JPH101497A - 新規な蛋白質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ウシ脳から、抗−ラットＧＡＰ１^mモノ
クローナル抗体に結合し、ＢＤＤＦに相同な領域を含む
新規な蛋白質（配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を
有する）、及びそれをコードするＤＮＡ（配列表配列番
号１に示す塩基配列を有する）を単離する。 【効果】 本発明のＤＮＡは、ゲノム解析ツールとして
利用することができる。本発明の蛋白質の生理活性等の
機能を解析することにより、医薬への応用が期待され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な蛋白質及び
それをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】散在反
復配列（interspersed repetitive nucleotide elemen
t）は、哺乳動物のゲノムに広く分布しており、転位因
子として遺伝子から遺伝子へ移動し得る。散在反復配列
には、ＳＩＮＥ（Short Interspersed DNA sequence El
ement）、ＬＩＮＥ（Long Interspersed DNA sequence
Element）があり、代表的なＳＩＮＥであるＡｌｕファ
ミリーは、ヒトゲノム当たりおよそ１０⁶コピー存在
し、ゲノムの約５％を構成している。近年、哺乳動物ゲ
ノムの広範な研究により、これらの転位因子は、イント
ロンの一部のような受動的因子として存在しているのみ
ならず、正常遺伝子（ＮＦ１）に挿入することによって
遺伝子失陥や発癌の直接的要因の１つとなることが示さ
れている。また、ｐ４０のように、ある種のトランスフ
ォームされた細胞株やガン患者において蛋白質の一部と
して発現される。さらに、完全なＡｌｕ因子が、細胞の
基本的生理作用を司る遺伝子のコード配列中に見い出さ
れている。ウシでは、Ａｌｕ様因子に加えて、ＢＤＤＦ
（bovine dimer-driven family）と呼ばれる３．１ｋｂ
の反復配列のファミリーが存在する。ＢＤＤＦの５’及
び３’末端は、ウシのＡｌｕ様配列に相同な配列に隣接
している。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ｒａｓ Ｇ
ＴＰａｓｅ活性化蛋白質であるラットＧＡＰ１^mに対す
るモノクローナル抗体を調製する過程で、ウシ脳抽出物
から、ＢＤＤＦに相同な領域を含む新規な蛋白質を単離
し、さらにこの蛋白質をコードする遺伝子を単離し、本
発明を完成するに到った。

【０００４】すなわち本発明は、配列表配列番号２に示
すアミノ酸配列を有する蛋白質である。本発明はさら
に、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列を提供する。このＤＮＡ配列として具体的には、配
列表配列番号１において塩基番号１２３〜１８９８で示
される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。

【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の蛋白質（以下、「ｐ９
７」と略すことがある）は、配列表配列番号２に示すア
ミノ酸配列を有する。ｐ９７は、例えば、以下に示すよ
うにウシ脳等の組織から精製することによって得られる
が、本発明によりｐ９７をコードするＤＮＡが得られた
ので、このＤＮＡを微生物等に導入して発現させること
によっても得ることができる。

【０００７】具体的には、ｐ９７は、ＧＡＰ１^mに結合
するモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより、ウシ脳Ｓ−１００画分から精製す
ることによって得られる。まず、ＧＡＰ１^mをコードす
るＤＮＡ（Maekawa, M. et al., Mol. Cell. Biol., 1
4, 6879-6885 (1994)参照）を大腸菌（E. coli）等の異
種蛋白質発現に適した宿主微生物に導入して発現させ、
ＧＡＰ１^mを得る。その際、菌体蛋白質からＧＡＰ１^mを
精製するのを容易にするために、グルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の蛋白質との融合蛋白質と
して発現させてもよい。その場合には、融合蛋白質はグ
ルタチオン−セファロースカラム（ファルマシア社製）
を用いることによって精製することができる。

【０００８】得られたＧＡＰ１^mで免疫したマウス等の
動物から脾細胞を抽出し、骨髄腫細胞と通常の方法（Ko
hler、Milstein、Nature,495-492(1975)参照）で細胞融
合させることによってハイブリドーマを作製する。この
ハイブリドーマの培養液を用いてウシ脳蛋白質のウェス
タンブロッティング解析を行い、９７ｋＤａの蛋白質を
認識するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択
する。

【０００９】得られたクローンを無血清培地で培養し、
培養上清からＩｇＧ画分を硫酸アンモニウムによる塩析
によって取得する。さらに、抗マウスＩｇＧ抗体を結合
させた担体（ザイメド社製）カラムを用いてＩｇＧ画分
を精製する。得られたＩｇＧ画分を、ＨｉＴｒａｐ−Ｎ
ＨＳ−活性化レジン（ファルマシア社製）等を用いて固
定化する。

【００１０】一方、ウシ脳Ｓ−１００画分（脳の抽出物
を遠心分離し、１００，０００×ｇの上清画分）を公知
の方法（Kobayashi, M. et al., FEBS Lett 327, 177-1
82 (1993)）で調製し、硫酸アンモニウム（３０〜５５
％）で分画する。得られる画分をヘパリンカラム（Ｈｉ
Ｔｒａｐ（ファルマシア社製）を１ｍｌ含む）に吸着さ
せ、吸着画分を０．７Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出させ
る。この溶出物を、前記の固定化ＩｇＧを充填したカラ
ムに通し、カラムに吸着した画分を０．１Ｍグリシン−
ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出させ、直ちに中和する。

【００１１】こうして得られるｐ９７は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で約
９７ｋＤａの分子量を示すが、ｐ９７をコードするｃＤ
ＮＡから推定されるアミノ酸配列からは、蛋白質部分は
より低分子量として計算される。しかし、ｐ９７ｃＤＮ
Ａ（２８３０塩基）をＣＯＳ細胞に発現させると、ｐ９
７と差のない蛋白質ができる。また、ｐ９７は分子量、
等電点（６前後）ともに不均質であるが、カゼインキナ
ーゼII（ＣＫII）及びプロテインキナーゼＣのリン酸化
のコンセンサス配列を含んでおり、ＣＫIIによってリン
酸化されることが確認されたことから、前記不均質性の
一部はリン酸化によるものと推定される。

【００１２】また、ｐ９７をコードするｃＤＮＡの塩基
配列から、ｐ９７には、Ｃ末端に４０個の親水性の酸性
アミノ酸からなる２つの繰返し配列（配列番号２におい
て、アミノ酸番号４９９〜５３８、５３９〜５７８）が
存在することが明らかになっているが、これらの繰返し
配列のうちの一方のほとんどを欠失している蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡが見い出されている。ｐ９７と共に抗
体と交叉する９３ｋＤａの分子が微量成分として常に検
出され、この４ｋＤａの差は、繰返し配列の大きさに一
致するので、短いｃＤＮＡは９３ｋＤａの蛋白質をコー
ドしていると予想される。このｃＤＮＡは配列表配列番
号２に示すｐ９７のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号１
〜５５０までをコードしており、３’非翻訳領域を含ん
でいる。

【００１３】本発明のＤＮＡは、上記ｐ９７をコードす
るＤＮＡであり、配列表配列番号２に示すアミノ酸配列
をコードするものであれば特に制限されないが、具体的
には、配列表配列番号１において塩基番号１２３〜１８
９８で示される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００１４】本発明のＤＮＡは、例えばウシ脳から抽出
したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから、ｐ９７のアミ
ノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）により増幅することによって得られる。後記
実施例では、プライマーとして配列番号８及び９に示す
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、３’及び
５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)）に
より、ｐ９７のｃＤＮＡの塩基配列決定を行ったが、本
発明により、ｐ９７ｃＤＮＡの塩基配列が明らかになっ
たので、コード領域の３’末端領域又は５’末端領域を
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これ
をプライマーとすることにより、ｐ９７ｃＤＮＡが得ら
れる。また、必要であれば、５’又は３’非コード領域
に相当するオリゴヌクレオチドを用いれば、コード領域
及び非コード領域を含むｐ９７ｃＤＮＡが得られる。さ
らに、ＰＣＲに用いる鋳型として、ウシ染色体ＤＮＡを
用いれば、ｐ９７遺伝子が得られる。染色体由来のｐ９
７遺伝子は、ｐ９７をコードする領域にイントロンを含
むことが予想されるが、ｐ９７をコードする限り、イン
トロンで分断されているＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含
まれる。

【００１５】一方、ｐ９７ｃＤＮＡは、例えばウシ脳ｃ
ＤＮＡ発現ライブラリー（Bovine Brain Cortex cDNA L
ibrary in the Lamda Zap^TMII Vector、ストラタジーン
社から市販されている）から、ｐ９７に結合するモノク
ローナル抗体を用いてｐ９７を発現するクローンを選択
することによっては得ることができず、ＬＩＮＥ−１様
の分子が見い出される。このことは、ｐ９７に関連する
分子は他にも存在する可能性を意味し、大きなファミリ
ーを形成しているものと推定される。

【００１６】また、ｐ９７ｃＤＮＡ又はｐ９７遺伝子
は、ｃＤＮＡライブラリー又は染色体ＤＮＡライブラリ
ーから、配列番号１に示す塩基配列の一部を有するオリ
ゴヌクレオチドをプロープとしてハイブリダイゼーショ
ンを行うことによっても、得ることができる。このよう
なプローブとしては、配列番号６又は７に示す塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００１７】ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び染色体ＤＮＡの調
製、ＤＮＡの合成、ＰＣＲ、ハイブリダイゼンション等
の技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual S
econd Edition、Sambrook、Fritsch、Maniatis、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press(1989)に記載されている。

【００１８】本発明のＤＮＡは、Ａｌｕ様反復配列を含
んでおり、この領域はゲノム解析ツールとして利用する
ことができると考えられる。また、ｐ９７の生理活性等
の機能を解析することにより、医薬への応用が期待され
る。

【００１９】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 ＜１＞モノクローナル抗体の調製 （１）抗原の調製 ラットＧＡＰ１^mの完全長のオープン・リーディング・
フレーム（ＯＲＦ）の９０％をカバーするＤＮＡ配列
（Maekawa, M. et al., Mol. Cell. Biol., 14,6879-68
85 (1994)）と、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡ配列とを含み、ｌａｃプ
ロモーター制御下でＧＡＰ１^mとＧＳＴとの融合蛋白質
を発現し得るプラスミド（ベクターとしてｐＵＣ１８を
含む）で形質転換したE. coliを、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ
存在下、２５℃で１４時間培養して、前記融合蛋白質を
発現させた。

【００２０】培養終了後、５Ｌの培養液からフレンチプ
レスを用いて細胞抽出液を調製し、１５,０００ｒｐｍ
で３０分間、４℃で遠心して上清を得た。この上清を、
直接グルタチオン−セファロースカラム（ファルマシア
社製）に供し、カラムに吸着した画分を、１０ｍＭグル
タチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．
６）で溶出した。

【００２１】（２）モノクローナル抗体の調製 上記で得られた溶出物（約５０μｇ）を、常法（Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual Second Edition、Sa
mbrook、Fritsch、Maniatis、Cold Spring HarborLaborato
ry Press 1989 参照）によりマウスに注射した。このマ
ウスから脾細胞を抽出し、通常の方法（Kohler、Milste
in、Nature,495-492(1975)参照）によりハイブリドーマ
を作製した。

【００２２】ウシ脳Ｓ−１００画分を７．５％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
で分離し、上記ハイブリドーマの培養液を用いたウェス
タンブロッティングにより、ウシ脳蛋白質に結合するモ
ノクローナル抗体を産生する株のスクリーニングを行な
った。その結果、精製したラットＧＡＰ１^mよりも９７
ｋＤａのウシ脳蛋白質（ｐ９７）を強く認識するモノク
ローナル抗体を産生する独立した５つの陽性クローンが
得られた。これらの株が産生するモノクローナル抗体の
クラスを市販のキット（アマシャム社製）を用いて調べ
たところ、いずれもＩｇＧ、κに属するものであった。
これらのクローンのうち１株は生育が悪かったため、以
下の実施例では残りの４株を用いた。

【００２３】＜２＞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ｐ９７をアミノ酸レベルで同定するため、上記の４株の
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を用い
て、ウシ脳ｃＤＮＡ発現ファージライブラリー（Bovine
Brain Cortex cDNA Library in the Lamda Zap^TMII Ve
ctor、ストラタジーン社）のスクリーニングを行ない、
独立した５つの陽性クローンを単離した。これらのクロ
ーンの塩基配列を解析した結果、これらのクローンは、
いずれもレトロポゾン様逆転写酵素に関連するＬＩＮＥ
−１反復配列と相同性を有し、これらのクローンがコー
ドするアミノ酸配列はラットＧＡＰ１^mと有意な相同性
を有していた。しかし、前記の陽性クローンの間で共通
する配列は見い出されなかったので、ｃＤＮＡライブラ
リーからｐ９７をコードするｃＤＮＡを単離するため、
ｐ９７を精製し、そのアミノ酸配列を決定し、オリゴヌ
クレオチドプローブを合成した。

【００２４】（１）ｐ９７の精製及びアミノ酸配列決定 （ｉ）抗−ｐ９７ ＩｇＧ−ＨｉＴｒａｐカラムの調製 上記で得られた各々のハイブリドーマ４株を無血清培地
（ＧＩＴ：ニッスイ社製）で培養した培養上清から、Ｉ
ｇＧ画分を調製した。すなわち、培養上清に硫酸アンモ
ニウムを加えることによって生じた沈殿を、ヤギ抗マウ
スＩｇＧ−セファロースカラム（ザイメド社製）にか
け、カラムに吸着したＩｇＧ画分を０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出
し、溶出液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で中和し
た。

【００２５】上記のようにして精製されたＩｇＧ調製物
を、７０％硫酸アンモニウムで濃縮し、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に対して透
析することによって、硫酸アンモニウムを除去した。こ
の調製物（２．５ｍｇ）を、ＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ−活
性化レジン（ファルマシア社製）と混合し、４℃で４時
間ロータリーシェーカーを用いて撹拌し、レジンにＩｇ
Ｇを結合させた。ブラッドフォード法（バイオラド社製
キットを用いた）により蛋白質濃度を測定して求めた結
合率は、約８８％であった。

【００２６】（ii）ｐ９７の単離 ラットをウシに置き換えた以外はKobayashi, M. et a
l., FEBS Lett 327, 177-182 (1993)に記載の方法と同
様にして調製したウシ脳Ｓ−１００画分（４.４ｍｇ／
ｍｌ、３００ｍｌ）を、硫酸アンモニウム（３０〜５５
％）で分画し、沈殿をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩
水）、続いて０．２Ｍ ＮａＣｌを含むＡ緩衝液（１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ Ｅ
ＧＴＡ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリ
セロール、プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン、アンチ
パイン、Ｅ−６４及びペプスタチンＡ）５μg／ｍｌづ
つを含む）に透析した後、ヘパリンカラム（ＨｉＴｒａ
ｐ（ファルマシア社製）を１ｍｌ含む）に３回繰り返し
て通した。このカラムを、０．２Ｍ及び０．３ＭのＮａ
Ｃｌを含むＡ緩衝液で連続して洗浄し、吸着画分を０．
７Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出させた。０．７Ｍ ＮａＣ
ｌ溶出画分を抗−ｐ９７ ＩｇＧ−ＨｉＴｒａｐカラム
にかけ、０．２Ｍ ＮａＣｌを含むＡ緩衝液、さらに１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で連続して洗
浄した後、吸着物を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ
２．５）で溶出させた。この溶出物を、直ちにＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で中和し、ウルトラフリー（Ul
trafree MW 30,000 cut、ミリポア社）を用いて１０倍
に濃縮した。製精度を評価するため、調製物を二次元電
気泳動で分離した。ウェスタンブロッティングでの比色
分析（Eur.J.Biochem.,227, 379-387 (1995)）によれ
ば、最終的な収率は約１０％、Ｓ−１００画分に比べて
約２０，０００倍の生成倍率であった。

【００２７】上記調製物は、等電点電気泳動、二次元ゲ
ル電気泳動における分子量のいずれにおいても、不均質
性を示した。

【００２８】（iii）ｐ９７のアミノ酸配列決定 上記のようにして部分精製したｐ９７を７．５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離し、ナイロンフィルター（Immobilo
n、ミリポア社）に移し、０．１％ポンソー（Ponseau
S）の１％酢酸溶液で染色した。目的のバンドを有する
フィルターを切り出し、エンドリジンペプチダーゼで１
４時間消化した後、消化物をＣ−８カラム（ＲＰ−３０
０、アプライドバイオシテスムズ社）を用いた逆相高速
液体クロマトグラフィーで分離した。主要なピークのア
ミノ酸配列を、エドマンアミノ酸シークエンサーを用い
て決定した。幅広のバンドはＣ−１８（ＲＰ−１８、ア
プライドバイオシステムズ社）で再クロマトグラフィー
を行なった後、アミノ酸シークエンサーで分析した。

【００２９】（２）ＲＡＣＥ法によるｐ９７ｃＤＮＡ塩
基配列の決定 上記でアミノ酸配列を決定したペプチドの１つ、Ｆｒ．
１９のアミノ酸配列を配列番号３に示す。Ｆｒ．１９に
相当するヌクレオチド配列を決定するため、Ｆｒ．１９
のＮ末端に対応する縮重塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド（配列番号４）と、Ｃ末端に対応する縮重塩基配
列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号５）を用い
て、ＰＣＲを行なった。Ｎ末端に対応するオリゴヌクレ
オチドは、ペプチドのＮ−末端のアミノ酸残基がリジン
であると仮定して設計した。このプライマーを用いて、
ウシ脳ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ウシ脳ｃ
ＤＮＡは、市販のｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック
社）を用い、キットの説明書に従って成ウシ脳ｍＲＮＡ
を材料として作製した。ＰＣＲにより増幅されたオリゴ
ヌクレオチドを２０％アクリルアミドゲル電気泳動で分
離し、ＱＩＡＥＸII gelextractionキット（ＱＩＡＧＥ
Ｎ社）で回収し、Ｔ−Ａクローニング（プロメガ社）を
用いてサブクローニングし、３つの独立クローンについ
て塩基配列決定を行なった。決定された二本鎖の各々の
塩基配列を配列番号６及び７に示す。この５３マーのオ
リゴヌクレオチドは、後述のハイブリダイゼーションの
プローブとして使用した。

【００３０】上記のようにして決定したＦｒ．１９に相
当するヌクレオチド配列に基づいて、これに完全にマッ
チするアンチセンスプライマー（配列番号８）を合成し
た。一方、アミノ酸配列を決定した他のペプチドＦｒ．
３６のアミノ酸配列（配列番号９）に相当する縮重オリ
ゴヌクレオチドプライマー（配列番号１０）を合成し、
これらのプライマーを用いて、ウシ脳ｃＤＮＡを鋳型と
して３’及び５’ＲＡＣＥ（Marathon^TM cDNA Amplific
ation Kit、クロンテック社）を行なった。こうして決
定されたｐ９７ｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を、配列番号１及び２に示し
た。また、このｃＤＮＡ及びこのｃＤＮＡがコードする
ｐ９７蛋白質の構造を図１に示した。

【００３１】（３）ｐ９７ｃＤＮＡクローンの単離 上記の５３マーのオリゴヌクレオチド（配列番号６及び
７）を³²Ｐ−γ−ＡＴＰでラベルし、これをプローブに
用いたハイブリダイゼーションにより、長鎖ｃＤＮＡを
含むウシ脳ｃＤＮＡライブラリー（奈良先端科学技術大
学院大学、貝淵弘三氏から恵与された。Kaibuchi,K. et
al., Mollecular and Cellular Biology, 11, 2873-28
80 (1991)参照）のスクリーニングを行なった。ハイブ
リダイゼーションは、２０％ホルムアミド存在下で、４
２℃で行なった。その結果、１０⁶個のクローンから５
つの陽性クローンが得られ、各々について塩基配列の決
定を行なった。これらのクローンについて、前記のｃＤ
ＮＡ配列における位置を図２に示した。尚、上記の５３
マーのオリゴヌクレオチドは、配列番号１において、塩
基番号１５９６〜１６４８に相当する。

【００３２】＜３＞ｐ９７及びそのｃＤＮＡの構造解析 ｐ９７ｃＤＮＡ（配列番号１）のＯＲＦの中央部には、
ヌクレオチドレベルで８０％のホモロジーを有するＡｌ
ｕ様ＢＤＤＦに相同な８４０ｂｐの領域（配列番号１に
おいて塩基番号７４７〜１５８６）が存在していた。ま
た、ｐ９７には、Ｃ末端に４０個の親水性の酸性アミノ
酸からなる２つの繰返し配列（配列番号２において、ア
ミノ酸番号４９９〜５３８、５３９〜５７８）が認めら
れた。一方、ＯＲＦのＣ末端を含む２つのファージクロ
ーンの一方（＃１）は、上記繰返し配列と完全に一致す
る２つの繰返し配列を含んでいたが、他方（＃２）は繰
返し配列を１つしか含んでおらず、５５０個のアミノ酸
残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。また、こ
れらの３’非コード領域は互いに異なっていた。

【００３３】ｐ９７のＢＤＤＦに相同な領域に存在する
アミノ酸配列の一部は、血球細胞系の転写因子ＥＴＳ
（E26 transformation-specific）と高い相同性を有し
ていた。

【００３４】＜４＞ｐ９７の不均質性とＣＫIIによるリ
ン酸化 前述したように、ｐ９７は、等電点電気泳動、二次元ゲ
ル電気泳動における分子量のいずれにおいても、不均質
性を示した。この不均質性は、より低分子量の蛋白質ｐ
９３においても認められた。ｐ９７は、カゼインキナー
ゼII（ＣＫII）及びプロテインキナーゼＣのリン酸化の
コンセンサス配列を多く含んでいる。特に、ｐ９７のペ
プチダーゼ消化で得られたＦｒ．１９ペプチドには、Th
r-Asn-Glu-Glu配列が２個含まれており、典型的なＣＫI
Iの基質となると考えられた。このことを確かめるため
に、ブタ精巣から精製したＣＫII（東京都臨床医学総合
研究所 宮田 愛彦氏からの供与による）を用いてｐ９７
のリン酸化を行なった。その結果、ｐ９７は確かにリン
酸化された。したがって、ｐ９７の等電点の不均質性
は、リン酸化による可能性が高い。

【００３５】＜５＞ｐ９７の発現及び局在性 ウシ脳及びそれ以外の組織２０μg又は４０μgをＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した後、ナイロンフィルターに移し、
ウェスタンブロッティングによりｐ９７の発現量を調べ
た。その結果、ｐ９７の発現は脳で多く、肝臓及び肺で
は中程度であり、心臓では少量認められた。ｐ９７の分
布はＣＫIIの分布と一致しているようである。

【００３６】次に、肝組織を用いてｐ９７の細胞内の局
在性を調べた。肝組織を用いたのは、脳は、酸性蛋白質
の細胞内局在の評価を妨げる可能性のあるミエリンを多
量に含んでおり、ｐ９７のＮ末端は確実に酸性度が高い
からである。ｐ９７の有意な量（２０％近く）は核画分
に検出された。

【００３７】ウシ脳の切片でのｐ９７の分布を調べたと
ころ、視床下部の神経細胞やプルキンエ細胞の核及び細
胞質に偏在していた。

【００３８】

【発明の効果】本発明により、新規蛋白質ｐ９７及びそ
れをコードするＤＮＡが提供される。

【００３９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2830 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名： 株名： 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：123..1898 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 CGCTGCGGAC TGGGGGGAGT TGCGGAGTCA GGCGCCATCG ACCACGCCGC AAGTCTACGG 60 TCCCTCCTGG AGCTTTGCTG TTGTACGCCC CTGCTGCGTC CCTGTGGCTT TGTGCGACAG 120 AC ATG GAG GAA TTC GAC TCC AAA GAC ATT TCC ACT TCG AAG GAC GAG 167 Met Glu Glu Phe Asp Ser Lys Asp Ile Ser Thr Ser Lys Asp Glu 1 5 10 15 GAC TGC GTG CCG TTG GGT GGA GAA TGT CAT GAA GAT GAT ATA AAT GAA 215 Asp Cys Val Pro Leu Gly Gly Glu Cys His Glu Asp Asp Ile Asn Glu 20 25 30 TTA GTG AAG GAA GAT GAA GTG GAT GGT GAA GAG GAG ACA CAG AAA ACC 263 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Asp Gly Glu Glu Glu Thr Gln Lys Thr 35 40 45 AAA GGG ACA AAA AGA AAG GCT GAG AGC ATT CTG GCC AGG AAG AGA AAA 311 Lys Gly Thr Lys Arg Lys Ala Glu Ser Ile Leu Ala Arg Lys Arg Lys 50 55 60 CAA GGT CGC CTC TCA CTG GAC CAA GAG GAG GAG GAG GAT GCC AGC AGG 359 Gln Gly Arg Leu Ser Leu Asp Gln Glu Glu Glu Glu Asp Ala Ser Arg 65 70 75 GAA TCT GGA GGG AGG ATT ATT GAG AAG GAA GAT GCA GCT GCA GAG CAG 407 Glu Ser Gly Gly Arg Ile Ile Glu Lys Glu Asp Ala Ala Ala Glu Gln 80 85 90 95 GAA AAA GGC GCC GAG TCA GAG GAT GCC AGG CAA GAG GAG GCT GAC GTG 45 Glu Lys Gly Ala Glu Ser Glu Asp Ala Arg Gln Glu Glu Ala Asp Val 100 105 110 CTG GCC AGC TCC GTC AGT GAC GCA GAA CCA AAA TCA GAA CTG CCT CCG 503 Leu Ala Ser Ser Val Ser Asp Ala Glu Pro Lys Ser Glu Leu Pro Pro 115 120 125 AGT ACA CAA ACC AAA ACA GGA GAG GAG ACT GAA GAG ACA AGT TCA AGT 551 Ser Thr Gln Thr Lys Thr Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ser Ser Ser 130 135 140 AAT TTG GTC AAA GTG GAA GAG CTA GAG AAA CCT AAA AAA GCA GAA GAA 599 Asn Leu Val Lys Val Glu Glu Leu Glu Lys Pro Lys Lys Ala Glu Glu 145 150 155 GTT AAA CTC ACC AAA TCA CCT CTT GCT GGT GAA GAA GTC AGG TTT CTT 647 Val Lys Leu Thr Lys Ser Pro Leu Ala Gly Glu Glu Val Arg Phe Leu 160 165 170 175 ACA CAG CAG GGA AGG CTC TCT GGC AGG ACA TCG AAA GAT GAG CCC CGC 695 Thr Gln Gln Gly Arg Leu Ser Gly Arg Thr Ser Lys Asp Glu Pro Arg 180 185 190 AGG TCC GAA GGG GTT CAA CAT GCT ACT GGA GAA GAG CGG AGG GCC GAT 743 Arg Ser Glu Gly Val Gln His Ala Thr Gly Glu Glu Arg Arg Ala Asp 195 200 205 ACT AAT ACC TCC AGT AAG AAT GAA GCG GCT GGG CAA AAG TGG AAA GGA 791 Thr Asn Thr Ser Ser Lys Asn Glu Ala Ala Gly Gln Lys Trp Lys Gly 210 215 220 CAG TCA GCT GTC GAT GTG TCT GGT GAC GAA AGT AAA CTC CGA TGC TGT 839 Gln Ser Ala Val Asp Val Ser Gly Asp Glu Ser Lys Leu Arg Cys Cys 225 230 235 AAA GAA GAA TAC TGC ATA GGA ACC TGG AAT GTT AGA TCT ATG AAT CCT 887 Lys Glu Glu Tyr Cys Ile Gly Thr Trp Asn Val Arg Ser Met Asn Pro 240 245 250 255 GGT AAA TTG GAT GTG GTG AAG CAG GAG ATG GAA AGA ATA AAC ATC GAC 935 Gly Lys Leu Asp Val Val Lys Gln Glu Met Glu Arg Ile Asn Ile Asp 260 265 270 ATC TTA GGA ATC AGT GAA CTA AAA TGG ACA GGA ATG GGC GAA TTG AAT 983 Ile Leu Gly Ile Ser Glu Leu Lys Trp Thr Gly Met Gly Glu Leu Asn 275 280 285 TCA GAT GAC CAT TAT ATC TAT TAC TGT GGG CAA CAA TCC CTT AGA AGA 1031 Ser Asp Asp His Tyr Ile Tyr Tyr Cys Gly Gln Gln Ser Leu Arg Arg 290 295 300 AAT GGA GTC GCT CTC ATA GTT AAC AAA AGA GTC CGA AAT GCA ATA ATT 1079 Asn Gly Val Ala Leu Ile Val Asn Lys Arg Val Arg Asn Ala Ile Ile 305 310 315 GGG TGC AAT CTG AAA AAC GAC AGG ATG ATT TCA GTT CGT TTC CAA GGC 1127 Gly Cys Asn Leu Lys Asn Asp Arg Met Ile Ser Val Arg Phe Gln Gly 320 325 330 335 AAA CCA TTC AAC CTC ACA GTA ATC CAA GTC TAT GCC CCA ACT CCT TAT 1175 Lys Pro Phe Asn Leu Thr Val Ile Gln Val Tyr Ala Pro Thr Pro Tyr 340 345 350 GCT GAA GAA GGT GAA GTT TAC CGG TTC TAT GAA GAC CTA CAA CAC CTT 1223 Ala Glu Glu Gly Glu Val Tyr Arg Phe Tyr Glu Asp Leu Gln His Leu 355 360 365 CTG GAA ATA ACA CCG AAA ATA GAT GTC CTT TTC ATC ATA GGG GAT TGG 1271 Leu Glu Ile Thr Pro Lys Ile Asp Val Leu Phe Ile Ile Gly Asp Trp 370 375 380 AAT GCA AAA GTG GGA AGT CAA GAG ATA CCT GGA ATA ACA GGC AGG TTT 1319 Asn Ala Lys Val Gly Ser Gln Glu Ile Pro Gly Ile Thr Gly Arg Phe 385 390 395 GGC CTT GGA ATG CAA AAT GAA GCA GGG CGA AGG CTA ATC GAG TTT TGT 1367 Gly Leu Gly Met Gln Asn Glu Ala Gly Arg Arg Leu Ile Glu Phe Cys 400 405 410 415 CAC CAC AAC AGG CTG GTC ATA ACA AAC ACC CTT TTC CAA CAA CCT AGT 1415 His His Asn Arg Leu Val Ile Thr Asn Thr Leu Phe Gln Gln Pro Ser 420 425 430 AGA CGT CTC TAC ACA TGG ACA TCA CCA GAT GGT CGA TAC CGA GAT CAG 1463 Arg Arg Leu Tyr Thr Trp Thr Ser Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Asp Gln 435 440 445 ATT GAT TAT ATT ATT TGT CGC CAA AGA TGG AGA AGC TCT GTA CAG TCA 1511 Ile Asp Tyr Ile Ile Cys Arg Gln Arg Trp Arg Ser Ser Val Gln Ser 450 455 460 GCA AAA ACA AGA CCT GGA GCT GAC TGT GGC TCA GAT CAT AAG CTC CTT 1559 Ala Lys Thr Arg Pro Gly Ala Asp Cys Gly Ser Asp His Lys Leu Leu 465 470 475 ATT GCA AAG TTC AGG CTT AAG TTG AAG ATA ATA CCA AAA ACG ACT CGG 1607 Ile Ala Lys Phe Arg Leu Lys Leu Lys Ile Ile Pro Lys Thr Thr Arg 480 485 490 495 CCA TTC AGA GTG ACT AAT GAA GAG GAT GCC ACA AAT GAA GAA GCA AAA 1655 Pro Phe Arg Val Thr Asn Glu Glu Asp Ala Thr Asn Glu Glu Ala Lys 500 505 510 TCT GTC TTA AAG CAG AAT GAG AAA GAA AAA CCT GAG GCT AAC GTT CCT 1703 Ser Val Leu Lys Gln Asn Glu Lys Glu Lys Pro Glu Ala Asn Val Pro 515 520 525 TCA ACT GTG TCC TCA GTT CCT GGT GGG TCA GGC ATG ACT AAG GAA GTG 1751 Ser Thr Val Ser Ser Val Pro Gly Gly Ser Gly Met Thr Lys Glu Val 530 535 540 GGT GAA ACA TCT CAA GAA GCG AAA TCT GTG TTC AAG CAA GAT GAG AAA 1799 Gly Glu Thr Ser Gln Glu Ala Lys Ser Val Phe Lys Gln Asp Glu Lys 545 550 555 GAC AAA CCT CAA GCT AAT GTC CCC TCA TCG GTG CCA TCA CTT CCT GCT 1847 Asp Lys Pro Gln Ala Asn Val Pro Ser Ser Val Pro Ser Leu Pro Ala 560 565 570 575 GGG TCA GGG CCT GAA AAA TGT GAC CTT GAA AAG AAA AAG GAT TGC AAC 1895 Gly Ser Gly Pro Glu Lys Cys Asp Leu Glu Lys Lys Lys Asp Cys Asn 580 585 590 AAT TAAGTATCTG ACTTTGTCCT TAAGCACCTA AACTGGTTTG TATAAAATAC 1948 Asn AGTTGTTAAC CTGTTTTTGT TATCTTTTTC TGTTTTGTTA TCTGTTAACA AAACAAAATT 2008 GTTATTGTTA GCTGTTTTGA AAATAATTTT GGCAATTAAG TCTTGACATT TTTAAAGGGG 2068 AGTTTTCATT GTGAGTGTAA GGCTAACTGC CCATGACTTC ATGTGCAGTG CTATTTGATT 2128 TAAAGCAATA TGCACTCTGG CTTCTGATTA AAAATAGCCA GGAGAACCAA TTTTCCAGGG 2188 GTAGTCAGAG AAGAAAAGTA CAAAGGATCA CAAAAAAGTA ACTGGACTTT TTTTTTTAAC 2248 TAATAGAAAA AGTTGCTTTT TTTTTTTTTA AACTTAGGTG AAGACTCTTT AGAGACCCTT 2308 GGACTGTAGT GAGATCAAAA GAGTTAATTC TAAAGGAAAT CAACTCTGAA TATTCAATGG 2368 TAGGACTGTT GCTTAAGCTC CAATAGTTTG GCCACCTGAT GCAGAGTGCT GACTCATTGA 2428 AAAATACTCA CACTGGGAAA GATTGAAGGC AGAAGAAGAG GTCAGCAGAG GACGAGATGG 2488 TTTGATACTA TTACCGACTC AGTGAACACG AATTTGACCA AACTCCGGGA CATAATGGAG 2548 CACAAAGGAG CCTCGGGAGC TGCAGTCCAT GGGGTCACAG AGTCTGACAT GACTTAACAA 2608 TTGAACAACA ATTCAACATA TATCTTTAAC TGTATTTCCT TTATGTTCAA CTTAACTAGT 2668 TTATGGTAAA ATTCTTGTCC AAAGATGTGA TTTAACTCTG CTTTGTAGGC TGTATGTTAG 2728 CATCCAGAAG CTTTTGTATG ATTATACACT GGGATTGCTG AAAGCTGATA CAGTTTGTGA 2788 AATAAATGTA TCATTTCAAC ACTGAAAAAA AAAAAAAAAA AA 2830

【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：592 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Phe Asp Ser Lys Asp Ile Ser Thr Ser Lys Asp Glu Asp 1 5 10 15 Cys Val Pro Leu Gly Gly Glu Cys His Glu Asp Asp Ile Asn Glu Leu 20 25 30 Val Lys Glu Asp Glu Val Asp Gly Glu Glu Glu Thr Gln Lys Thr Lys 35 40 45 Gly Thr Lys Arg Lys Ala Glu Ser Ile Leu Ala Arg Lys Arg Lys Gln 50 55 60 Gly Arg Leu Ser Leu Asp Gln Glu Glu Glu Glu Asp Ala Ser Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Gly Arg Ile Ile Glu Lys Glu Asp Ala Ala Ala Glu Gln Glu 85 90 95 Lys Gly Ala Glu Ser Glu Asp Ala Arg Gln Glu Glu Ala Asp Val Leu 100 105 110 Ala Ser Ser Val Ser Asp Ala Glu Pro Lys Ser Glu Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Thr Gln Thr Lys Thr Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ser Ser Ser Asn 130 135 140 Leu Val Lys Val Glu Glu Leu Glu Lys Pro Lys Lys Ala Glu Glu Val 145 150 155 160 Lys Leu Thr Lys Ser Pro Leu Ala Gly Glu Glu Val Arg Phe Leu Thr 165 170 175 Gln Gln Gly Arg Leu Ser Gly Arg Thr Ser Lys Asp Glu Pro Arg Arg 180 185 190 Ser Glu Gly Val Gln His Ala Thr Gly Glu Glu Arg Arg Ala Asp Thr 195 200 205 Asn Thr Ser Ser Lys Asn Glu Ala Ala Gly Gln Lys Trp Lys Gly Gln 210 215 220 Ser Ala Val Asp Val Ser Gly Asp Glu Ser Lys Leu Arg Cys Cys Lys 225 230 235 240 Glu Glu Tyr Cys Ile Gly Thr Trp Asn Val Arg Ser Met Asn Pro Gly 245 250 255 Lys Leu Asp Val Val Lys Gln Glu Met Glu Arg Ile Asn Ile Asp Ile 260 265 270 Leu Gly Ile Ser Glu Leu Lys Trp Thr Gly Met Gly Glu Leu Asn Ser 275 280 285 Asp Asp His Tyr Ile Tyr Tyr Cys Gly Gln Gln Ser Leu Arg Arg Asn 290 295 300 Gly Val Ala Leu Ile Val Asn Lys Arg Val Arg Asn Ala Ile Ile Gly 305 310 315 320 Cys Asn Leu Lys Asn Asp Arg Met Ile Ser Val Arg Phe Gln Gly Lys 325 330 335 Pro Phe Asn Leu Thr Val Ile Gln Val Tyr Ala Pro Thr Pro Tyr Ala 340 345 350 Glu Glu Gly Glu Val Tyr Arg Phe Tyr Glu Asp Leu Gln His Leu Leu 355 360 365 Glu Ile Thr Pro Lys Ile Asp Val Leu Phe Ile Ile Gly Asp Trp Asn 370 375 380 Ala Lys Val Gly Ser Gln Glu Ile Pro Gly Ile Thr Gly Arg Phe Gly 385 390 395 400 Leu Gly Met Gln Asn Glu Ala Gly Arg Arg Leu Ile Glu Phe Cys His 405 410 415 His Asn Arg Leu Val Ile Thr Asn Thr Leu Phe Gln Gln Pro Ser Arg 420 425 430 Arg Leu Tyr Thr Trp Thr Ser Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Asp Gln Ile 435 440 445 Asp Tyr Ile Ile Cys Arg Gln Arg Trp Arg Ser Ser Val Gln Ser Ala 450 455 460 Lys Thr Arg Pro Gly Ala Asp Cys Gly Ser Asp His Lys Leu Leu Ile 465 470 475 480 Ala Lys Phe Arg Leu Lys Leu Lys Ile Ile Pro Lys Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Phe Arg Val Thr Asn Glu Glu Asp Ala Thr Asn Glu Glu Ala Lys Ser 500 505 510 Val Leu Lys Gln Asn Glu Lys Glu Lys Pro Glu Ala Asn Val Pro Ser 515 520 525 Thr Val Ser Ser Val Pro Gly Gly Ser Gly Met Thr Lys Glu Val Gly 530 535 540 Glu Thr Ser Gln Glu Ala Lys Ser Val Phe Lys Gln Asp Glu Lys Asp 545 550 555 560 Lys Pro Gln Ala Asn Val Pro Ser Ser Val Pro Ser Leu Pro Ala Gly 565 570 575 Ser Gly Pro Glu Lys Cys Asp Leu Glu Lys Lys Lys Asp Cys Asn Asn 580 585 590

【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Thr Arg Pro Phe Arg Val Thr Asn Glu Glu Asp Ala Thr Asn Glu 1 5 10 15 Glu Ala

【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 AARACNACNM GNCCNTT 17

【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 TCYTCRTTNG TNGCRTC 17

【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 AAGACTACTC GGCCCTTCAG AGTGACTAAT GAAGAGGATG CCACCAACGA AGA 53

【００４５】配列番号：７ 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 TCTTCGTTGG TGGCATCCTC TTCATTAGTC ACTCTGAAGG GCCGAGTAGT CTT 53

【００４６】配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 TCCTCTTCAT TAGTCACTGA A 21

【００４７】配列番号：９ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Leu Ala Gly Glu Glu Val Arg Phe Leu Thr Gln Gln Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ser Gly Arg 20

【００４８】配列番号：１０ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 TTYTNACNCA RCARGG 16

【００４９】配列番号：１１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Asn Glu Glu

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ａｌｕ−関連反復配列領域を有するｐ９７蛋
白質の構造とｃＤＮＡの構造とを示す図。

【図２】 ｐ９７ｃＤＮＡの構造及びｐ９７ｃＤＮＡク
ローンの関係を示す図。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を
   有する蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を
   コードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表配列番号１において塩基番号１２
   ３〜１８９８で示される塩基配列を有する請求項２記載
   のＤＮＡ。