JPH10152497A - ヘリコバクター・ピロリのリピドａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新しい免疫活性物質として医薬品分野で有用な
ヘリコバクター・ピロリ由来のリピドＡを提供する。 【解決手段】 式 【化１】 で表される化学構造を有するヘリコパクター・ピロリの
リピドＡ及びこれを含む医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なリピドＡ、よ
り詳しくはヘリコバクター・ピロリから単離されたリピ
ドＡ及びこれを有効成分とする医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】グラム陰性菌の細胞壁外膜に含まれるリ
ポ多糖（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅ）は、リピドＡと呼ばれる糖脂質に種々の糖類が結合
したものであり、昔から内毒素の主たる成分であること
が知られている（Ｒａｅｔｚ，Ｃ．Ｒ．Ｈ．， Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆｌｉｐｉｄ Ａ， Ｖｏｌ．
Ｉ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｃ． ａｎｄ Ｒｙａ
ｎ，Ｊ．Ｌ． ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉ
ｎｃ．， ＢｏｃａＲａｔｏｎ， １９９２， ６７−
８０）。

【０００３】また、上記ＬＰＳは、宿主に対して様々な
免疫生物学的活性を発揮し、その活性発現部位が、上記
リピドＡであることが明らかにされ、大腸菌（Escheric
hiacoli）やサルモネラ菌（Salmonella）等に由来する
各種のリピドＡが種々単離され、その化学構造も解明さ
れ、之等のリピドＡについて、免疫調節作用や抗腫瘍作
用等の多彩な免疫薬理学的作用が報告されている（Zahr
inger, U. et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.,
1994, 50, 211-276; Takada, H. and Kotani,S., Bacte
rial endotoxic lipopolysaccharides (Morrison, D.
C. and Ryan, J.L. eds), CRC Press, New York, 1992,
pp.107-134; Rietschel, E. T. et al., Prog. Clin.
Biol. Res., 1987, 231, 25-53; Homma, J. Y., et a
l., DrugsFuture, 1989, 4, 645-665）。

【０００４】本発明者は、先に、歯周病の原因菌の一つ
と考えられるグラム陰性嫌気性桿菌であるポルフィロモ
ナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のＬ
ＰＳが、発熱原性や致死毒性等の内毒素作用は非常に弱
いが、強い免疫増強作用を発揮する点に着目して、その
リピドＡを単離調製し、構造決定に成功した（Ogawa,
T., FEBS Lett., 1993, 332, 197-201；特開平６−２０
６８９３号公報）。

【０００５】一方、ヘリコバクター・ピロリ（Helicoba
cter pylori）は、慢性活動性胃炎患者から頻繁に単離
され、ヒト十二指腸潰瘍及び胃潰瘍と関連している（Wa
rren, J. R. and Marshall, B., Lancet, 1983, i, 127
3-1275; Buck, G. E., et al., J. Infect. Dis., 198
6, 153, 664-669; O'Connor, H. J., Scand. J. Gastro
enterol., 1994, 201, 11-15; Goodwin, C. S., Med. M
icrobiol. Lett., 1995, 4, 155-164）。

【０００６】本菌は、グラム陰性、微好気性桿菌であ
り、細胞表面にＬＰＳを有しており、該ＬＰＳ分子は化
学的及び生物学的に、腸内細菌ＬＰＳとは異なる特性を
有している（Geis, G., et al., J. Clin. Microbiol.,
1990, 28, 930-932; Conrad,R. S., et al., Curr. Mi
crobiol., 1992, 24, 165-169; Moran, A., et al., J.
Bacteriol., 1992, 174, 1370-1377）。

【０００７】該ピロリ由来ＬＰＳのリピドＡが提供でき
れば、これは、新しい免疫活性物質として、医薬品分野
で有用であると考えられる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記ヘリコバクター・ピロリのリピドＡを提供する
ことにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、下記式
（１）で表される化学構造を有するヘリコバクター・ピ
ロリのリピドＡ（以下、「本発明リピドＡ」という）が
提供される。

【００１０】

【化２】

【００１１】また、本発明によれば、本発明リピドＡを
有効成分として含有する医薬組成物が提供される。

【００１２】本発明リピドＡは、上記化学構造式で表わ
される通り、２位及び２’位にそれぞれ（Ｒ）−３−ヒ
ドロキシオクタデカノイル基及び（Ｒ）−３−オクタデ
カノイルオキシオクタデカノイル基を有する、グルコサ
ミニルβ（１−６）グルコサミン−α−アミノエチルホ
スフェートであり、これは、従来の大腸菌やサルモネラ
菌由来のリピドＡとは異なって、４′位にリン酸基を持
たず、３位及び３′位の水酸基が遊離のままである点、
及び１位リン酸基にアミノエチル基を含んでいる点にお
いて特徴づけられる。

【００１３】また、本発明リピドＡは、多彩な生物活
性、例えばＩＬ−６産生作用、ＩＬ−８産生作用、ヒト
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性等を有し、しかも低
（無）毒性であり、発熱原性も非常に低い特徴を有して
いる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明リピドＡの単離調製
法につき詳述すれば、これは、その起源微生物より、一
般的方法に従って製造することができる。ここで、起源
微生物としては、各種高等動物の胃粘膜、胃液等から単
離されたヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylor
i）をいずれも利用できる。その標準株は、例えばＡＴ
ＣＣ４３５０４として寄託されている。

【００１５】上記起源微生物からのＬＰＳの分離精製
は、該起源微生物の培養物より濾過、遠心分離等の常法
に従って菌体を回収し、該菌体について、そのＬＰＳの
理化学的性質に基づいた各種の手段、例えば代表的に
は、熱フェノール水抽出法等の抽出手段、各種酵素処理
手段、遠心分離、溶媒分画手段、各種樹脂を利用したカ
ラムクロマトグラフィー手段、之等の組合せを行なうこ
とにより実施できる。

【００１６】かくして得られるＬＰＳからの本発明リピ
ドＡの製造は、一般的な加水分解手段、好ましくは例え
ば０．０５〜０．２Ｎ程度の酢酸等の弱酸を用いた加水
分解反応により行なうことができ、目的とするリピドＡ
は、通常の精製手段、例えば溶媒抽出、各種クロマトグ
ラフィー等により精製することができる。

【００１７】本発明リピドＡの化学構造は、既知の化学
操作、気液クロマトグラフィ、核磁気共鳴分光分析（Ｎ
ＭＲ）、質量分析（ＭＳ）等により解析できる。

【００１８】また、本発明リピドＡは、上記により解析
された化学構造を基礎として、化学合成することもでき
る。これは、例えば通常の保護基で保護された上記化学
構造に対応するＮ−グルコサミン誘導体を、配糖体結合
形成反応に従わせてジサッカライド誘導体とし、これに
適当な脂肪酸をＮ−アシル化反応させるか、或いは適当
な脂肪酸によりＮ−アシル化され、通常の保護基で保護
された上記化学構造に対応するＮ−グルコサミン誘導体
を、配糖体結合形成反応に従わせてジサッカライド誘導
体とし、得られる誘導体について、還元末端１位のリン
酸化を、Ｎ−保護アミノエチル基を有するフォスホノア
ミダイトを反応させて行なった後、酸化してリン酸エス
テルとし、最後に接触還元して保護基を全て脱離させる
ことにより、実施することができる。

【００１９】かくして得られる本発明リピドＡは、その
リン酸基部分で薬理的に許容される塩を形成させること
ができる。該塩としては、例えばナトリウム、カリウム
等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等の
アルカリ土類金属の塩、テトラメチルアンモニウム等の
アンモニウムの塩、メチルアミン、トリエチルアミン、
ベンジルアミン、ピリジン、ピペリジン、ジエタノール
アミン、リジン、アルギニン等の有機アミンの塩等を例
示できる。

【００２０】本発明リピドＡ及びその薬理的に許容され
る塩は、これを有効成分として、該有効成分と共に適当
な製剤担体を用いて、一般的な医薬製剤組成物の形態と
され、医薬用途に実用される。従って、本発明はかかる
医薬組成物をも提供するものである。

【００２１】本発明医薬組成物は、その有効成分の有す
る生物学的活性、例えばアジュバント活性、Ｂ細胞活性
化作用、ＮＫ細胞活性、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、
特異的・非特異的感染防御作用等に基づいて、各種リン
ホカイン産生剤、免疫賦活剤、各種感染症治療及び予防
剤、敗血症治療及び予防剤、関節リウマチ等の治療及び
予防剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤等として有用である。

【００２２】本発明医薬組成物において、用いられる製
剤担体としては、製剤の使用形態に応じて、通常使用さ
れる充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活
性剤、滑沢剤等の希釈剤或いは賦形剤を例示でき、之等
は得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用で
きる。

【００２３】本発明医薬組成物の投与単位形態として
は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表
的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳
剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤
等）、軟膏剤等が挙げられる。

【００２４】錠剤の形態に成形するに際しては、上記製
剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブド
ウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結
晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、
水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖
液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロー
ス、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン
末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウ
ム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノ
グリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオ
バター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウ
ム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリ
セリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリ
ン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製
タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリ
コール等の滑沢剤等を使用できる。

【００２５】更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した
錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィ
ルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることがで
きる。

【００２６】丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、
硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴ
ム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合
剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

【００２７】坐剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高
級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチ
ン、半合成グリセライド等を使用できる。カプセル剤は
常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種
の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプ
セル等に充填して調整される。

【００２８】本発明薬剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射
剤として調製される場合、之等は殺菌され且つ血液と等
張であるのが好ましく、之等の形態に成形するに際して
は、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロ
ゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステア
リルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等
を使用できる。尚、この場合等張性の溶液を調整するに
充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明
薬剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩
衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

【００２９】更に、本発明薬剤中には、必要に応じて着
色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を
含有させることもできる。

【００３０】ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形
態に成形するに際しては、希釈剤として例えば白色ワセ
リン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、ポ
リエチレングリコール、シリコン、ベントナイト等を使
用できる。

【００３１】本発明薬剤中に含有されるべき有効成分の
量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通
常医薬製剤中に約０．１〜７０％程度含有されるものと
するのがよい。

【００３２】上記医薬製剤の投与方法は特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液
剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与さ
れ、注射剤は単独で又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の
補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で
筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直
腸内投与される。

【００３３】上記医薬製剤の投与量は、その用法、患者
の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選
択されるが、通常有効成分の量が１日成人１人当り約
０．０１〜１００ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１
日に１〜４回に分けて投与することができる。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明リピドＡの製造例を実施例として挙げ、次いで本発
明リピドＡにつき行なわれた生物活性試験例を挙げる。

【００３５】尚、生物活性試験例におけるＣ５７ＢＬ／
６マウス（雄性、８週齢）は、日本ＳＬＣ社（浜松）か
ら入手し、国産日本白色ウサギは、オリエンタル酵母
（大阪）から購入した。また、該試験例における参考試
料としての天然物及び合成物は、以下の通り調製した。

【００３６】即ち、P. gingivalis 381のリピドＡは、
前述した特開平６−２０６８９３号公報記載の方法に従
い調製した。以下これを「P. gingivalis リピドＡ」と
いう。E. coli型合成リピドＡ（Imoto, M., et al., T
etrahedron Lett., 1985, 26, 1545-1548）は、第一化
学薬品（東京）から購入した。以下これを「化合物５０
６」という。両者共、０．１％トリエチルアミン水溶液
中に濃度２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、ストック溶液を４℃
に保存し、アッセイ前に発熱物質を含まない生理食塩水
（ＰＢＳ；微研、大阪）又は細胞培養培地で適当に希釈
して用いた。

【００３７】また、各試験例における結果より、被験群
及び対照群の統計的有意差を、Student's ｔ検定で調べ
た。各試験は、少なくとも３回繰り返し実施し、この繰
り返しによっても同様の結果が得られることが確認され
た。

【００３８】

【実施例１】本発明リピドＡの調製及び精製 ピロリ菌（臨床分離株、兵庫医科大学より入手）を、５
％Ｏ₂、１５％ＣＯ₂及び８０％Ｎ₂の雰囲気中で、７％ウ
マ血液、Skirrow Supplement (OXOID, Hampshire, UK)
及び０．４％ Fungizone (Life Technology, Inc., New
York，USA）添加Brucella培地（Becton Dickinson and
Company, Cockeysville, USA）プレートで、３７℃で
７２時間培養した。菌細胞を発熱物質を含まない水に集
菌し、５０００ｇ、４℃で３０分間、遠心分離して採取
した。これを２回洗浄後、菌ペレットを凍結乾燥した。
凍結乾燥菌体をクロロホルム／メタノール（１／２）処
理して脱脂した。

【００３９】上記凍結乾燥脱脂菌体から、温フェノール
／水法（Westphal, O. and Jann, K., Meth. Carbohyd
r., 1965, 5, 83-91）により本菌のＬＰＳを抽出した。

【００４０】得られたＬＰＳ（３００ｍｇ）を１０５℃
で２．５時間、０．６％酢酸中で加水分解後、冷却中和
した。この加水分解物を水で１００ｍｌとし、その後、
ＣＨＣｌ₃／メタノール／水／トリエチルアミン（３０
／１２／２／０．１）４４０ｍｌに添加し、下層を減圧
下に蒸発させて、リピドＡ分画を得た。

【００４１】得られたリピドＡ分画を、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィ（Merck No. 9385, Darmstadt, Ger
many）にかけ、ＣＨＣｌ₃／メタノール／水／トリエチ
ルアミン（３０／１５／０．５／０．１）によって分離
した。溶出液を、Merck No.5715プレート上で薄層クロ
マトグラフィ（ＴＬＣ）でモニターした。このプレート
をＣＨＣｌ₃／メタノール／水／トリエチルアミン（３
０／８／０．７／０．１）で展開し、アニスアルデヒド
−硫酸（有機化学実験のてびき１、化学同人、１９８
８、１２０頁）及びニンヒドリン試薬で発色させた。

【００４２】同化合物（Ｒｆ＝０．４）は単一スポット
として観察でき、主成分であることがわかった。

【００４３】このリピドＡにつき、種々の機器分析を行
なったところ、以下の結果が得られた。之等を総合的に
解析し、他のリピドＡの分析結果とも比較して、その化
学構造を前記式（１）と同定した。

【００４４】（１）ＮＭＲスペクトル：ＣＯＳＹ（２次
元シフト相関¹Ｈ−ＮＭＲ）及びＴＯＣＳＹ（２次元全
相関¹Ｈ−ＮＭＲ）を測定した結果、図１及び図２（各
図において、縦軸はＤ１（ｐｐｍ）を、横軸はＤ２（ｐ
ｐｍ）を示す）に示すチャートが得られた。之等の結果
より、本発明リピドＡにおける置換基の位置等の構造が
支持された。

【００４５】また、Ｐ−Ｈ・ＨＭＢＣ（２次元異核多結
合相関ＮＭＲ）の結果を示すチャートを図３及び図４
（図３の部分拡大図）（各図において、縦軸はＦ１（ｐ
ｐｍ）を、横軸はＦ２（ｐｐｍ）を示す）に示す。

【００４６】之等各図より、リン原子と１位水素及びア
ミノエチル基の水素とのカップリングが確認された。
尚、上記各ＮＭＲはいずれも１：１メタノール−ｄ４：
重クロロホルムに少量の重ピリジンを添加した溶媒中で
行なった。

【００４７】（２）質量スペクトル：ｍ−ニトロベンジ
ルアルコールマトリックス中でのＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ
（高速電子衝撃タンデムＭＳ）並びにＥＳＩ−ＭＳ−Ｍ
Ｓ（イオンスプレー型タンデムＭＳ）を実施した。結果
を図５（ＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ、ノーマルスキャン）、図
６（ＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ、リンクドスキャン）及び図７
（ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）に示す。

【００４８】之等各図より、１２９３〔（Ｍ−Ｈ）^-〕
のピークと、１００９、７４５、７２７、５８４、５６
６、４６３、１４０及び７９の主要ピークが観察され、
之等を含めたＭＳの解離パターンは、（２−アミノエチ
ル）リン酸基等の各置換基の種類や母核構造等を支持す
るものであった。

【００４９】また、ＦＡＢ高分解能ＭＳ分析結果は、図
８に示す通りであり、該図より、１２９２．９１９５３
の分子イオンピークが確認され、この値は、分子式Ｃ₆₈
Ｈ₁₃₁Ｎ₃Ｏ₁₇Ｐ^-に基づいて計算した値１２９２．９２
１５２によく一致した。

【００５０】更に、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳを実施した結果
より、オクタデカノイル基及び３−ヒドロキシオクタデ
カノイル基の存在が確認された。

【００５１】（３）リンの定量：リンの定量を文献（FE
MS Immunol. Med. Microbiol., 1995, 12, 97-112）記
載の方法に準拠して行なったところ、１分子中に１モル
のリン原子の存在が確認された。

【００５２】

【生物活性試験例１】ガラクトサミン投与マウスにおけ
る致死毒性 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群５匹）に、ＰＢＳ ０．５
ｍｌ中Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（和光純薬、大阪）１
６ｍｇを腹腔内に投与し、ＰＢＳ ０．２ｍｌ中被験試
料を、ガラノス（Galanos）らの方法（Galanos, C., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1979, 76, 59
39-5943）によって直ぐに段階的用量で尾静脈より注射
投与した。中毒によるマウス死亡を２４時間観察し、各
群の５０％致死量（ＬＤ₅₀)をケルバー（Karber）の方
法（Karber, G., Arch. Exp. Pathol. Pharmakol., 193
1, 162, 480-483）で計算した。

【００５３】上記試験の結果を次表に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】表１より、本発明リピドＡは、各マウス当
たり最大１０μｇの用量で致死毒性がなく、５０％致死
用量（ＬＤ₅₀）は、３１．６μｇ／マウスであることが
判った。また、表１より、P.gingivalis リピドＡの致
死毒性も低く、そのＬＤ₅₀は、マウス当たり１２．６μ
ｇであったが、化合物５０６の毒性（ＬＤ₅₀）は、０．
００７９μｇ／マウスとかなり強いことが判った。

【００５６】

【生物活性試験例２】発熱性 各群３匹の国産日本白色ウサギ（雄性；２．２−２．５
ｋｇ）に、発熱性物質非含有ＰＢＳ １０ｍｌ中被験試
料を、処方用量で耳静脈より注射投与した（Ogawa, T.,
Eur. J. Biochem., 1994, 219, 737-742）。

【００５７】各ウサギの直腸温を測定し、自動測定機器
（ＥＰ６７０、１２；イイオ電気、東京）で連続的に記
録した。尚、本試験では、測定を簡素化し、それぞれ第
１相及び第２相温度について、被験試料投与後１−１．
５時間（ピーク１）及び２．５−４時間（ピーク２）ま
で３０分おきに各ウサギの直腸温を調べ、０．６℃を超
える直腸温上昇を発熱反応陽性とした。

【００５８】上記試験の結果を次表に示す。

【００５９】

【表２】

【００６０】表２に示す通り、本発明リピドＡは、ウサ
ギにおいて全く発熱反応を誘発しなかった。これに対し
て、P.gingivalis リピドＡの発熱性も低く、ピーク２
において極めて低い発熱性が用量１０μｇ／ｋｇで観察
されたが、ピーク１では観察されなかった。また、化合
物５０６を０．０１μｇ／ｋｇ投与されたウサギではピ
ーク１及び２の両者で顕著な発熱反応を示した。

【００６１】

【生物活性試験例３】リムルス試験 試薬添付の使用方法に従い、Tachypleus tridentatusか
ら調製したアメーバ細胞溶解物であるプレゲル（Pre Ge
l）を用いて本試験を行なった。規定された粘度増加よ
りも強い反応を起こした用量を、最小作用量とした。

【００６２】上記試験の結果を次表に示す。

【００６３】

【表３】

【００６４】表３より、化合物５０６は、この試験でT.
tridentatus アメーバ細胞溶解物の凝集酵素カスケード
を強力に活性化し、これとは対照的に、本発明リピドＡ
並びにP.gingivalis リピドＡは、化合物５０６よりも
はるかに弱く、本発明リピドＡの活性は化合物５０６の
活性の１／１０００であることが判った。

【００６５】

【生物活性試験例４】サイトカインアッセイ 健常ドナーから採取したヘパリン添加静脈血をHistopaq
ue（Sigma Chemical Co., St. Louis，MO，USA）を用い
て分画し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。上記Ｐ
ＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血
清（FBS，Hyclone）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（微研、
大阪）１ｍｌ当たり１．５×１０⁶細胞密度になるよう
に懸濁させた。ＰＢＭＣ（１．５×１０⁵／ウェル）を
３７℃で７２時間、濃度の異なる被験試料含有又は非含
有９６ウェル培養プレート（Becton Dickinson）中で５
％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂含有湿潤空気中でインキュベーショ
ンし、α型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びインタロイ
キン−６（ＩＬ−６）アッセイを行なった。

【００６６】正常ヒト歯肉線維芽細胞継代株（Ｇｉｎ−
１、大日本製薬株式会社より購入）も同様増殖させ、１
０％ＦＢＳ（Hyclone Laboratories，Inc.）添加改良Du
lbecco's Eagle's培地（ＤＭＥＭ；微研）中で５％ＣＯ
₂雰囲気中３７℃に保持し、１０継代及び１２継代目を
アッセイに使用した。

【００６７】Ｇｉｎ−１細胞（２．０×１０⁴／０．１
ｍｌ／ウェル）を処方量の被験試料存在下又は非存在下
において３７℃で２４時間、９６ウェル培養プレート
（Becton Dickinson）でインキュベーションし、ＩＬ−
８をアッセイした。インキュベーション後、上清を採取
し、サイトカインアッセイに使用した。

【００６８】サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及び
ＩＬ−８，Amersham Internationalplc.,Amersham，U
K）の産生量を、それぞれ市販のＥＬＩＳＡキットを用
いて培地上清中で測定した。アッセイは製造業者の指示
に従い行ない、各アッセイについてデータを標準曲線に
よって求めた。

【００６９】上記試験の結果を図９、１０及び１１に示
す。

【００７０】各図は、それぞれ各被験試料の各投与量に
ついて、ＴＮＦ−α産生量（ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６産
生量（ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−８産生量（ｐｇ／ｍｌ）
を示した棒グラフである。

【００７１】図９（本発明リピドＡとP.gingivalis リ
ピドＡ及び化合物５０６とのＴＮＦ−α産生活性をアッ
セイして比較した結果）より、本発明リピドＡ及びP.gi
ngivalis リピドＡは、ヒトＰＢＭＣ培養上清中におい
て化合物５０６よりも低いＴＮＦ−α産生活性を示すこ
とが明らかである。

【００７２】図１０（同様に各リピドＡのＩＬ−６産生
活性を示したもの）より、本発明リピドＡは、図９に示
されるＴＮＦ−α産生活性とは対照的に、化合物５０６
及びP.gingivalis リピドＡに匹敵するＩＬ−６産生を
誘導することが判った。

【００７３】図１１より、本発明リピドＡは、ヒト歯肉
線維芽細胞Ｇｉｎ−１株を刺激し、培養上清中にＩＬ−
８を用量依存性に産生することが判った。その活性は、
化合物５０６のそれには及ばなかった。

【００７４】

【生物活性試験例５】細胞溶解性アッセイ 細胞溶解性のアッセイを、放射能放出アッセイ（Anders
son, L. C., et al.,Int. J. Cancer, 1979, 23, 143-1
47）で行なった。即ち、ヒトＰＢＭＣ（１．０×１０⁶
／ウェル）を１５％ＦＢＳ（Hyclone Laboratories、In
c.）添加ＲＰＭＩ培地（微研）中で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ
₂含有湿潤空気雰囲気で３７℃で７２時間、処方量の被
験試料とともにインキュベーションした。ＲＰＭＩ１６
４０で洗浄後、ＮＫ細胞感受性赤白血球細胞株である⁵¹
Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞２×１０⁴個とエフェクト／ター
ゲット細胞比５０：１で３７℃で４時間、インキュベー
ションした。インキュベーション後培養上清を集め、ガ
ンマカウンターを用いて計数した。

【００７５】細胞活性％を下式のように計算した。

【００７６】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性（％）
＝１００×（放出実験値−自然放出値）／（総放出−自
然放出） 但し、放出実験値は、エフェクター細胞とともに放出さ
れた平均ｃｐｍを、自然放出値は、ターゲット細胞単独
から放出された平均ｃｐｍを、総放出は、０．１Ｎ Ｎ
ａＯＨで溶解させたターゲット細胞に取り込まれた⁵¹Ｃ
ｒの総量をそれぞれ示す。

【００７７】上記試験の結果は図１２に示す通りであ
る。

【００７８】該図より、本発明リピドＡ、P.gingivalis
リピドＡ及び化合物５０６のそれぞれとインキュベー
ションしたヒトＰＢＭＣにおいて、略同等のＮＫ細胞活
性誘導が観察された。

【００７９】上述した各試験結果及びその他の生物活性
試験の結果より、次のことが明らかとなった。

【００８０】即ち、ガラクトサミン投与マウスにおける
致死毒性、ウサギに対する発熱性及びリムルス試験活性
等の内毒素性について、本発明リピドＡは、毒素が皆無
であるか又は極めて弱い（表１〜３）。この低毒性は、
P.gingivalis リピドＡと同様に、Ｃ−２’位及びＣ−
３’位において２個のアシルオキシアシル基を有する化
合物５０６のそれよりもかなり弱い。

【００８１】また、本発明リピドＡは、化合物５０６及
びP.gingivalis リピドＡに匹敵するＩＬ−６産生及び
ヒトＮＫ細胞の活性が観察された。

【００８２】本発明リピドＡの構造上の特徴は、以下の
通りまとめられる。即ち、グルコサミンβ（１−６）グ
ルコサミンという二糖骨格を有し、還元末端の１位に
は、エタノールアミンがリン酸エステル結合で結合した
リン酸がα結合している。更に、非還元末端側グルコサ
ミンの４’位にはリン酸基は存在せず、また、３位及び
３’位の水酸基においてエステル結合の脂肪酸は存在し
ない。脂肪酸は炭素数１８の（Ｒ）−βヒドロキシ脂肪
酸が、還元末端グルコサミンの２位アミノ基とアミド結
合で、また非還元末端グルコサミンの２′位のアミノ基
に３−アシルオキシアシル型の脂肪酸である炭素数１８
の脂肪酸がエステル結合した炭素数１８の（Ｒ）−βヒ
ドロキシ脂肪酸が結合している。以上の点で、腸内細菌
のリピドＡ類とは、明確に識別されることが明らかであ
る。

【００８３】本発明リピドＡは、また、B.fragilis（We
intraub, A., et al., Eur. J. Biochem., 1989, 183,
425-431）、P.gingivalis、Prevotella intermedia (Jo
hne,B., et al., Oral Microbiol. Immunol., 1988, 3,
22-27)のリピドＡと同様に、４′位にリン酸基を有し
ておらず、このことが極めて弱い毒性の原因因子である
と見なし得る。

【００８４】本発明リピドＡは、３−アシルオキシアシ
ル基を１個しか有しておらず、これにより内毒素性が皆
無又は極めて低い（ＴＮＦ−α産生も弱い）が、他のサ
イトカイン産生及びＮＫ細胞活性化は、化合物５０６と
同等に強く、かかる低内毒素及び強い免疫生体活性は、
骨格構造に結合した３−アシルオキシアシル基の位置に
起因していると考えられる。

【００８５】本発明リピドＡは、腸内細菌のリピドＡと
は異なり、P.gingivalis リピドＡと同様の化学構造を
有し、免疫刺激性を有するが、内毒素性は極めて低く、
従って炎症、免疫生体特性の制御等に重要な役割を演じ
ると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた本発明リピドＡの２次元シ
フト相関ＮＭＲ（ＣＯＳＹ）スペクトル分析結果を示す
グラフである。

【図２】実施例１で得られた本発明リピドＡの２次元全
相関ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ）スペクトル分析結果を示すグ
ラフである。

【図３】実施例１で得られた本発明リピドＡの２次元異
核多結合相関ＮＭＲ（Ｐ−Ｈ・ＨＭＢＣ）スペクトル分
析結果を示すグラフである。

【図４】実施例１で得られた本発明リピドＡの２次元異
核多結合相関ＮＭＲ（Ｐ−Ｈ・ＨＭＢＣ）スペクトル分
析結果（図３の部分拡大）を示すグラフである。

【図５】実施例１で得られた本発明リピドＡの質量スペ
クトル（ＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ、ノーマルスキャン）分析
結果を示すグラフである。

【図６】実施例１で得られた本発明リピドＡの質量スペ
クトル（ＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ、リンクドスキャン）分析
結果を示すグラフである。図７（ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）

【図７】実施例１で得られた本発明リピドＡの質量スペ
クトル（ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）分析結果を示すグラフで
ある。

【図８】実施例１で得られた本発明リピドＡのＦＡＢ高
分解能質量スペクトル分析結果を示すグラフである。

【図９】生物活性試験例４に従い求められた本発明リピ
ドＡのＴＮＦ−α産生活性を示すグラフである。

【図１０】生物活性試験例４に従い求められた本発明リ
ピドＡのＩＬ−６産生活性を示すグラフである。

【図１１】生物活性試験例４に従い求められた本発明リ
ピドＡのＩＬ−８産生活性を示すグラフである。

【図１２】生物活性試験例５に従い求められた本発明リ
ピドＡのＮＫ細胞活性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ ＡＤＺ ＡＤＺ (72)発明者 田村 俊秀 大阪府吹田市青山台２−８−５ (72)発明者 下山 孝 兵庫県神戸市東灘区岡本６−12−34−301

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 で表される化学構造を有するヘリコバクター・ピロリの
   リピドＡ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のヘリコバクター・ピロ
   リのリピドＡを有効成分として含む医薬組成物。