JPH10146190A - ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法 - Google Patents
ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法Info
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- JPH10146190A JPH10146190A JP8316906A JP31690696A JPH10146190A JP H10146190 A JPH10146190 A JP H10146190A JP 8316906 A JP8316906 A JP 8316906A JP 31690696 A JP31690696 A JP 31690696A JP H10146190 A JPH10146190 A JP H10146190A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】標的核酸と安定なハイブリッドを形成すること
が可能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子、及び該ヘア
ピン型核酸プローブ分子を使用して、該核酸プローブに
含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出する方
法を提供する。 【解決手段】標的核酸の末端に相補的な部分を有する、
ヘアピン型構造の一本鎖ハイブリダイゼーション用プロ
ーブ分子にＲｅｃＡを接触させた後に、この複合体を標
的核酸と接触させて、ＲｅｃＡの機能により三本鎖の組
み換え中間体を形成させ、プローブと標的核酸とを連結
した後にプローブ上の標識により標的核酸を検出する。
が可能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子、及び該ヘア
ピン型核酸プローブ分子を使用して、該核酸プローブに
含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出する方
法を提供する。 【解決手段】標的核酸の末端に相補的な部分を有する、
ヘアピン型構造の一本鎖ハイブリダイゼーション用プロ
ーブ分子にＲｅｃＡを接触させた後に、この複合体を標
的核酸と接触させて、ＲｅｃＡの機能により三本鎖の組
み換え中間体を形成させ、プローブと標的核酸とを連結
した後にプローブ上の標識により標的核酸を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘアピン型構造の
核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した
核酸検出方法に関する。
核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した
核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】種々の核酸検出技術は、病気の診断、動
植物の品種や親子の鑑定、ＤＮＡのクローニング等に応
用されている。従来の核酸を検出する方法としては、サ
ザンハイブリダイゼーション等の、標識したプローブを
用いた検出方法がある。これらの方法に関して、これま
でに種々の改良がなされてきた。
植物の品種や親子の鑑定、ＤＮＡのクローニング等に応
用されている。従来の核酸を検出する方法としては、サ
ザンハイブリダイゼーション等の、標識したプローブを
用いた検出方法がある。これらの方法に関して、これま
でに種々の改良がなされてきた。
【０００３】その中の一つとしては、ＲｅｃＡタンパク
質を使った酵素反応により、標的二重鎖ＤＮＡと、オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いて組み換え中間体
を形成させることを特徴とする、標的ＤＮＡ検出方法が
ある（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-1511
7, 1988 ）。ハイブリダイゼーションにより形成された
中間体は、オリゴヌクレオチドプローブの標的ＤＮＡへ
の結合に関して、特に除タンパク質操作の後に不安定で
あるため、上記の引例においては、光架橋を行って安定
な組み換え中間体を形成させている。しかし、光架橋に
より標的ＤＮＡへのプローブの非特異的な結合が起きる
ことや、光架橋時の紫外線照射により標的ＤＮＡが損傷
を受けてしまうという不具合があった。
質を使った酵素反応により、標的二重鎖ＤＮＡと、オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いて組み換え中間体
を形成させることを特徴とする、標的ＤＮＡ検出方法が
ある（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-1511
7, 1988 ）。ハイブリダイゼーションにより形成された
中間体は、オリゴヌクレオチドプローブの標的ＤＮＡへ
の結合に関して、特に除タンパク質操作の後に不安定で
あるため、上記の引例においては、光架橋を行って安定
な組み換え中間体を形成させている。しかし、光架橋に
より標的ＤＮＡへのプローブの非特異的な結合が起きる
ことや、光架橋時の紫外線照射により標的ＤＮＡが損傷
を受けてしまうという不具合があった。
【０００４】一方、別の改良方法としては、南京錠型オ
リゴヌクレオチドをプローブとして、その両末端を、標
的ＤＮＡで隣り合った配列へハイブリダイゼーションさ
せ、ハイブリダイゼーション後に該プローブの両末端を
連結し、より安定なハイブリッドを形成させ、上記の別
法の不具合の一部を改善した方法がある（Nilsson eta
l., Science, 265, 2085, 1994）。しかしながらこの方
法では、標的核酸分子は一本鎖でなくてはならず、ゲノ
ムＤＮＡなどの二重鎖の解析ができないという難点があ
った。
リゴヌクレオチドをプローブとして、その両末端を、標
的ＤＮＡで隣り合った配列へハイブリダイゼーションさ
せ、ハイブリダイゼーション後に該プローブの両末端を
連結し、より安定なハイブリッドを形成させ、上記の別
法の不具合の一部を改善した方法がある（Nilsson eta
l., Science, 265, 2085, 1994）。しかしながらこの方
法では、標的核酸分子は一本鎖でなくてはならず、ゲノ
ムＤＮＡなどの二重鎖の解析ができないという難点があ
った。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記した従来の改良方
法では、標的核酸分子への損傷により、後の解析時の障
害となったり、一本鎖のみしか検出できないといった、
難点または不具合があった。本発明の目的は、下記のハ
イブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該核酸
プローブ分子を利用した核酸検出方法を提供することに
ある： １）標的核酸の二重鎖のままでの検出を可能にする方
法； ２）標的核酸と安定なハイブリッドを形成することが可
能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子； ３）標的核酸に損傷を与えずに、上記のヘアピン型核酸
プローブ分子を標的核酸にハイブリダイズさせて、形成
されたハイブリッドを検出することにより、該核酸プロ
ーブに含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出
する方法。
法では、標的核酸分子への損傷により、後の解析時の障
害となったり、一本鎖のみしか検出できないといった、
難点または不具合があった。本発明の目的は、下記のハ
イブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該核酸
プローブ分子を利用した核酸検出方法を提供することに
ある： １）標的核酸の二重鎖のままでの検出を可能にする方
法； ２）標的核酸と安定なハイブリッドを形成することが可
能な、ヘアピン型の核酸プローブ分子； ３）標的核酸に損傷を与えずに、上記のヘアピン型核酸
プローブ分子を標的核酸にハイブリダイズさせて、形成
されたハイブリッドを検出することにより、該核酸プロ
ーブに含まれる配列と相補的な配列を有する核酸を検出
する方法。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決し、目
的を達成するために、本発明のヘアピン型構造の核酸プ
ローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検
出方法は、以下のごとく構成されている。 （１）本発明の核酸プローブ分子は、自己相補的なステ
ム・ループ構造を有する第一のヌクレオチド部分と、該
第一のヌクレオチド部分の一端から延出した一本鎖構造
を有する第二のヌクレオチド部分とを具備したヘアピン
型構造の核酸プローブ分子であって、前記第二のヌクレ
オチド部分は検出すべき所望のヌクレオチド配列に対し
て相補的である、ハイブリダイゼーション用核酸プロー
ブ分子である。
的を達成するために、本発明のヘアピン型構造の核酸プ
ローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検
出方法は、以下のごとく構成されている。 （１）本発明の核酸プローブ分子は、自己相補的なステ
ム・ループ構造を有する第一のヌクレオチド部分と、該
第一のヌクレオチド部分の一端から延出した一本鎖構造
を有する第二のヌクレオチド部分とを具備したヘアピン
型構造の核酸プローブ分子であって、前記第二のヌクレ
オチド部分は検出すべき所望のヌクレオチド配列に対し
て相補的である、ハイブリダイゼーション用核酸プロー
ブ分子である。
【０００７】なお、上記の第二のヌクレオチド部分は、
少なくとも１５塩基のヌクレオチドであることが好まし
く、また第一のヌクレオチド部分の長さは、少なくとも
１３塩基のヌクレオチドであることが好ましい。前記の
核酸プローブは更に標識を付していることが好ましい。 （２）本発明の、上記核酸プローブを利用した核酸検出
方法は、標識した核酸プローブを標的核酸分子とハイブ
リダイズさせることにより、該プローブに含まれる配列
に対して相補的な所望の配列を有する標的核酸分子を検
出する方法であって、標識を付した上記の核酸プローブ
分子にＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブ・Ｒ
ｅｃＡ複合体を形成させる第一ステップと、標的核酸を
該複合体に接触させて、該プローブと該標的核酸分子と
の間の一部、又は全ての相補的塩基間でハイブリッドを
形成させる第二ステップと、ハイブリッドを形成してい
る該標的核酸鎖の末端と、該プローブの第一ヌクレオチ
ド部分の末端との間でリガーゼを作用させることによ
り、該プローブと該標的核酸分子とを連結させる第三ス
テップと、該ハイブリッドからタンパク質を除去する第
四ステップと、ハイブリッドを形成しなかった未反応プ
ローブを、該ハイブリッドから分離する第五ステップと
を具備し、該ハイブリッドに含まれる核酸プローブ中の
標識を検出することにより、該プローブと相補的な配列
を有する核酸を検出する方法である。
少なくとも１５塩基のヌクレオチドであることが好まし
く、また第一のヌクレオチド部分の長さは、少なくとも
１３塩基のヌクレオチドであることが好ましい。前記の
核酸プローブは更に標識を付していることが好ましい。 （２）本発明の、上記核酸プローブを利用した核酸検出
方法は、標識した核酸プローブを標的核酸分子とハイブ
リダイズさせることにより、該プローブに含まれる配列
に対して相補的な所望の配列を有する標的核酸分子を検
出する方法であって、標識を付した上記の核酸プローブ
分子にＲｅｃＡタンパク質分子を加えて、プローブ・Ｒ
ｅｃＡ複合体を形成させる第一ステップと、標的核酸を
該複合体に接触させて、該プローブと該標的核酸分子と
の間の一部、又は全ての相補的塩基間でハイブリッドを
形成させる第二ステップと、ハイブリッドを形成してい
る該標的核酸鎖の末端と、該プローブの第一ヌクレオチ
ド部分の末端との間でリガーゼを作用させることによ
り、該プローブと該標的核酸分子とを連結させる第三ス
テップと、該ハイブリッドからタンパク質を除去する第
四ステップと、ハイブリッドを形成しなかった未反応プ
ローブを、該ハイブリッドから分離する第五ステップと
を具備し、該ハイブリッドに含まれる核酸プローブ中の
標識を検出することにより、該プローブと相補的な配列
を有する核酸を検出する方法である。
【０００８】なお、前記の標的核酸分子は二重鎖ＤＮＡ
であることが好ましく、更に上記のリガーゼはNAD 要求
性リガーゼであることが好ましい。また上記のリガーゼ
を使った反応は、３７〜７５℃の溶液中で行うことが好
ましい。
であることが好ましく、更に上記のリガーゼはNAD 要求
性リガーゼであることが好ましい。また上記のリガーゼ
を使った反応は、３７〜７５℃の溶液中で行うことが好
ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下において本願発明の実施の形
態を示すが、これはあくまで本願発明を例示するにとど
まり、本願発明を限定するものではないことは、当業者
には自明である。
態を示すが、これはあくまで本願発明を例示するにとど
まり、本願発明を限定するものではないことは、当業者
には自明である。
【００１０】図１は本発明に係るヘアピン型ＤＮＡプロ
ーブ分子を利用して、二重鎖ＤＮＡの検出を行う方法を
示す概略図である。本発明の技術的思想を最もよく表す
ヘアピン型ＤＮＡプローブ分子、及び該ＤＮＡプローブ
分子を利用した標的二重鎖ＤＮＡ分子の検出方法につい
て、図１を参照して順次説明する。 〈ヘアピン型核酸プローブ分子〉図１において１１は、
標的ＤＮＡ分子１６の末端の配列を認識して検出するた
めの、ヘアピン型ＤＮＡプローブ分子である。該プロー
ブ１１はその５’末端に、当該技術分野で広く知られた
方法において、３２P により標識１２を入れたものであ
る。該プローブ１１の５’側には、標的ＤＮＡ１６の末
端の配列に相補的な部分があり（標識１２からステム・
ループ構造部分１３までの間）、その３’側には自己相
補的でステム・ループ構造をとる配列１３がある。標的
ＤＮＡ１６の末端配列に相補的な部分は、鎖交換反応
時、及びそれに続くライゲーション反応時にプローブと
標的ＤＮＡとの間の安定な中間体形成を可能にする長さ
を有し、この長さは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ
であることが好ましい。しかし該中間体を、該鎖交換反
応時、及びライゲーション反応時に安定に存在させるた
めに必要なプローブの長さは、ＧＣ含有量といった、標
的ＤＮＡの配列の特徴、並びに反応温度及び反応液中の
塩濃度などの反応条件により影響されるものであるが、
このことは当業者らには自明であり、当業者らは、標的
ＤＮＡの末端配列の特徴、及び反応条件に応じてプロー
ブの長さを調節するであろうことは自明である。よって
該プローブの、標的ＤＮＡの末端配列に相補的な部分
は、鎖交換反応時に安定な組み換え中間体を形成し、ラ
イゲーション反応時にも該中間体が安定であることを保
証するものであることを具備している。
ーブ分子を利用して、二重鎖ＤＮＡの検出を行う方法を
示す概略図である。本発明の技術的思想を最もよく表す
ヘアピン型ＤＮＡプローブ分子、及び該ＤＮＡプローブ
分子を利用した標的二重鎖ＤＮＡ分子の検出方法につい
て、図１を参照して順次説明する。 〈ヘアピン型核酸プローブ分子〉図１において１１は、
標的ＤＮＡ分子１６の末端の配列を認識して検出するた
めの、ヘアピン型ＤＮＡプローブ分子である。該プロー
ブ１１はその５’末端に、当該技術分野で広く知られた
方法において、３２P により標識１２を入れたものであ
る。該プローブ１１の５’側には、標的ＤＮＡ１６の末
端の配列に相補的な部分があり（標識１２からステム・
ループ構造部分１３までの間）、その３’側には自己相
補的でステム・ループ構造をとる配列１３がある。標的
ＤＮＡ１６の末端配列に相補的な部分は、鎖交換反応
時、及びそれに続くライゲーション反応時にプローブと
標的ＤＮＡとの間の安定な中間体形成を可能にする長さ
を有し、この長さは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ
であることが好ましい。しかし該中間体を、該鎖交換反
応時、及びライゲーション反応時に安定に存在させるた
めに必要なプローブの長さは、ＧＣ含有量といった、標
的ＤＮＡの配列の特徴、並びに反応温度及び反応液中の
塩濃度などの反応条件により影響されるものであるが、
このことは当業者らには自明であり、当業者らは、標的
ＤＮＡの末端配列の特徴、及び反応条件に応じてプロー
ブの長さを調節するであろうことは自明である。よって
該プローブの、標的ＤＮＡの末端配列に相補的な部分
は、鎖交換反応時に安定な組み換え中間体を形成し、ラ
イゲーション反応時にも該中間体が安定であることを保
証するものであることを具備している。
【００１１】次にヘアピン型ＤＮＡプローブ１１のステ
ム・ループ構造１３は、一本鎖の当該プローブを安定化
して、更に標的ＤＮＡのうちのハイブリダイズする側の
鎖の５’末端へ、該プローブの３’末端を近付けるため
に、このようなステム・ループ構造をとっている。該ス
テム・ループのステム部分は１２〜３０ヌクレオチド
で、ループ部分は、１〜１０ヌクレオチドで、全体では
１３〜４０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。
そして該プローブは、標的ＤＮＡと組み換え中間体を形
成したときに、そのステム・ループ構造の３’末端のヌ
クレオチドが、標的二重鎖ＤＮＡのうちの該プローブと
ハイブリダイズしている方の鎖の５’末端のヌクレオチ
ドに隣接し、その間にギャップが生じないように構成さ
れている。また、このステム・ループ構造１３の長さ
は、該プローブ分子１１と標的分子１６との間のハイブ
リッド形成条件下で、自己相補的塩基間で結合すること
を保証する長さであることが好ましい。 〈ヘアピン型ＤＮＡプローブを利用した二重鎖ＤＮＡの
検出方法〉図１においてまず、ヘアピン型ＤＮＡプロー
ブ１１とＲｅｃＡタンパク質１４とを接触させて、Ｒｅ
ｃＡ・プローブ複合体１５を形成させる。ＲｅｃＡは大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＤＮＡの相同組み換えに
関与している酵素タンパク質であり、ＡＴＰの存在下で
一本鎖ポリヌクレオチドと結合することによりその酵素
活性が活性化される。ＲｅｃＡは更に、ＡＴＰアーゼ活
性を有し、二重鎖ＤＮＡを部分的に巻き戻して、これと
部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡを結合させることによ
り、ＤＮＡの組み換えを行う酵素である。次に、この中
間体１５に標的ＤＮＡ１６を接触させる。このときに、
ＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳ（アデノシン5 ’- Ｏ-
（３- チオ三リン酸））などのＡＴＰ類縁体を使用する
と、鎖交換反応においてプローブ・標的ＤＮＡ中間体１
７が形成されたところで反応が停止する。もしＡＴＰ類
縁体の代わりにＡＴＰを使用すると、溶液中のＲｅｃＡ
のＡＴＰアーゼ活性により反応液中のＡＤＰ濃度が上昇
する。このＡＤＰ濃度の上昇は、ＲｅｃＡ・プローブ・
標的核酸の反応中間体１７からのＲｅｃＡの解離を引き
起こしてしまい、ハイブリッド核酸が解消してしまうお
それがある。この反応中間体１７に対してリガーゼ１８
を効かせることにより、該プローブの３’末端と、標的
二重鎖ＤＮＡのうち該プローブとハイブリダイズしてい
る側の鎖の５’末端との間の連結を行う。上記のとお
り、この反応系にはＡＴＰを用いることが好ましくない
ので、ここで使用するリガーゼはＮＡＤをエネルギーと
して要求するタイプのものであることが好ましい。ＮＡ
Ｄ要求性リガーゼとしては、例えば高熱細菌から抽出さ
れる耐熱性リガーゼがある。ライゲーション反応の温度
は、３７〜７５℃であることが好ましいが、この温度範
囲は、プローブと標的核酸末端との間の安定なハイブリ
ッド形成、及び効率のよい連結反応を保証するためのも
のである。反応温度が３７℃未満の場合は、リガーゼの
反応速度が低下し、一方、７５℃を越える場合には、プ
ローブと標的核酸との間でアニーリングが起きにくくな
り、ともにハイブリッド形成を阻害すると考えられるた
めである。ライゲーション反応終了後に除タンパクを行
い、次いでハイブリダイズしなかったプローブと、ハイ
ブリッドとを分離する。以上の工程により、標的ＤＮＡ
の末端部分に、標識の入ったプローブを安定に連結し
て、この標識を検出することにより該標的ＤＮＡを検出
することが可能となる。 〈変形例〉上記の実施形態に示されたヘアピン型一本鎖
ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該プ
ローブ分子を利用した標的核酸分子検出方法は下記の変
形例を含んでいる： ・当該技術分野で広く知られる方法により、５’末端以
外を標識したヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション
用核酸プローブ分子、及び該プローブ分子を利用した標
的核酸分子検出方法； ・分子の５’側にステム・ループ構造を有し、その３’
側に、標的核酸の末端配列と相補的な配列を有するヘア
ピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分
子、及び該プローブ分子を利用した標的核酸分子検出方
法； ・一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを標的核酸分子とする、ヘア
ピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分
子を利用した該標的核酸検出方法。
ム・ループ構造１３は、一本鎖の当該プローブを安定化
して、更に標的ＤＮＡのうちのハイブリダイズする側の
鎖の５’末端へ、該プローブの３’末端を近付けるため
に、このようなステム・ループ構造をとっている。該ス
テム・ループのステム部分は１２〜３０ヌクレオチド
で、ループ部分は、１〜１０ヌクレオチドで、全体では
１３〜４０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。
そして該プローブは、標的ＤＮＡと組み換え中間体を形
成したときに、そのステム・ループ構造の３’末端のヌ
クレオチドが、標的二重鎖ＤＮＡのうちの該プローブと
ハイブリダイズしている方の鎖の５’末端のヌクレオチ
ドに隣接し、その間にギャップが生じないように構成さ
れている。また、このステム・ループ構造１３の長さ
は、該プローブ分子１１と標的分子１６との間のハイブ
リッド形成条件下で、自己相補的塩基間で結合すること
を保証する長さであることが好ましい。 〈ヘアピン型ＤＮＡプローブを利用した二重鎖ＤＮＡの
検出方法〉図１においてまず、ヘアピン型ＤＮＡプロー
ブ１１とＲｅｃＡタンパク質１４とを接触させて、Ｒｅ
ｃＡ・プローブ複合体１５を形成させる。ＲｅｃＡは大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＤＮＡの相同組み換えに
関与している酵素タンパク質であり、ＡＴＰの存在下で
一本鎖ポリヌクレオチドと結合することによりその酵素
活性が活性化される。ＲｅｃＡは更に、ＡＴＰアーゼ活
性を有し、二重鎖ＤＮＡを部分的に巻き戻して、これと
部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡを結合させることによ
り、ＤＮＡの組み換えを行う酵素である。次に、この中
間体１５に標的ＤＮＡ１６を接触させる。このときに、
ＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳ（アデノシン5 ’- Ｏ-
（３- チオ三リン酸））などのＡＴＰ類縁体を使用する
と、鎖交換反応においてプローブ・標的ＤＮＡ中間体１
７が形成されたところで反応が停止する。もしＡＴＰ類
縁体の代わりにＡＴＰを使用すると、溶液中のＲｅｃＡ
のＡＴＰアーゼ活性により反応液中のＡＤＰ濃度が上昇
する。このＡＤＰ濃度の上昇は、ＲｅｃＡ・プローブ・
標的核酸の反応中間体１７からのＲｅｃＡの解離を引き
起こしてしまい、ハイブリッド核酸が解消してしまうお
それがある。この反応中間体１７に対してリガーゼ１８
を効かせることにより、該プローブの３’末端と、標的
二重鎖ＤＮＡのうち該プローブとハイブリダイズしてい
る側の鎖の５’末端との間の連結を行う。上記のとお
り、この反応系にはＡＴＰを用いることが好ましくない
ので、ここで使用するリガーゼはＮＡＤをエネルギーと
して要求するタイプのものであることが好ましい。ＮＡ
Ｄ要求性リガーゼとしては、例えば高熱細菌から抽出さ
れる耐熱性リガーゼがある。ライゲーション反応の温度
は、３７〜７５℃であることが好ましいが、この温度範
囲は、プローブと標的核酸末端との間の安定なハイブリ
ッド形成、及び効率のよい連結反応を保証するためのも
のである。反応温度が３７℃未満の場合は、リガーゼの
反応速度が低下し、一方、７５℃を越える場合には、プ
ローブと標的核酸との間でアニーリングが起きにくくな
り、ともにハイブリッド形成を阻害すると考えられるた
めである。ライゲーション反応終了後に除タンパクを行
い、次いでハイブリダイズしなかったプローブと、ハイ
ブリッドとを分離する。以上の工程により、標的ＤＮＡ
の末端部分に、標識の入ったプローブを安定に連結し
て、この標識を検出することにより該標的ＤＮＡを検出
することが可能となる。 〈変形例〉上記の実施形態に示されたヘアピン型一本鎖
ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分子、及び該プ
ローブ分子を利用した標的核酸分子検出方法は下記の変
形例を含んでいる： ・当該技術分野で広く知られる方法により、５’末端以
外を標識したヘアピン型一本鎖ハイブリダイゼーション
用核酸プローブ分子、及び該プローブ分子を利用した標
的核酸分子検出方法； ・分子の５’側にステム・ループ構造を有し、その３’
側に、標的核酸の末端配列と相補的な配列を有するヘア
ピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分
子、及び該プローブ分子を利用した標的核酸分子検出方
法； ・一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを標的核酸分子とする、ヘア
ピン型一本鎖ハイブリダイゼーション用核酸プローブ分
子を利用した該標的核酸検出方法。
【００１２】
実施例１：ヘアピン型ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとの
中間体形成における配列特異性の確認 〈実験材料及び実験方法〉３２P で５’末端を標識した
６３量体のヘアピン型ＤＮＡプローブ分子を利用した、
ScaIで切断した直鎖状プラスミドＤＮＡ、ｐＢｌｅｕｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ（−）の検出 配列番号１及び図２に示した６３量体のヘアピン型ＤＮ
Ａプローブ（ＴＲＩ−２０−６３）は、当該技術分野で
広く行なわれている化学合成方法により作成し、ＨＰＬ
Ｃにより精製したものを使用した。このプローブの5 ’
末端４０ヌクレオチド部分は、プラスミドＤＮＡ、p Bl
uescriptSK(-) をScaIで切断したときのその末端の配列
と相補的な配列からなる。ＲｅｃＡタンパク質は市販の
ものを使用した（Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
社製）。まず、以下の組成の反応液Ａ及び反応液Ｂを調
整した。 反応液Ａ： １０Ｘ緩衝液Ａ ０．５μｌ ４８ｍＭ ＡＴＰγＳ ０．５μｌ ヘアピン型プローブ（ＴＲＩ−２０−６３） ５ｎｇ ＲｅｃＡ ０．４８μｇ これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。 反応液Ｂ： １０Ｘ緩衝液Ｂ ０．５μｌ ４８ｍＭ ＡＴＰγＳ ０．５μｌ 標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ １００ｎｇ これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。なお、上記の
１０Ｘの緩衝液の詳細は次のとおりである。 １０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭ トリス・酢酸塩（ｐＨ
７．２）／２５ｍＭ （ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ １０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭ トリス・酢酸塩（ｐＨ
７．２）／２２５ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ 標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ：制限酵素ＳｃａＩ、またはＥ
ｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手） 上記の反応液Ａ及び反応液Ｂを３７℃で１５分間反応さ
せた後に混合して、３７℃で３０分間反応させた。次
に、以下の組成のライゲ−ション反応液１０μlを加え
て、４５℃で一晩反応させた。 ライゲーション反応液 １０X アンプリガーゼ ＤＮＡ リガーゼ ＲＸＤ 緩衝液 （エピセンターテクノロジー社） ２μl アンプリゲース（エピセンターテクノロジー社） （100 ユニット/ μl ） ２０ユニット これに二回蒸留水を加えて１０μl とした。
中間体形成における配列特異性の確認 〈実験材料及び実験方法〉３２P で５’末端を標識した
６３量体のヘアピン型ＤＮＡプローブ分子を利用した、
ScaIで切断した直鎖状プラスミドＤＮＡ、ｐＢｌｅｕｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ（−）の検出 配列番号１及び図２に示した６３量体のヘアピン型ＤＮ
Ａプローブ（ＴＲＩ−２０−６３）は、当該技術分野で
広く行なわれている化学合成方法により作成し、ＨＰＬ
Ｃにより精製したものを使用した。このプローブの5 ’
末端４０ヌクレオチド部分は、プラスミドＤＮＡ、p Bl
uescriptSK(-) をScaIで切断したときのその末端の配列
と相補的な配列からなる。ＲｅｃＡタンパク質は市販の
ものを使用した（Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
社製）。まず、以下の組成の反応液Ａ及び反応液Ｂを調
整した。 反応液Ａ： １０Ｘ緩衝液Ａ ０．５μｌ ４８ｍＭ ＡＴＰγＳ ０．５μｌ ヘアピン型プローブ（ＴＲＩ−２０−６３） ５ｎｇ ＲｅｃＡ ０．４８μｇ これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。 反応液Ｂ： １０Ｘ緩衝液Ｂ ０．５μｌ ４８ｍＭ ＡＴＰγＳ ０．５μｌ 標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ １００ｎｇ これに二回蒸留水を加えて５μｌとした。なお、上記の
１０Ｘの緩衝液の詳細は次のとおりである。 １０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭ トリス・酢酸塩（ｐＨ
７．２）／２５ｍＭ （ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ １０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭ トリス・酢酸塩（ｐＨ
７．２）／２２５ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ 標的直鎖状二重鎖ＤＮＡ：制限酵素ＳｃａＩ、またはＥ
ｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手） 上記の反応液Ａ及び反応液Ｂを３７℃で１５分間反応さ
せた後に混合して、３７℃で３０分間反応させた。次
に、以下の組成のライゲ−ション反応液１０μlを加え
て、４５℃で一晩反応させた。 ライゲーション反応液 １０X アンプリガーゼ ＤＮＡ リガーゼ ＲＸＤ 緩衝液 （エピセンターテクノロジー社） ２μl アンプリゲース（エピセンターテクノロジー社） （100 ユニット/ μl ） ２０ユニット これに二回蒸留水を加えて１０μl とした。
【００１３】反応停止液（０．２２Ｍ ＥＤＴＡ／５．
６％ ＳＤＳ）を１．８μｌ加えて、反応を停止させ
た。次いで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテネースＫを
１μｌ加え、そのまま４５℃で１５分間反応させて、タ
ンパク質を分解させた。反応終了後にＢＰＢ色素液２μ
ｌを加え、０．８％アガロースゲル電気泳動に試料をか
けた。ゲルを臭化エチジウムで染色して写真を撮り、次
いでゲルドライヤーでゲルを乾燥させた。この乾燥させ
たゲルをオートラジオグラフィーにかけて（−８０℃、
一晩）、Ｘ線フィルムを現像した。臭化エチジウム染色
の泳動像と、オートラジオグラフィー像とを比較した。 〈結果〉図３は、上記の実施例に示された実験の結果を
まとめたものである。図３（Ａ）は、オートラジオグラ
フィーの結果を、図３（Ｂ）は、同じゲルの臭化エチジ
ウムの染色結果を示すものである。（Ａ）のゲルのレー
ン１〜３を比較して、レーン１に特異的に検出されてい
るバンド（レーン１）が、ＳｃａＩで切断した直鎖状の
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）にヘアピン型ＤＮＡ
プローブがハイブリダイズして検出されたものである。
レーン２にはレーン１と同じ長さで同じ量のＤＮＡがあ
るが（Ｂを参照）、標的ＤＮＡの末端配列がレーン１の
ものとは異なるために、ヘアピン型ＤＮＡプローブとハ
イブリダイズできず、よって標的ＤＮＡが検出されてい
ない。レーン１及び２において、同じ長さで同じ量のＤ
ＮＡが存在することは、（Ｂ）のゲルで示されている。
レーン３ではプローブが認識しないＤＮＡを使って行っ
た、ネガティブの対照実験である。
６％ ＳＤＳ）を１．８μｌ加えて、反応を停止させ
た。次いで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテネースＫを
１μｌ加え、そのまま４５℃で１５分間反応させて、タ
ンパク質を分解させた。反応終了後にＢＰＢ色素液２μ
ｌを加え、０．８％アガロースゲル電気泳動に試料をか
けた。ゲルを臭化エチジウムで染色して写真を撮り、次
いでゲルドライヤーでゲルを乾燥させた。この乾燥させ
たゲルをオートラジオグラフィーにかけて（−８０℃、
一晩）、Ｘ線フィルムを現像した。臭化エチジウム染色
の泳動像と、オートラジオグラフィー像とを比較した。 〈結果〉図３は、上記の実施例に示された実験の結果を
まとめたものである。図３（Ａ）は、オートラジオグラ
フィーの結果を、図３（Ｂ）は、同じゲルの臭化エチジ
ウムの染色結果を示すものである。（Ａ）のゲルのレー
ン１〜３を比較して、レーン１に特異的に検出されてい
るバンド（レーン１）が、ＳｃａＩで切断した直鎖状の
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）にヘアピン型ＤＮＡ
プローブがハイブリダイズして検出されたものである。
レーン２にはレーン１と同じ長さで同じ量のＤＮＡがあ
るが（Ｂを参照）、標的ＤＮＡの末端配列がレーン１の
ものとは異なるために、ヘアピン型ＤＮＡプローブとハ
イブリダイズできず、よって標的ＤＮＡが検出されてい
ない。レーン１及び２において、同じ長さで同じ量のＤ
ＮＡが存在することは、（Ｂ）のゲルで示されている。
レーン３ではプローブが認識しないＤＮＡを使って行っ
た、ネガティブの対照実験である。
【００１４】実施例２：ヘアピン型ＤＮＡプローブによ
る標的二重鎖ＤＮＡ検出における、ＲｅｃＡ及びリガー
ゼ依存性の確認 （実験材料及び実験方法）実験は、実施例１に記載のも
のと本質的に同様にして行った。鎖交換反応及びそれに
続くライゲーション反応の条件を以下の組み合わせによ
り行った。 組み合わせ ＲｅｃＡ リガーゼ １ − − ２ ＋ − ３ − ＋ ４ ＋ ＋ 〈実験結果〉図４に実施例２の結果を示した。（Ａ）の
ゲルはオートラジオグラフィーの結果を、（Ｂ）のゲル
は臭化エチジウム染色の結果を表している。レーン１〜
４を比較すると、ＲｅｃＡ及びリガーゼをともに作用さ
せた実験のみにおいて、ヘアピン型プローブと標的ＤＮ
Ａとがハイブリダイズして検出されている。この実験
は、ＲｅｃＡ及びリガーゼのどちらか一方でも欠く場合
には、プローブと標的ＤＮＡとの安定なハイブリッドは
形成されないため、ハイブリッドが検出されなかったこ
とを示している。（Ｂ）のゲルにおいては、レーン１〜
４において全て、同じ長さで同じ量のＤＮＡが各レーン
にあったことを示している。実施例１の結果と合わせる
と、標的核酸分子の末端配列に相補的な配列を有するヘ
アピン型プローブとＲｅｃＡとの組み合わせにより、安
定な組み換え中間体が形成されて検出されることが示さ
れた。
る標的二重鎖ＤＮＡ検出における、ＲｅｃＡ及びリガー
ゼ依存性の確認 （実験材料及び実験方法）実験は、実施例１に記載のも
のと本質的に同様にして行った。鎖交換反応及びそれに
続くライゲーション反応の条件を以下の組み合わせによ
り行った。 組み合わせ ＲｅｃＡ リガーゼ １ − − ２ ＋ − ３ − ＋ ４ ＋ ＋ 〈実験結果〉図４に実施例２の結果を示した。（Ａ）の
ゲルはオートラジオグラフィーの結果を、（Ｂ）のゲル
は臭化エチジウム染色の結果を表している。レーン１〜
４を比較すると、ＲｅｃＡ及びリガーゼをともに作用さ
せた実験のみにおいて、ヘアピン型プローブと標的ＤＮ
Ａとがハイブリダイズして検出されている。この実験
は、ＲｅｃＡ及びリガーゼのどちらか一方でも欠く場合
には、プローブと標的ＤＮＡとの安定なハイブリッドは
形成されないため、ハイブリッドが検出されなかったこ
とを示している。（Ｂ）のゲルにおいては、レーン１〜
４において全て、同じ長さで同じ量のＤＮＡが各レーン
にあったことを示している。実施例１の結果と合わせる
と、標的核酸分子の末端配列に相補的な配列を有するヘ
アピン型プローブとＲｅｃＡとの組み合わせにより、安
定な組み換え中間体が形成されて検出されることが示さ
れた。
【００１５】
【発明の効果】本発明に係るヘアピン型一本鎖ハイブリ
ダイゼーション用核酸プローブを用いて、本発明に係る
核酸検出方法を実施すると、以下のような効果が生ず
る： ・標的核酸を完全に変性することなく、プローブと標的
核酸とのハイブリダイゼーションを行うことができるの
で、二重鎖ゲノムのような長い核酸の検出を比較的簡単
な操作で行うことができ、更に、標的核酸自体の情報が
得られる； ・本発明の方法には、サザンハイブリッド法で使用され
るような固相支持体を要せず、チューブ内において行う
ことが可能であるため、一度に多数の試料を扱うこと
や、異なる種類のプローブを使って核酸についての異な
る情報を同時に得ることが、比較的短い時間に行える； ・反応に関する成分が全て反応溶液中に存在するため
に、プローブ濃度を上げて反応速度を上げることが可能
である； ・固相支持体を使わずに全ての反応を液中で行うため
に、バックグラウンドを低くすることが可能である； ・強い紫外線を標的核酸に照射する必要がないので、標
的核酸に障害を与えない。
ダイゼーション用核酸プローブを用いて、本発明に係る
核酸検出方法を実施すると、以下のような効果が生ず
る： ・標的核酸を完全に変性することなく、プローブと標的
核酸とのハイブリダイゼーションを行うことができるの
で、二重鎖ゲノムのような長い核酸の検出を比較的簡単
な操作で行うことができ、更に、標的核酸自体の情報が
得られる； ・本発明の方法には、サザンハイブリッド法で使用され
るような固相支持体を要せず、チューブ内において行う
ことが可能であるため、一度に多数の試料を扱うこと
や、異なる種類のプローブを使って核酸についての異な
る情報を同時に得ることが、比較的短い時間に行える； ・反応に関する成分が全て反応溶液中に存在するため
に、プローブ濃度を上げて反応速度を上げることが可能
である； ・固相支持体を使わずに全ての反応を液中で行うため
に、バックグラウンドを低くすることが可能である； ・強い紫外線を標的核酸に照射する必要がないので、標
的核酸に障害を与えない。
【００１６】よって本発明によれば、標的核酸と安定な
ハイブリッドを形成することが可能な、ヘアピン型の核
酸プローブ分子、並びに標的核酸に損傷を与えずに、上
記のヘアピン型核酸プローブ分子を標的核酸にハイブリ
ダイズさせて、形成されたハイブリッドを検出すること
により、該核酸プローブに含まれる配列と相補的な配列
を有する核酸を検出する方法が提供される。
ハイブリッドを形成することが可能な、ヘアピン型の核
酸プローブ分子、並びに標的核酸に損傷を与えずに、上
記のヘアピン型核酸プローブ分子を標的核酸にハイブリ
ダイズさせて、形成されたハイブリッドを検出すること
により、該核酸プローブに含まれる配列と相補的な配列
を有する核酸を検出する方法が提供される。
【００１７】
配列番号：１ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC ６０ CGC ６３
【図１】本発明のヘアピン型核酸プローブを用いた、核
酸検出方法の概略を示す図。
酸検出方法の概略を示す図。
【図２】本発明の実施例で使用したヘアピン型一本鎖Ｄ
ＮＡプローブの構造を示す図。
ＮＡプローブの構造を示す図。
【図３】本発明の方法により形成させた組み換え中間体
の検出を示す、オートラジオグラフィー、及びゲル電気
泳動後の臭化エチジウム染色像の写真。
の検出を示す、オートラジオグラフィー、及びゲル電気
泳動後の臭化エチジウム染色像の写真。
【図４】本発明の方法により形成する組み替え中間体の
検出が、ＲｅｃＡ及びリガーゼに依存することを示す、
オートラジオグラフィー、及びゲル電気泳動後の臭化エ
チジウム染色像の写真。
検出が、ＲｅｃＡ及びリガーゼに依存することを示す、
オートラジオグラフィー、及びゲル電気泳動後の臭化エ
チジウム染色像の写真。
１１・・・ヘアピン型一本鎖核酸プローブ １２・・・標識 １３・・・ステム・ループ構造 １４・・・ＲｅｃＡ １５・・・ＲｅｃＡ・プローブ複合体 １６・・・標的核酸 １７・・・組み換え中間体 １８・・・リガーゼ １９・・・プロテネースＫ
Claims (8)
- 【請求項１】 自己相補的なステム・ループ構造を有す
る第一のヌクレオチド部分と、該第一のヌクレオチド部
分の一端から延出した一本鎖構造を有する第二のヌクレ
オチド部分とを具備したヘアピン型構造の核酸プローブ
分子であって、前記第二のヌクレオチド部分は検出すべ
き所望のヌクレオチド配列に対して相補的である、ハイ
ブリダイゼーション用核酸プローブ分子。 - 【請求項２】 上記の第二のヌクレオチド部分が、少な
くとも１５塩基のヌクレオチドであることを特徴とす
る、請求項１に記載の核酸プローブ分子。 - 【請求項３】 上記の第一のヌクレオチド部分の長さ
が、少なくとも１３塩基のヌクレオチドであることを特
徴とする、請求項１又は２の何れか一項に記載の核酸プ
ローブ分子。 - 【請求項４】 前記の核酸プローブが更に標識を有して
いることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか一項に
記載の核酸プローブ。 - 【請求項５】 標識した核酸プローブを標的核酸分子と
ハイブリダイズさせることにより、該プローブに含まれ
る配列に対して相補的な所望の配列を有する標的核酸分
子を検出する方法であって、 請求項４に記載の核酸プローブ分子にＲｅｃＡタンパク
質分子を加えて、プローブ・ＲｅｃＡ複合体を形成させ
る第一ステップと、 標的核酸を該複合体に接触させて、該プローブと該標的
核酸分子との間の一部、又は全ての相補的塩基間でハイ
ブリッドを形成させる第二ステップと、 ハイブリッドを形成している該標的核酸鎖の末端と、該
プローブの第一ヌクレオチド部分の末端との間でリガー
ゼを作用させることにより、該プローブと該標的核酸分
子とを連結させる第三ステップと、 該ハイブリッドからタンパク質を除去する第四ステップ
と、 ハイブリッドを形成しなかった未反応プローブを、該ハ
イブリッドから分離する第五ステップとを具備し、 該ハイブリッドに含まれる核酸プローブ中の標識を検出
することにより、該プローブと相補的な配列を有する核
酸を検出する方法。 - 【請求項６】 上記の標的核酸分子が二重鎖ＤＮＡであ
ることを特徴とする、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 上記のリガーゼがNAD 要求性リガーゼで
あることを特徴とする、請求項５または６の何れか一項
に記載の方法。 - 【請求項８】 上記のリガーゼを使った反応を、３７〜
７５℃の溶液中で行うことを特徴とする、請求項７に記
載の方法。
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