JPH1014584A - 新規の核酸配列を有するプラスミド - Google Patents
新規の核酸配列を有するプラスミドInfo
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- JPH1014584A JPH1014584A JP8186621A JP18662196A JPH1014584A JP H1014584 A JPH1014584 A JP H1014584A JP 8186621 A JP8186621 A JP 8186621A JP 18662196 A JP18662196 A JP 18662196A JP H1014584 A JPH1014584 A JP H1014584A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 特定の核酸配列を有するプラスミド。
【効果】 本発明は、ビール混濁乳酸菌のホップ耐性に
関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプロー
ブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に検出
することができる。これによりビールの品質に影響する
ラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行うこ
とができる。
関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプロー
ブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に検出
することができる。これによりビールの品質に影響する
ラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行うこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定の配列を有するプ
ラスミドに関するものである。
ラスミドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】ビール
は、アルコールの含有、炭素源の枯渇、低ｐＨ、嫌気状
態という条件であることに加えて、抗菌活性をもつホッ
プを含むことから、微生物の生育抑制効果がある。しか
し、ある種のラクトバチルス（Lactobacillus）属菌
は、ホップ中の成分であるisoα酸に対して耐性を持つ
ことから、ビール製品に混入し生育することがある。
は、アルコールの含有、炭素源の枯渇、低ｐＨ、嫌気状
態という条件であることに加えて、抗菌活性をもつホッ
プを含むことから、微生物の生育抑制効果がある。しか
し、ある種のラクトバチルス（Lactobacillus）属菌
は、ホップ中の成分であるisoα酸に対して耐性を持つ
ことから、ビール製品に混入し生育することがある。
【０００３】このビールの品質に影響するラクトバチル
ス属菌の検出、判定については従来から検討されてお
り、例えば、抗原抗体反応を利用したビール醸造有害細
菌の検出法（特開昭５７−５９１６６）、ビール乳酸菌
に対するモノクローナル抗体を用いた検出法（特開平０
６−１０５６９８）、乳酸菌からＤＮＡを抽出して特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い
配列を増幅させた後乳酸菌の有無を判定する方法（特開
平０６−１４１８９９等）がある。
ス属菌の検出、判定については従来から検討されてお
り、例えば、抗原抗体反応を利用したビール醸造有害細
菌の検出法（特開昭５７−５９１６６）、ビール乳酸菌
に対するモノクローナル抗体を用いた検出法（特開平０
６−１０５６９８）、乳酸菌からＤＮＡを抽出して特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い
配列を増幅させた後乳酸菌の有無を判定する方法（特開
平０６−１４１８９９等）がある。
【０００４】しかしながら、これらの方法は、主として
ラクトバチルス ブレビスのような特定の乳酸菌の判定
を行う手法であり、このため、ホップ耐性のないブレビ
スの検出が行われる一方、ホップ耐性のある他の種の菌
を検出できないので、ビール混濁乳酸菌を確実に検出で
きないという問題点があった。
ラクトバチルス ブレビスのような特定の乳酸菌の判定
を行う手法であり、このため、ホップ耐性のないブレビ
スの検出が行われる一方、ホップ耐性のある他の種の菌
を検出できないので、ビール混濁乳酸菌を確実に検出で
きないという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで本発明では、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性に関係するプラスミドを特定
し、そのプラスミドをプローブとして利用してホップ耐
性乳酸菌を迅速に検出するものである。本発明のホップ
耐性プラスミドは次の方法により得られ、ホップ耐性乳
酸菌を検出することができる。
ル混濁乳酸菌のホップ耐性に関係するプラスミドを特定
し、そのプラスミドをプローブとして利用してホップ耐
性乳酸菌を迅速に検出するものである。本発明のホップ
耐性プラスミドは次の方法により得られ、ホップ耐性乳
酸菌を検出することができる。
【０００６】すなわち、（１）ビール混濁乳酸菌を徐々
にホップ濃度の高い培地に植え継いで行き馴化し、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性を強化する。（２）この馴化
操作を繰り返していくことによって、ビール混濁乳酸菌
の中に増加したホップ耐性に関係するプラスミドを確認
する。（３）確認されたプラスミドの一部または全部の
ＤＮＡを標識して判定用プローブをつくる。（４）ホッ
プ耐性乳酸菌か否かを判定したい乳酸菌を（３）で得た
プローブで判定する。
にホップ濃度の高い培地に植え継いで行き馴化し、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性を強化する。（２）この馴化
操作を繰り返していくことによって、ビール混濁乳酸菌
の中に増加したホップ耐性に関係するプラスミドを確認
する。（３）確認されたプラスミドの一部または全部の
ＤＮＡを標識して判定用プローブをつくる。（４）ホッ
プ耐性乳酸菌か否かを判定したい乳酸菌を（３）で得た
プローブで判定する。
【０００７】ビール混濁乳酸菌は、ビール製造において
耐酸性と耐アルコール性を有する有害菌であり、具体的
には、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is)、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus p
lantarum)、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus cas
ei) 等がある。以下に、本発明をさらに詳しく説明す
る。
耐酸性と耐アルコール性を有する有害菌であり、具体的
には、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is)、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus p
lantarum)、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus cas
ei) 等がある。以下に、本発明をさらに詳しく説明す
る。
【０００８】ビール混濁乳酸菌のホップ馴化を行う培地
は乳酸菌が生育できる培地であればいずれでもよいが、
例えばＭＲＳ液体培地等が使用できる。培地に添加する
ホップエキスとしては、イソ化ホップエキスが利用でき
る。ホップエキスを添加する濃度は、試験に供するビー
ル混濁乳酸菌が生育できる最大濃度から開始し、その濃
度から５０〜１００マイクロモル（イソα酸換算）ずつ
上昇し、最大濃度の３倍以上まで達成させる。
は乳酸菌が生育できる培地であればいずれでもよいが、
例えばＭＲＳ液体培地等が使用できる。培地に添加する
ホップエキスとしては、イソ化ホップエキスが利用でき
る。ホップエキスを添加する濃度は、試験に供するビー
ル混濁乳酸菌が生育できる最大濃度から開始し、その濃
度から５０〜１００マイクロモル（イソα酸換算）ずつ
上昇し、最大濃度の３倍以上まで達成させる。
【０００９】培養条件は、ビール混濁乳酸菌が生育でき
る通常の適温で嫌気条件であればよい。培養時間は、各
ホップエキス含有培地で生育するまでであるが、最大５
日程度内である。ホップエキス馴化したビール混濁乳酸
菌からホップ耐性プラスミドを取得する方法は以下のと
おりである。
る通常の適温で嫌気条件であればよい。培養時間は、各
ホップエキス含有培地で生育するまでであるが、最大５
日程度内である。ホップエキス馴化したビール混濁乳酸
菌からホップ耐性プラスミドを取得する方法は以下のと
おりである。
【００１０】培養したビール混濁乳酸菌を公知のアルカ
リＳＤＳ法（文献：D. G. Ardersen& L. L. Mckay, App
l. Env. Microbiol., 46, 549 (1983))で乳酸菌内の全
プラスミドを得る。得られた各プラスミドをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、馴化前に比べて馴化後にコピー数
の増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、アガロ
ースを除去する。得られたプラスミドが、本発明のホッ
プ耐性プラスミドである。
リＳＤＳ法（文献：D. G. Ardersen& L. L. Mckay, App
l. Env. Microbiol., 46, 549 (1983))で乳酸菌内の全
プラスミドを得る。得られた各プラスミドをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、馴化前に比べて馴化後にコピー数
の増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、アガロ
ースを除去する。得られたプラスミドが、本発明のホッ
プ耐性プラスミドである。
【００１１】この得られたホップ耐性プラスミドをプロ
ーブに利用するには、プラスミド全体を用いてもよく、
あるいはこのうちの一部を用いても良い。特に本発明の
実施例で得られたＯＲＦ５のホップ耐性プラスミドは、
ＡＴＰ binding casette transporter によるホップ排
出ポンプ遺伝子をコードしたプラスミドと推定され、非
常にビール混濁乳酸菌の検出に有効なものである。この
プローブは通常これらを利用して検出することができる
公知の方法によって標識するのが好ましく、例えば、ビ
オチン−アビジン、ジゴキシゲニン等の標識、あるいは
放射性標識等が利用できる。
ーブに利用するには、プラスミド全体を用いてもよく、
あるいはこのうちの一部を用いても良い。特に本発明の
実施例で得られたＯＲＦ５のホップ耐性プラスミドは、
ＡＴＰ binding casette transporter によるホップ排
出ポンプ遺伝子をコードしたプラスミドと推定され、非
常にビール混濁乳酸菌の検出に有効なものである。この
プローブは通常これらを利用して検出することができる
公知の方法によって標識するのが好ましく、例えば、ビ
オチン−アビジン、ジゴキシゲニン等の標識、あるいは
放射性標識等が利用できる。
【００１２】この標識されたホップ耐性プローブを用
い、ビール混濁乳酸菌を判定する方法としては、一般に
利用されているコロニーハイブリダイゼーション法、サ
ザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が利用でき
る。
い、ビール混濁乳酸菌を判定する方法としては、一般に
利用されているコロニーハイブリダイゼーション法、サ
ザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が利用でき
る。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。 （１）ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is）ＡＢＢＣ４５株のホップ耐性プラスミドの取得 ラクトバチルス ブレビスＡＢＢＣ４５株をイソ化ホッ
プエキスを１５０マイクロモル含有したＭＲＳ液体培地
５ｍｌに１０6 セル／ｍｌの割合で添加し、３０℃で３
日間培養した。
is）ＡＢＢＣ４５株のホップ耐性プラスミドの取得 ラクトバチルス ブレビスＡＢＢＣ４５株をイソ化ホッ
プエキスを１５０マイクロモル含有したＭＲＳ液体培地
５ｍｌに１０6 セル／ｍｌの割合で添加し、３０℃で３
日間培養した。
【００１４】その後、ホップ馴化をすすめるために、５
０マイクロモルずつイソ化ホップエキスを増加してい
き、最終濃度が９００マイクロモルになるまで上記の条
件で同様の操作を行った。馴化前後の乳酸菌を集菌、洗
浄し、次いでアルカリＳＤＳ法によって全プラスミドを
取得した。馴化前後の乳酸菌から得られた全プラスミド
をそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、馴化後にコ
ピー数が増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、
アガロースを除去した。
０マイクロモルずつイソ化ホップエキスを増加してい
き、最終濃度が９００マイクロモルになるまで上記の条
件で同様の操作を行った。馴化前後の乳酸菌を集菌、洗
浄し、次いでアルカリＳＤＳ法によって全プラスミドを
取得した。馴化前後の乳酸菌から得られた全プラスミド
をそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、馴化後にコ
ピー数が増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、
アガロースを除去した。
【００１５】得られたプラスミド（以下、ｐＲＨ４５と
いう）は１４．５ｋｂであり、制限酵素地図は図１のと
おりである。ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI ２kb断片を、大
腸菌と乳酸菌のシャトルベクター上にクローニングする
ことにより増幅させ、ベーリンガーマンハイム社製ＤＩ
ＧＤＮＡ標識及び検出キットを使用し、ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰを用いたランダムプライムシステムによるＤ
ＮＡ標識を行った。
いう）は１４．５ｋｂであり、制限酵素地図は図１のと
おりである。ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI ２kb断片を、大
腸菌と乳酸菌のシャトルベクター上にクローニングする
ことにより増幅させ、ベーリンガーマンハイム社製ＤＩ
ＧＤＮＡ標識及び検出キットを使用し、ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰを用いたランダムプライムシステムによるＤ
ＮＡ標識を行った。
【００１６】表１に示した乳酸菌から前記の方法で、同
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
【００１７】
【表１】
【００１８】（２）標識されたホップ耐性プローブを用
いたビール混濁乳酸菌の判定 表２に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（１）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
いたビール混濁乳酸菌の判定 表２に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（１）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
【００１９】
【表２】
【００２０】（３）ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断片のＤ
ＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断
片のＤＮＡ配列を図２に示した。 （４）実施例（１）で得られたｐＲＨ４５から別の断片
を得て実施例（１）と同様に試験した。すなわち、ｐＲ
Ｈ４５のＯＲＦ５断片を、ＰＣＲ法により増幅させ、ベ
ーリンガーマンハイム社製ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出
キットを使用し、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いたラ
ンダムプライムシステムによるＤＮＡ標識を行った。
ＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断
片のＤＮＡ配列を図２に示した。 （４）実施例（１）で得られたｐＲＨ４５から別の断片
を得て実施例（１）と同様に試験した。すなわち、ｐＲ
Ｈ４５のＯＲＦ５断片を、ＰＣＲ法により増幅させ、ベ
ーリンガーマンハイム社製ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出
キットを使用し、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いたラ
ンダムプライムシステムによるＤＮＡ標識を行った。
【００２１】表３に示した乳酸菌から前記の方法で、同
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
【００２２】
【表３】
【００２３】（５）標識されたホップ耐性プローブを用
いたビール混濁乳酸菌の判定 表４に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（４）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
いたビール混濁乳酸菌の判定 表４に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（４）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
【００２４】
【表４】 （６）ｐＲＨ４５のＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のＯＲＦ５断片の
ＤＮＡ配列を図３に示した。
ＤＮＡ配列を図３に示した。
【００２５】
【発明の効果】本発明は、ビール混濁乳酸菌のホップ耐
性に関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプ
ローブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に
検出することができる。これによりビールの品質に影響
するラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行
うことができる。
性に関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプ
ローブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に
検出することができる。これによりビールの品質に影響
するラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行
うことができる。
【図１】本発明の実施例において得られたプラスミドの
制限酵素地図を示す図である。
制限酵素地図を示す図である。
【図２】本発明の実施例において得られたｐＲＨ４５の
BamHI-BamHI 断片のＤＮＡ配列を示す図である。
BamHI-BamHI 断片のＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】本発明の実施例において得られたｐＲＨ４５の
ＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列を示す図である。
ＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１２月４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 新規の核酸配列を有するプラスミド
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定の配列を有するプ
ラスミドに関するものである。
ラスミドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】ビール
は、アルコールの含有、炭素源の枯渇、低ｐＨ、嫌気状
態という条件であることに加えて、抗菌活性をもつホッ
プを含むことから、微生物の生育抑制効果がある。しか
し、ある種のラクトバチルス（Lactobacillus）属菌
は、ホップ中の成分であるisoα酸に対して耐性を持つ
ことから、ビール製品に混入し生育することがある。
は、アルコールの含有、炭素源の枯渇、低ｐＨ、嫌気状
態という条件であることに加えて、抗菌活性をもつホッ
プを含むことから、微生物の生育抑制効果がある。しか
し、ある種のラクトバチルス（Lactobacillus）属菌
は、ホップ中の成分であるisoα酸に対して耐性を持つ
ことから、ビール製品に混入し生育することがある。
【０００３】このビールの品質に影響するラクトバチル
ス属菌の検出、判定については従来から検討されてお
り、例えば、抗原抗体反応を利用したビール醸造有害細
菌の検出法（特開昭５７−５９１６６）、ビール乳酸菌
に対するモノクローナル抗体を用いた検出法（特開平０
６−１０５６９８）、乳酸菌からＤＮＡを抽出して特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い
配列を増幅させた後乳酸菌の有無を判定する方法（特開
平０６−１４１８９９等）がある。
ス属菌の検出、判定については従来から検討されてお
り、例えば、抗原抗体反応を利用したビール醸造有害細
菌の検出法（特開昭５７−５９１６６）、ビール乳酸菌
に対するモノクローナル抗体を用いた検出法（特開平０
６−１０５６９８）、乳酸菌からＤＮＡを抽出して特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い
配列を増幅させた後乳酸菌の有無を判定する方法（特開
平０６−１４１８９９等）がある。
【０００４】しかしながら、これらの方法は、主として
ラクトバチルス ブレビスのような特定の乳酸菌の判定
を行う手法であり、このため、ホップ耐性のないブレビ
スの検出が行われる一方、ホップ耐性のある他の種の菌
を検出できないので、ビール混濁乳酸菌を確実に検出で
きないという問題点があった。
ラクトバチルス ブレビスのような特定の乳酸菌の判定
を行う手法であり、このため、ホップ耐性のないブレビ
スの検出が行われる一方、ホップ耐性のある他の種の菌
を検出できないので、ビール混濁乳酸菌を確実に検出で
きないという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで本発明では、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性に関係するプラスミドを特定
し、そのプラスミドをプローブとして利用してホップ耐
性乳酸菌を迅速に検出するものである。本発明のホップ
耐性プラスミドは次の方法により得られ、ホップ耐性乳
酸菌を検出することができる。
ル混濁乳酸菌のホップ耐性に関係するプラスミドを特定
し、そのプラスミドをプローブとして利用してホップ耐
性乳酸菌を迅速に検出するものである。本発明のホップ
耐性プラスミドは次の方法により得られ、ホップ耐性乳
酸菌を検出することができる。
【０００６】すなわち、（１）ビール混濁乳酸菌を徐々
にホップ濃度の高い培地に植え継いで行き馴化し、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性を強化する。（２）この馴化
操作を繰り返していくことによって、ビール混濁乳酸菌
の中に増加したホップ耐性に関係するプラスミドを確認
する。（３）確認されたプラスミドの一部または全部の
ＤＮＡを標識して判定用プローブをつくる。（４）ホッ
プ耐性乳酸菌か否かを判定したい乳酸菌を（３）で得た
プローブで判定する。
にホップ濃度の高い培地に植え継いで行き馴化し、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性を強化する。（２）この馴化
操作を繰り返していくことによって、ビール混濁乳酸菌
の中に増加したホップ耐性に関係するプラスミドを確認
する。（３）確認されたプラスミドの一部または全部の
ＤＮＡを標識して判定用プローブをつくる。（４）ホッ
プ耐性乳酸菌か否かを判定したい乳酸菌を（３）で得た
プローブで判定する。
【０００７】ビール混濁乳酸菌は、ビール製造において
耐酸性と耐アルコール性を有する有害菌であり、具体的
には、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is)、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus p
lantarum)、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus cas
ei) 等がある。以下に、本発明をさらに詳しく説明す
る。
耐酸性と耐アルコール性を有する有害菌であり、具体的
には、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is)、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus p
lantarum)、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus cas
ei) 等がある。以下に、本発明をさらに詳しく説明す
る。
【０００８】ビール混濁乳酸菌のホップ馴化を行う培地
は乳酸菌が生育できる培地であればいずれでもよいが、
例えばＭＲＳ液体培地等が使用できる。培地に添加する
ホップエキスとしては、イソ化ホップエキスが利用でき
る。ホップエキスを添加する濃度は、試験に供するビー
ル混濁乳酸菌が生育できる最大濃度から開始し、その濃
度から５０〜１００マイクロモル（イソα酸換算）ずつ
上昇し、最大濃度の３倍以上まで達成させる。
は乳酸菌が生育できる培地であればいずれでもよいが、
例えばＭＲＳ液体培地等が使用できる。培地に添加する
ホップエキスとしては、イソ化ホップエキスが利用でき
る。ホップエキスを添加する濃度は、試験に供するビー
ル混濁乳酸菌が生育できる最大濃度から開始し、その濃
度から５０〜１００マイクロモル（イソα酸換算）ずつ
上昇し、最大濃度の３倍以上まで達成させる。
【０００９】培養条件は、ビール混濁乳酸菌が生育でき
る通常の適温で嫌気条件であればよい。培養時間は、各
ホップエキス含有培地で生育するまでであるが、最大５
日程度内である。ホップエキス馴化したビール混濁乳酸
菌からホップ耐性プラスミドを取得する方法は以下のと
おりである。
る通常の適温で嫌気条件であればよい。培養時間は、各
ホップエキス含有培地で生育するまでであるが、最大５
日程度内である。ホップエキス馴化したビール混濁乳酸
菌からホップ耐性プラスミドを取得する方法は以下のと
おりである。
【００１０】培養したビール混濁乳酸菌を公知のアルカ
リＳＤＳ法（文献：D. G. Ardersen& L. L. Mckay, App
l. Env. Microbiol., 46, 549 (1983))で乳酸菌内の全
プラスミドを得る。得られた各プラスミドをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、馴化前に比べて馴化後にコピー数
の増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、アガロ
ースを除去する。得られたプラスミドが、本発明のホッ
プ耐性プラスミドである。
リＳＤＳ法（文献：D. G. Ardersen& L. L. Mckay, App
l. Env. Microbiol., 46, 549 (1983))で乳酸菌内の全
プラスミドを得る。得られた各プラスミドをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、馴化前に比べて馴化後にコピー数
の増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、アガロ
ースを除去する。得られたプラスミドが、本発明のホッ
プ耐性プラスミドである。
【００１１】この得られたホップ耐性プラスミドをプロ
ーブに利用するには、プラスミド全体を用いてもよく、
あるいはこのうちの一部を用いても良い。特に本発明の
実施例で得られたＯＲＦ５のホップ耐性プラスミドは、
ＡＴＰ binding casette transporter によるホップ排
出ポンプ遺伝子をコードしたプラスミドと推定され、非
常にビール混濁乳酸菌の検出に有効なものである。この
プローブは通常これらを利用して検出することができる
公知の方法によって標識するのが好ましく、例えば、ビ
オチン−アビジン、ジゴキシゲニン等の標識、あるいは
放射性標識等が利用できる。
ーブに利用するには、プラスミド全体を用いてもよく、
あるいはこのうちの一部を用いても良い。特に本発明の
実施例で得られたＯＲＦ５のホップ耐性プラスミドは、
ＡＴＰ binding casette transporter によるホップ排
出ポンプ遺伝子をコードしたプラスミドと推定され、非
常にビール混濁乳酸菌の検出に有効なものである。この
プローブは通常これらを利用して検出することができる
公知の方法によって標識するのが好ましく、例えば、ビ
オチン−アビジン、ジゴキシゲニン等の標識、あるいは
放射性標識等が利用できる。
【００１２】この標識されたホップ耐性プローブを用
い、ビール混濁乳酸菌を判定する方法としては、一般に
利用されているコロニーハイブリダイゼーション法、サ
ザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が利用でき
る。
い、ビール混濁乳酸菌を判定する方法としては、一般に
利用されているコロニーハイブリダイゼーション法、サ
ザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が利用でき
る。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。 （１）ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is）ＡＢＢＣ４５株のホップ耐性プラスミドの取得 ラクトバチルス ブレビスＡＢＢＣ４５株をイソ化ホッ
プエキスを１５０マイクロモル含有したＭＲＳ液体培地
５ｍｌに１０6 セル／ｍｌの割合で添加し、３０℃で３
日間培養した。
is）ＡＢＢＣ４５株のホップ耐性プラスミドの取得 ラクトバチルス ブレビスＡＢＢＣ４５株をイソ化ホッ
プエキスを１５０マイクロモル含有したＭＲＳ液体培地
５ｍｌに１０6 セル／ｍｌの割合で添加し、３０℃で３
日間培養した。
【００１４】その後、ホップ馴化をすすめるために、５
０マイクロモルずつイソ化ホップエキスを増加してい
き、最終濃度が９００マイクロモルになるまで上記の条
件で同様の操作を行った。馴化前後の乳酸菌を集菌、洗
浄し、次いでアルカリＳＤＳ法によって全プラスミドを
取得した。馴化前後の乳酸菌から得られた全プラスミド
をそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、馴化後にコ
ピー数が増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、
アガロースを除去した。
０マイクロモルずつイソ化ホップエキスを増加してい
き、最終濃度が９００マイクロモルになるまで上記の条
件で同様の操作を行った。馴化前後の乳酸菌を集菌、洗
浄し、次いでアルカリＳＤＳ法によって全プラスミドを
取得した。馴化前後の乳酸菌から得られた全プラスミド
をそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、馴化後にコ
ピー数が増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、
アガロースを除去した。
【００１５】得られたプラスミド（以下、ｐＲＨ４５と
いう）は１４．５ｋｂであり、制限酵素地図は図１のと
おりである。ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI ２kb断片を、大
腸菌と乳酸菌のシャトルベクター上にクローニングする
ことにより増幅させ、ベーリンガーマンハイム社製ＤＩ
ＧＤＮＡ標識及び検出キットを使用し、ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰを用いたランダムプライムシステムによるＤ
ＮＡ標識を行った。
いう）は１４．５ｋｂであり、制限酵素地図は図１のと
おりである。ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI ２kb断片を、大
腸菌と乳酸菌のシャトルベクター上にクローニングする
ことにより増幅させ、ベーリンガーマンハイム社製ＤＩ
ＧＤＮＡ標識及び検出キットを使用し、ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰを用いたランダムプライムシステムによるＤ
ＮＡ標識を行った。
【００１６】表１に示した乳酸菌から前記の方法で、同
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
【００１７】
【表１】
【００１８】（２）標識されたホップ耐性プローブを用
いたビール混濁乳酸菌の判定 表２に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（１）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
いたビール混濁乳酸菌の判定 表２に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（１）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
【００１９】
【表２】
【００２０】（３）ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断片のＤ
ＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断
片のＤＮＡ配列を図２および配列表の配列番号：１に示
した。 （４）実施例（１）で得られたｐＲＨ４５から別の断片
を得て実施例（１）と同様に試験した。すなわち、ｐＲ
Ｈ４５のＯＲＦ５断片を、ＰＣＲ法により増幅させ、ベ
ーリンガーマンハイム社製ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出
キットを使用し、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いたラ
ンダムプライムシステムによるＤＮＡ標識を行った。
ＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のBamHI-BamHI 断
片のＤＮＡ配列を図２および配列表の配列番号：１に示
した。 （４）実施例（１）で得られたｐＲＨ４５から別の断片
を得て実施例（１）と同様に試験した。すなわち、ｐＲ
Ｈ４５のＯＲＦ５断片を、ＰＣＲ法により増幅させ、ベ
ーリンガーマンハイム社製ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出
キットを使用し、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いたラ
ンダムプライムシステムによるＤＮＡ標識を行った。
【００２１】表３に示した乳酸菌から前記の方法で、同
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
【００２２】
【表３】
【００２３】（５）標識されたホップ耐性プローブを用
いたビール混濁乳酸菌の判定 表４に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（４）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
いたビール混濁乳酸菌の判定 表４に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（４）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
【００２４】
【表４】 （６）ｐＲＨ４５のＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列 公知の方法により分析したｐＲＨ４５のＯＲＦ５断片の
ＤＮＡ配列を図３および配列表の配列番号：２に示し
た。
ＤＮＡ配列を図３および配列表の配列番号：２に示し
た。
【００２５】
【発明の効果】本発明は、ビール混濁乳酸菌のホップ耐
性に関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプ
ローブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に
検出することができる。これによりビールの品質に影響
するラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行
うことができる。
性に関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプ
ローブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に
検出することができる。これによりビールの品質に影響
するラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行
うことができる。
【００２６】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：2190 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus br
evis） 株名：ABBC45 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGATCCCGTG GTAGGCCCTT TTAACTTTAT GCTGTAGCGC GCCATTTTTC 50 TTGTTCTGTT AGTTCACCAT TATGCTGGAT ATTAAAAAGC TTTTGCCGTT 100 CATCTTGAAA ATGTCCTTGT GAGAAATCAT TTGTAATTTT TCCTTTCAGG 150 TTTCCAAGCA AAAGNAATAA CCAATAACTG GTTTTCCTCG GACCTTTCAC 200 CATATTTNCT TTNCTAATTG TTNAGGACCT CTAAAAAGAG GGGTTAATTC 250 TTCTCTGATT GGTTTAAGAA CGTACCTATC AACGTCTCCT GGTTTTTTCC 300 AATAACTTTT AGGGATATCA AGTAACTCAA AAAAATCTTC TTTTGATAAA 350 AAAGCATAAC CAGTTGTTCT GAAGCCTTTT AACAATCTAA AAGCGGTTTT 400 AGCATAACTG CTTCGCGATC TCTAAATTCC GCTAAAGCAT ATCTAACCCA 450 CGTGTCTAAA TTATTGAGAA GTGGTAGAGC ATCTTTATAT ACTTCAATAT 500 CTATATAAGG AGAATCAGCT TCACCAACAA TTCTAAATTT AGTAAACATA 550 AAAAATATTT CTCTATTTAA TCCAGATTTA CTACGTCTTC CAAAATGAAG 600 TCCCATTAGC TTTTCATAAG TTCTTTGAAT ATCATCTTCA AAACGATTAT 650 TGTGCAGTCG GTTTATAGTT GCTCAAATCT TTTAAGTTTG TTCAAAAGAG 700 AATCTAACTG TTTGATCTCC TTTTATCACG GATACGGGGA NATATTGAAA 750 AATAGATTCA TTTCAATAGG GGTGAATTTA CGTAATGGAA TGGTATTAAG 800 CTTCAGGATC ATATTTTATA AGTTCATTGC TCATAATCAC ACCTCCACAA 850 CTATTATATA AAATCAACGN TTTTTTATCA ACGNTCACCA TTAAAMCGCC 900 TCGTTGAATA AAACAAGCAC AAAAACCTCG TTGAATAAAA CAAGCACAAA 950 AACCTCGTTG AATAAAACAA GCCAAAAACC TCGTTGAATA AAACAAGCAC 1000 AAAAACCTCG TTGATAAAAT TCTGTATCCC TTGTGAGAGT AAGACTAAAA 1050 TGGGGTCTAA AAGAGGTTTA AAAGAGGTTT ATAAAAGAGG TTTAAAAGAG 1100 GCACTACTGT ACGAGGTCAA AACCTAGAAT CAAAAAACAC AAAGGAGTGA 1150 GCCAAAAAAA CAGGCTCACA TTAAACTCCA GCGCTATGCT CCTTGCGCCT 1200 CACTCTGTTC GTTGCCTAAA AGGTGTGGCA AGCCACATTA ATTCGGCGCT 1250 GCCGCCCCGA ACCCCGTCCA AGCTGAGCCA GCTTGACCGC TTTTTCACTC 1300 GCCGTTAGGC AGGAAAGCAA AGTTTTATAG AAAACTTTGC TTTCGCCAAT 1350 TCAGTGTTAA GACTGGCTTA GAGCTGTCAA TTCCTTATGC TCCCACGCTT 1400 TGCTCGTCCG CTACCATTGA CAGCAAACAG TTAGTTTTTG AATCTTAACA 1450 AGAACTTTAG CTGCTATGTT CGTTTTTTAG GGCCNTNATT TTTCGTTNCT 1500 AGCAATTTAA GACTAGTTCA TATATATTCA TACCAAAACA AAAATAAAAA 1550 GCCCTCAGTG AGCTTTTAGA GGGCTAGATG ACGAAACCTG GACGATTAAT 1600 AATATCTTCT TGTCTKTTTT GCAAAATATA AGTGTATAAG GAATCATACA 1650 GATTCCTTTT GATCTCGTCA GGTTCATTGG CAGAAGCTTC AAACAATTCT 1700 TGAATATCAA CTTGCCATGG ATCAGCAAGC ATTTCATCAA TTTGTTTTAA 1750 TACTTTCTTT TCGTCAATCT TAATGACTCC TAACATCAAA ATAATGCTTT 1800 CAGTTTAAAT TCACAGATCT TACAGCACCG TTATTCAAAA TTTGTTACCA 1850 AGCTTATAAA GATTATCTGC ACAAAGCAAT TAAAAAATTT TGGCTTAAAA 1900 CAGCGTAATC TGAAACACTT TTTAAATATT TAAAACATGA CAATCCTAGT 1950 TAGGTGCAAA CATAAATTGA ATTAAAAATA CAGCAATCAA CAACAGCAGA 2000 AATTGATTTT ATGGTTATCA GCAGACCGAG TGAAATGAGG CAATGCGCAC 2050 TTTACACCCT TGACAAGTGT CAAGGGTACA TTTAATCCCC ACTTTTGATG 2100 GGCGTTACTT TGTATTACGA GACGTAACCC CAACTATCAA AAACCTAGAC 2150 GTTAAATCTT AAGATTAATC AATCACATTA TGAAGGATCC 2190
evis） 株名：ABBC45 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGATCCCGTG GTAGGCCCTT TTAACTTTAT GCTGTAGCGC GCCATTTTTC 50 TTGTTCTGTT AGTTCACCAT TATGCTGGAT ATTAAAAAGC TTTTGCCGTT 100 CATCTTGAAA ATGTCCTTGT GAGAAATCAT TTGTAATTTT TCCTTTCAGG 150 TTTCCAAGCA AAAGNAATAA CCAATAACTG GTTTTCCTCG GACCTTTCAC 200 CATATTTNCT TTNCTAATTG TTNAGGACCT CTAAAAAGAG GGGTTAATTC 250 TTCTCTGATT GGTTTAAGAA CGTACCTATC AACGTCTCCT GGTTTTTTCC 300 AATAACTTTT AGGGATATCA AGTAACTCAA AAAAATCTTC TTTTGATAAA 350 AAAGCATAAC CAGTTGTTCT GAAGCCTTTT AACAATCTAA AAGCGGTTTT 400 AGCATAACTG CTTCGCGATC TCTAAATTCC GCTAAAGCAT ATCTAACCCA 450 CGTGTCTAAA TTATTGAGAA GTGGTAGAGC ATCTTTATAT ACTTCAATAT 500 CTATATAAGG AGAATCAGCT TCACCAACAA TTCTAAATTT AGTAAACATA 550 AAAAATATTT CTCTATTTAA TCCAGATTTA CTACGTCTTC CAAAATGAAG 600 TCCCATTAGC TTTTCATAAG TTCTTTGAAT ATCATCTTCA AAACGATTAT 650 TGTGCAGTCG GTTTATAGTT GCTCAAATCT TTTAAGTTTG TTCAAAAGAG 700 AATCTAACTG TTTGATCTCC TTTTATCACG GATACGGGGA NATATTGAAA 750 AATAGATTCA TTTCAATAGG GGTGAATTTA CGTAATGGAA TGGTATTAAG 800 CTTCAGGATC ATATTTTATA AGTTCATTGC TCATAATCAC ACCTCCACAA 850 CTATTATATA AAATCAACGN TTTTTTATCA ACGNTCACCA TTAAAMCGCC 900 TCGTTGAATA AAACAAGCAC AAAAACCTCG TTGAATAAAA CAAGCACAAA 950 AACCTCGTTG AATAAAACAA GCCAAAAACC TCGTTGAATA AAACAAGCAC 1000 AAAAACCTCG TTGATAAAAT TCTGTATCCC TTGTGAGAGT AAGACTAAAA 1050 TGGGGTCTAA AAGAGGTTTA AAAGAGGTTT ATAAAAGAGG TTTAAAAGAG 1100 GCACTACTGT ACGAGGTCAA AACCTAGAAT CAAAAAACAC AAAGGAGTGA 1150 GCCAAAAAAA CAGGCTCACA TTAAACTCCA GCGCTATGCT CCTTGCGCCT 1200 CACTCTGTTC GTTGCCTAAA AGGTGTGGCA AGCCACATTA ATTCGGCGCT 1250 GCCGCCCCGA ACCCCGTCCA AGCTGAGCCA GCTTGACCGC TTTTTCACTC 1300 GCCGTTAGGC AGGAAAGCAA AGTTTTATAG AAAACTTTGC TTTCGCCAAT 1350 TCAGTGTTAA GACTGGCTTA GAGCTGTCAA TTCCTTATGC TCCCACGCTT 1400 TGCTCGTCCG CTACCATTGA CAGCAAACAG TTAGTTTTTG AATCTTAACA 1450 AGAACTTTAG CTGCTATGTT CGTTTTTTAG GGCCNTNATT TTTCGTTNCT 1500 AGCAATTTAA GACTAGTTCA TATATATTCA TACCAAAACA AAAATAAAAA 1550 GCCCTCAGTG AGCTTTTAGA GGGCTAGATG ACGAAACCTG GACGATTAAT 1600 AATATCTTCT TGTCTKTTTT GCAAAATATA AGTGTATAAG GAATCATACA 1650 GATTCCTTTT GATCTCGTCA GGTTCATTGG CAGAAGCTTC AAACAATTCT 1700 TGAATATCAA CTTGCCATGG ATCAGCAAGC ATTTCATCAA TTTGTTTTAA 1750 TACTTTCTTT TCGTCAATCT TAATGACTCC TAACATCAAA ATAATGCTTT 1800 CAGTTTAAAT TCACAGATCT TACAGCACCG TTATTCAAAA TTTGTTACCA 1850 AGCTTATAAA GATTATCTGC ACAAAGCAAT TAAAAAATTT TGGCTTAAAA 1900 CAGCGTAATC TGAAACACTT TTTAAATATT TAAAACATGA CAATCCTAGT 1950 TAGGTGCAAA CATAAATTGA ATTAAAAATA CAGCAATCAA CAACAGCAGA 2000 AATTGATTTT ATGGTTATCA GCAGACCGAG TGAAATGAGG CAATGCGCAC 2050 TTTACACCCT TGACAAGTGT CAAGGGTACA TTTAATCCCC ACTTTTGATG 2100 GGCGTTACTT TGTATTACGA GACGTAACCC CAACTATCAA AAACCTAGAC 2150 GTTAAATCTT AAGATTAATC AATCACATTA TGAAGGATCC 2190
【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：1749 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（plasmid DNA） 起源 生物名：ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus br
evis） 株名：ABBC45 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：1083-1620 ATP binding cassette（ABC）tr
ansporter 配列 ATGCAAGCTC AGTCCAAGAA CAATACCAAG TTTAACTTTA AAACATTTAT 50 GGGCCTAATC AACCGAATTC ACCCCCGTTA CTGGCAACTG CTGCTTGGCT 100 TTTTTCTAGG AGTTGTCGCA ACGGCGATGC AATTGATGGT TCCCGGCATC 150 GCCAAGGGGA TCATCAACTC AATCGGTCAT TCAATGGATG TCGGCCTAAT 200 CGTTGCCGTC ATTTTACTAT TCGTTTTCAG TACCATTATT GGAGCCTTTT 250 CCGGCAGTAT TTTAGGCTTC TTCGGTGAAG ACGTCGTCTA TAAGCTGCGA 300 ACAACACTTT GGGATAAAAT CTTAACCCTG CCGGTGGGTT ATTTTGACCA 350 AACCAAATCT GGCGAAATAA CGTCCAGGTT GGTCAATGAT TCCACACAGG 400 TCAAGGAACT GTTGGCCAAT TCGGTTCCCA AAACCGCAAC TTCGATTCTG 450 CAACTGGTTG GCGCATTGGT CTTAATGCTC ATCATGGACT GGCGGATGAC 500 TATCATTATG TTTATCGCCG TTCCGCTCGT CTTGATCTGC CTGCTGCCAA 550 TTGTCCGCCA ATCCCACAAA GTTGCCAGAG CGAGACAGGA CGCACTGGCA 600 GATCTCAATG GTAAAGCCGG TGAAATGCTG GGCGAAGTCC GTCTAGTCAA 650 ATCGTCTACC GCAGAAAACT TAGAACGAAC AGCCGGCGAT AAACGGATGT 700 ATCGCCTTTA TCGCATCGGG TTAAAAGAAG CGATCTATGA TTCAATTGCC 750 GGACCTGTAA TGGGCATGGT CATGATGGCC ATGGTCCTGG AAATTCTGGG 800 CTATGGTGCG ATCCGGGTTC GGGAAGGTGC CATTGATATT GGGACCTTAT 850 TTTCATTTCT GATGTACCTG GTTCAAATGA TTAGTCCATT TGCGGTTCTC 900 GGCCAATTCA TGTCTGATGT TGCCAAGGCA AGTGGCTCAA CCACTCGAAT 950 CCAGGCATTA TTGCAAACTC ATGAAGAAGA TCGTCTGACT GGAACGGATT 1000 TGGATATTGG CGATCAAACA CTTCAGATGA ACCACGTCAG TTTTTCTTAT 1050 GATCAGCATC ACCCCATTTT ATCCGGCGTG TCGTTTACGG CAGAACCCAA 1100 TTCGGTCATT GCCTTTGCCG GACCATCCGG CGGTGGCAAA TCAACCATTT 1150 TCAGCTTAAT TGAACGTTTT TATGAACCTA ACGAGGGCAG CATCACGATT 1200 GGCAATACCA ATATTACTGA TATTCAACTT GCCGATTGGC GCCAGCAAAT 1250 CGGCCTGGTC GGCCAAGACG CTGCGATCAT GTCTGGAACG ATTCGTTACA 1300 ATTTAACCTA TGGTTTGCCG GGGCATTTTT CCGATGAACA GCTTTGGCAT 1350 GTCTTGGAAA TGGCTTTACG CAACGAATTT GTCCAGAAGA TGCCTCGGGG 1400 CTTGGACACG GAAGTCGGTG AGCGTGGAGT CAAGGTATCG GGGGGCCAAC 1450 GCCAACGATT GGCGATTGCC CGGGCCTTCC TGCGTAATCC AAAAATATTA 1500 ATGTTGGATG AAGCAACGGC GAGCCTGGAT TCCGAGTCCG AAATGATGGT 1550 CCAAAAAGCG CTGGACCAGT TGATGGCCAA TCGAACAACA TTGGTGATCG 1600 CCCACAGGCT AAGCACAATT ACCAACGCCG ACGAAATTTA TTTCATAGAA 1650 AACGGCAGGG TAACGGGCCA GGGAACCCAC CAACAGTTAG TGAAAACGAC 1700 TCCTTTGTAT AGGGAGTATG TGAAAAATCA GAGCGCGACG AGCAACGGG 1749
evis） 株名：ABBC45 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：1083-1620 ATP binding cassette（ABC）tr
ansporter 配列 ATGCAAGCTC AGTCCAAGAA CAATACCAAG TTTAACTTTA AAACATTTAT 50 GGGCCTAATC AACCGAATTC ACCCCCGTTA CTGGCAACTG CTGCTTGGCT 100 TTTTTCTAGG AGTTGTCGCA ACGGCGATGC AATTGATGGT TCCCGGCATC 150 GCCAAGGGGA TCATCAACTC AATCGGTCAT TCAATGGATG TCGGCCTAAT 200 CGTTGCCGTC ATTTTACTAT TCGTTTTCAG TACCATTATT GGAGCCTTTT 250 CCGGCAGTAT TTTAGGCTTC TTCGGTGAAG ACGTCGTCTA TAAGCTGCGA 300 ACAACACTTT GGGATAAAAT CTTAACCCTG CCGGTGGGTT ATTTTGACCA 350 AACCAAATCT GGCGAAATAA CGTCCAGGTT GGTCAATGAT TCCACACAGG 400 TCAAGGAACT GTTGGCCAAT TCGGTTCCCA AAACCGCAAC TTCGATTCTG 450 CAACTGGTTG GCGCATTGGT CTTAATGCTC ATCATGGACT GGCGGATGAC 500 TATCATTATG TTTATCGCCG TTCCGCTCGT CTTGATCTGC CTGCTGCCAA 550 TTGTCCGCCA ATCCCACAAA GTTGCCAGAG CGAGACAGGA CGCACTGGCA 600 GATCTCAATG GTAAAGCCGG TGAAATGCTG GGCGAAGTCC GTCTAGTCAA 650 ATCGTCTACC GCAGAAAACT TAGAACGAAC AGCCGGCGAT AAACGGATGT 700 ATCGCCTTTA TCGCATCGGG TTAAAAGAAG CGATCTATGA TTCAATTGCC 750 GGACCTGTAA TGGGCATGGT CATGATGGCC ATGGTCCTGG AAATTCTGGG 800 CTATGGTGCG ATCCGGGTTC GGGAAGGTGC CATTGATATT GGGACCTTAT 850 TTTCATTTCT GATGTACCTG GTTCAAATGA TTAGTCCATT TGCGGTTCTC 900 GGCCAATTCA TGTCTGATGT TGCCAAGGCA AGTGGCTCAA CCACTCGAAT 950 CCAGGCATTA TTGCAAACTC ATGAAGAAGA TCGTCTGACT GGAACGGATT 1000 TGGATATTGG CGATCAAACA CTTCAGATGA ACCACGTCAG TTTTTCTTAT 1050 GATCAGCATC ACCCCATTTT ATCCGGCGTG TCGTTTACGG CAGAACCCAA 1100 TTCGGTCATT GCCTTTGCCG GACCATCCGG CGGTGGCAAA TCAACCATTT 1150 TCAGCTTAAT TGAACGTTTT TATGAACCTA ACGAGGGCAG CATCACGATT 1200 GGCAATACCA ATATTACTGA TATTCAACTT GCCGATTGGC GCCAGCAAAT 1250 CGGCCTGGTC GGCCAAGACG CTGCGATCAT GTCTGGAACG ATTCGTTACA 1300 ATTTAACCTA TGGTTTGCCG GGGCATTTTT CCGATGAACA GCTTTGGCAT 1350 GTCTTGGAAA TGGCTTTACG CAACGAATTT GTCCAGAAGA TGCCTCGGGG 1400 CTTGGACACG GAAGTCGGTG AGCGTGGAGT CAAGGTATCG GGGGGCCAAC 1450 GCCAACGATT GGCGATTGCC CGGGCCTTCC TGCGTAATCC AAAAATATTA 1500 ATGTTGGATG AAGCAACGGC GAGCCTGGAT TCCGAGTCCG AAATGATGGT 1550 CCAAAAAGCG CTGGACCAGT TGATGGCCAA TCGAACAACA TTGGTGATCG 1600 CCCACAGGCT AAGCACAATT ACCAACGCCG ACGAAATTTA TTTCATAGAA 1650 AACGGCAGGG TAACGGGCCA GGGAACCCAC CAACAGTTAG TGAAAACGAC 1700 TCCTTTGTAT AGGGAGTATG TGAAAAATCA GAGCGCGACG AGCAACGGG 1749
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において得られたプラスミドの
制限酵素地図を示す図である。
制限酵素地図を示す図である。
【図２】本発明の実施例において得られたｐＲＨ４５の
BamHI-BamHI 断片のＤＮＡ配列を示す図である。
BamHI-BamHI 断片のＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】本発明の実施例において得られたｐＲＨ４５の
ＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列を示す図である。
ＯＲＦ５断片のＤＮＡ配列を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 北本 勝ひこ 東京都文京区弥生１−１−１ 東京大学大 学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻 内 (72)発明者 佐見 学 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社酒類開発研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 図２の核酸配列を有するプラスミド。
- 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドを利用するビ
ール中のホップ耐性乳酸菌の検出方法。 - 【請求項３】 図３の核酸配列を有するプラスミド。
- 【請求項４】 請求項３記載のプラスミドを利用するビ
ール中のホップ耐性乳酸菌の検出方法。
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|---|---|---|---|
| JP18662196A JP3163436B2 (ja) | 1996-06-27 | 1996-06-27 | 乳酸菌のホップ耐性ｄｎａおよびホップ耐性乳酸菌の検出方法 |
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|---|---|---|---|
| JP18662196A JP3163436B2 (ja) | 1996-06-27 | 1996-06-27 | 乳酸菌のホップ耐性ｄｎａおよびホップ耐性乳酸菌の検出方法 |
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| JP2000248358A Division JP3398897B2 (ja) | 2000-08-18 | 2000-08-18 | 乳酸菌のホップ耐性ｄｎａおよびホップ耐性乳酸菌の検出方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014584A true JPH1014584A (ja) | 1998-01-20 |
| JP3163436B2 JP3163436B2 (ja) | 2001-05-08 |
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-
1996
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5972617A (en) * | 1997-07-07 | 1999-10-26 | Asahi Breweries, Ltd. | Oligonucleotides and methods for determining beer spoilage ability of lactic acid bacteria |
| WO2002095028A1 (en) * | 2001-05-23 | 2002-11-28 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Polynucleotide probe and primer for detecting beer-clouding lactic acid bacteria and method of detecting beer-clouding lactic acid bacteria |
| EP1403370A4 (en) * | 2001-05-23 | 2005-05-11 | Kirin Brewery | POLYNUCLEOTIDE PROBE AND PRIMER FOR DETECTING BEARING LACTIC ACID BACTERIA, AND METHOD FOR DETECTING BEER TROUGHING LACTIC ACID BACTERIA |
Also Published As
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