レーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。

【００１８】(4) ＲＮＲの精製 本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培地で
培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積さ
せ、該培養物から該ポリペプチドを採取することにより
製造することができる。本発明の形質転換体を培地で培
養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従
って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として
得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質
転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【００１９】炭素源としては、例えばグルコース、フラ
クトース、スクロース等の炭水化物、酢酸等の有機酸、
エタノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源とし
ては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の
他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン
酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられ
る。

【００２０】培養は、通常振盪培養などの好気的条件
下、25〜37℃で発現誘導後６時間以上行う。培養中は、
アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に
添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベ
クターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデ
ューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG) 、
インドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することが
できる。

【００２１】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、例えばRPMI-1640 、DMEM培地
又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用い
られる。培養は、通常５％ＣＯ₂存在下、35〜37℃で１
〜４日行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。本発明において、ＲＮ
Ｒの精製は例えば以下のように行うことができる。

【００２２】本発明の遺伝子を保有する大腸菌等のクロ
ーンを、アンピシリンを含む２ｘＴＹ培地で振盪培養を
行う。波長600nmの吸光度が1.0に達したときにIPTGを0.
1mMとなるように培地に添加し、更に20時間培養する。
ＲＮＲの精製は、得られる培養物を遠心して細胞を回収
し、ソニケーターにて細胞を破砕した後、NTA-アガロー
ス（キアゲン製）等のアフィニティークロマトグラフィ
ー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単
独で又は適宜組み合わせることによって行うことができ
る。

【００２３】得られた精製物質が目的のＲＮＲであるこ
との確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により
行う。上記手法により目的とするＲＮＲを大量に得るこ
とができるため、これを用いて抗体の作製やＲＮＲ阻害
剤評価の材料として利用することができる。

【００２４】また、本発明の遺伝子をＲＮＲの検出用試
薬として用いることができる。例えば、癌細胞ではＲＮ
Ｒの発現が多いことから、本発明の遺伝子を癌の診断薬
として利用することができる。また、体細胞の崩壊（例
えば心筋梗塞や脳梗塞のような血管梗塞における組織の
壊死）によりＲＮＲが血中に放出されることから、ＲＮ
Ｒの検出を指標として細胞の崩壊を検出することができ
る。さらに、体内で活発に細胞分裂が行われている骨髄
細胞などに障害が生じた場合にも検出が可能である。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕ＲＮＲのクローニング (1) ハイドロキシウレア耐性ヒト白血病細胞（K562/HU)
ｃＤＮＡの調製 ヒト白血病細胞（K562；ATCC CCL243 ) のハイドロキシ
ウレア耐性株を10％牛胎児血清を含むRPMI培地（日水製
薬（株））50ml中で培養し、対数増殖期に3,500 rpm で
10分間遠心することにより細胞を集めた（３×10
⁷個）。これにISOGEN（和光純薬工業製）８mlを加えペ
ッスルで細胞を破壊し、５分放置後１時間氷中に置い
た。この溶液に1.6 mlのクロロフォルムを添加し１分間
振盪し、3,000 rpm で15分遠心し、上清液を回収した。
そこに４mlのイソプロパノールを添加し10分放置後、15
0,000rpmで10分遠心し、沈殿物を75％エタノールで洗浄
し乾燥して50μLのＴＥバッファーに溶解した。その結
果、640μgのＲＮＡが得られた。このうち150μgに10％
ＳＤＳを1.5μL添加し、150μLの「Oligotex-dT30 」
（宝酒造製）を添加し65℃で５分間保温した後、氷中で
急冷した。この溶液に30μLの５M 塩化ナトリウムを混
合し37℃で10分保温した。この懸濁液を15,000rpmで15
分間遠心し、上清を回収してエタノール沈殿を行った。

【００２６】乾燥した沈殿を20μLの加熱滅菌した純水
に溶解し、K562/HU ポリ(A)⁺ ＲＮＡとした。以下、こ
の溶液について、ファルマシアのｃＤＮＡ合成キットを
用いてマニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。その結
果、オリゴdTでプライミングされたK562/HU 二重鎖ｃＤ
ＮＡ溶液20μLを得た。

【００２７】(2) Ｍ１ＤＮＡ及びＭ２ＤＮＡのクローニ
ング (1) で得たK562/HU 由来ｃＤＮＡを鋳型として以下の条
件でＰＣＲを行った。宝酒造製のLA-PCR Kitを用い、Mg
Cl₂ 量を変更した以外はマニュアルに従った。ＰＣＲの
反応液組成及び反応条件をそれぞれ表１、表２に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】

【表２】

【００３０】プライマー配列は以下の通りである。 Ｍ１用のプライマー１：配列番号５ Ｍ１用のプライマー２：配列番号６ Ｍ２用のプライマー１：配列番号７ Ｍ２用のプライマー２：配列番号８

【００３１】反応液200μLを、ミネラルオイルを除くた
めに等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、10
％ＳＤＳを４μL添加し、65℃で５分間保温した。この
溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理した後水層を回
収し、エタノール沈殿しＤＮＡ断片を回収した。乾燥さ
せて得られる沈殿を20μLのＴＥに溶解し、アガロース
ゲル電気泳動にかけた。

【００３２】その結果、Ｍ１ＤＮＡでおよそ2.5kb 、Ｍ
２ＤＮＡで1.2kb のバンドが見られ、各バンドからＤＮ
Ａ断片を切り出し、「Prep-A-Gene 」(Bio-Rad製) を使
用しマニュアルに従いＤＮＡを回収した。回収したＤＮ
Ａ断片を、Ｍ１ＤＮＡについてはXhoI及びPstIで、Ｍ２
ＤＮＡについてはBamHI及びHind IIIでそれぞれ消化
し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し
た。水層から「Prep-A-Gene 」を用いてXhoI及びPstIで
消化したＭ１ＤＮＡ断片、並びにBamHI 及びHind IIIで
消化したＭ２ＤＮＡ断片を回収した。

【００３３】同様にして、プラスミドベクターpTrcHis
(インビトロジェン製) １μgをXhoI及びPstI消化、又は
BamHI及びHind III消化を行い、その反応液を等量のＴ
Ｅ飽和フェノールで処理し、その水層から「Prep-A-Gen
e 」を用いてXhoI及びPstIで消化したpTrcHis ＤＮＡ並
びにBamHI及びHind IIIで消化したpTrcHis ＤＮＡを回
収した。なお、このプラスミドを使用することにより目
的タンパク質はＮ末に６個のヒスチジンが付いた形で得
られる。このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミ
ドＤＮＡとを10：１のモル比で混合し、ライゲーション
（ライゲーションキット、宝酒造製）を行った。このラ
イゲーション溶液を用いて大腸菌JM109 のコンピテント
セル（東洋紡製）を形質転換した。

【００３４】得られる形質転換体を、75μg/mlのアンピ
シリンを含む２ｘＴＹ培地（１L 中16ｇトリプトン、10
ｇ酵母エキス、５ｇ塩化ナトリウム、1.5ｇ寒天) にプ
レーティングし、37℃で一夜培養した。出現するアンピ
シリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、前述のＰＣＲ反応
液から鋳型を除いた溶液15μLに移し、前述と同様にＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲ後アガロース電気泳動し、Ｍ１で
およそ2.5kb 、Ｍ２でおよそ1.2kb のＤＮＡを与えるコ
ロニーから更にシングルコロニーを単離し、少量の培養
液からプラスミドＤＮＡを精製した（「J.Sambrook, et
al.,“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, 1989」の方法に従った。) 。これらの
プラスミドＤＮＡをXhoI及びPstI、又はBamHI及びHind
IIIで消化し、それぞれ2.5kb 、1.2kb のＤＮＡ断片が
生じることを確認した。これらのプラスミドＤＮＡの各
一つをプライマー５（配列番号９）及びプライマー６
（配列番号10）を用いて配列決定を行った（「J.Sambro
ok, et al.,“Molecular Cloning”, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989」の方法に従った。）。

【００３５】その結果、配列番号３（Ｍ１ＤＮＡ）及び
配列番号４（Ｍ２ＤＮＡ）で表される配列が得られた。
また、Ｍ１ＤＮＡは配列番号１で表される792 個のアミ
ノ酸配列、Ｍ２ＤＮＡは配列番号２で表される390 個の
アミノ酸配列をコードしていた。

【００３６】(3) ヒト組換え型ＲＮＲの調製 前記の塩基配列を確認した各プラスミドを保有する大腸
菌クローンを、50μg/mlアンピシリンを含む500mlの２
ｘＴＹ培地で、それぞれ30℃で振盪培養を行った。波長
600nmの吸光度が1.0に達したときにIPTGを0.1mMとなる
ように培地に添加し、更に20時間培養した。得られる培
養物を遠心して細胞を回収し、ソニケーターにて細胞を
破砕した後、ＮＴＡ−アガロース（キアゲン製）を用い
て精製を行った。精製はマニュアルに記載された方法に
従った。その結果、純度80％程度のＭ１、Ｍ２タンパク
質をそれぞれ約７mg調製した。

【００３７】得られたタンパク質について、レムリ法
（レムリ（U.K.Laemmli) Nature 227,680(1970) ）によ
りＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結
果、Ｍ１については分子量90,000程度、Ｍ２については
分子量47,000程度のバンドが認められた（図１）。

【００３８】〔実施例２〕発現産物の解析 (1) Ｍ２の再活性化 ＲＮＲが酵素活性を示すためにはＭ２の分子内にＦｅ³⁺
が配位していること、及び177 番目のアミノ酸であるチ
ロシンのフェニル基上の水酸基がラジカルの状態である
ことが必須である。そこで、公知方法（Graham J. Mann
et al.,Biochemistry,30,pp.1939-1947(1991)）に従っ
てＦｅ³⁺の添加とラジカルの付与を行い、Ｍ２の再活性
化を行った。その結果、Ｍ２は、生体内に存在するＲＮ
Ｒと同じ活性を示した。

【００３９】(2) ＣＤＰ（シチジン5'- 二リン酸）リダ
クターゼ活性 発現産物の酵素活性、すなわちＣＤＰリダクターゼ活性
は、１nmolのＣＤＰを基質として37℃で１時間当たりに
生成させるｄＣＤＰを１unitとして表される。活性の測
定は公知手法により行った（Engstrom et al., EMBO
J.,3,863-867(1984)。

【００４０】すなわち、大腸菌で発現させ精製したＭ
１、Ｍ２各10μgを混合し、100 μLの反応液(100mM HEP
ES(pH7.6), 3mM ATP, 4mM Mg(OAc)₂, 6mM DTT, 50μM [
³H]CDP(0.5 μCi/7.5nmole)) 中で、37℃で30分反応さ
せた。反応後はSnake Venom で処理した後、Borate Col
umn にかけスルー画分を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。その結果、約30unit/mg の活性が認めら
れた。従って、本発明のＲＮＲは癌細胞中で存在するの
と同様の酵素活性を有していた。

【００４１】

【発明の効果】本発明により組換え型ＲＮＲ及びＲＮＲ
をコードする遺伝子が提供される。本発明の組換え型Ｒ
ＮＲは、ＲＮＲ阻害剤（モノクローナル抗体、ポリクロ
ーナル抗体等）の材料として有用であり、本発明の遺伝
子は、ＲＮＲの検出用試薬として有用である。

【００４２】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７９２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met His Val Ile Lys Arg Asp Gly Arg Gln Glu Arg Val Met Phe Asp 1 5 10 15 Lys Ile Thr Ser Arg Ile Gln Lys Leu Cys Tyr Gly Leu Asn Met Asp 20 25 30 Phe Val Asp Pro Ala Gln Ile Thr Met Lys Val Ile Gln Gly Leu Tyr 35 40 45 Ser Gly Val Thr Thr Val Glu Leu Asp Thr Leu Ala Ala Glu Thr Ala 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Thr Lys His Pro Asp Tyr Ala Ile Leu Ala Ala Arg 65 70 75 80 Ile Ala Val Ser Asn Leu His Lys Glu Thr Lys Lys Val Phe Ser Asp 85 90 95 Val Met Glu Asp Leu Tyr Asn Tyr Ile Asn Pro His Asn Gly Arg His 100 105 110 Ser Pro Met Val Ala Ser Ser Thr Leu Asp Ile Val Met Ala Asn Lys 115 120 125 Asp Arg Leu Asn Ser Ala Ile Ile Tyr Asp Arg Asp Phe Ser Tyr Asn 130 135 140 Tyr Phe Gly Phe Lys Thr Leu Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Lys Ile Asn 145 150 155 160 Gly Lys Val Ala Glu Arg Pro Gln His Met Leu Met Arg Val Ser Val 165 170 175 Gly Ile His Lys Glu Asp Ile Asp Ala Ala Ile Glu Thr Tyr Asn Leu 180 185 190 Leu Ser Glu Lys Trp Phe Thr His Ala Ser Pro Thr Leu Phe Asn Ala 195 200 205 Gly Thr Asn Arg Pro Gln Leu Ser Ser Cys Phe Leu Leu Ser Met Lys 210 215 220 Asp Asp Ser Ile Glu Gly Ile Tyr Asp Thr Leu Lys Gln Cys Ala Leu 225 230 235 240 Ile Ser Lys Ser Ala Gly Gly Ile Gly Val Ala Val Ser Cys Ile Arg 245 250 255 Ala Thr Gly Ser Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Gly Asn Ser Asn Gly Leu 260 265 270 Val Pro Met Leu Arg Val Tyr Asn Asn Thr Ala Arg Tyr Val Asp Gln 275 280 285 Gly Gly Asn Lys Arg Pro Gly Ala Phe Ala Ile Tyr Leu Glu Pro Trp 290 295 300 His Leu Asp Ile Phe Glu Phe Leu Asp Leu Lys Lys Asn Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Glu Gln Arg Ala Arg Asp Leu Phe Phe Ala Leu Trp Ile Pro Asp 325 330 335 Leu Phe Met Lys Arg Val Glu Thr Asn Gln Asp Trp Ser Leu Met Cys 340 345 350 Pro Asn Glu Cys Pro Gly Leu Asp Glu Val Trp Gly Glu Glu Phe Glu 355 360 365 Lys Leu Tyr Glu Ser Tyr Glu Lys Gln Gly Arg Val Arg Lys Val Val 370 375 380 Lys Ala Gln Gln Leu Trp Tyr Ala Ile Ile Glu Ser Gln Thr Glu Thr 385 390 395 400 Gly Thr Pro Tyr Met Leu Tyr Lys Asp Ser Cys Asn Arg Lys Ser Asn 405 410 415 Gln Gln Asn Leu Gly Thr Ile Lys Cys Ser Asn Leu Cys Thr Glu Ile 420 425 430 Val Glu Tyr Thr Ser Lys Asp Glu Val Ala Val Cys Asn Leu Ala Ser 435 440 445 Leu Ala Leu Asn Met Tyr Val Thr Pro Glu His Thr Tyr Asp Phe Glu 450 455 460 Lys Leu Ala Glu Val Thr Lys Val Ile Val Arg Asn Leu Asn Lys Ile 465 470 475 480 Ile Asp Ile Asn Tyr Tyr Pro Ile Pro Glu Ala His Leu Ser Asn Lys 485 490 495 Arg His Arg Pro Ile Gly Ile Gly Val Gln Gly Leu Glu Asp Ala Phe 500 505 510 Ile Leu Met Arg Tyr Pro Phe Glu Ser Pro Glu Ala Gln Leu Leu Asn 515 520 525 Lys Gln Ile Phe Glu Thr Ile Tyr Tyr Gly Ala Leu Glu Ala Ser Cys 530 535 540 Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Gly Pro Tyr Glu Thr Tyr Glu Gly Ser Pro 545 550 555 560 Val Ser Lys Gly Ile Leu Gln Tyr Asp Met Trp Asn Val Ala Pro Thr 565 570 575 Asp Leu Trp Asp Trp Lys Pro Leu Lys Glu Lys Ile Ala Lys Tyr Gly 580 585 590 Ile Arg Asn Ser Leu Leu Ile Ala Pro Met Pro Thr Ala Ser Thr Ala 595 600 605 Gln Ile Leu Gly Asn Asn Glu Ser Ile Glu Pro Tyr Thr Ser Asn Ile 610 615 620 Tyr Thr Arg Arg Val Leu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Val Asn Pro His 625 630 635 640 Leu Leu Lys Asp Leu Thr Glu Arg Gly Leu Trp Asn Glu Glu Met Lys 645 650 655 Asn Gln Ile Ile Ala Cys Asn Gly Ser Ile Gln Ser Ile Pro Glu Ile 660 665 670 Pro Asp Asp Leu Lys Gln Leu Tyr Lys Thr Val Trp Glu Ile Ser Gln 675 680 685 Lys Thr Val Leu Lys Met Ala Ala Glu Arg Gly Ala Phe Ile Asp Gln 690 695 700 Ser Gln Ser Leu Asn Ile His Ile Ala Glu Pro Asn Tyr Gly Lys Leu 705 710 715 720 Thr Ser Met His Phe Tyr Gly Trp Lys Gln Gly Leu Lys Thr Gly Met 725 730 735 Tyr Tyr Leu Arg Thr Arg Pro Ala Ala Asn Pro Ile Gln Phe Thr Leu 740 745 750 Asn Lys Glu Lys Leu Lys Asp Lys Glu Lys Ala Leu Lys Glu Glu Glu 755 760 765 Glu Lys Glu Arg Asn Thr Ala Ala Met Val Cys Ser Leu Glu Asn Arg 770 775 780 Glu Glu Cys Leu Met Cys Gly Ser *** 785 790

【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：３９０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Leu Ser Leu Arg Val Pro Leu Ala Thr Ile Ala Asp Gln Gln Gln 1 5 10 15 Leu Gln Leu Ser Pro Leu Lys Arg Leu Thr Leu Ala Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ser Thr Arg Val Leu Ala Ser Lys Ala Ala 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Gln Asp Ser Ala Glu Leu Glu Ser Lys Ala Pro Thr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Glu Asp Glu Pro Leu Leu Arg Glu Asn Pro Arg Arg 65 70 75 80 Phe Val Val Phe Pro Ile Glu Tyr His Asp Ile Trp Gln Met Tyr Lys 85 90 95 Lys Ala Glu Ala Ser Phe Trp Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Ser Lys 100 105 110 Asp Ile Gln His Trp Glu Ala Leu Lys Pro Asp Glu Arg His Phe Ile 115 120 125 Ser His Val Leu Ala Phe Phe Ala Ala Ser Asp Gly Ile Val Asn Glu 130 135 140 Asn Leu Val Glu Arg Phe Ser Gln Glu Val Gln Val Thr Glu Ala Arg 145 150 155 160 Cys Phe Tyr Gly Phe Gln Ile Ala Met Glu Asn Ile His Ser Glu Met 165 170 175 Tyr Ser Leu Leu Ile Asp Thr Tyr Ile Lys Asp Pro Lys Glu Arg Glu 180 185 190 Tyr Leu Phe Asn Ala Ile Glu Thr Met Pro Cys Val Lys Lys Lys Ala 195 200 205 Asp Trp Ala Leu Arg Trp Ile Gly Asp Lys Glu Ala Thr Tyr Gly Glu 210 215 220 Arg Val Val Ala Phe Ala Ala Val Glu Gly Ile Phe Phe Ser Gly Ser 225 230 235 240 Phe Ala Ser Ile Phe Arg Leu Lys Lys Arg Gly Leu Met Pro Gly Leu 245 250 255 Thr Phe Ser Asn Glu Leu Ile Ser Arg Asp Glu Gly Leu His Cys Asp 260 265 270 Phe Ala Cys Leu Met Phe Lys His Leu Val His Lys Pro Ala Glu Gln 275 280 285 Arg Val Arg Glu Ile Ile Thr Asn Ala Val Arg Ile Glu Gln Glu Phe 290 295 300 Leu Thr Glu Ala Leu Pro Val Lys Leu Ile Gly Met Asn Cys Thr Leu 305 310 315 320 Met Lys Gln Tyr Ile Glu Phe Val Ala Asp Arg Leu Met Leu Glu Leu 325 330 335 Gly Phe Asn Lys Ile Phe Arg Val Glu Asn Pro Phe Asp Phe Met Glu 340 345 350 Asn Ile Ser Leu Glu Gly Lys Thr Asn Phe Phe Glu Lys Arg Val Gly 355 360 365 Glu Tyr Gln Arg Met Gly Val Met Ser Asn Ser Thr Glu Asn Ser Phe 370 375 380 Thr Leu Asp Ala Asp Phe 385 390

【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：２３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATGCATGTGA TCAAGCGAGA TGGCCGCCAA GAGCGAGTTA TGTTTGACAA AATTACATCA 60 CGAATCCAGA AACTCTGTTA TGGACTCAAC ATGGACTTTG TTGATCCTGC TCAGATCACC 120 ATGAAAGTAA TCCAAGGCCT ATATAGTGGG GTCACCACAG TGGAACTGGA CACCCTGGCT 180 GCTGAGACAG CCGCGACCTT GACCACGAAG CACCCTGACT ATGCCATCCT GGCAGCAAGG 240 ATAGCCGTCT CTAACTTGCA CAAAGAAACA AAGAAAGTGT TCAGTGATGT GATGGAGGAT 300 CTCTACAACT ACATAAATCC GCACAACGGC AGACACTCTC CCATGGTGGC CAGCTCAACA 360 CTCGACATTG TTATGGCCAA TAAGGATCGC CTGAATTCTG CCATTATCTA TGACCGAGAT 420 TTCTCTTATA ACTACTTTGG CTTTAAGACA CTGGAACGGT CATATTTGTT GAAGATCAAT 480 GGTAAAGTGG CTGAAAGACC ACAGCATATG TTGATGAGGG TTTCTGTGGG GATTCACAAA 540 GAAGATATTG ATGCTGCAAT TGAAACCTAC AACCTACTTT CTGAGAAGTG GTTCACTCAT 600 GCCTCTCCTA CTCTCTTCAA TGCTGGGACC AACCGCCCAC AGCTGTCTAG CTGTTTCCTC 660 TTGAGTATGA AAGATGACAG CATTGAAGGA ATTTATGATA CTCTGAAGCA GTGTGCCTTG 720 ATTTCTAAGT CCGCTGGGGG AATTGGTGTT GCTGTGAGTT GTATTCGGGC CACTGGTAGC 780 TACATCGCTG GGACTAATGG CAATTCTAAT GGCCTTGTGC CAATGCTGAG AGTATATAAC 840 AACACAGCTC GCTATGTGGA TCAAGGTGGA AACAAGCGCC CAGGCGCGTT TGCTATTTAC 900 CTGGAGCCTT GGCACTTAGA CATCTTTGAG TTCCTTGACT TGAAGAAGAA CACAGGCAAG 960 GAAGAACAGC GAGCACGCGA TCTCTTCTTT GCACTTTGGA TCCCAGATCT CTTCATGAAG 1020 CGAGTGGAGA CTAACCAGGA CTGGTCATTG ATGTGTCCCA ATGAGTGTCC TGGTCTGGAC 1080 GAGGTCTGGG GAGAGGAGTT TGAGAAGTTA TATGAAAGTT ACGAGAAGCA GGGTCGTGTC 1140 CGAAAAGTTG TAAAAGCTCA GCAGCTTTGG TATGCCATCA TTGAGTCCCA GACGGAGACC 1200 GGTACCCCAT ACATGCTCTA CAAAGATTCC TGTAACCGGA AGAGCAACCA GCAGAACCTG 1260 GGAACCATCA AATGCAGCAA CCTGTGTACA GAAATAGTAG AGTACACCAG TAAAGATGAG 1320 GTTGCAGTTT GTAACTTGGC TTCTCTGGCT CTGAATATGT ATGTCACACC GGAACATACG 1380 TATGACTTTG AGAAACTGGC AGAAGTCACT AAAGTCATTG TCCGAAATCT GAATAAAATA 1440 ATTGATATAA ACTACTACCC TATTCCAGAG GCACACTTAT CAAATAAACG CCATCGGCCC 1500 ATTGGAATTG GGGTACAAGG TTTAGAAGAT GCTTTCATCC TGATGAGATA CCCCTTTGAG 1560 AGCCCAGAAG CCCAGTTATT AAATAAGCAG ATCTTTGAAA CCATTTACTA TGGAGCCCTG 1620 GAAGCCAGCT GTGAACTAGC CAAGGAGTAT GGCCCCTATG AAACGTATGA GGGATCTCCA 1680 GTCAGCAAGG GTATTCTTCA GTATGACATG TGGAATGTTG CTCCTACAGA CCTGTGGGAC 1740 TGGAAGCCTC TCAAGGAGAA GATTGCAAAG TATGGTATAA GGAACAGTTT ACTTATTGCC 1800 CCAATGCCTA CTGCTTCAAC TGCCCAGATT CTGGGGAATA ATGAGTCCAT TGAGCCTTAT 1860 ACCAGTAACA TCTACACTCG AAGAGTCTTG TCAGGGGAAT TTCAGATTGT GAATCCTCAC 1920 TTACTGAAAG ATCTTACTGA GCGGGGCTTG TGGAATGAAG AGATGAAAAA TCAGATTATT 1980 GCATGCAATG GCTCCATTCA GAGCATACCA GAAATTCCTG ATGACCTGAA GCAACTCTAT 2040 AAGACCGTGT GGGAAATCTC TCAGAAGACT GTTCTCAAGA TGGCAGCCGA GAGAGGTGCT 2100 TTCATCGATC AGAGCCAGTC TTTAAACATC CATATTGCTG AGCCCAACTA TGGCAAACTC 2160 ACTAGTATGC ACTTCTACGG TTGGAAGCAG GGTTTAAAGA CTGGAATGTA TTACTTAAGG 2220 ACGAGGCCTG CCGCTAATCC AATCCAGTTC ACTCTGAACA AGGAAAAACT GAAAGATAAG 2280 GAAAAGGCAC TGAAGGAGGA GGAGGAGAAG GAGAGGAACA CAGCAGCCAT GGTGTGCTCT 2340 TTGGAGAACA GAGAGGAGTG TCTGATGTGT GGATCCTGA 2379

【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：１１７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATGCTCTCCC TCCGTGTCCC GCTCGCCACC ATCGCTGACC AGCAGCAGCT GCAGTTGTCG 60 CCGCTGAAGC GACTCACCCT GGCTGACAAG GAGAACACGC CCCCGACTCT CAGCAGCACC 120 CGCGTCCTGG CCAGCAAAGC TGCGAGGAGA ATCTTCCAGG ACTCCGCCGA GCTGGAAAGT 180 AAAGCGCCTA CTAACCCCAG CGTTGAGGAT GAGCCGTTGC TGAGAGAAAA CCCCCGCCGC 240 TTCGTTGTCT TTCCCATCGA GTACCATGAT ATCTGGCAGA TGTACAAGAA AGCCGAGGCC 300 TCCTTTTGGA CTGCCGAGGA GGTGGACCTT TCCAAGGATA TTCAGCACTG GGAAGCTCTG 360 AAACCCGATG AGAGACATTT TATATCTCAC GTTCTGGCTT TCTTTGCAGC GAGTGATGGC 420 ATAGTCAATG AGAACTTGGT GGAGCGATTT AGCCAAGAAG TTCAAGTTAC AGAGGCCCGC 480 TGTTTCTATG GCTTCCAAAT TGCCATGGAA AACATACACT CTGAAATGTA CAGTCTCCTT 540 ATTGACACTT ACATTAAAGA TCCCAAGGAA AGAGAATATC TCTTCAATGC TATTGAAACT 600 ATGCCTTGTG TGAAGAAGAA GGCTGACTGG GCCTTGCGCT GGATTGGGGA CAAAGAGGCT 660 ACGTATGGAG AACGCGTTGT GGCCTTTGCC GCCGTAGAAG GAATCTTCTT TTCCGGTTCT 720 TTTGCATCGA TATTCAGGCT CAAGAAACGG GGGCTGATGC CGGGCCTTAC ATTTTCCAAT 780 GAGCTTATTA GCAGAGACGA GGGTTTACAC TGTGACTTTG CCTGCCTGAT GTTCAAGCAC 840 CTGGTACACA AGCCAGCGGA GCAGAGGGTC CGAGAGATAA TCACCAACGC CGTTAGGATA 900 GAGCAGGAGT TCCTCACGGA GGCCTTGCCC GTGAAGCTCA TCGGGATGAA CTGCACTTTG 960 ATGAAGCAGT ACATTGAGTT TGTGGCCGAC AGGCTTATGC TGGAGCTGGG TTTTAACAAG 1020 ATTTTCAGAG TAGAAAATCC GTTTGACTTC ATGGAAAATA TCTCACTAGA AGGAAAGACA 1080 AACTTCTTTG AGAAGCGAGT AGGCGAGTAT CAGAGGATGG GAGTCATGTC GAATTCGACA 1140 GAGAACTCTT TTACCTTGGA TGCTGACTTC 1170

【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCTCCTCGA GCATGTGATC AAGCGAGATG G 31

【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCTCCTGCA GTCAGGATCC ACACATCAGA C ３１

【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCTCGGATC CCTCTCCCTC CGTGTCCCGC T 31

【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCTCAAGCT TTTAGAAGTC AGCATCCAAG G 31

【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACAGCAAAT GCGTCGGGA 19

【００５１】配列番号：１０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AATCTGTATC AGGCTGAAA 19

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１及び／又は２で表されるアミ
   ノ酸配列を実質的に含み、リボヌクレオチドリダクター
   ゼ酵素活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号１及び／又は２で表されるアミ
   ノ酸配列を実質的にコードするＤＮＡを含むリボヌクレ
   オチドリダクターゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号３及び／又は４で表される塩基
   配列を実質的に含むリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝
   子。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のリボヌクレオチド
   リダクターゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡによって
   形質転換された形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
   し、得られる培養物からリボヌクレオチドリダクターゼ
   を採取することを特徴とするリボヌクレオチドリダクタ
   ーゼの製造方法。