JPH1014585A - 新規オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームｐ４５０ ２ｃ１９ 遺伝子のエクソン４中の点突然変異の検査方法 - Google Patents
新規オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームｐ４５０ ２ｃ１９ 遺伝子のエクソン４中の点突然変異の検査方法Info
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- JPH1014585A JPH1014585A JP8195360A JP19536096A JPH1014585A JP H1014585 A JPH1014585 A JP H1014585A JP 8195360 A JP8195360 A JP 8195360A JP 19536096 A JP19536096 A JP 19536096A JP H1014585 A JPH1014585 A JP H1014585A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 CYP2C19 のエクソン５中のｍ１とエクソン
４中のｍ２の検出を同一のＰＣＲ条件にて、非特異バン
ドの出現なしに行う手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１及び配列番号２でそ
れぞれ示される塩基配列を有する、ヒトチトクロームP4
50 2C19 遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検査
用オリゴヌクレオチドプライマーを提供した。
４中のｍ２の検出を同一のＰＣＲ条件にて、非特異バン
ドの出現なしに行う手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１及び配列番号２でそ
れぞれ示される塩基配列を有する、ヒトチトクロームP4
50 2C19 遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検査
用オリゴヌクレオチドプライマーを提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトチトクローム
P450 2C19 遺伝子（以下、「CYP2C19 」ということがあ
る）のエクソン４中の点突然変異の検査に用いられるオ
リゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチト
クロームP450 2C19 遺伝子のエクソン４中の突然変異の
検査方法に関する。
P450 2C19 遺伝子（以下、「CYP2C19 」ということがあ
る）のエクソン４中の点突然変異の検査に用いられるオ
リゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチト
クロームP450 2C19 遺伝子のエクソン４中の突然変異の
検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗痙攣剤である(S)-メフェニトインの代
謝能力には遺伝的多型が見られる。この遺伝的多型は
(S)-メフェニトインの代謝だけではなく、臨床的に重要
なジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾール及びプロ
プラノロール並びに選択的セロトニン再取込み阻害剤
（serotonin reuptake inhibitor) の酸化的代謝能力と
ともに遺伝的に分離するので、(S)-メフェニトインの代
謝異常を調べることは臨床的に重要である。
謝能力には遺伝的多型が見られる。この遺伝的多型は
(S)-メフェニトインの代謝だけではなく、臨床的に重要
なジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾール及びプロ
プラノロール並びに選択的セロトニン再取込み阻害剤
（serotonin reuptake inhibitor) の酸化的代謝能力と
ともに遺伝的に分離するので、(S)-メフェニトインの代
謝異常を調べることは臨床的に重要である。
【０００３】従来、(S)-メフェニトインの代謝異常は、
被検者に(S)-メフェニトインを経口投与し、８時間後に
排泄される尿中に含まれる4'- ヒドロキシメフェニトイ
ンを定量することにより行われていた。しかしながら、
この方法は時間がかかる上に被検者に無用の薬剤を投与
しなければならない。
被検者に(S)-メフェニトインを経口投与し、８時間後に
排泄される尿中に含まれる4'- ヒドロキシメフェニトイ
ンを定量することにより行われていた。しかしながら、
この方法は時間がかかる上に被検者に無用の薬剤を投与
しなければならない。
【０００４】(S)-メフェニトインの代謝異常の遺伝的な
原因は、少なくとも日本人については明らかになってい
る。すなわち、CYP2C19 のエクソン５中のＧがＡになる
点突然変異（部位は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６８１nt、
本明細書においてこの点突然変異を「ｍ１」という）
（Sonia M.F. de Morais et al., The Journal of Biol
ogical Chemistry Vol.269, No. 22, pp.15419-15422,
1994( 以下、この文献を「文献１」という））及びCYP2
C19 のエクソン４中のＧがＡになる点突然変異（部位
は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６３６nt、本明細書において
この点突然変異を「ｍ２」という）（Sonia M.F. de Mo
rais et al., Molecular Pharmaoclogy, 46:594-598,19
94( 以下、この文献を「文献２」という））の少なくと
もどちらかによって(S)-メフェニトインの代謝異常が起
きることがわかっている。従って、CYP2C19 のエクソン
５及び４中の上記ｍ１及びｍ２を調べることにより、
(S)-メフェニトインの代謝異常を検査することができ、
さらには、その遺伝子型を分類（ジェノタイピング）す
ることもできる。
原因は、少なくとも日本人については明らかになってい
る。すなわち、CYP2C19 のエクソン５中のＧがＡになる
点突然変異（部位は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６８１nt、
本明細書においてこの点突然変異を「ｍ１」という）
（Sonia M.F. de Morais et al., The Journal of Biol
ogical Chemistry Vol.269, No. 22, pp.15419-15422,
1994( 以下、この文献を「文献１」という））及びCYP2
C19 のエクソン４中のＧがＡになる点突然変異（部位
は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６３６nt、本明細書において
この点突然変異を「ｍ２」という）（Sonia M.F. de Mo
rais et al., Molecular Pharmaoclogy, 46:594-598,19
94( 以下、この文献を「文献２」という））の少なくと
もどちらかによって(S)-メフェニトインの代謝異常が起
きることがわかっている。従って、CYP2C19 のエクソン
５及び４中の上記ｍ１及びｍ２を調べることにより、
(S)-メフェニトインの代謝異常を検査することができ、
さらには、その遺伝子型を分類（ジェノタイピング）す
ることもできる。
【０００５】上記文献１及び２には、それぞれ、ＰＣＲ
−ＲＦＬＰ法によりｍ１及びｍ２を検出する方法が記載
されている。すなわち、エクソン５及びエクソン４のそ
れぞれについて各一対のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、増幅産物を制限酵素で消化して電気泳動で分離する
ことにより、突然変異の有無に応じて異なるサイズの断
片が検出される。
−ＲＦＬＰ法によりｍ１及びｍ２を検出する方法が記載
されている。すなわち、エクソン５及びエクソン４のそ
れぞれについて各一対のプライマーを用いてＰＣＲを行
い、増幅産物を制限酵素で消化して電気泳動で分離する
ことにより、突然変異の有無に応じて異なるサイズの断
片が検出される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】一般に、臨床検査セン
ター等で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体に
ついて限られた時間内に検査をする必要があるので、検
査を効率良く行うことが重要である。(S)-メフェニトイ
ンの代謝異常について遺伝子検査を行う場合、上記のよ
うにエクソン５中のｍ１及びエクソン４中のｍ２の両方
について検査を行う必要がある。もし、ｍ１及びｍ２の
検査を同一のＰＣＲ条件で行うことができれば、同じ装
置を用いて同時に両方の検査を行うことができるので非
常に効率が良い。本願発明者らは、上記文献１及び２に
記載されたプライマーを用い、ｍ１検出のためのＰＣＲ
とｍ２検出のためのＰＣＲを同一条件で行うべく鋭意研
究を行ったが、どうしてもｍ２の検出において非特異的
なバンドが多く現れてしまうという問題があった。多数
の検体を限られた時間内に処理する場合、非特異バンド
が多数あると誤診の原因になり、好ましくない。
ター等で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体に
ついて限られた時間内に検査をする必要があるので、検
査を効率良く行うことが重要である。(S)-メフェニトイ
ンの代謝異常について遺伝子検査を行う場合、上記のよ
うにエクソン５中のｍ１及びエクソン４中のｍ２の両方
について検査を行う必要がある。もし、ｍ１及びｍ２の
検査を同一のＰＣＲ条件で行うことができれば、同じ装
置を用いて同時に両方の検査を行うことができるので非
常に効率が良い。本願発明者らは、上記文献１及び２に
記載されたプライマーを用い、ｍ１検出のためのＰＣＲ
とｍ２検出のためのＰＣＲを同一条件で行うべく鋭意研
究を行ったが、どうしてもｍ２の検出において非特異的
なバンドが多く現れてしまうという問題があった。多数
の検体を限られた時間内に処理する場合、非特異バンド
が多数あると誤診の原因になり、好ましくない。
【０００７】従って、本発明の目的は、CYP2C19 のエク
ソン５中のｍ１とエクソン４中のｍ２の検出を同一のＰ
ＣＲ条件にて、非特異バンドの出現なしに行う手段を提
供することである。
ソン５中のｍ１とエクソン４中のｍ２の検出を同一のＰ
ＣＲ条件にて、非特異バンドの出現なしに行う手段を提
供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ｍ２の検出のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーとして文献２に記載のものとは異なるものを用い
ることにより、ｍ１の検出のためのＰＣＲとｍ２の検出
のためのＰＣＲを同一条件で行うことができることを見
出し、本発明を完成した。
究の結果、ｍ２の検出のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーとして文献２に記載のものとは異なるものを用い
ることにより、ｍ１の検出のためのＰＣＲとｍ２の検出
のためのＰＣＲを同一条件で行うことができることを見
出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
及び配列番号２でそれぞれ示される塩基配列を有する、
ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子のエクソン４中の点
突然変異ｍ２の検査用オリゴヌクレオチドプライマーを
提供する。さらに本発明は、上記本発明の２種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして用い、ヒ
トチトクロームP450 2C19 遺伝子を鋳型としてＰＣＲを
行う工程と、得られたＰＣＲ産物を制限断片長多型法に
より解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19
遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検査方法を提
供する。
及び配列番号２でそれぞれ示される塩基配列を有する、
ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子のエクソン４中の点
突然変異ｍ２の検査用オリゴヌクレオチドプライマーを
提供する。さらに本発明は、上記本発明の２種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして用い、ヒ
トチトクロームP450 2C19 遺伝子を鋳型としてＰＣＲを
行う工程と、得られたＰＣＲ産物を制限断片長多型法に
より解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19
遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検査方法を提
供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】上記のように、本発明のオリゴヌ
クレオチドプライマーは、CYP2C19 のエクソン４中の上
記点突然変異ｍ２を検出するためのものである。forwar
d 側プライマー（以下、「プライマーＦ」ということが
ある）は配列表の配列番号１で示される塩基配列を有
し、reverse 側プライマー（以下、「プライマーＲ」と
いうことがある）は、配列番号２で示される塩基配列を
有する。プライマーＦはCYP2C19のエクソン４中の６１
０〜６２９nt（ｃＤＮＡ基準）の領域とハイブリダイズ
するものであり、プライマーＲはCYP2C19 のイントロン
４中の６７〜８６nt（イントロン４の第１塩基を１ntと
して）の領域とハイブリダイズするものである。
クレオチドプライマーは、CYP2C19 のエクソン４中の上
記点突然変異ｍ２を検出するためのものである。forwar
d 側プライマー（以下、「プライマーＦ」ということが
ある）は配列表の配列番号１で示される塩基配列を有
し、reverse 側プライマー（以下、「プライマーＲ」と
いうことがある）は、配列番号２で示される塩基配列を
有する。プライマーＦはCYP2C19のエクソン４中の６１
０〜６２９nt（ｃＤＮＡ基準）の領域とハイブリダイズ
するものであり、プライマーＲはCYP2C19 のイントロン
４中の６７〜８６nt（イントロン４の第１塩基を１ntと
して）の領域とハイブリダイズするものである。
【００１１】本発明のプライマーＦ及びプライマーＲを
用いてＰＣＲを行う場合、アニーリングは５３〜６３℃
で１分間〜２分間、伸長は７２℃で１分間〜２分間行
う。変性条件は変性が行われればよいので特に限定され
ないが、通常、９４℃で１分間〜２分間行う。サイクル
数は特に限定されないが、２０〜４０サイクルが好まし
い。また、ＰＣＲバッファー中の塩化マグネシウムの濃
度は、1.0 ないし2.0 mMが好ましい。なお、ＰＣＲ法自
体はこの分野において周知であり、必要な試薬類のキッ
ト及び装置も市販されているので、これらを用いて容易
に行うことができる。
用いてＰＣＲを行う場合、アニーリングは５３〜６３℃
で１分間〜２分間、伸長は７２℃で１分間〜２分間行
う。変性条件は変性が行われればよいので特に限定され
ないが、通常、９４℃で１分間〜２分間行う。サイクル
数は特に限定されないが、２０〜４０サイクルが好まし
い。また、ＰＣＲバッファー中の塩化マグネシウムの濃
度は、1.0 ないし2.0 mMが好ましい。なお、ＰＣＲ法自
体はこの分野において周知であり、必要な試薬類のキッ
ト及び装置も市販されているので、これらを用いて容易
に行うことができる。
【００１２】本発明のプライマーを用いることにより、
CYP2C19 のエクソン５中のｍ１を検出するためのＰＣＲ
と同一の熱的条件でＰＣＲを行うことができるようにな
った。従って、ｍ１の検査のためのＰＣＲとｍ２の検査
のためのＰＣＲを同一の装置内で同時に行うことができ
るようになった。なお、ｍ１の検出のためのプライマー
は、文献１に記載されており、forward 側及びreverse
側のプライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号
３及び４に示す。本発明のプライマーを用いると、ｍ１
の検出のためのＰＣＲと熱的条件が同じだけではなく、
ＰＣＲバッファーも同じものを用いることができるの
で、検査の効率がさらに高くなる。なお、ｍ２の検査の
ためのＰＣＲをｍ１の検査のためのＰＣＲと同じ装置内
で同時に行う場合でも、別々のチューブに入れて反応を
行う。
CYP2C19 のエクソン５中のｍ１を検出するためのＰＣＲ
と同一の熱的条件でＰＣＲを行うことができるようにな
った。従って、ｍ１の検査のためのＰＣＲとｍ２の検査
のためのＰＣＲを同一の装置内で同時に行うことができ
るようになった。なお、ｍ１の検出のためのプライマー
は、文献１に記載されており、forward 側及びreverse
側のプライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号
３及び４に示す。本発明のプライマーを用いると、ｍ１
の検出のためのＰＣＲと熱的条件が同じだけではなく、
ＰＣＲバッファーも同じものを用いることができるの
で、検査の効率がさらに高くなる。なお、ｍ２の検査の
ためのＰＣＲをｍ１の検査のためのＰＣＲと同じ装置内
で同時に行う場合でも、別々のチューブに入れて反応を
行う。
【００１３】ＰＣＲ後、得られたＰＣＲ産物について制
限断片長多型解析（ＲＦＬＰ）を行う。ＲＦＬＰ自体は
周知の方法である。すなわち、ＰＣＲ産物を制限酵素で
消化することにより、点突然変異の有無に応じて長さの
異なる断片を生じるような制限酵素でＰＣＲ産物を消化
し、電気泳動で分離してバンドのサイズを測定する方法
である。本発明のプライマーＦ及びプライマーＲを用い
てＰＣＲを行いｍ２を検査する場合、制限酵素BamHI を
用いることができる。すなわち、BamHI でＰＣＲ産物を
消化すると、遺伝子にｍ２が存在する場合には、ゲル電
気泳動で分離すると１１９ｂｐのサイズのバンドが現
れ、野生型（以下、野生型のことを「ｗｔ」と記載する
ことがある）の場合には９３ｂｐのバンドが現れるの
で、検体遺伝子にｍ２が存在するか否かを検査すること
ができる。なお、相同染色体は１対ずつ存在するので、
ｗｔのホモ接合の場合には９３ｂｐのバンドのみが現
れ、ｍ２のホモ接合の場合には１１９ｂｐのバンドのみ
が現れ、ｗｔとｍ２のヘテロ接合の場合には両方のバン
ドが現れる。従って、本発明の方法により、遺伝子型を
も検査することができる。なお、ＲＦＬＰに用いること
ができる制限酵素はBamHIに限定されるものではなく、
ｍ２の存在の有無に応じて異なるサイズの断片を生じる
制限酵素であれば他のものも用いることができる。
限断片長多型解析（ＲＦＬＰ）を行う。ＲＦＬＰ自体は
周知の方法である。すなわち、ＰＣＲ産物を制限酵素で
消化することにより、点突然変異の有無に応じて長さの
異なる断片を生じるような制限酵素でＰＣＲ産物を消化
し、電気泳動で分離してバンドのサイズを測定する方法
である。本発明のプライマーＦ及びプライマーＲを用い
てＰＣＲを行いｍ２を検査する場合、制限酵素BamHI を
用いることができる。すなわち、BamHI でＰＣＲ産物を
消化すると、遺伝子にｍ２が存在する場合には、ゲル電
気泳動で分離すると１１９ｂｐのサイズのバンドが現
れ、野生型（以下、野生型のことを「ｗｔ」と記載する
ことがある）の場合には９３ｂｐのバンドが現れるの
で、検体遺伝子にｍ２が存在するか否かを検査すること
ができる。なお、相同染色体は１対ずつ存在するので、
ｗｔのホモ接合の場合には９３ｂｐのバンドのみが現
れ、ｍ２のホモ接合の場合には１１９ｂｐのバンドのみ
が現れ、ｗｔとｍ２のヘテロ接合の場合には両方のバン
ドが現れる。従って、本発明の方法により、遺伝子型を
も検査することができる。なお、ＲＦＬＰに用いること
ができる制限酵素はBamHIに限定されるものではなく、
ｍ２の存在の有無に応じて異なるサイズの断片を生じる
制限酵素であれば他のものも用いることができる。
【００１４】また、ｍ１の検査のためのＲＦＬＰは文献
１に記載されているようにSmaIを用いて行うこともでき
るし、下記実施例に記載したようにMspIを用いて行うこ
ともできる。なお、MspIを用いた場合には、ｗｔであれ
ば１２０ｂｐのバンドが現れ、ｍ１であれば１６９ｂｐ
のバンドが現れる。
１に記載されているようにSmaIを用いて行うこともでき
るし、下記実施例に記載したようにMspIを用いて行うこ
ともできる。なお、MspIを用いた場合には、ｗｔであれ
ば１２０ｂｐのバンドが現れ、ｍ１であれば１６９ｂｐ
のバンドが現れる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１６】(1) ジェノタイピング １８６人の日本人から静脈血を７ｍｌずつ採取し、市販
の抽出キットを用いて抹消リンパ球からＤＮＡを抽出し
た。本発明のプライマーＦ及びプライマーＲを用い得ら
れたゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。さ
らに、配列番号３及び４に示される塩基配列を有する、
文献１記載のプライマーを用いて別のチューブで、しか
し同じ装置内で同時にＰＣＲを行った。２００μＭのデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物（dATP,
dCTP, dGTP及びdTTP、宝酒造社製）、０．２μＭの各プ
ライマー、１．２５単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ
（Hoffmann-La Roche 社製）及び1.5 mM塩化マグネシウ
ムを含むＰＣＲバッファー（10 mM Tris-HCl, pH 8.3,
50 mM KCl, 0.01%ゼラチン）中で２００ｎｇの上記ゲノ
ミックＤＮＡを増幅した。増幅はPerkin Elmer社製のサ
ーモサイクラーを用いて行った。最初に９４℃で５分間
変性を行った後、９４℃、１分間の変性工程、５７℃、
１分間のアニーリング工程、７２℃、２分間の伸長工程
からなるサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で５
分間伸長を行った。次いで、ｍ１検査用のチューブには
２５単位のMspIを加え、ｍ２検査用のチューブには２５
単位のBamHI を加え、３７℃で１時間インキュベートし
て制限酵素開裂工程を行った。消化したＰＣＲ増幅産物
を３％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジ
ウムで染色した。
の抽出キットを用いて抹消リンパ球からＤＮＡを抽出し
た。本発明のプライマーＦ及びプライマーＲを用い得ら
れたゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。さ
らに、配列番号３及び４に示される塩基配列を有する、
文献１記載のプライマーを用いて別のチューブで、しか
し同じ装置内で同時にＰＣＲを行った。２００μＭのデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)混合物（dATP,
dCTP, dGTP及びdTTP、宝酒造社製）、０．２μＭの各プ
ライマー、１．２５単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ
（Hoffmann-La Roche 社製）及び1.5 mM塩化マグネシウ
ムを含むＰＣＲバッファー（10 mM Tris-HCl, pH 8.3,
50 mM KCl, 0.01%ゼラチン）中で２００ｎｇの上記ゲノ
ミックＤＮＡを増幅した。増幅はPerkin Elmer社製のサ
ーモサイクラーを用いて行った。最初に９４℃で５分間
変性を行った後、９４℃、１分間の変性工程、５７℃、
１分間のアニーリング工程、７２℃、２分間の伸長工程
からなるサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で５
分間伸長を行った。次いで、ｍ１検査用のチューブには
２５単位のMspIを加え、ｍ２検査用のチューブには２５
単位のBamHI を加え、３７℃で１時間インキュベートし
て制限酵素開裂工程を行った。消化したＰＣＲ増幅産物
を３％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジ
ウムで染色した。
【００１７】典型的な結果を図１に示す。予想された通
り、MspI消化物では、１６９ｂｐのバンド又は１２０ｂ
ｐのバンドが観察され、ヘテロ接合のものでは両方のバ
ンドが観察された。また、BamHI 消化物では、予想どお
り、１１９ｂｐ又は９３ｂｐのバンドが観察され、ヘテ
ロ接合のものでは両方のバンドが観察された。また、非
特異バンドは観察されなかった。
り、MspI消化物では、１６９ｂｐのバンド又は１２０ｂ
ｐのバンドが観察され、ヘテロ接合のものでは両方のバ
ンドが観察された。また、BamHI 消化物では、予想どお
り、１１９ｂｐ又は９３ｂｐのバンドが観察され、ヘテ
ロ接合のものでは両方のバンドが観察された。また、非
特異バンドは観察されなかった。
【００１８】上記方法により得られた、ジェノタイピン
グの結果を下記表１に示す。
グの結果を下記表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】(2) 遺伝子型と表現型との関係 上記１８６人中、４６人についてその表現型を調べた。
表現型は、各人に１００ｍｇのラセミ型メフェニトイン
を経口投与した８時間後に排泄された尿中の4'- ヒドロ
キシメフェニトインを定量することにより調べた。この
試験により、(S)-メフェニトインの４’位を水酸化する
能力がわかる。投与量に対する排泄された4'- ヒドロキ
シメフェニトインのモル基準での割合（％）の常用対数
が０．３未満の者を代謝異常者（poor metabolizers 、
PM) 、それ以外の者を正常者(extensive metabolizers,
EM)とした。
表現型は、各人に１００ｍｇのラセミ型メフェニトイン
を経口投与した８時間後に排泄された尿中の4'- ヒドロ
キシメフェニトインを定量することにより調べた。この
試験により、(S)-メフェニトインの４’位を水酸化する
能力がわかる。投与量に対する排泄された4'- ヒドロキ
シメフェニトインのモル基準での割合（％）の常用対数
が０．３未満の者を代謝異常者（poor metabolizers 、
PM) 、それ以外の者を正常者(extensive metabolizers,
EM)とした。
【００２１】測定された表現型と、先に検査した遺伝子
型との関係を図２に示す。図２から明らかなように、代
謝異常者にはｗｔを有しているものがおらず、一方、正
常者は必ず少なくとも一方の遺伝子がｗｔである。従っ
て、本発明の方法により、表現型を調べることなく(S)-
メフェニトインの代謝異常の診断を行うことができるこ
とが確認された。
型との関係を図２に示す。図２から明らかなように、代
謝異常者にはｗｔを有しているものがおらず、一方、正
常者は必ず少なくとも一方の遺伝子がｗｔである。従っ
て、本発明の方法により、表現型を調べることなく(S)-
メフェニトインの代謝異常の診断を行うことができるこ
とが確認された。
【００２２】比較例１、２ 文献２に記載された公知のｍ２検出用プライマー（forw
ard 側及びreverse 側のプライマーの塩基配列をそれぞ
れ配列番号５及び６に示す）を用い、文献１に記載のｍ
１検出用のＰＣＲ条件（変性が９４℃、１分、アニーリ
ングが５７℃、３０秒、伸長が７２℃、１分のサイクル
を３０回）でＰＣＲを行った。比較例１ではバッファー
中の塩化マグネシウム濃度を文献１に記載の１．０ｍＭ
とし、比較例２では文献２に記載の３．０ｍＭとした。
その結果、比較例１では増幅は起きず、比較例２では増
幅は起き、予想どおりのサイズのバンドが観察されるも
のの、非特異バンドも多数現れた。
ard 側及びreverse 側のプライマーの塩基配列をそれぞ
れ配列番号５及び６に示す）を用い、文献１に記載のｍ
１検出用のＰＣＲ条件（変性が９４℃、１分、アニーリ
ングが５７℃、３０秒、伸長が７２℃、１分のサイクル
を３０回）でＰＣＲを行った。比較例１ではバッファー
中の塩化マグネシウム濃度を文献１に記載の１．０ｍＭ
とし、比較例２では文献２に記載の３．０ｍＭとした。
その結果、比較例１では増幅は起きず、比較例２では増
幅は起き、予想どおりのサイズのバンドが観察されるも
のの、非特異バンドも多数現れた。
【００２３】比較例３ 配列表の配列番号５及び６で示される、文献２に記載さ
れたプライマーを用い、上記本発明の実施例と同じＰＣ
Ｒ条件でＰＣＲを行った。その結果、増幅は起き、予想
どおりのサイズのバンドが観察されるものの、非特異バ
ンドも多数現れた。
れたプライマーを用い、上記本発明の実施例と同じＰＣ
Ｒ条件でＰＣＲを行った。その結果、増幅は起き、予想
どおりのサイズのバンドが観察されるものの、非特異バ
ンドも多数現れた。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、ｍ１とｍ２の検査のため
のＰＣＲを同一条件で行うことを可能にする、ｍ２検出
用オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたｍ２
の遺伝子検査法が初めて提供された。本発明によれば、
ｍ１とｍ２の検査を同じＰＣＲ装置を用いて同時に行う
ことが可能であるので、検査の効率が大幅に向上すると
いう効果が奏される。
のＰＣＲを同一条件で行うことを可能にする、ｍ２検出
用オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたｍ２
の遺伝子検査法が初めて提供された。本発明によれば、
ｍ１とｍ２の検査を同じＰＣＲ装置を用いて同時に行う
ことが可能であるので、検査の効率が大幅に向上すると
いう効果が奏される。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AACATCAGGA TTGTAAGCAC 20
【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 TCAGGGCTTG GTCAATATAG 20
【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AATTACAACC AGAGCTTGGC 20
【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 TATCACTTTC CATAAAAGCA AG 22
【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 配列 TATTATTATC TGTTAACTAA TATGA 25
【００３０】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 ACTTCAGGGC TTGGTCAATA 20
【図１】本発明の方法によりジェノタイピングを行った
結果を示す電気泳動図の模式図である。
結果を示す電気泳動図の模式図である。
【図２】本発明の方法により決定されたジェノタイプと
表現型との関係を示す図である。
表現型との関係を示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有する、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子のエクソ
ン４中の点突然変異ｍ２の検査用オリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
を有する、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子のエクソ
ン４中の点突然変異ｍ２の検査用オリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項３】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーと、請求項２記載のオリゴヌクレオチドプライマ
ーをプライマーとして用い、ヒトチトクロームP450 2C1
9 遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、得られたＰ
ＣＲ産物を制限断片長多型法により解析する工程を含
む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子のエクソン４中
の点突然変異ｍ２の検査方法。 - 【請求項４】 制限酵素としてBamHI を用いる請求項３
記載の方法。 - 【請求項５】 前記ＰＣＲは、配列表の配列番号３及び
４にそれぞれ示される塩基配列を有する一対のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いてヒトチトクロームP450 2
C19 遺伝子を鋳型として行うヒトチトクロームP450 2C1
9 遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１の検査のため
のＰＣＲと同一の熱的条件で同時に行う請求項３又は４
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記両ＰＣＲは同一組成のＰＣＲ緩衝液
を用いて行う請求項５記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8195360A JPH1014585A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 新規オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームｐ４５０ ２ｃ１９ 遺伝子のエクソン４中の点突然変異の検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8195360A JPH1014585A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 新規オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームｐ４５０ ２ｃ１９ 遺伝子のエクソン４中の点突然変異の検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014585A true JPH1014585A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=16339888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8195360A Pending JPH1014585A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 新規オリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームｐ４５０ ２ｃ１９ 遺伝子のエクソン４中の点突然変異の検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1014585A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012757A1 (en) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | A method for measuring a patient's ability to metabolise certain drugs |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP8195360A patent/JPH1014585A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012757A1 (en) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | A method for measuring a patient's ability to metabolise certain drugs |
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